CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP ALKALOID TRONG TÂM SEN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA DƯỢC- ĐIỀU DƯỠNG
BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH

CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP ALKALOID TRONG TÂM SEN
(NELUMBO NUCIFERA GAERTN NELUMBONACEAE)

Sinh viên: Phù Hạnh Nguyên
Lê Hữu Bảo Trân
Lớp : Đại Học Dược 7B
Người hướng dẫn : Lưu Thảo Phúc Trường

Cần Thơ, 2015

Mục lục:
Trang

Danh mục chữ viết tắt........................................................................................3
Phần 1: Tổng quan tài liệu ................................................................................4


Bài tiểu luận hóa phân tích
1.1 Tóm tắt và giới thiệu.....................................................................................4
1.2 Đặt vấn đề......................................................................................................5
Phần 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu.............................................5
2.1 Đối tượng nghiên cứu....................................................................................5
2.2 Hóa chất, dung môi........................................................................................5
2.3 Phương pháp nghiên cứu...............................................................................5
Phần 3: Kết quả và bàn luận............................................................................5

3.1 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng....................................................................6
3.2 Chiết xuất alkaloid toàn phần từ tâm sen......................................................7
3.3 Phân lập alkaloid từ tâm sen ........................................................................8
Phần 4: Kết luận................................................................................................. 10
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................10

Danh mục chữ viết tắt

PDA : Photodiode array ( Màng Diod quang).
TCL : sắc ký lớp mỏng.
Đại Học Dược 7B

Trang 2


Bài tiểu luận hóa phân tích
UV-VIS : tử ngoại- khả kiến.
UV: tử ngoại.
DCM : : Diclometan
MeOH : Methanol

Phần 1: Tổng quan tài liệu
1/ Tóm tắt và giới thiệu:
Đại Học Dược 7B

Trang 3


Bài tiểu luận hóa phân tích
Từ khóa: Nelumbo nucifera, Nelumbonaceae, Alkaloid, Neferin.

Mở đầu: Sen (Nelumbo nucifera Gaertn ) họ
Nelumbonaceae được biết đến với nhiều ứng dụng
quan trọng trong cuộc sống, giá trị trong thực phẩm và
mang ý nghĩa tâm linh. Với vẻ đẹp thanh khiết, Sen trở
thành một biểu tượng không thể thiếu trong một số nền
văn hóa, và gắn liền với tâm hồn con người Việt Nam..
Ngoài ra, từ lâu Sen đã được biết đến như một dược
liệu quý. Sen đã được nghiên cứu và áp dụng để chữa
nhiều bệnh, các bệnh trên đường tiêu hóa, tim mạch,
tâm thần kinh, sưng viêm, rất thành công.
Hiện nay, càng có nhiều nghiên cứu về thành phần quan trọng trong Sen là
alkaloid. Chúng tồn tại trong toàn bộ cây sen: thân, lá, hoa và có nhiều trong tâm
sen. Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu kỹ và toàn diện
về tâm Sen. Vì thế đề tài này được thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu về thành
phần alkaloid của tâm Sen và phân lập alkaloid chính trong Sen để dùng làm chất
chuẩn cho tiêu chuẩn hoá các dược liệu cũng như góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu
về thành phần hóa học cho cây Sen Việt Nam.
Mục tiêu: Chiết xuất, phân lập alkaloid trong tâm Sen.
Phương pháp: Chiết cao chiết toàn phần và tách thành các phân đoạn đơn giản
bằng phân bố giữa nước với các dung môi có độ phân cực khác nhau và theo pH.
Phân lập chất tinh khiết bằng sắc ký cột chân không và sắc ký cột cổ điển...
Kết quả: Tách được các phân đoạn đơn giản hơn (P, NP8, NP5) từ cao alkaloid
toàn phần theo sự biến thiên pH. Đồng thời đã phân lập được alcaloid EN-1, EN-2
được xác định là neferin và nuciferin.
Kết luận: Đề tài đã xác định được chất tinh khiết neferin và nuciferin tạo cơ sở
cho việc định tính điểm chỉ và định lượng neferin trong tâm Sen ở các vùng miền
và mùa thu hái khác nhau .

2/ Đặt vấn đề:

Đại Học Dược 7B

Trang 4


Bài tiểu luận hóa phân tích
Trong kho tàng thực vật và cây thuốc Việt Nam, cây Sen (Nelumbo nucifera
Gaertn. Nelumbonaceae) mọc ở ao, hồ có ở khắp mọi miền đất nước, là một trong
số ít các dược thảo mà tất cả các bộ phận đều là những vị thuốc quí, có giá trị sinh
học cao. Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng các chế phẩm bào chế từ tâm, lá Sen
như thuốc viên uống, cao thuốc, các loại trà đều là dạng cao toàn phần, dịch chiết
toàn phần. Do đó nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tiêu chuẩn hóa thành phần
alkaloid chính có tác dụng sinh học trong tâm Sen Việt Nam sẽ góp phần nâng cao
tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu và các chế phẩm từ Sen cũng như thăm dò các
tác dụng sinh học của chúng là việc làm cần thiết.

Phần 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (được sấy khô ở 400C và bảo quản ở
nhiệt độ thấp) được thu hái tại Đồng tháp và mua tại nhà thuốc đông dược.

2.2 Hóa chất, dung môi
Tất cả các dung môi, hóa chất đều là loại tinh khiết đạt tiêu chuẩn phân tích.

2.3 Phương pháp nghiên cứu
Chiết cao chiết cồn toàn phần và tách thành các phân đoạn đơn giản bằng phân bố
giữa nước với các dung môi có độ phân cực khác nhau và theo pH. Phân tách các
phân đoạn chiết bằng phân bố lỏng-lỏng, sắc kí cột chân không.
Phân lập chất tinh khiết bằng sắc ký cột cổ điển, sắc ký rây phân tử và kết tinh
phân đoạn.

Phần 3: Kết quả và bàn luận
3.1 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Qua thăm dò một số hệ dung môi cho sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi
DCM-MeOH-NH4OH (90:10:1) có khả năng tách tốt các alkaloid phân
cực mạnh và trung bình của tâm Sen và hệ dung môi DCM-MeOH NH4OH
(95:5:1) tách tốt các alkaloid kém phân cực.

UV365
Đại Học Dược 7B

UV254
Trang 5

Dragendorff


Bài tiểu luận hóa phân tích

Sắc ký đồ alkaloid toàn phần của tâm sen

3.2 Chiết xuất alkaloid toàn phần từ tâm sen
Chiết xuất alkaloid toàn phần từ tâm sen theo quy trình sau :
Bột dược liệu làm ẩm bằng NH4OH 10% sau đó chiết bằng cồn 700 dịch chiết cồn
được cất dưới áp suất giảm để thu hồi cồn.Hòa tan cắn vao nước, acid hóa bằng
HCL 5% đến PH =2.Lọc loại bỏ cặn.Dịch lọc acid được chiết bằng ether dầu hỏa
để loại tạp.Dịch chiết acid được thêm NH4OH 10% đến PH=10-11 rồi chiết bằng
CHCl3 .Dịch chiết CHCl3 được cất thu hồi dung môi,còn lại cắn alkaloid toàn phần.

Bột tâm sen

Cồn 70%,
thu hồi cồn dưới áp suất giảm

Dịch chiết đậm
Đại Học Dược 7B

Trang 6

Phân đoạn
Dịch
Dịch
sau
chiết
khi
Phân
đoạn
Điều chỉnh đến pH=7-8,
Dịch
acid
Dịch
kiềm
Phân
đoạnthô
P I
NP5
loại
kết
Kết
tinh
Sơtinh

đồ chiết cao
toàn
phần của tâm
sen
pH=5
Chiếtcồn
vớiCHCl
NaOH
Chiết
với
NP
3


Bài tiểu luận hóa phân tích

Thêm HCl 5% đến pH =2

NH4OH 10% đến pH=10,chiết với CHCl3

Dịch chiết
CHCl3

Dịch kiềm
pH=7-8

Phân đoạn
NP8

3.3 Phân lập alkaloid từ tâm sen

Phân lập alkaloid bằng sắc ký cột sử dụng silica gel GF254(Merck):Hoạt hóa silica
gel ở nhiệt độ 1100C trong 1 giờ.Lắc silica gel với hệ dung môi đã chọn thành hỗn
dịch ,rót từ từ vaò cột, sau đó cho dung môi chảy qua liên tục với thời gian là 5
giờ để ổn định cột.Cắn alkaloid toàn phần ở trên được hòa vaò một lượng nhỏ với
Đại Học Dược 7B

Trang 7


Bài tiểu luận hóa phân tích
hệ dung môi đã chọn tạo thành dịch alkaloid đậm đặc rồi trộn với một lượng silica
gel vừa đủ đưa vào cột sắc ký đã chuẩn bị ở trên .
Rửa giải bằng hệ dung môi đã chọn theo tỉ lệ độ phân cực tăng dần.Tốc độ chảy
khỏang 30 giọt/ phút,hứng mỗi phân đoạn khoảng 5ml vào các ống nghiệm riêng
và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng.Chọn riêng các phân đoạn chỉ có một vết trên
sắc ký đồ ,bốc hơi dung môi thu được cắn alkaloid.Kết tinh lại nhiều lần sẽ thu
được alkaloid tinh khiết.Riêng các phân đoạn có 2 hoặc 3 vết được tiến hành phân
lập tiếpbằng sắc ký lớp mỏng điều chế.
Tách phân đoạn P, NP, NP8
Từ phân đoạn NP ở trên, dịch CHCl3 được cô đến cắn, hòa vào HCl 5% điều chỉnh
đến pH=2 bằng NH4OH 25%, chiết phân bố với CHCl3 đến khi hầu như không còn
alkaloid qua lớp CHCl3. Dịch chiết được gộp lại thu được phân đoạn NP5. Tiếp
tục kiềm hóa dịch pH=4-5 ở trên đến pH=7-8, chiết phân bố với CHCl3 đến khi hầu
như không còn alkaloid qua lớp CHCl3. Dịch chiết được gộp lại thu được phân
đoạn NP8

Kết quả tách các phân đoạn từ cao chiết cồn được minh hoạ trong hình sau:

Đại Học Dược 7B

Trang 8


Bài tiểu luận hóa phân tích
Dragendorff

UV254

UV365

TPNP5
P NPNP7
NP5 NP7
TP P NP

TP P NP NP5 NP7

Hình :Sắc ký đồ các phân đoạn từ cao
cồn
Phân lập alkaloid bằng sắc ký lớp mỏng điều chế: Chấm dung dịch chứa 2 hoặc 3
vết lên những bản mỏng có kích thước 20 x 20 cm được tráng chất hấp phụ là silica
gel G (Merck), đã hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ. Hệ dung môi khai triển là
CHCl3:MeOH:NH4OH ( 50 :9 :1 ). Bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó
phun thuốc thử Dragendorff lên một góc để phát hiện và đánh dấu vết alkaloid.
Cạo lấy silica gel chứa chất cần tách, phản hấp phụ bằng CHCl3 và lọc. Để CHCl3
bốc hơi tự nhiên, sau đó hoàn tan lại bằn cồn ethanol rồi để tủ lạnh, cho kết tinh lại
nhiều lần thu được 2 alkaloid tinh khiết là EN-1 và EN-2.

Phân lập EN-1
Phần kết tinh thô I được hòa tan trong một lượng vừa đủ HCl, lọc và để kết tinh

trong tủ lạnh. Tinh thể được lọc và rửa kỹ bằng nước lạnh đến khi dịch rửa trung
tính, thu được tinh thể hình kim, màu trắng (EN-1).Tiến hành sắc ký lớp mỏng cho
thấy EN-1 là một alkaloid phân cực trung bình và có hàm lượng cao nhất trong tâm
Sen và EN-1 chỉ cho một vết trên đèn UV và thuốc thử Dragendorff cho thấy kết
tinh thô I là tinh khiết trên TLC với EN-1

Đại Học Dược 7B

Trang 9


Bài tiểu luận hóa phân tích

Hình : SKĐ của EN-1 trên ba hệ dung môi khác nhau
Phổ UV của EN-1 trong dung môi nước cho λmax 282nm nằm trong vùng hấp thu
của alkaloid có khung bibenzylisoquinolein phù hợp với λmax của neferin mà tài
liệu nước ngoài đã công bố.

Công thức cấu tạo của Neferin

Phân lập EN-2 từ NP8
NP8 được cô dưới áp suất giảm để được dịch CHCl3 đậm đặc và phần kết tủa màu
vàng.Dịch CHCl3 được cô tới cắn. Hòa tan cắn với lượng vừa đủ dung dịch HCl
5%. Dịch acid được loại tạp bằng ether dầu hỏa và kiềm hóa bằng amoniac tới pH
8-9. Chiết alkaloid từ dịch kiềm bằng chloroform và cô thu hồi dung môi thu được
cắn. Hòa tan vào một lượng tối thiểu methanol và để kết tinh thu được hình lăng
trụ (EN-2).
Tiến hành SKLM cho EN-2 với ba hệ dung môi khác nhau, EN-2 chỉ cho một vết
trên đèn UV và thuốc thử Dragendorff cho thấy EN-2 là một alkaloid kém phân
cực và tinh khiết trên TLC.

Đại Học Dược 7B

Trang 10


Bài tiểu luận hóa phân tích

Hình : Sắc ký đồ kiểm tra của EN-2
EN-2 có dạng tinh thể hình lăng trụ, không màu, không mùi, vị đắng. Căn cứ vào
nhiệt độ nóng chảy khoảng 163-1640C,phổ UV.Qua các dữ liệu thu được có thể kết
luận EN-2 là nuciferin (C19H21NO2)

Công thức cấu tạo của Nuciferin

Phần 4 :Kết luận
Thành phần alkaloid của tâm Sen đã được khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng. Alkaloid
chính trong đó đã được phân lập và xác định cấu trúc là neferin và nuciferin. Các
alkaloid này có thể sử dụng làm chất đánh dấu trong nghiên cứu tiêu chuẩn hoá
tâm Sen và các chế phẩm có tâm Sen cũng như để khảo sát các tác dụng dược lý.

Đại Học Dược 7B

Trang 11


Bài tiểu luận hóa phân tích
TÀI LIỆU THAM KHẢO :
1. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn , Trần Hùng (2011), Nghiên cứu
thành phần alkaloid trong tâm sen, Y Học TP. Hồ Chí Minh

2. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn , Trần Hùng (2011),Xây dựng
qui trình định lượng Neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò diod quang, Y Học TP. Hồ Chí
Minh
3. Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012), Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Conessin,
Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm
nghiệm thuốc, trang 16

Đại Học Dược 7B

Trang 12