XÁC ĐỊNH GENOTYPE CHỦNG VIRUS NEWCASTLE PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM DỰA TRÊN MỘT PHẦN GEN KHÁNG NGUYÊN F

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI
XÁC ĐỊNH GENOTYPE CHỦNG VIRUS NEWCASTLE PHÂN LẬP
TẠI VIỆT NAM DỰA TRÊN MỘT PHẦN GEN KHÁNG NGUYÊN F

HÀ NỘI, 10/2016


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
XÁC ĐỊNH GENOTPE CỦA NEWCASTLE VIRUS PHÂN LẬP
TẠI VIỆT NAM DỰA TRÊN MỘT PHẦN GEN KHÁNG NGUYÊN F

Sinh viên
Ngành
Giảng viên hướng dẫn

Đỗ Thị Hằng
Công nghệ sinh học
TS.Lê Thị Kim Xuyến
Viện Công nghệ sinh học
TS.Nguyễn Hữu Đức

Học viện Nông nghiệp Việt Nam
HÀ NỘI, 10/2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong luận văn là do chính tôi trực tiếp thực
hiện.
Các số liệu và kết quả được công bố trong luận văn là hoàn toàn trung thực,
chính xác và chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng
Sinh viên

-3-

năm 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS.Lê Thị Kim
Xuyến- Cán bộ phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học- Viện hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam vàThầy giáoTS. Nguyễn Hữu Đức – Phó Trưởng khoa
Công nghệ sinh học, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Học viện Nông
nghiệp Việt Namlà người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện
tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Tôicũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tớicác cán bộ phòng Miễn dịch học đã luôn
tận tình chỉ bảo, động viên và cho tôi những lời khuyên quý báu trong công việc cũng
như trong cuộc sống.
Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô trong khoa Công nghệ sinh

học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình
học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến Bố, Mẹ và toàn thể
những người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn hỗ trợ, động viên, khuyến khích
tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

Sinh viên

-4-

năm 2016


MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH

-5-


DANH MỤC BẢNG

-6-


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

(Chữ viết tắt, kí hiệu chuyên ngành)
Từ viết tắt
NDV
IGS
PCR
RNA
DNA
cDNA
bp
µl

Tên đầy đủ
Newcastle Disease Virus
Intergenic Sequences
Polymerase Chain Reaction
Ribonucleotide Acid
Deoxyribonucleic Acid
Complementary Deoxyribonucleic Acid
Base pair
Microlitre

-7-


-8-


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
Chăn nuôi gia súc, gia cầm từ lâu đã đóng một vị trí quan trọng trong ngành chăn
nuôi của nước ta. Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi đã có những thay đổi

đáng kể và có ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình phát triển của ngành nông nghiệp
Việt Nam, góp phần cải thiện đời sống vật chất, nâng cao mức sống cho người dân ở
thành thị cũng như nông thôn. Tuy nhiên, bên cạnh những thành tựu đã đạt được, chăn
nuôi gia cầm cũng đang gặp phải những khó khăn khách quan và thách thức không
nhỏ do bệnh tật gây ra, gây tổn hại nghiêm trọng về kinh tế cho ngành chăn nuôi. Một
trong những bệnh thường gặp ở gia cầm tại các cơ sở chăn nuôi là bệnh Newcastle.
Bệnh gây ra bởi virus Paramyxovirus serotype 1 thuộc nhóm Paramyxovididae, chúng
gây bệnh tích trên đường hô hấp, tiêu hóa và tác động tới hệ thần kinh, bệnh thường
nhiễm ghép với các bệnh khác và tỉ lệ chết rất cao. Bệnh được phát hiện vào những
năm 20 của thế kỉ XX nhưng cho đến nay bệnh vẫn là mối đe dọa nguy hiểm đối với
ngành chăn nuôi gia cầm Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Hiện nay, bệnh
chưa có thuốc điều trị. Biện pháp tốt nhất để kiểm soát nguy cơ bùng phát dịch bệnh là
thực hiện an toàn sinh học và sử dụng vacine phòng bệnh (Grace D., 2014).
Với mục đích tìm hiểu về đặc tính phân tử của chủng virus Newcastle đương nhiễm
tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xác định genotype của chủng
virus Newcastle phân lập ở Việt Nam dựa trên một phần gen kháng nguyên F”.


Mục tiêu nghiên cứu
-

Xác định trình tự một phần gen kháng nguyên F của chủng virus
Newcastle phân lập tại Việt Nam.

-

Đưa ra được những phân tích, đánh giá về các đặc tính sinh học của
genotype đã được xác định với các genotype trên thế giới.

-

Xây dựng được mối quan hệ nguồn gốc phả hệ với các genotype đã được
công bố trên thế giới.

-9-


PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đại cương về bệnh Newcastle
Bệnh Newcastle hay còn gọi là bệnh gà rù, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan
rất nhanh ở gà, do một loại virus thuộc nhóm Paramixo gây ra. Bệnh gây xáo trộn và hư
hại trên đường tiêu hóa, hô hấp, thần kinh. Bệnh là mối nguy hiểm thường trực cho ngành
chăn nuôi gia cầm. Bệnh gây chết với tỉ lệ chết có thể lên đến 100% (Doyle, 1985).
2.1.1.Lịch sử và địa dư bệnh

 Lịch sử bệnh
Năm 1926, bệnh Newcastle xảy ra đầu tiên ở quần đảo Java (Indonesia) và ở
Newcastle- upon- type (Anh). Theo Doyle (1985), các nhà khoa học đã tiến hành giải
phẫu và mô tả bệnh, đây là bệnh có tỉ lệ chết cao, có khi lên tới 100%.
Riêng ở California (Mỹ), bệnh này xảy ra vào giữa những năm 1930 (Alexander,
1988) được gọi là bệnh “viêm não phổi”, bệnh có tỉ lệ chết thấp, hiếm khi tới 15%, với
biểu hiện hô hấp nhẹ, đôi khi có triệu chứng thần kinh nhưng khác hẳn với bệnh đã
được Doyle mô tả.
Sau đó, vào các năm 1941, 1946, 1951, một số lượng lớn ổ dịch do virus Newcastle
lại xuất hiện ở Mỹ và đã thiệt hại 52 triệu đôla. Bệnh tiếp tục bùng phát mãnh liệt vào
năm 1977, 1979 và 1980. Năm 2002, bệnh lại quay lại California và Nevadan, đến
tháng 1 năm 2003 đã có hơn 1,2 triệu gia cầm bị bệnh và buộc phải tiêu hủy để ngăn
ngừa bệnh lây lan (OIE, 2005).
Tại Venezuela, Mexico tỉ lệ chết của gà trưởng thành tới 100% (Brandly, 1965).
Năm 1966, bệnh xảy ra ở Iran với thể cấp tính. Bệnh lây lan vào châu Á rồi từ Tây Âu

qua Trung Đông (Lancaster và Alexader, 1975).
Ở châu Âu, cho đến năm 1990 các vụ dịch xảy ra ở những năm đầu của thập kỉ 70
vẫn diễn ra nhưng với quy mô nhỏ lẻ mặc dù đã có chương trình về vaccine để tiêm
chủng cho gà (Alexander et al., 1998).

 Tình hình bệnh trên thế giới
Virus Newcastle (Newcastle Disease Virus-NDV) được báo cáo có thể lây nhiễm ở
động vật từ chim, bò sát và con người, có ít nhất 241 loài chim đại diện cho 27 trong
tổng 50 bộ của lớp Chim. Hầu như tất cả các loài chim đều dễ bị lây nhiễm, tuy nhiên
-10-


bệnh Newcastle có thể biến đổi đa dạng từ loài này sang loài khác (FAO, 2002).
NDV thường xuyên phân lập từ các loài chim hoang dã và các loài thủy cầm khác.
Hầu hết những virus này được phân lập từ chim đều có độc lực thấp đối với gà
(Lancaster và Alexander, 1975). Các vụ dịch nghiêm trọng của NDV ở chim hoang dã
được báo cáo ở chim Phalacrocorax auritus trong những năm 1990 tại Bắc Mỹ.
Những báo cáo phát hiện sớm hơn của ND ở loài này và các loài liên quan khác là vào
cuối những năm 1940 tại Scotland và Quebec năm 1975 (FAO, 2002). Các vụ dịch xảy
ra gần đây liên quan đến chim cốc là năm 1990 tại Alberta, Saskatchewan và Manitoba
của Canada. Năm 1992, bệnh này quay trở lại lây nhiễm trên chim cốc ở phía Tây
Canada, xung quanh hồ Great Lakes và sau đó lây lan sang gà tây.
Các loại gia cầm có thể bị lây nhiễm NDV và chúng đóng vai trò quan trọng trong quá
trình kiểm soát lây nhiễm NDV. Các loài chim bao gồm vịt, gà, ngỗng, gà tây, bồ câu...
Vào những năm cuối thập niên 70, một chủng Newcastle với nhiều kháng nguyên
khác nhau từ giống cổ điển đã xuất hiện ở chim bồ câu. Nghiên cứu bệnh Newcastle ở
chim bồ câu cho thấy tỉ lệ mắc chiếm từ 30%- 70%, tỉ lệ chết có thể thấp, hiếm khi
vượt quá 100%. Thời gian ủ bệnh từ vài ngày đến vài tuần. Triệu chứng chủ yếu là thần
kinh và ỉa chảy, ngoài ra còn thấy triệu chứng ở đường hô hấp, viêm mũi, viêm màng kết
mạc mắt, run rẩy, ngoẹo cổ và thiếu sự kết hợp (Alexander, 1986; Estudillo, 1972).

Bệnh biểu hiện ở gà tây là bình thường, ít nghiêm trọng, với triệu chứng chủ yếu là hô
hấp và thần kinh. Bệnh có ảnh hưởng đến sản xuất trứng, trứng có vỏ mềm, mất hình dáng
và chất lượng trứng giảm. Gà có thể liệt 1-2 chân, trong ổ dịch quá cấp có tỉ lệ chết cao.
Chim cút ít mẫn cảm với virus Newcastle hơn gà, thời gian ủ bệnh từ 2- 15 ngày,
trung bình 5-6 ngày. Tỉ lệ chết có thể lên tới 90% ở chim cút hậu bị và 50% ở chim cút
trưởng thành.
Vịt, ngan, ngỗng đều có khả năng nhiễm bệnh Newcastle (Asplin, 1947; Higgins,
1971 và Estudillo, 1972). Ở ngỗng và vịt mắc bệnh có biểu hiện liệt chân, cánh và
không có triệu chứng hô hấp. Tỉ lệ nhiễm của ngỗng, ngan và vịt khoảng 10% hoặc ít
hơn. Tỉ lệ chết chỉ có ở vịt và ngỗng khoảng 10%.
Gà là đối tượng có tỉ lệ nhiễm và chết do bệnh Newcastle cao nhất trong các loại
gia cầm. Bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi. Tỉ lệ chết 90-100%.
Bệnh ít xảy ra ở người nhưng bệnh có thể gây viêm kết mạc mắt, các hạch lâm ba ngoại
-11-


biên, trong trường hợp bệnh nặng có thể gây khó thở, viêm phổi. Trẻ em có thể bị viêm màng
não.

 Tình hình bệnh tại Việt Nam
Ở Việt Nam bệnh đã có từ lâu, nhưng mãi đến năm 1949, Jacotot và Louet đã
chứng minh virus Newcastle ở Nha Trang sau khi nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm
cho gà và nuôi cấy trên phôi gà, làm phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA), phản ứng
ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) và miễn dịch chéo. Năm 1956, Nguyễn Lương và
Trần Quan Nhiên đã nghiên cứu bệnh này ở nhiều tỉnh và chứng minh chắc chắn rằng
bệnh Newcastle đã có ở nước ta. Ở miền Bắc từ cuối năm 1955-1957 đã có nhiều
nghiên cứu tìm hiểu bệnh dịch tả gà và bệnh Newcastle, chưa thấy có virus dịch tả gà.
Điều này cũng phù hợp với thông báo của uy ban quốc tế phân loại virus gà: từ năm
1940 trở lại đây trên thế giới không có bệnh dịch tả gà cổ điển nữa. Nguyễn Bá Huệ và
Nguyễn Thu Hồng (1980) đã nghiên cứu và chứng minh được rằng: virus gây ra

những trận dịch lớn năm 1970 ở nông trường An Khánh, đầu năm 1974 ở Đông Anh,
Hà Nội, Hải Phòng là do virus cường độc Newcastle gây ra.
Theo nghiên cứu tình hình bệnh Newcastle trên các giống gà thả vườn được
thực hiện qua việc khảo sát dấu hiệu lâm sàng, quan sát bệnh tích và xét nghiệm bằng
phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) từ 47 đàn gà
tại tỉnh Hậu Giang trong năm 2011, kết quả cho thấy có 23 đàn gà mắc bệnh
Newcastle từ 35 đàn nghi ngờ. Tỷ lệ chết của gà mắc NDV là 20,02% cao hơn gà mắc
các bệnh khác (18,09%). Bệnh thường xảy ra nhất ở các đàn gà không được tiêm
phòng, kế đến là các đàn gà chỉ được tiêm phòng 1 lần và gà được tiêm phòng 2 lần.
Cho đến nay, ở Việt Nam, bệnh Newcastle vẫn thường xuyên xảy ra và gây ra những
tổn thất lớn trong ngành chăn nuôi gà, nhất là chăn nuôi gà công nghiệp phát triển mạnh.
2.1.2. Đặc tính gây bệnh
Bện Newcastle do loài virus Newcastle gây nhiễm trên các loài gia cầm như gà, gà
tây, chim cút, bồ câu. Mọi lứa tuổi đều cảm thụ với bệnh, gia cầm non mẫn cảm hơn
gia cầm lớn. Vịt, ngỗng …và người cũng có thể nhiễm đề kháng với virus. Những loài
chim như két đóng vai trò là vật mang trùng. Năm 1987, Acha và Szyfres phát hiện ra
bệnh ít xảy ra trên người, chủ yếu là những người có tính chất nghề nghiệp có liên
quan như: công nhân lò mổ, nhân viên phòng thí nghiệm hoặc những người thực hiện
-12-


việc chủng ngừa vaccine sống (Kaleta, E.F. & Baldauf, C. , 1988). Dấu hiệu lâm sàng
của bệnh rất khác nhau giữa các loài chim bị nhiễm virus. Hầu hết thủy cầm đề kháng
với virus nhưng những loài chim nuôi nhốt thành đàn lại mẫn cảm với virus.

Hình 2.1: Vòng truyền lây của virus Newcastle
(Nguồn: )
2.1.3. Cơ chế gây bệnh
Thời gian ủ bệnh trên gà từ 2- 5 ngày, bồ câu từ 4 -18 ngày (Beard và Hanson,
1984), chim cút từ 2 -15 ngày, nhưng trung bình từ 5 -6 ngày (Sharaway, 1994).

Virus có thể xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa, qua niêm mạc hầu, họng vào
máu, gây nhiễm trùng huyết và gây viêm hoại tử từ nội mô ở các cơ quan, gây xuất
huyết do thành huyết quản bị phá hủy và xuất dịch vào các xoang trong cơ thể.
Virus không tác động trực tiếp gây viêm phổi, nhưng thường gây khó thở do tác
động của virus làm rối loạn hệ thống tuần hoàn và trung khu hô hấp của hệ thần
kinh trung ương.
Tùy thuộc vào động lực của chủng virus gây bệnh và sức đề kháng của vật chủ mà
vật chủ đó có thể sống hoặc chết hoặc có thể miễn dịch với bệnh.
-13-


Virus vào cơ thể sau khi được nhân lên, gây tổn thương thực thể tế bào rồi thải ra
ngoài và nó có thể được phát hiện trong phân vào ngày thứ 3- 5 sau khi nhiễm bệnh
(Nguyễn Vĩnh Phước, 1978; Nguyễn Thái và cs, 1976).
2.1.4. Triệu chứng lâm sàng
Bệnh lây lan nhanh, mạnh, qua hô hấp, tiêu hóa, tiết dịch. Gà mọi lứa tuổi đều mắc
bệnh và tỉ lệ chết thường rất cao từ 90 - 100%. Bệnh có 5 thể biểu hiện: quá cấp tính,
cấp, dưới cấp, mãn tính và không điển hình. Theo Lê Văn Năm (2012), bệnh chia làm
3 thể: thể phát nhanh (thể quá cấp và cấp tính), thể trung bình (dưới cấp) và thể phát
triển chậm (thể mãn tính và thể không điển hình).
-

 Thể phát nhanh
Gà bỏ ăn, ủ rũ, buồn ngủ, mào thâm, rù, tiêu chảy phân xanh hoặc trắng, khó

thở, thở khò khè đôi khi sặc khoẹt kèm theo tiếng, nước mũi chảy dàn dụa,
nước mắt, nước dãi chảy dài kéo thành sợi, diều chứa thức ăn không tiêu và
-

nhiều hơi khí.

Ở gà đẻ thấy giảm đẻ, có nhiều trứng non, vỏ mềm, kích thước nhỏ, gà gầy sút

-

nhanh và chết rất nhanh, chết mỗi ngày một tăng, tỷ lệ chết lên đến 100%.
 Thể phát trung bình
Các biểu hiện chủ yếu là ho hen sặc khoẹt, gà rất khó thở, phải rước dài, rướn

-

cao cổ để hít khí.
Gà đi tiêu chảy phân xanh, phân xanh trắng, ăn uống kém, diều chứa đầy hơi
hoặc chất lỏng, gầy ruộc, mào thâm, xung quanh lỗ huyệt bẩn do phân xanh

-

bám dính.
Gà bệnh bị liệt chân, liệt cánh, ngoẹo đầu, ngoẹo cổ khiến gà không ăn uống được,

-

gầy sút nhanh và chết. Gà chết mỗi ngày một tăng, tỷ lệ chết lên đến 60-70%.
 Thể phát chậm
Đây là thể bệnh thường xảy ra ở những đàn gà đã được dùng vaccine Lasota hoặc

-

ND-IB thậm chí hoặc Clone 45 để phòng bệnh, nhưng đáp ứng miễn dịch chưa đủ.
Lúc đầu, gà bệnh xuất hiện lác đác trong đàn gà với biểu hiện giảm hoặc bỏ ăn,
trong khi nhìn tổng thể cả đàn không thấy triệu chứng bệnh, nhưng mỗi ngày số

-

gà ốm cứ tăng dần.
Sau đó, nhiều gà ốm bắt đầu tiêu chảy loãng, phân xanh trắng, xung quanh lô
huyệt bẩn, chân mỏ khô quắt, lông xơ, chúng đứng lẻ loi, mắt nhắm nghiền rụt

-

cổ hoặc nằm tụm đống vào một góc chuồng, mòa thâm hoặc thâm xám.
Trong đàn gà phần lớn gà vẫn ăn uống bình thường thì đêm nào cũng có gà
chết, chúng chết lác đác, rải rác lúc đầu vào ban đêm, sau tăng dần và chết cả
-14-


-

vào ban ngày, xác chết gầy, ướt, thịt thâm, mào thâm tím.
Đối với gà đẻ, tỷ lệ đẻ giảm nhẹ dần theo thời gian và có nhiều trứng non, kích
thước nhỏ, đôi khi gà đẻ ra không có vỏ cứng, dễ rách vỡ.

1

2

3

Hình 1Hình

4

2.2: Triệu chứng lâm sàng của bệnh Newcastle

1.Gà ngoẹo cổ. 2.Trứng gà đẻ ra không có vỏ cứng, dễ bị vỡ.
3.Hiện tượng gà xuất huyết ở gà.4. Lỗ huyệt bẩn do phân xanh bám
dính.
(Nguồn: />2.1.6. Chẩn đoán bệnh
Có nhiều phương pháp để chẩn đoán bệnh Newcastle, đó là dựa vào các dấu hiệu
lâm sàng hay các chỉ thị hóa sinh (FAO, 2002).
 Chẩn đoán lâm sàng

Để chẩn đoán xác định bệnh Newcastle, việc phân lập virus hay sử dụng các đặc
tính trong phòng thí nghiệm là rất cần thiết. Tuy nhiên, nếu bệnh xảy ra ở một khu vực
nhất định thì các dấu hiệu lâm sàng thường được sử dụng nhiều hơn trong chẩn đoán bệnh.
Các dấu hiệu phổ biến ở gà bệnh như: kiệt sức, lông xù, tiêu chảy phân trắng xanh.
Nếu gà bệnh còn sống thì nghẹo cổ, liệt hai chân, cánh hay có các dấu hiệu thần kinh
khác. Bệnh lây lan nhanh, tử vong trong vòng 2-3 ngày, tỉ lệ tử vong trên 50% ở các
quần thể gà con, và thời gian ủ bệnh thường là 3-6 ngày.
-15-


 Chẩn đoán cận lâm sàng

+ Phương pháp phân lập virus:
Việc chẩn đoán xác định bệnh Newcastle được thực hiện thông qua sự phân lập và
nhận dạng của virus (Alexander, 1998). Dịch từ khí quản và lỗ huyệt là nguồn dùng để
phân lập virus từ các loài chim đang sống mà không cần giết chúng. Bông gạc được
chèn vào khí quản hoặc lỗ huyệt, sau đó mẫu bệnh phẩm được đưa vào một lọ chứa
dung dịch đệm phosphate có penicilin và streptomycin sao cho đảm bảo mẫu được phủ
một lớp màng. Các mẫu này phải được giữ lạnh trong khi vận chuyển, bảo quản ở 4 0C

nếu chúng được xử lý trong vòng 48 giờ, hoặc đông lạnh ít nhất -20 0C cho đến khi
mẫu được phân lập (FAO, 2002). Phôi trứng gà 9 ngày tuổi được tiêm 0,1ml dịch vào
khoang niệu mô và tiếp tục ấp. Những quả trứng này được soi 2 lần/ ngày (FAO, 2002.
Khi phôi chết, thu nước trứng và kiểm tra bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu. Chẩn
đoán dựa trên sự ức chế ngưng kết hồng cầu bằng dung dịch anti- NDV đặc hiệu.
 Chẩn đoán cận lâm sàng

+ Phương pháp huyết thanh học
Trong trường hợp không tiêm phòng, sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu chống lại
NDV cho thấy gà bị nhiễm virus tại một thời gian, nhưng không nhất thiết tại thời
điểm lấy mẫu. Thực tế, nồng độ kháng thể cao cho thấy cá thể mới bị lây nhiễm bệnh.
Hai phương pháp được sử dụng để xác định nồng độ kháng thể: phản ứng ức chế hồng
cầu (HI) và phương pháp miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) (FAO, 2002). Cả hai
phương pháp này cần phải thu thập mẫu máu của gà. Theo Alders và Spradbrow
(2001), các mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch cánh. Việc thu thập mẫu ở gà mái dễ hơn
ở gà trống, có thể lấy máu trực tiếp vào một ống tiêm hoặc thu vào ống sau khi dùng
kim đâm vào tinh mạch. Trong cả hai trường hợp, mẫu máu đông được dùng để tách
huyết thanh và bảo quản lạnh cho đến khi được đông lạnh trong phòng thí nghiệm.
+ Các thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu
Virus Newcastle bị trung hòa bởi huyết thanh dương tính Newcastle, khi bị trung
hòa, virus không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Bằng phản ứng HI sẽ phát
hiện kháng thể làm ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Dựa vào phản ứng này để phát hiện
gián tiếp sự nhiễm virusNewcastle của đàn gà, xác định hiệu giá đáp ứng miễn dịch
Newcastle với vaccine và để phân biệt các chủng virusNewcastle (FAO, 2002).
2.1.7. Phòng chống bệnh
-16-


 Thực hiện đầy đủ các quy định của pháp luật về thú y
Kiểm dịch gia cầm trước khi xuất nhập. Thời gian kiểm dịch ít nhất 35 ngày với sự

giám sát chặt chẽ của thú y.

 Vaccine phòng bệnh
Dựa vào đặc tính của virus Newcastle, khi xâm nhập vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể
sản sinh kháng thể, tạo khả năng miễn dịch chống lại bệnh một cách đặc hiệu. Allen và
cộng sự (1978), Meulemans (1987) đã đề cập đến các loại vaccine Newcastle và việc
sử dụng vaccine Newcastle để khống chế bệnh.
Có hai loại vaccine là vaccine sống và vaccine vô hoạt.

- Vaccine sống (gồm hai chủng): chủng Lentogen và chủng Mesogen.
- Vaccine vô hoạt: vaccine vô hoạt được sản xuất từ những virus sống, được xử lý bớt
Formalin hoặc Betaprpiolactone, sau đó bổ sung thêm chất bổ trợ để làm tăng tính
miễn dịch của vaccine (Sproteinnadbrow, P.B., 1988).
2.2. Sinh học phân tử virus Newcastle
2.2.1. Phân loại
NDV là thành viên thuộc chi Avulavirus, phân họ Paramyxovirinae, họ Paramyxiviridae
và bộ Mononergavirales (Mayo, 2002; Myrphy và cs, 1995). Virus này cũng được biết đến
thuộc phân nhóm PMV- 1(Alexander D.J, 1988).Các thành viên khác quan trọng của họ này là
virus sởi, virus quai bị, virus cúm loại 2 (PIV2), virus simian (SV5), virus hendra và virus
nipah.
2.2.2. Hình thái cấu tạo NDV
Virus Newcastle thuộc họ Paramyxoviridae, phân nhóm PMV- 1 (Alexander D.J,
1988) là một RNA virus sợi đơn, có cấu tạo xoắn. Virus thường đa hình thái: hình
tròn, hình trụ, hình sợi…virus có vỏ bọc lipid bên ngoài. Kích thước virion của virus
từ 120- 130nm, trung bình khoảng 180nm. Virus có cấu trúc nucleocapsid dạng xoắn
ốc đường kính 17- 18nm. Vỏ bọc được phủ các gai (glycoprotein HN- F) dài 8- 12nm.
Bộ gen của NDV bao gồm 6 gen được sắp xếp lần lượt 3’ NP-P-M-F-HN-L 5’ mã
hóa cho ít nhất 8 protein (Yongqi Yan, 2008). Vùng gen từ đầu 3’ có chiều dài 55
nucleotide mở đầu và vùng kết thúc 5’ dài 144 nucleotide. Trình tự mở đầu và kết thúc
rất cần thiết cho quá trình phiên mã và dịch mã của virus. Giữa vùng gen mở đầu và

vùng gen kết thúc có một đoạn nucleotide không mã hóa được gọi là vùng gen hoạt động
-17-


(IGS- Intergenic sequences) với chiều dài từ 1-47 nucleotide (Yongqi Yan, 2008).

Hình 2.3: Cấu trúc bộ gen ND

Hình 2.4: Bản đồ gen RNA của NDV.
(Nguồn: Yongqi Yan, 2008)
Các gen của NDV mã hóa cho ít nhất 8 protein: NP, P, M, F, HN, L, V và W.
Protein V và W được tạo ra bởi việc chèn phần bổ sung dư thừa G vào gen P của ORF
nhờ RNA polymerase trong phiên mã gen P của quá trình chỉnh sửa(Yongqi Yan,
2008). Hầu hết các tài liệu đều có liên quan đến chức năng của protein NDV được suy
ra từ những nghiên cứu về các thành viên khác của họParamyxoviridae hoặc họ
Rhabdoviridae(Yongqi Yan, 2008).
Gen NP của virus Newcastle dài 1747 nucleotide, mã hóa cho 489 amino acid của
protein NP. NP có khối lượng phân tử được dự đoán là 54 kD. Protein NP giữ vai trò quan
trọng trong quá trình phiên mã để tái bản bộ gen của virus (Yongqi Yan, 2008).
Protein P và gen P: protein P là protein nặng nhất của virus, có bản chất là acid và được
tạo ra từ bản không sửa chữa của gen P trong ORF. Chiều dài của gen P là 1451 nucleotide
-18-


và mã hóa cho 395 amino acid của protein P. Protein P với NP và L tạo nên phức hợp
enzyme polymerase hoạt động như nhân tố phiên mã và tái bản (Yongqi Yan, 2008).
Protein L: protein có cấu trúc lớn nhất nhưng không đa dạng trong lõi virus (chứa 50
bản sao) và là thành phần chính của enzyme RNA- dependent RNA polymerase trong sợi
âm (Yongqi Yan, 2008).Gen L chứa 6704 nucleotide và ORF của nó có 6615 nucleotide
mã hóa cho chuỗi polypeptide 2204 amino acid với khối lượng khoảng 242 kD. Protein L

cũng tham gia vào quá trình gắn đuôi poly A vào đầu 5’ và 3’ cho mRNAs sợi mới.
Protein M là protein có thành phần đa dạng nhất bên trong virus. Gen M có chiều dài
1241 nucleotide mã hóa cho chuỗi polypeptide dài 364 amino acid. Khối lượng phân tử là
40 kD. Protein M tương tác với phần đuôi của màng protein, lớp lipid kép và nucleocapsid
và được coi là cơ quan trung tâm của hình thái virus (Yongqi Yan, 2008).
Lớp vỏ của NDV gồm 2 màng glycoprotein: Fusion (F) protein dung hợp pH của
vỏ virus với màng bào tương của tế bào chủ và hemaggluyinin- neuraminidase (HN)
glycoprotein có nhiệm vụ gắn virus vào màng tế bào chủ.
Protein HN: HN glycoprotein đa chức năng là quyết định kháng nguyên chính của
virus. Gen HN có chiều dài 1998 nucleotide mã hóa cho 577 amino acid. Khối lượng
phân tử của HN là 74 kD. HN không chỉ liên kết với acid sialic, có vai trò trong việc
gắn của virus với acid sialic chứa receptor mà còn là enzyme phân cắt acid sialic (hoạt
tính neuraminidase) từ bề mặt của virus cũng như tính lây nhiễm tế bào chủ(Yongqi
Yan, 2008).
2.2.3. Kiểu gen NDV
Sử dụng phân tích phát sinh loài, NDV được chia làm hai lớp: lớp I và lớp II.
Lớp I được nhóm lại thành một kiểu gen duy nhất bao gồm chủ yếu là các virus đã
được phân lập từ thủy cầm và chim biển, và đôi khi từ các mẫu thu thập tại các thị
trường gia cầm sống trên toàn thế giới và các loài chim hoang dã bị bắt.
Virus nhóm II ban đầu được nhóm lại thành 15 kiểu gen. Sau đó, bốn kiểu gen bổ
sung đã được thêm kể từ năm 2012 (Courtney và cs 2013; Diel và cs, 2012; Snoeck và
cs, 2013). Virus từ loại II có mặt ở cả hai loài chim và gia cầm hoang dã. Tuy nhiên,
nguy hiểm nhất NDV (vNDV) phân lập được lấy từ gia cầm (Dundon và cs, 2012).
Virus của kiểu gen II, III, IV và loại II gây nên vùng dịch đầu tiên từ năm 1920 đến
năm 1960(Alexander, 2001), trong khi vụ dịch thứ hai ở châu Âu trong thời gian cuối
-19-


năm 1960 là kết quả của các chủng phân lập của kiểu gen V (Lomniczi và cs, 1998).
Sau đó, có 2 kiểu gen mới là VII và VIII được tìm thấy ở châu Á, Nam Phi và một số

nước châu Âu. Các kiểu gen III, IV, IX và X có liên quan với các kiểu gen I và II,
nhưng chỉ hạn chế ở một số vùng trên thế giới. Virus của kiểu gen phụ VIb có nguồn
gốc ở Trung Đông và gây nên vụ dịch thứ ba ở chim bồ câu trong suốt những năm
1980 (Kaleta và cs, 1985). Bùng phát vụ dịch thứ ba ở châu Á, trong đó có Pakistan,
và ở châu Âu kể từ năm 1984 hoặc sớm hơn do kiểu gen VII và VIII gây nên (Diel và
cs, 2012; Shabbir và cs, 2013). Kiểu gen VII của NDV gây nên vụ thứ tư và cho đến
ngày hôm nay, đã lây lan từ châu Á, châu Phi, châu Âu và thậm chí đã được phân lập
ở Nam Mỹ (Miller và Koch, 2013; Perozo và cs, 2012). Kiểu gen IV được phát hiện
khoảng năm 1985 tại khu vực Đông Nam Á và lan rộng đến hầu hết các nước châu Phi
và Venezuela, Nam Mỹ. Kiểu gen V, VI, VII, VIII và XI nổi lên sau năm 1960, được
coi là '' muộn '' và chỉ chứa các chủng vNDV (Czegledi và cs, 2006). Hiện nay, virus
từ kiểu gen VII thường xuyên liên quan đến sự bùng phát của NDV ở Trung Đông
(Radwan và cs, 2013) và châu Á (Yi và cs, 2011). Các loại virus này là mối quan tâm
đặc biệt như một số nghiên cứu đã chứng minh tỷ lệ tử vong cao hơn ở gia cầm được
tiêm phòng. Tuy nhiên, các loại virus này có khả năng lây nhiễm trong nhiều đối
tượng khác và hiện nay có thể gây bệnh ở ngỗng (Wang và cs, 2012). Kiểu gen VII
đầu tiên ở Israel được báo cáo trong năm 2000 (dữ liệu không được công bố). Kiểu
gen XIV chứa vNDV phân lập được ở Tây và Trung Phi giữa năm 2006 và 2008
(Snoeck và cs, 2013), được chia thành ba kiểu gen nhỏ XIVa, b và c (de Almeida và
cs, 2013). Kiểu gen XV gồm các chủng phân lập được từ gà và ngỗng ở Trung Quốc,
đã được phân loại trước đó thành các kiểu gen VIId (phân lập XJ- 2/97 và FJ- 2/99)
hoặc VIIe (JX- 2/99) (Liu và cs, 2003).
2.2.4. Đường lây truyền của virus
Theo Alexander (1988), virus có trong thức ăn, nước uống, phân theo đường
tiêu hóa (miệng, hầu, thực quản) hoặc qua không khí theo đường hô hấp khi gia cầm
hít thở sẽ xâm nhập vào cơ thể gây bệnh.
Mức độ truyền lây phụ thuộc vào độc lực của virus đường xâm nhập, liều lượng lây
nhiễm và sức đề kháng của gia cầm.
Việc lây truyền còn qua đường vận chuyển các sản phẩm của gia cầm như thịt, xác
-20-

chết, phân thải, thức ăn thừa hoặc qua tiếp xúc giữa các gia cầm nuôi với chim hoang dã.
Ở gà công nghiệp, đường lây truyền chủ yếu là đường hô hấp (mũi, miệng) và niêm
mạc mắt .Thời gian lây qua đường tiêu hóa chậm hơn đường hô hấp. Gà nhiễm bệnh
sẽ thải virus qua phân và bệnh xuất hiện khi gà ăn phải mầm bệnh (Alexander,
1988).Khả năng truyền dọc từ trứng nhiễm bệnh ở đường sinh dục mẹ chưa rõ ràng
(Beard và Hanson, 1984). Gà mái nhiễm virus Newcastle chủng Velogen có thể ngừng
đẻ nhưng gà mái nhiễm chủng Lentogen và có miễn dịch vẫn tiếp tục đẻ. Phôi nhiễm
bệnh trước khi nở thường bị chết, nhưng vẫn có thể nở khi virus không có độc lực (và
cs, 1967).Trên bề mặt trứng nhiễm virus Newcastle từ phân, sau khi nở, gà có thể mắc
bệnh. Phôi trứng chết do nhiễm bệnh là môi trường tốt cho virus tồn tại. Virus
Newcastle có thể tồn tại trong nước trứng ở nhiệt độ 37 0C trên 3 tháng
( )
Ngoại kí sinh trùng có thể làm lây lan virus Newcastle nhưng không quan trọng.
Muỗi cùng có thể truyền virus Newcastle ( />2.3. Tầm quan trọng của kháng nguyên F của virus NDV
Gen F có chiều dài 1792 nucleotide, mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 553 amino
acid. Glycoprotein F của NDV có vai trò gián tiếp trong sự xâm nhập bằng dung hợp
giữa vỏ virus và màng plasma tế bào chủ(Yongqi Yan, 2008). Quá trình dung hợp tạo
ra các lỗ trên màng plasma, thông qua đó mà nucleocapsid của virus được vận chuyển
vào trong tế bào chất. Protein F là protein màng loại I và được tổng hợp bởi một
protein tiền thân không hoạt động (F 0), cần có sự có mặt của enzyme phân giải protein
của tế bào chủ cho việc cắt của nó(Yongqi Yan, 2008).Sự phân cắt F0 tạo thành hai
đơn vị nhỏ F1 và F2 liên kết với nhau bằng cầu nối disulfideF 0 được dự đoán có khối
lượng phân tử khoảng 66 kD trong khi F1 và F2 có khối lượng xấp xỉlần lượt khoảng
55 kD và 12,5 kD. Trong suốt quá trình lây nhiễm, gen F được sao chép trong bào
tương, tổng hợp trong mạng lưới nội chất nhám và sau đó được biểu hiện bên ngoài
màng tế bào chủ(Yongqi Yan, 2008). Protein F biểu hiện quá trình lây nhiễm bằng
cách dung hợp gián tiếp với các tế bào bên cạnh để tạo các tế bào đa nhân khổng lồ
hay hợp nhân, đây là dấu hiệu của sự lây nhiễm NDV trong tế bào chủ. Thông tin dung

hợp cũng như sự kiểm soát quá trình dung hợp của virus do protein F là một trong những
nhân tố quan trọng của độc lực virus cũng như sự lây lan của nó(Yongqi Yan, 2008).
-21-


2.4. Phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử bằng phản ứng Polymerase
Chain Reaction (PCR)
Hiện nay, phương pháp PCR đã được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây
bệnh, ngay cả các vi sinh vật không thể phát hiện được bằng các xét nghiệm khác.
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karry Mullis và cộng sự
(Mỹ) phát minh năm 1985. Đây là phương pháp invitro sử dụng các cặp mồi để tổng
hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của
enzyme polymerase. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase
trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều
cần mồi, đây là những đoạn DNA ngắn (20-30 nucleotide) có khả năng bắt cặp bổ
sung với một đầu của mạch khuôn (template). Đoạn mồi này sau đó sẽ được kéo dài nhờ
hoạt động của Taq DNA polymerase để hình thành một mạch DNA mới hoàn chỉnh.
 Nguyên lý của phản ứng PCR:

PCR là một phản ứng hóa sinh phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình
sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt, có 2
đoạn ngắn DNA một sợi làm mồi, và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để
tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:
-

Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ mạch đôi (chuỗi xoắn kép)

-

thành dạng mạch đơn.
Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.
Giai đoạn kéo dài chuỗi (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống DNA gốc.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý
thuyết, ta sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi. Như vậy,
kết quả là một đoạn DNA định trước được “nhân lên” với một lượng rất lớn (Lê Thanh
Hòa, 2002; Lê Thanh Hòa, 2006).

 Các thành phần tham gia phản ứng PCR

Khuôn DNA (nucleic acid đích, chuỗi acid nucleic)
Phản ứng Pcr tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhưng nhiều kĩ thuật chẩn
đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào.
Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm với việc sử dụng các enzyme DNA
-22-


polymerase cho hiệu quả cao (khoảng <100ng). Hơn nữa việc giảm lượng mẫu ban
đầu còn hạn chế được các hiện tượng nhân bản giả tạo nên các sản phẩm phụ không
mong muốn. Một ưu điểm lớn khác của PCR là cho phép nhân bản cả những mẫu
DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong các vết máu để
lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người đã chết (Lê Thanh Hòa,
2002; Lê Thanh Hòa, 2006).
Primer hay đoạn mồi
Mồi (primer) là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự nhân bản đặc trưng và
hiệu quả cao nhằm thu nhận sản phẩm PCR có chất lượng cao trên khuôn DNA biết
trước. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR và phải tuân thủ
một số nguyên tắc sau:
-

Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi
và mồi ngược, và cũng không có cấu trúc kẹp tóc (hair- loop forming) do sự bắt

-

cặp bổ sung giữa các phần khác nhau trong chuỗi nucleotide của một mồi.
Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa (thông

-

thường trong khoảng 4-5oC).
Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần nhân bản, không trùng hợp

-

với các trình tự lặp lại trên gen.
Độ dài cần chọn cho một mồi đặc hiệu thông thường là 18-30 nucleotide. Nếu
quá ngắn (dưới 10 nucleotide), mồi sẽ bám không đặc hiệu; nếu quá dài (trên 30
nucleotide), chu kỳ nhiệt ở giai đoạn thứ 3 (giai đoạn tổng hợp hay kéo dài) sẽ
ảnh hưởng đến cơ chế bám của mồi. Nhiệt độ nóng chảy của mồi không vượt quá
chu kỳ nhiệt ở giai đoạn thứ 3 (720C) (Lê Thanh Hòa, 2002; Lê Thanh Hòa, 2006).

dNTP ( deoxy nucleoside triphosphate)
Bốn loại nucleotde trong phản ứng PCR thường được sử dụng ở dạng deoxy
nucleotide (dNTP bao gồm dATP, dCTP, dTTP và dGTP) ở nồng độ cuối cùng là
200µM/mỗi nucleotide. Nồng độ cao hơn hay thấp hơn dễ dẫn đến sự tạo nên sản
phẩm PCR giả. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi
sao chép của enzyme DNA polymerase (Lê Thanh Hòa, 2002; Lê Thanh Hòa, 2006).
Enzyme polymerase và dung dịch đệm cho phản ứng PCR
Thường dùng nhất trong các phòng thí nghiệm là enzyme Taq polymerase, đây là

enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, là một vi khuẩn chịu nhiệt
-23-


sống trong các suối nước nóng.
Đệm Tris HCl 10 mM, KCl 50 Mm và MgCl 2. Ngoài ra, dung dịch đệm PCR còn có
thể chứa 0,001% BSA hay Gelatine và trong một sô phản ứng PCR còn có thể thêm
Tween, Dimethyl sulfoxide (DMSO) hay formamide... Trong các thành phần trên, ảnh
hưởng đến chất lượng của PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl 2. Vì vậy để có được một phản
ứng PCR có độ nhạy cao và đặc hiệu, cần phải tối ưu hóa MgCl 2 từ 1,5mM đến 5 mM để
thăm dò, xác định được nồng độ tối ưu nhất(Lê Thanh Hòa, 2002; Lê Thanh Hòa, 2006).
Ion Mg2+
Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR. Nồng độ của Mg2+ cuối
cùng để một phản ứng PCR thực hiện được là 100-250 µM, tối ưu là 150-200 µM. Trong
nhiều trường hợp, cần thực hiện một dãy phản ứng PCR với nồng độ thay đổi (100125-150-175-200-225-250 µM) để tối ưu hóa (optimization) nồng độ Mg 2+ cuối cùng
cho phản ứng PCR thành công (Lê Thanh Hòa, 2002; Lê Thanh Hòa, 2006).
Nước
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa bất kì ion nào,
không chứa enzyme phân hủy DNA (DNase), phân hủy RNA (RNase), enzyme giới
hạn cắt DNA (endonuclease) và bất kì các thành phần nào khác. Ion khác lạ sẽ ảnh
hưởng đến nồng độ dung dịch đệm trong phản ứng, các loại enzyme sẽ phân hủy hay
cắt bỏ DNA làm khuôn hoặc sản phẩm PCR (Lê Thanh Hòa, 2002)

Hình 2.5 : Chu trình phản ứng PCR
-24-


2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Trong nghiên cứu phân tử, sự phát sinh loài được sử dụng cho việc tìm kiếm mức độ
tiến hóa giữa các sinh vật. Các mối quan hệ di truyền giữa các loài có thể được biểu diễn

bằng cây tiến hóa. Ban đầu, phân tích phát sinh loài chủ yếu là sử dụng đặc tính hình thái
như kích thước, màu sắc, hoặc các đặc tính vật lý khác để xác định các mối quan hệ. Sự
phân tích phát sinh loài hiện đại dựa trên thông tin từ vật liệu di truyền như DNA, RNA
hoặc các chuỗi protein và các phương pháp tính toán tiên tiến có sẵn cho việc hỗ trợ xây
dựng những cây tiến hóa. Những cây tiến hóa này về cơ bản có thể được xây dựng dựa trên
sự sắp xếp các trình tự tương đồng từ trình tự của DNA, RNA hay protein (M,Potter,
2008). GeneDoc và MEGA6 là các chương trình được sử dụng phổ biến cho nhiều trình tự
để xây dựng cây tiến hóa, sau đó tính chính xác của ước lượng thống kê được đánh giá bởi
một thông số gọi là bootstrap. Bootstrap là chỉ số được trình bày ở bên cạnh mỗi nút của
cây tiến hóa nhằm xác định các công cụ hỗ trợ cho các nhánh cũng như cung cấp đánh giá
“sự tin tưởng”. Do uy tín, GeneDoc và MEGA6 được sử dụng thường xuyên trong các
nghiên cứu phát sinh loài.

-25-