ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THU HOÀI
NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT SINH METHANE ỨNG DỤNG
CHO SẢN XUẤT BIOGAS TRONG ĐIỀU KIỆN
MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội – 2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THU HOÀI
NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT SINH METHANE ỨNG DỤNG
CHO SẢN XUẤT BIOGAS TRONG ĐIỀU KIỆN
MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 62 420107
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TS. Đinh Thúy Hằng
2. GS. TS. Nguyễn Lân Dũng
Hà Nội - 2015
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cộng tác cùng
với các cộng sự khác.
Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tập san và tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý của
các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.
Tác giả luận án
Nguyễn Thu Hoài
LỜI CẢM ƠN
Thành công của Luận án này là kết quả của sự cố gắng nỗ lực bản thân
trong suốt quá trình nghiên cứu, tìm hiểu đề tài. Đồng thời bản thân tôi còn
nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của các thầy cô hướng dẫn, các anh
chị và các bạn đồng nghiệp.
Trước tiên, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ
Phòng Sinh thái Vi sinh vật, Phòng Công nghệ Enzyme - Protein của Viện Vi
sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội vì đã tạo mọi điều
kiện, giúp đỡ về cơ sở vật chất cũng như khích lệ tôi trong quá trình thực tập
Nghiên cứu sinh.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin được gửi cảm ơn tới TS. Đinh Thúy
Hằng - Trưởng phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ
sinh học - ĐHQGHN là người trực tiếp định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và
chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Đồng gửi lời
cảm ơn tới GS.TS Nguyễn Lân Dũng - chuyên gia cao cấp của Viện Vi sinh
vật và Công nghệ sinh học - người đã cho tôi nhiều lời khuyên bảo và giúp đỡ
trong thời gian nghiên cứu luận án.
Tôi cũng gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Vi sinh vật
và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cơ sở vật
chất giúp tôi hoàn thành Luận án này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Thường vụ Đảng ủy, Ban Tổng Giám
đốc Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga đã tạo điều kiện giúp đỡ và khuyến khích,
động viên tôi trong suốt quá trình làm Nghiên cứu sinh.
Tôi mong muốn được cảm ơn đến Phân viện trưởng và các bạn đồng
nghiệp của Phân viện Công nghệ sinh học, Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga đã
nhiệt tình giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện thời gian và cơ sở vật chất
trong suốt thời gian tham gia làm Nghiên cứu sinh.
Tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà
- Chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh vật, các thầy cô giáo của Bộ môn Vi sinh vật học
và Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - ĐHQGHN đã trực
tiếp giảng dạy và giúp đỡ tôi trong khóa học Nghiên cứu sinh.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và người thân
đã luôn ủng hộ, cổ vũ và động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình
học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2015
Nguyễn Thu Hoài
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
1
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
5
Danh mục các bảng
6
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
7
MỞ ĐẦU
10
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
12
Xử lý chất thải hữu cơ theo công nghệ phân hủy kỵ khí sinh
methane trong điều kiện nhiễm mặn
12
1.1.1. Ô nhiễm chất thải hữu cơ trong môi trường nhiễm mặn
12
1.1.2. Xử lý ô nhiễm chất hữu cơ bằng phân hủy kỵ khí
14
1.1.3. Xử lý chất thải hữu cơ bằng phân hủy kỵ khí trong điều kiện
nhiễm mặn
18
1.2.
Bản chất sinh học của phân hủy kỵ khí sinh methane
21
1.3.
Đa dạng di truyền và đặc tính sinh học của VSVSMT
25
1.3.1. Phân bố của VSVSMT trong tự nhiên
25
1.3.2. Vị trí phân loại của VSVSMT
26
1.3.3. Đặc tính sinh học của VSVSMT
30
1.4.
1.3.3.1. Cơ chất của quá trình phân hủy kỵ khí sinh methane
30
1.3.3.2. Sinh hóa của quá trình phân hủy kỵ khí sinh methane
32
1.3.3.3. Một số phương pháp nghiên cứu quần xã VSVSMT
35
1.3.3.4. VSVSMT trong môi trường nước lợ và nước biển
37
Công nghệ xử lý chất thải hữu cơ bằng phân hủy kỵ khí sinh
methane
40
1.4.1. Một số công nghệ phổ biến
40
1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phân hủy kỵ khí sinh methane
43
1.4.2.1. Cân bằng dinh dưỡng
43
1.4.2.2. Các yếu tố lý hóa và sinh học
44
1
1.5.
Nghiên cứu về VSVSMT và công nghệ phân hủy kỵ khí tạo biogas
ở Việt Nam
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
46
48
48
2.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
48
2.1.2. Hóa chất, môi trường và thiết bị
48
2.2. Phương pháp nghiên cứu
49
2.2.1. Làm giàu và phân lập VSVSMT
49
2.2.1.1. Làm giàu VSVSMT
49
2.2.1.2. Phân lập VSVSMT
50
2.2.2. Nghiên cứu các đặc tính sinh học của VSVSMT
51
2.2.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái
51
2.2.2.2. Xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sinh
trưởng của VSVSMT
51
2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường và chủng thuần khiết
52
2.2.3.1. Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường
52
2.2.3.2. Tách DNA tổng số của chủng thuần khiết
53
2.2.3.3. Điện di DNA trên gel agarose
54
2.2.4. Phương pháp PCR- DGGE
54
2.2.4.1. Khuếch đại đoạn 16S rDNA cho phân tích DGGE
54
2.2.4.2. Điện di biến tính DGGE
55
2.2.4.3. Cắt băng và thôi gel
55
2.2.5. Phân tích trình tự 16S rDNA của các chủng VSVSMT
56
2.2.6. Thiết lập và phân tích thư viện gen mcrA(clone library)
57
2.2.6.1. Nhân PCR và tinh sạch sản phẩm
57
2.2.6.2. Phản ứng ghép nối gen vào vector
57
2.2.6.3. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli DH5α
bằng phương pháp sốc nhiệt
57
2.2.6.4. Tách dòng và giải trình tự gen mcrA
58
2.2.6.5. Phân tích trình tự gen mcrA và dựng cây phân loại
59
2
2.2.7. Phân tích hóa học
59
2.2.7.1. Phân tích COD hòa tan
59
2.2.7.2. Xác định hàm lượng muối trong nước
60
2.2.7.3. Xác định tổng thể tích khí sinh ra trong quá trình phân hủy kỵ khí
61
2.2.7.4. Xác định hàm lượng methane trong mô hình thí nghiệm
61
2.2.7.5. Xác định hoạt tính sinh methane
62
2.2.8. Thiết lập mô hình phân hủy kỵ khí chất thải hữu cơ ở điều kiện
nước lợ và nước mặn
63
64
2.3. Sơ đồ mô tả các bước thí nghiệm
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Làm giàu VSVSMT từ trầm tích biển Nha Trang và Cát Bà
65
65
3.1.1. Làm giàu VSVSMT trong môi trường nước lợ
65
3.1.2. Làm giàu VSVSMT trong môi trường nước mặn
67
3.2. VSVSMT chiếm ưu thế trong các mẫu làm giàu
70
3.2.1. Mẫu làm giàu bằng methanol và acetate
70
3.2.2. Mẫu làm giàu bằng rong biển Ulva sp.
72
3.2.2.1. Phân tích bằng PCR-DGGE đoạn 16S rDNA
3.2.2.2. Đánh giá VSVSMT trong mẫu làm giàu bằng rong biển qua
thư viện gen mcrA
72
73
3.3. Phân lập VSVSMT từ các mẫu làm giàu
78
3.4. Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng VSVSMT phân lập
84
3.4.1. Khả năng sinh methane của các chủng VSVSMT phân lập
84
3.4.2. Ảnh hưởng của độ mặn tới sinh trưởng của hai chủng M7 và M37
86
3.4.3. Các đặc điểm sinh học của chủng M37
88
3.5. Tạo nguồn VSVSMT để hỗ trợ quá trình phân hủy kỵ khí ở điều kiện
nước lợ và nước mặn
93
3.5.1. Lựa chọn nguồn VSVSMT phù hợp
93
3.5.2. Tạo giống khởi động VSVSMT
95
3.5.3. Bảo quản nguồn VSVSMT trong điều kiện phòng thí nghiệm
99
3
3.6.Thiết lập và vận hành mô hình kỵ khí xử lý chất thải hữu cơ theo
phương pháp phân hủy kỵ khí sinh methane ở điều kiện nước lợ và nước
mặn
99
3.6.1. Thiết lập mô hình
99
3.6.2. Vận hành mô hình
101
3.6.3. Đánh giá VSVSMT chiếm ưu thế trong các mô hình
105
KẾT LUẬN
108
KIẾN NGHỊ
109
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN
110
TÀI LIỆU THAM KHẢO
111
PHỤ LỤC
4
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
AF
Anaerobic Filter
Bp
Base pair
BKM
Bùn kỵ khí ưa mặn
BSA
Bovin serum albumin
VSVSMT
Vi sinh vật sinh methane
CTAB
Cetyl trimethyl ammonium bromide
COD
Chemical oxygen demand
DGGE
Denaturing gradient gel electrophoresis
DMSO
Dimethyl sulfoxide
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTP
2’- deoxyribonucleotide 5’- triphosphate
EDTA
Ethylenediamintetraacetic acid
EtBr
Ethidium bromide
IPTG
Isopropylthio - β - D – glucosamine
LB
Môi trường Luria – Bertani
mcrA
Đoạn gen mã hóa cho tiểu phần α của methyl - coenzyme M
reductase
MPN
Most probable number
MQ
Mili – Q
SDS
Sodium dodecyl sunfate
TAE
Tris – acetate – EDTA
TE
Tris – EDTA
TEMED
Tetramethylethylenediamine
PCI
Phenol - Chloroform - Isoamyl alcohol
PCR
Polymerase Chain Reaction
RT-PCR
Realtime PCR
UASB
Upflow Anaerobic Sludge Blanket
X-Gal
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside
5
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Đặc điểm các chi thuộc 5 bộ VSVSMT
28
2.1
Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE
55
2.2
PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA để định danh VSVSMT
56
3.1
VSVSMT trong mẫu làm giàu NTLRE3 bằng rong biển Ulva
sp.
75
3.2
VSVSMT phân lập từ các mẫu làm giàu của trầm tích biển
Nha Trang và Cát Bà
79
3.3
Vị trí phân loại của mười chủng VSVSMT phân lập dựa trên
so sánh trình tự đoạn 16S rDNA
82
3.4
Khả năng sinh khí biogas và mức độ phát huỳnh quang của tế
bào ở các chủng VSVSMT phân lập
85
3.5
Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sinh trưởng của hai chủng
VSVSMT M7 và M37
86
3.6
Nguồn hữu cơ trong các mô hình
101
3.7
Sự biến động của COD (mg/L) trong các mô hình nghiên cứu
102
6
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình
Tên hình
Trang
1.1
Một số nguồn chất thải hữu cơ tại các vùng ven biển Việt Nam
13
1.2
Chuyển hóa cacbon hữu cơ trong phân hủy hiếu khí và kỵ khí
14
1.3
Hầm biogas loại nhỏ phổ biến ở các gia đình nông thôn Việt
Nam
17
1.4
Các nhóm vi sinh vật tham gia vào quá trình phân hủy kỵ khí sinh
methane
21
1.5
Vi khuẩn acetogen và VSVSMT trong bùn kỵ khí từ bể biogas
24
1.6
Cây phân loại thể hiện vị trí của VSVSMT so với các ngành cổ
khuẩn khác dựa trên trình tự 16S rRNA
27
1.7
Hình thái tế bào của một số loài VSVSMT đã được mô tả
29
1.8
Con đường hình thành methane từ acetate, methanol và CO2
32
1.9
Sơ đồ mcr-operon ở VSVSMT Methanosarcina mazei
33
1.10
Hình ảnh VSVSMT dưới kính hiển vi huỳnh quang
34
1.11
Cơ chế tác động của các chất ức chế oxyanion nhóm VI tới quá
trình khử sulfate ở vi khuẩn khử sulfate
39
1.12
Bể tự hoại hai ngăn
40
1.13
Sơ đồ bể biogas xử lý chất thải có hàm lượng hữu cơ cao
41
1.14
Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của bể UASB
42
1.15
Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của tầng lọc kỵ khí
42
2.1
Rong biển (Ulva sp.) sử dụng trong thí nghiệm phân hủy kỵ khí
sinh methane
48
2.2
Các bước phân lập chủng thuần khiết VSVSMT bằng phương
pháp ống thạch bán lỏng
50
2.3
Nguyên lý của phương pháp cột nước xác định tổng lượng khí
sinh ra từ bể phân hủy kỵ khí
61
2.4
Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng methane trên thiết bị sắc ký khí
62
2.5
Mô hình phân hủy kỵ khí chất hữu cơ sinh methane và hệ thống
đo tổng lượng khí sinh ra bằng phương pháp cột nước
63
7