Tách dòng và biểu hiện gen CNAZU8 (P2SEQ12) mã hóa bacteriocin có tiềm năng kháng ung thư từ clostridium nexile trong escherichia coli

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
--- o0o ---

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN CNAZU8 (P2SEQ12)
MÃ HÓA BACTERIOCIN CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG
UNG THƯ TỪ Clostridium nexile trong Escherichia coli

GVHD: TS. Phạm Thu Thủy
SVTH: Trần Thị Châu Loan
MSSV: 54130760

Khánh Hòa, 07/2016


i

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo Viện Công nghệ
sinh học và môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm chỉ bảo và
giảng dạy nhiệt tình giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời
gian học tập tại trường.
Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Văn Duy và TS. Phạm
Thu Thủy, Viện Công nghệ sinh học và môi trường đã định hướng, dìu dắt, tận tình
hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án
tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn lớp 54CNSH đã luôn quan tâm giúp đỡ,

chia sẻ những kinh nghiệm, kiến thức trong suốt 4 năm học.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, những người luôn quan
tâm, giúp đỡ, động viên và là chỗ dựa tinh thần lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công
việc được giao trong suốt thời học tập vừa qua.
Nha Trang, ngày 10 tháng 07 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Châu Loan


ii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ...........................................................................................................i
MỤC LỤC ............................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. v
DANH MỤC BẢNG ...............................................................................................vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ vii
LỜI MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về ung thư ......................................................................................... 3
1.1.1. Bản chất của ung thư ............................................................................... 3
1.1.2. Nguyên nhân ung thư ............................................................................... 3
1.1.3. Phương pháp điều trị ung thư .................................................................. 4
1.2. Tổng quan về bacteriocin kháng ung thư và azurin ............................................ 6
1.2.1. Tổng quan về peptit kháng ung thư.......................................................... 6
1.2.2. Tổng quan về bacteriocin kháng ung thư............................................... 10
1.2.3. Tổng quan về azurin .............................................................................. 11
1.3. Giới thiệu về gen cnazu8 từ Clostridium nexile mã hóa bacteriocin kháng ung

thư tương tự azurin .................................................................................................. 14
1.3.1. Clostridium nexile ................................................................................. 14
1.3.2. Gen cnazu8 (p2seq12) ........................................................................... 14
1.4. Tổng quan về tách dòng và biểu hiện gen......................................................... 15
1.4.1. Tạo dòng gen ......................................................................................... 15
1.4.2. Biểu hiện gen ......................................................................................... 20
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................. 23
2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu ....................................................... 23


iii

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 23
2.1.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................. 23
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu.............................................................................. 23
2.2. Vật liệu ............................................................................................................. 23
2.2.1. Plasmid .................................................................................................. 23
2.2.2. Chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy ............................................. 23
2.2.3. Oligonucleotide và đoạn gen tổng hợp ................................................. 25
2.2.4. Enzym và hóa chất sinh học phân tử...................................................... 25
2.2.5. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 27
2.3.1. Thu đoạn gen đích bằng phương pháp PCR .......................................... 27
2.3.2. Điện di trên gel ...................................................................................... 30
2.3.3. Tinh sạch sản phẩm PCR ....................................................................... 33
2.3.4. Thực hiện phản ứng cắt gen và plasmid bằng enzym cắt giới hạn ......... 33
2.3.5. Phản ứng nối DNA tạo vector tái tổ hợp ............................................... 35
2.3.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli OmniMAX khả biến......... 36
2.3.7. Tách chiết plasmid pDT008 ................................................................... 37
2.3.9. Kiểm tra biểu hiện protein Cnazu8 trong E. coli BL21.......................... 39

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 42
3.1. Thu nhận trình tự gen cnazu8 bằng PCR .......................................................... 42
3.2. Thực hiện phản ứng cắt mở vòng vecter pHT7048........................................... 44
3.3. Thực hiện phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp ................................................... 46
3.4. Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli OmniMAX ................................................ 47
3.5. Sàng lọc dòng E. coli OmniMAX mang vector mục tiêu ................................. 48
3.7. Khuếch đại đoạn DNA mang gen cnazu8 từ plasmid pDT008 để chuẩn bị giải
trình tự ..................................................................................................................... 52


iv

3.8. Kết quả giải trình tự đoạn DNA mang gen cnazu8 ........................................... 53
3.9. Kiểm tra biểu hiện Cnazu8 trong E. coli BL21................................................. 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 59
PHỤ LỤC ............................................................................................................... 65


v

DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Cấu trúc Azurin ....................................................................................... 12
Hình 1.2. Mô hình gắn kết giữa Azurin-p28 đối với protein đích ung thư p53........ 13
Hình 1.3. Hình ảnh điện di SDS-PAGE................................................................... 22
Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pET42a(+) ........................................................................ 24
Hình 2.2. Sơ đồ cách tiếp cận tổng quát của đề tài .................................................. 28
Hình 2.3. Sản phẩm khuếch đại gen cnazu8 từ tổ hợp gen ...................................... 29

Hình 2.4. Plasmid tái tổ hợp pDT008 (pET42a(+) + cnazu8).................................. 37
Hình 2.5. Kết quả giải trình tự bằng máy tự động ................................................... 39
Hình 3.1. Sản phẩm khuếch đại gen cnazu8 ............................................................ 42
Hình 3.2. Sản phẩm tinh sạch gen cnazu8 ............................................................... 44
Hình 3.3. Kết quả cắt mở vòng plasmid pET42a(+) ................................................ 46
Hình 3.4. Khuẩn lạc E.coli OmniMAX mang vector tái tổ hợp pDT008 ................ 47
Hình 3.5. Sản phẩm khuếch đại gen từ khuẩn lạc E. coli OmniMAX mang vector tái
tổ hợp pDT008 ........................................................................................................ 50
Hình 3.6. Kết quả tách plasmid pDT008 ................................................................. 51
Hình 3.7. Sản phẩm PCR đoạn DNA mang gen cnazu8 trong plasmid pDT008 ........... 53
Hình 3.8. Kết quả giải trình tự đoạn DNA mang gen cnazu8 trong plasmid
pDT008.3 ................................................................................................................ 54
Hình 3.9. Kết quả khuẩn lạc E.coli BL21 mang plasmid pDT008........................... 56
Hình 3.10. Kết quả điện di protein tái tổ hợp .......................................................... 56


vi

DANH MỤC BẢNG
Trang

Bảng 1.1. Peptit kháng ung thư và hoạt tính chống ung thư ...................................... 7
Bảng 1.2. So sánh đặc điểm protein Cnazu8 với azurin hoặc laz ............................ 16
Bảng 1.3. Một số loại vector phổ biến ..................................................................... 19
Bảng 2.1. Trình tự mồi PCR gen cnazu8 ................................................................. 25
Bảng 2.2. Nồng độ gel sử dụng trong điện di .......................................................... 31


vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ACP

: Anticancer peptides

APS

: Ammonium Persulphate

bp

: Base pair (cặp bazơ)

Cs

: Cộng sự

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

EDTA

: Disodium ethylenediamine tetraacetate

GEM

: Grafts experimental model

ICL

: Immortal cancer-cell lineage

IPTG

: Isopropyl-thiogalactoside

kDa

: Kilodalton

LB

: Luria Bertani Broth

MSC

: Multiple cloning site (Vùng cắt đa vị)

PAGE

: Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di polyacrylamide)

PCR

: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

PEG

: Polyethylene glycol

PYG

: Peptone-Yeast Extract-Glucose

RE

: Restriction enzyme (Enzym giới hạn)

SDS

: Sodium Dodecyl Sulphate

TAE

: Tris-acetate-EDTA

TEMED

: Tetramethylethylenediamine

WHO

: World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)


1

LỜI MỞ ĐẦU

Lý do thực hiện đề tài
Ung thư là một bệnh được nhắc đến nhiều trên thế giới hiện nay và gây ra tỉ
lệ tử vong cao cho bệnh nhân mắc ung thư. Cho đến nay ung thư vẫn là một vấn đề
thời sự bởi tính chất nguy hiểm của nó. Ước tính từ các Cơ quan quốc tế Nghiên
cứu Ung thư (IARC) cho thấy rằng 12,7 triệu trường hợp ung thư mới và 7,6 triệu
ca tử vong ung thư xảy ra trên toàn thế giới trong năm 2008 (Ferlay và cs, 2010 ).
Năm 2012 đã có khoảng 14 triệu trường hợp mới và 8,2 triệu ca tử vong liên quan
đến bệnh ung thư (WHO, 2012). Số lượng các ca ung thư mới sẽ tăng lên đến 22
triệu trong vòng hai thập kỷ. Cho đến nay vẫn chưa có một phương pháp điều trị
nào có thể ngăn chặn được ung thư tái phát. Phương pháp điều trị hiện nay thường
là bằng phẫu thuật để loại bỏ các khối u sau đó là xạ trị để tiêu diệt các tế bào ung
thư còn sót lại và hóa trị liệu lâu dài nhằm ngăn chặn các tế bào ung thư phát triển
trở lại. Trong các biện pháp điều trị, hóa trị liệu có thể gây ra tác động phụ đối với
các tế bào bình thường và dẫn tới hiện tượng kháng thuốc của tế bào ung thư bằng
cách sử dụng con đường sinh trưởng khác hoặc bơm ngược để bơm thuốc ra ngoài.
Vì vậy, việc tìm kiếm các liệu pháp điều trị mới là cấp thiết.
Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ rõ tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn trong
nhiều lĩnh vực khác nhau như nông nghiệp, công nghiệp, thực phẩm… và cả y học.
Gần đây, mô hình điều trị ung thư sử dụng các vi khuẩn sống và sản phẩm tinh sạch
từ chúng được quan tâm trở lại. Điều này đã mở ra hướng mới trong điều trị căn
bệnh hiểm nghèo này. Trong số những sản phẩm từ vi khuẩn thì protein và peptit là
được quan tâm nhiều hơn cả. Bacteriocin là một chất kháng khuẩn có bản chất là
protein và peptit, đây được coi là vũ khí vạn năng của vi khuẩn chống lại những vi
khuẩn khác, đang hứa hẹn mang đến khả năng chữa trị ung thư trong thời điểm hiện
tại. Vì vậy dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Thu Thủy, tôi thực hiện đề tài: “Tách
dòng và biểu hiện gen cnazu8 (p2seq12) mã hóa bacteriocin có tiềm năng kháng
ung thư từ Clostridium nexile trong Escherichia coli”. Các kết quả nghiên cứu từ


2

đề tài là rất cần thiết góp phần vào việc tìm ra các loại thuốc chống ung thư để bảo
vệ sức khỏe con người.
Mục tiêu của đề tài
- Tách dòng gen cnazu8 (p2seq12) mã hóa bacteriocin có tiềm năng kháng
ung thư từ Clostridium nexile.
- Kiểm tra biểu hiện gen cnazu8 (p2seq12) từ Clostridium nexile trong
Escherichia coli.
Phạm vi nghiên cứu của đề tài
Gen cnazu8 (p2seq12) mã hóa bacteriocin có tiềm năng kháng ung thư từ
Clostridium nexile được sàng lọc từ hệ vi sinh đường ruột người.
Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về tạo dòng và biểu hiện
bacteriocin tương tự azurin có tiềm năng kháng ung thư.
- Kết quả đề tài này làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về bacteriocin
tiềm năng kháng ung thư như tinh chế, thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Nghiên cứu này là cơ sở cho việc phát triển thuốc kháng ung thư thế hệ mới
từ các peptit của vi khuẩn có tính chọn lọc cao và hiệu ứng phụ thấp.


3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về ung thư
1.1.1. Bản chất của ung thư
Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào, liên quan tới sự mất kiểm soát quá
trình sinh trưởng và biệt hóa ở các tế bào động vật có vú. Căn bệnh này liên quan
tới các con đường truyền tín hiệu tế bào thông qua Hsp90, PI3 K, AKT, mTOR,
ERK protein,…;các gen tiền ung thư như Bcl-2 hay Ras; các yếu tố kìm hãm ung

thư như p53 hay PTEN. Ung thư còn liên quan đến các yếu tố thúc đẩy sinh trưởng
như VEGF, PDGF và các thụ thể của chúng. Sự thay đổi thông qua các con đường
tín hiệu cuối cùng dẫn đến thay đổi trong biểu hiện protein và các quá trình sinh lý
cần thiết cho sinh trưởng và sự sống của tế bào (Chakrabarty, 2014). Ung thư để lại
những hậu quả sức khỏe nghiêm trọng và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu,
ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, dạ dày, gan là loại ung thư gây tử vong nhiều
nhất ở nam giới (WHO, 2015).
Các tế bào ung thư có khả năng xâm lấn và phá hủy các tổ chức xung quanh.
Đồng thời chúng di trú và đến phát triển ở nhiều cơ quan khác nhau và hình thành
nên di căn, cuối cùng ung thư gây tử vong cho bệnh nhân.
Theo thống kê của IARC thì năm 2002, trên toàn thế giới ước tính có khoảng
10,9 triệu người mới mắc bệnh ung thư. Trong năm 2012 trên toàn thế giới có 14,1
triệu trường hợp ung thư mới, 8,2 triệu ca tử vong ung thư và 32,6 triệu người sống
với ung thư. Trong năm 2012, ở Việt Nam có số lượng người chết vì ung thư đứng
thứ 78 trên thế giới và thứ 4 Đông Nam Á, cứ 1 ngày đã có 265 người chết vì ung
thư (Bộ Y tế, 2016).
1.1.2. Nguyên nhân ung thư
Nguyên nhân gây ung thư gồm 2 nhóm chính là các yếu tố môi trường và tác
nhân di truyền.
-

Tác nhân môi trường


4

Tác nhân vật lý bao gồm bức xạ ion và tia cực tím: Quá trình phóng xạ đã
bắn ra các hạt làm ion hóa các thành phần hữu cơ của tế bào tạo ra các gốc tự do.
Chính các gốc tự do này tác động lên các bazơ nitơ của DNA làm rối loạn các gen
tế bào tạo ra các biến dị và đột biến gây ung thư, quái thai và dị tật.

Tác nhân sinh học là các tác nhân như virus, kí sinh trùng và vi khuẩn khi xâm
nhiễm vào cơ thể và gây ra ung thư ở một số cơ quan. Ví dụ như trường hợp virus
HBV gắn xen vào gen thụ thể của axit retinoic sẽ gây ra ung thư gan. Ký sinh trùng
và khuẩn như nhiễm sán Schistosoma gây ung thư bàng quang và ung thư ống mật, vi
khuẩn Helicobacter pylori gây ra u lympho dạ dày và ung thư biểu mô dạ dày.
Tác nhân hóa học chẳng hạn như thuốc lá có hơn 4000 hợp chất gây ung thư
đã được nghiên cứu, độc tố aflatoxin (chất từ nấm mốc Aspergillus flavus thường có
ở gạo, lạc mốc) gây ra ung thư gan. Hiện nay tỷ lệ mắc bệnh ung thư được dự báo
ngày càng tăng và khả năng chữa khỏi bệnh vẫn còn hạn chế do đa số phát hiện ở
giai đoạn muộn.
-

Tác nhân di truyền
Những năm trở lại đây nhờ những nghiên cứu về gen, người ta đã tìm được

các gen sinh ung thư (oncogene). Ban đầu những gen này được tìm thấy ở retrovirus
gây ra khối u ở động vật, về sau còn tìm thấy trên khối u ở người. Thực chất các gen
sinh ung thư là các gen tiền ung thư (proto-oncogene). Dưới tác động của một vài
tác nhân nào đó tiền gen sinh ung thư hoạt hóa và biến thành gen sinh ung thư. Từ
đó gen sinh ung thư mã hóa để sản xuất các protein và enzym liên quan đến quá
trình phân chia và biệt hóa tế bào theo xu hướng ác tính. Một loại gen quan trọng
khác và các gen ức chế ung thư (anti-oncogen). Khi cơ thể vắng mặt các gen này,
nguy cơ mắc ung thư sẽ tăng cao. Một số gen ức chế sinh ung thư quan trọng là gen
P53 của bệnh ung thư liên bào võng mạc mắt, gen WT1 trong bệnh u wilms, gen
NF1 trong bệnh đa u xơ thần kinh tuyp 1 (Nguyễn Bá Đức, 2001).
1.1.3. Phương pháp điều trị ung thư
Việc điều trị ung thư là quan trọng trong chương trình phòng chống ung thư
ở mọi quốc gia. Có 3 phương pháp điều trị ung thư phổ biến hiện nay

5

-

Điều trị bằng phẫu thuật
Trong một thời gian dài phẫu thuật được xem là phương pháp duy nhất để

điều trị ung thư và đến nay nó vẫn còn được xem là nền tảng trong điều trị ung thư
hiện đại. Phẫu thuật có thể phối hợp với các phương pháp điều trị khác như xạ trị,
hóa trị, nội tiết… Nhược điểm của phẫu thuật ung thư là có thể để lại biến chứng đe
dọa tới tính mạng bệnh nhân hoặc làm mất chức năng sinh lý của các cơ quan, vì
vậy cần cân nhắc trước khi phẫu thuật để tránh làm tổn thương những cơ quan quan
trọng và đó là một trong những nguyên nhân gây thất bại của phẫu thuật. Những tổn
thương ác tính đã vượt qua giai đoạn tại chỗ và tại vùng thì vai trò của phẫu thuật
không còn phù hợp. Phẫu thuật chỉ hiệu quả cho ung thư giai đoạn đầu, còn khu trú,
còn nếu khối ung thư đã di căn phẫu trị chỉ có hiệu lực tạm thời, không có hiệu lực
hoặc thậm chí còn kích thích sự di căn và phát triển của khối ung thư (Nguyễn Bá
Đức, 2001).
-

Điều trị bằng xạ trị
Điều trị tia xạ là dùng các tia bức xạ ion hóa để tiêu diệt các tế bào ung thư,

đây là một trong những phương pháp mang lại hiệu quả tương đối tốt để làm giảm
sự phát triển của tế bào ung thư. Điều trị tia xạ đơn thuần có thể chữa khỏi nhiều
loại ung thư khi còn ở giai đoạn khu cư trú tại chỗ, nhất là trong các bệnh ung thư
hạch bạch huyết, ung thư da, ung thư cổ tử cung, ung thư vòm họng, một số ung thư
vùng đầu cổ… Việc dùng tia phóng xạ không chỉ diệt tế bào ung thư mà có thể diệt
luôn tế bào lành ở vùng bị chiếu gây ra các biến chứng. Một số ung thư chống chỉ
định của xạ trị như ung thư dạ dày, đại tràng hoặc tụy. Điều trị bằng tia xạ là

phương pháp không gây đau đớn nhưng nếu xạ trị với thời gian lâu sẽ gây ra nhiều
phản ứng phụ như sung phù, vô sinh, mệt mỏi toàn thân, gây rụng tóc, khô các
tuyến tiết, nghẽn các hệ thống bạch huyết dưới da gây phù bạch huyết,.. Tính chất,
mức độ trầm trọng và thời gian kéo dài của phản ứng xạ trị phụ thuộc vào cơ quan
tiếp nhận tia xạ, vào phương pháp điều trị, vào bệnh nhân (Phùng Phướng, 2009).
-

Điều trị hóa chất


6

Từ khi bắt đầu tiến triển, ung thư đã có thể di căn, do đó phương pháp điều
trị tại chỗ hoặc tại vùng nhưng phẫu thuật và xạ trị thường không mang lại hiệu quả.
Sử dụng các thuốc điều trị ung thư đặc biệt là các hóa chất chống ung thư có thể
ngăn chặn được tiến triển của ung thư. Hóa chất chống ung thư đều là những chất
gây độc cho tế bào. Muốn tăng hiệu quả điều trị, thuốc hoá chất phải đến được và
tập trung càng cao càng tốt ở những nơi có tế bào u. Ở những khối u lớn thường có
những vùng kém máu nuôi dưỡng làm cản trở điều trị. Vì vậy, ngoài đường uống,
tiêm tĩnh mạch, có thể ưu tiên phân phối nồng độ cao của thuốc vào một vùng cơ
thể có khối u làm tăng khả năng thuốc tiếp xúc với tế bào u bằng cách truyền hoá
chất vào động mạch (trong ung thư gan, một số ung thư đầu cổ) hoặc bơm vào các
khoang (phúc mạc, phế mạc, bàng quang), nhờ đó làm tăng nồng độ thuốc tại chỗ
mà giảm được ảnh hưởng toàn thân (Nguyễn Bá Đức, 2005). Điều trị hóa chất dựa
trên sự đáp ứng khác biệt nhau giữa các tế bào bình thường và tế bào ung thư dẫn
tới hiện tượng kháng thuốc của tế bào ung thư bằng cách sử dụng con đường sinh
trưởng khác, những bơm ngược để bơm thuốc ra ngoài do đó làm giảm hiệu quả của
thuốc.
1.2. Tổng quan về bacteriocin kháng ung thư và azurin
1.2.1. Tổng quan về peptit kháng ung thư

Peptit kháng ung thư (ACP) là những protein nhỏ (ít hơn 50 axit amin)
thường là các ion dương trong tự nhiên thể hiện khả năng gây độc ung thư chọn lọc
do đó tránh được những thiếu sót của phương pháp điều trị ung thư khác. ACP có
ưu điểm là độ đặc hiệu cao, độc tính nội tại thấp, thâm nhập các mô cao (Gaspar và
cs, 2013).
Cơ chế kháng ung thư của peptit gồm phá vỡ màng tế bào chất qua mixen
hóa hoặc hình thành lỗ màng và cảm ứng quá trình tự chết tế bào theo chu trình.
Ngoài ra, một số peptit chống ung thư đã được báo cáo thể hiện hoạt tính chống ung
thư thông qua các cơ chế khác nhau. Các peptit DK6L9 cho thấy tính độc tế bào
chọn lọc do tương tác tĩnh điện với phosphatidylserine bề mặt tiếp xúc trong các tế


7

bào ung thư. Brevinin-2R là một peptit có thể kích hoạt con đường chết lysosom ti
thể và liên quan đến chết tế bào như autophagy (Huang và cs, 2011).
Bảng 1.1. Peptit kháng ung thư và hoạt tính chống ung thư
(Gaspar và cs, 2013)

Peptit

Tế bào ung

Thử

Chọn

Hoạt tính

Tài liệu

thư

nghiệm

lọc

chống ung thư

tham khảo

D-peptit A, B,

Cổ tử cung, u

ICL

Có

Phá vỡ màng tế

Iwasaki và

C và D

thần kinh đệm,

bào

cs, 2009

Ly giải màng tế

Hilchie và

bào

cs, 2011

Hoại tử

Zhang và

phổi, chuột u
tủy
NRC- 03,

Tế bào vú

NRC-07
MPI-1

ICL/GE

Không

M
Cổ tử cung,

GEM

Có

tuyến tiền liệt

cs, 2010

và tế bào gan
Polybia-MPI

Bàng quang và

ICL

Có

Phá vỡ màng tế

Wang và cs,

bào

2008

Không rõ, có thể

Rodrigues

xác định phá màng tế bào

và cs, 2008

tuyến tiền liệt
Gomesin

Tế bào vú,
ruột kết và cổ

ICL

Không

tử cung
Trong nhiều năm qua, cũng đã có nhiều nghiên cứu về các peptit chống ung
thư trên thế giới từ nhiều nguồn khác nhau từ tự nhiên hoặc bằng tổng hợp hóa học
(bảng 1.1).
Một số nghiên cứu về peptit kháng ung thư được nghiên cứu và thử nghiệm
trên thế giới ví dụ, Lycosin-I là một peptit độc tố có nguồn gốc từ nọc độc của nhện,
đã được chứng minh là một ứng cử viên đầy hứa hẹn cho sự ức chế tăng trưởng tế
bào khối u in vitro và in vivo bằng cách tương tác và thẩm thấu qua màng tế bào
(Tan, 2016).


8

Peptit ACFB có nguồn gốc từ sữa bò có khả năng ức chế sự phát triển và gây
ra cái chết theo chu trình của các tế bào ung thư buồng trứng (Zhou và cs, 2016)
hoặc peptit PCN-27 hoạt động gắn với protein HDM-2 trên tế bào ung thư tạo ra các
lỗ trên màng và làm hoại tử tế bào ung thư mà không ảnh hưởng tới tế bào bình
thường (Davitt và cs, 2014).

Dermaseptin-PD-1 và dermaseptin-PD-2 thuộc họ peptit kháng khuẩn
dermaseptin có chiều dài khoảng 27-34 acid amin được phân lập từ dịch chiết da
hoặc da ếch phyllomedusine, Pachymedusa dacnicolor. Hai peptit này có khả năng
ức chế cao đối với các dòng vi sinh vật thử nghiệm và các dòng tế bào ung thư hoạt
động tán huyết thấp (ShiD và cs, 2016). Một số peptit kháng ung thư từ động vật
lưỡng cư khác như aurein từ tuyến lưng của ếch xanh (Rozek và cs, 2000), gaegurin
5 từ da của ếch Rana rugosa (Won và cs, 2006) có hoạt tính kháng lại tế bào ung
thư.
Lunasin là một loại peptit trong đậu tương đã được nghiên cứu tác dụng
chống ung thư và chống viêm. Lunasin có khả năng ngăn ngừa sự biến đổi của các
chất gây ung thư, ức chế các tế bào ung thư tăng sinh (Hernández-Ledesma, de
Lumen, 2008). Cn-AMP2 (TESYFVFSVGM), là một peptit từ nước dừa xanh của
cây Cocos nucifera có khả năng xâm nhập vào các tế bào ung thư và làm cho các tế
bào đó không thể tăng sinh (Prabhu, 2014).
Ngoài những nghiên cứu peptit từ động vật và thực vật thì những nghiên cứu
peptit từ vi khuẩn cũng đang được quan tâm nhiều. Coley toxin độc tố có hoạt tính
kháng ung thư ở vi khuẩn đã được sử dụng để kháng lại nhiều loại ung thư khác
nhau, mặc dù vậy một số bệnh nhân đã bị nhiễm khuẩn hệ thống và chết
(Chakrabarty, 2003). Tuy nhiên, hiện nay nhiễm khuẩn hệ thống được loại trừ nhờ
sử dụng các vi khuẩn đã được làm suy yếu, do vậy có khả năng nhiễm khuẩn yếu.
Ngoài ra, người ta sử dụng các sản phẩm chiết xuất từ vi khuẩn có khả năng nhận
diện và giết đặc hiệu tế bào ung thư. Các sản phẩm từ vi khuẩn thường là độc tố vi
khuẩn, các protein, peptit và enzym.


9

Độc tố vi khuẩn là một trong những loại độc tố mạnh nhất trong tự nhiên
(Pastan và cs, 2007). Các chiến lược mới trong kỹ thuật gen và protein mở ra khả
năng dung hợp các độc tố này với kháng thể đơn dòng tạo nên các độc tố miễn dịch

(immunotoxin) là protein dung hợp có hiệu quả mới với khả năng hướng đích đặc
hiệu các tế bào ung thư (Weldon & Pastan, 2011). Các độc tố vi khuẩn có vùng
chức năng cho phép các độc tố tập trung với mật độ cao xung quanh tế bào ung thư,
vùng vận chuyển cho phép độc tố xâm nhập vào trong tế bào và vùng gây chết cảm
ứng hiệu quả gây độc tế bào. Đối với các độc tố miễn dịch sử dụng trong liệu pháp
chống ung thư, vùng nhận biết tế bào thường được thay thế bằng một phối tử mới
gắn kết với các thụ thể đặc hiệu, điều này cho phép độc tố chỉ tác động lên một số
loại tế bào ung thư nhất định (Pastan và cs, 2007; Weldon & Pastan 2011). Ví dụ
Exotoxin A từ Pseudomonas aeruginosa và độc tố bạch hầu từ Corynebacterium
diphtheria là những độc tố được sử dụng phổ biến nhất trong liệu pháp chống ung
thư (Lorberboum-Galski, 2011) trong khi đó OntakTM là immunotoxin đầu tiên
được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị ung thư tế bào lympho T (Choudhary và
cs, 2011). Sử dụng độc tố Exotoxin A từ Pseudomonas aeruginosa độc tố docetaxel
trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt (Michalska, 2016).
Các protein và peptit được tìm thấy ở các vi khuẩn được cho là không liên
quan đến hoạt tính kháng ung thư. Ví dụ, SSL10 là một protein giống siêu kháng
nguyên từ Staphylococcus aureus, có khả năng ức chế sự di chuyển của tế bào ung
thư máu Jurkat và tế bào ung thư cổ tử cung Hela theo cơ chế cảm ứng biểu hiện
CXCl12 (Walenkamp và cs, 2009). Một protein giống siêu kháng nguyên khác từ S.
aureus là SSL5 có thể ngăn chặn sự dính bám của các tế bào bạch cầu lên các tế bào
nội mạc của thành mạch và các tiểu cầu. Sự dính bám của các tế bào khối u vào tế
bào nội mạc kích thích sự hình thành mạch máu và di căn, do vậy đóng vai trò quan
trọng trong việc kìm hãm sự phát triển của khối u (Walenkamp và cs, 2010). Các
trường hợp khác, ActA, protein cảm ứng sự tập hợp actin, đóng vai trò quan trọng
trong tiến trình gây bệnh của L. monocytogens, đã được sử dụng sử dụng rộng rãi
trong liệu pháp miễn dịch đối với các đáp ứng miễn dịch trung gian qua tế bào TCD8


10

(Wood và cs, 2010). Romidepsin, một dipeptit tự nhiên từ Chromobacterium
violaceum có hoạt tính ức chế các histone deacetylase, enzym quan trọng trong sự
phát triển và lan rộng của khối u, vì vậy là một trong các đích quan trọng đối với bệnh
ung thư máu (Vinodhkumar và cs, 2008). Spiruchostatin B, một peptit có cấu trúc
tương tự Romidepsin từ Pseudomonas sp cũng thể hiện hoạt tính tương tự đối với các
tế bào ung thư (Kanno và cs, 2012). Cuối cùng, Pep27anal2, phân tử có cấu trúc
tương tự peptit Pep27, từ Streptococcus pneumoniae cảm ứng quá trình chết theo chu
trình của các tế bào ung thư theo các con đường truyền tín hiệu khác nhau. Peptit này
sau đó đã được cải biến nhằm làm tăng hoạt tính chống ung thư ở các nồng độ thấp
hơn (Lee và cs, 2005).
Hiện nay tại Việt Nam các nghiên cứu về peptit chống ung thư từ vi khuẩn
và các sản phẩm từ vi khuẩn rất hạn chế. Nghiên cứu về bacteriocin tiềm năng
kháng ung thư tương tự azurin (Nguyen và Nguyen, 2016) là nghiên cứu về peptit
kháng ung thư đầu tiên ở Việt Nam. Ngoài ra có một vài nghiên cứu cơ bản hoặc
ứng dụng về bacteriocin từ vi khuẩn lactic tại Việt Nam nhằm ứng dụng cho công
nghệ thực phẩm hoặc nuôi trồng thủy sản.
1.2.2. Tổng quan về bacteriocin kháng ung thư
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là các peptit hoặc protein do gen
mã hóa được sản sinh từ cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương để ức chế
các vi khuẩn cạnh tranh khác. Bacteriocin có hoạt tính kháng các vi sinh vật cạnh
tranh trong cùng ổ sinh thái, thường kháng cùng loài (phổ hẹp) nhưng đôi khi kháng
nhiều loài khác (phổ rộng). Vì vậy chúng được mong đợi có tác động có lợi đến sức
khỏe của người, động vật nuôi và một số thực vật (Riley, 2009). Bacteriocin hứa
hẹn là một trong các chất kháng ung thư hiệu quả, các tính chất hóa sinh của chúng
đã và đang được nghiên cứu. Từ cuối năm 1970, từ phát hiện dịch bacteriocin thô có
thể gây độc ở các tế bào động vật có vú dẫn đến phát hiện khả năng kháng ung thư
của bacteriocin (Cornut và cs, 2008). Hiện nay các nhóm bacteriocin được chứng tỏ
có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư khác nhau (Chakrabarty, 2014).

11

Nisin là một bacteriocin có khả năng kháng ung thư đối với ung thư tế bào
vảy ở đầu và cổ (HNSCC) bằng khả năng cảm ứng quá trình chết theo chương trình,
làm ngừng chu trình tế bào, ức chế quá trình tăng sinh tế bào chọn lọc ở tế bào
HNSCC so với các tế bào sừng (keratinocyte) (Joo và cs, 2012).
Colicins là peptit kháng khuẩn tiết ra bởi E. coli và vi khuẩn thuộc họ
Enterobacteriaceae có khả năng chống lại các dòng tế bào ung thư ở người in vitro như
ung thư vú, ung thư ruột kết, ung thư xương và dòng tế bào tử cung (Smegmatocin, 2015).
Microcin E492 (M-E492) là một bacteriocins tiết ra bởi Klebsiella
pneumoniae RYC492 có tác dụng gây độc cho những dòng tế bào ác tính, tế bào
ung thư đại trực tràng. M-E492 gây cảm ứng quá trình chết theo chương trình của tế
bào ung thư và làm hoại tử các tế bào đó. Ngoài ra còn có các peptit có bản chất là
bacteriocin với tiềm năng kháng ung thư như pyocins, pediocins, plantaricin A,
bovicin, smegmatocin (Kaur, Kaur, 2015).
1.2.3. Tổng quan về azurin
Azurin là protein cupredoxin do Pseudomonas aeruginosa có mặt trong hệ vi
sinh vật đường ruột người tiết ra, có thể thấm chọn lọc các tế bào ung thư ở người
và gây độc và cảm ứng quá trình chết tế bào theo chương trình, nhưng không tác
động đối với tế bào bình thường (Punj và cs, 2004; Yamada và cs, 2004, 2002).
Azurin có thể tương tác trực tiếp và làm ổn định cấu trúc protein p53 (Punj và cs,
2003). Vùng chức năng chịu trách nhiệm đối với quá trình xâm nhập vào tế bào ung
thư của azurin nằm từ vị trí axit amin từ 50–77 (vùng p28- Azurin). Vùng này có
cấu trúc xoắn alpha và lưỡng tính. Quá trình xâm nhập vào tế bào của azurin không
kèm theo phá vỡ màng tế bào và dẫn tới làm tan bào.
Một thử nghiệm cận lâm sàng nhằm đánh giá các thông số dược động học, trao
đổi chất và độc tính của azurin-p28 (đoạn peptit tổng hợp dài 28 acid amin có nguồn
gốc azurin) tiến hành trên linh trưởng và chuột đã chứng minh peptit này không độc và
không cảm ứng đáp ứng miễn dịch (Jia và cs, 2011). Hơn thế nữa, gần đây tương tác
protein-protein giữa azurin và p53 đã được phân tích bằng công cụ tin sinh học và kính

hiển vi lực nguyên tử (Grandis và cs, 2007; Taranta và cs, 2008, 2009).


12

P18
1

50

67

77

128
Axit amin

P28

Xâm nhập và ức
chế sự nhân lên của
tế bào ung thư

Hình 1.1. Cấu trúc Azurin
Đoạn peptit tổng hợp dài 28 axit amin (p28) với hoạt tính kháng ung thư và
xâm nhập đặc hiệu các tế bào ung thư đã được kiểm tra độc tính trên các động vật
trong đó có khỉ. Kết quả cho thấy p28 không độc tính và đáp ứng miễn dịch . Tương
tự Azurin, bằng các kích thích động học phân tử và sử dụng kính hiển vi lực nguyên
tử, peptit p28 được ghi nhận có khả năng tương tự liên kết với protein p53 cũng như
ức chế sự hình thành mạch máu mới, và các đặc tính ức chế khối u khác. Vì vậy,

peptit p28 đã được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I trên người bởi công ty CDG
Therapeutics Inc, Mỹ. Kết quả cho thấy không gây độc tính và đáp ứng miễn dịch ở
tất cả các bệnh nhân. Kết quả thử nghiệm p28 cho thấy ung thư đã suy giảm một
phần ở hai bệnh nhân trong khi ở hai bệnh nhân khác ung thư hoàn toàn suy giảm
chứng tỏ cơ chế tác động hiệu quả của p28 (Yamada và cs, 2011).
Các nghiên cứu còn chứng minh Azurin có khả năng gắn với nhiều đích khác
nhau ở trong và ngoài tế bào của động vật có vú. Ngoài khả năng gắn với protein
p53, Azurin cũng tác động đến quá trình phân chia tế bào thông qua EphB2 tyrosine
kinase (Chaudhari và cs, 2007). Bên cạnh đó, sự ưu tiên xâm nhập của Azurin và
quá trình ức chế phosphoryl hóa VEGFR-2, FAK và Akt dẫn đến ức chế sự hình
thành mạch, vì vậy ức chế sự phát triển của khối u. Khả năng liên kết của Azurin


13

với các thụ thể ephrin cho phép tạo ra một peptit dung hợp với nicotinamide có hiệu
quả cao hơn gấp 13 lần (Micewicz và cs, 2011).
Hiệu quả của Azurin với hoạt tính kháng ung thư của vi khuẩn đã được
chứng minh thông qua chủng E. coli Nissle 1917 (EcN) biểu hiện Azurin, làm giảm
40% lượng các hạch di căn sau 30 ngày điều trị so với nhóm đối chứng.
Azurin một loại bacteriocin không chỉ có hoạt tính chống ung thư mà còn ức
chế sự xâm nhiễm của virus HIV-1, ký sinh trùng sốt sét Plasmodium falciparum
(Chaudhari và cs, 2006) và ký sinh trùng Toxoplasma gondii (Naguleswaran và cs,
2008, Fialho and Chakrabarty, 2010). Vì vậy Azurin được cho rằng là vũ khí của
P.aeruginosa sử dụng để xâm nhập cơ thể người và cư trú lâu dài mà không gây hại
hay gây ra bất cứ độc tính nào đối với tế bào vật chủ (Fialho and Chakrabarty,
2010). Như vậy Azurin có thể đặc hiệu cho các khối u trong các cơ quan có
P.aeruginosa xâm nhiễm. Kết quả sàng lọc peptit kháng ung thư từ hệ vi sinh
đường ruột người Việt Nam có 9 trình tự đoạn gen azurin từ P. aeruginosa. Các
trình tự này có độ tương đồng cao so với trình tự azurin từ P. aeruginosa được tìm

thấy trên genbank (Nguyễn Thị Thanh Trà, 2016). Đây là một trong những nghiên
cứu về peptit kháng ung thư đầu tiên ở Việt Nam.

Hình 1.2. Mô hình gắn kết giữa Azurin-p28 đối với protein đích ung thư p53
Bên cạnh đó, Neisseria meningitides sản xuất một protein giống azurin được
đặt tên là Laz gồm 127 gốc axit amin (Azurin của P. aeruginosa dài 128 axit amin)
có mức độ tương đồng 56% so với Azurin của P. aeruginosa. Tuy nhiên, Laz được


14

gắn thêm 39 axit amin ở đầu N, đoạn này được gọi là epitope H8 (Hong và cs,
2006). Điều ngạc nhiên là trong khi Azurin có khả năng xâm nhập hiệu quả tế bào
ung thư vú MCF-7, phân tử này lại không có khả năng xâm nhập các tế bào ung thư
thần kinh đệm LN-229. Ngược lại, H8-azurin đi qua hàng rào máu não và xâm nhập
hiệu quả các tế bào thần kinh đệm. Điều này cho thấy N. meningitides đã trang bị
Azurin như một vũ khí chống ung thư cùng với epitope H8 đóng vai trò hỗ trợ
Azurin vượt qua các hàng rào và xâm nhập vào các tế bào u thần kinh đệm để giết
chúng (Chakrabarty, 2014).
1.3. Giới thiệu về gen cnazu8 từ Clostridium nexile mã hóa bacteriocin kháng
ung thư tương tự azurin
1.3.1. Clostridium nexile
Clostridium nexile (tên gọi khác Tyzzerella nexilis), thuộc chi Clostridium
bao gồm khoảng 150 loài chuyển hóa đa dạng của vi khuẩn yếm khí, có mặt ở khắp
mọi nơi trong môi trường. Đây là vi khuẩn Gram dương có hàm lượng GC thấp
trong DNA hình que, di động. Một số loài Clostridium (ví dụ, C. perfringens, C.
botulinum, C. tetani) được biết đến là mầm bệnh độc tố sản xuất ở động vật và con
người. Clostridium nexile được phân lập từ phân người và là một thành viên của hệ
vi khuẩn đường ruột của con người. Bộ gen dài 3861016 bp (% GC là 40,3%) mã
hóa cho 3446 protein. Clostridium nexile nuôi cấy ở 30-37oC trong điều kiện yếm

khí, trên môi trường PYG. Khuẩn lạc trên bề mặt thạch máu có kích thước 0,5-1
mm, tròn, lồi có tâm đục, màu trắng hoặc vàng ra đến bờ khuẩn lạc. Clostridium
nexile có khả năng phân giải sữa, cho kết quả dương tính với thủy phân esculin,
giảm màu đỏ không rõ rệt, làm mất màu, sử dụng cơ chất và tạo axit từ fructose,
galactose, lactose.
1.3.2. Gen cnazu8 (p2seq12)
Cnazu8 (p2seq12) quy định bacteriocin tương tự azurin từ vi khuẩn
Clostridium nexile DSM 1787 được sàng lọc từ hệ gen của 66 loài vi khuẩn ưu thế
trong đường ruột bằng công cụ tin sinh học.Kết quả cho thấy trong số 66 loài, thì có
26 loài loài được xác định là có sản xuất bacteriocin giả định, trong đó Clostridium


15

nexile DSM 1787 có số lượng lớn nhất của bacteriocin giả định là 25. Chiều dài của
đoạn trình tự bacteriocin thay đổi từ 30 đến 518 amino acid. Kết quả từ ProtFun 2.2
và tin sinh học Kihara azurin thì cho ra 14 bacteriocin tương tự như Azurin và Laz
(Nguyen & Nguyen, 2015).
Bảng 1.2 cho thấy số vị trí phosphoryl hóa của protein Cnazu8 và Azurin gần
tương tự như nhau. Vị trí phosphoryl hóa là rất quan trọng trong nghiên cứu peptit
kháng ung thư, đây có thể là tác nhân chống ung thư tiềm năng.
Chúng tôi chọn protein AOI1 orf036 được mã hóa bởi gen cnazu8 (p2sqe12)
quy đinh 33 axit amin để thực hiện dòng hóa và biểu hiện gen từ chủng Clostidium
nexile DSM 1787_AOI1 orf036 (Tyzzerella nexilis DSM 1787 Scfld16) .
Trình tự của gen cnazu8 dài 99 nucleotit ATG AAT CTG ATA TAC TGT
AAA CAC TAC AGA AAG AAG GAT TAT TAT TAT GTC TCG AAC AAG
AAG AAA TTT CTC TGC CAA ATT CAA ATC AGA ATT AGT GAT TGA. Mã
hóa cho protein AOI1 orf036 có chiều dài là 33 axit amin là
MNLIYCKHYRKKDYYYVSNKKKFLCQIQIRISD.
1.4. Tổng quan về tách dòng và biểu hiện gen

Công nghệ DNA tái tổ hợp được ra đời từ những năm 1970 nhờ sự phát triển
các phương pháp và kĩ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trình sinh học ở mức độ
phân tử.
1.4.1. Tạo dòng gen
Tạo dòng gen bao gồm việc cài một DNA lạ vào một vector bằng phương
pháp hóa sinh. Sau đó đưa vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ đã chọn bằng phương
pháp biến nạp hoặc tải nạp.
Mục tiêu của tạo dòng để thu được một lượng lớn bản sao DNA xác định hay
nói các khác tạo dòng chính là chọn lọc trong một thư viện gen dòng vi khuẩn tái tổ
hợp cần tìm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2008).


16

Bảng 1.2. So sánh đặc điểm protein Cnazu8 với azurin hoặc laz
( Nguyen and Nguyen, 2015)

STT ID protein

1

Loài/Chủng

AOI1

Clostridium nexile

orf036

DSM 1787

2

Azurin

3

Laz

Pseudomonas
aeruginosa PA01
Neisseria
meningitides

Độ

Nhóm

Hoạt

dài

chức

tính

aa

năng

Enzym

33

148

183

Dịch
mã
Vỏ tế
bào
Vỏ tế
bào

Không

Không

Không

Bản đồ ngữ
nghĩa gen
(Gen
Ontology)
Đáp ứng
miễn dịch
Đáp ứng
miễn dịch
Đáp ứng

stress

Số vị trí
phosphoryl
hóa

Vị trí protein trong
tế bào

4

Tiết ra ngoại bào

6

Tiết ra ngoại bào

8

Tiết ra ngoại bào


17

Các bước cơ bản của tạo dòng
Bước 1: Chuẩn bị DNA mục tiêu
DNA mục tiêu có thể được thu nhận trước tiếp từ DNA bộ gen thông qua
phương pháp PCR hay được cắt trực tiếp từ một lượng lớn DNA bộ gen ban đầu.
DNA mục tiêu sẽ được cắt bằng enzym giới hạn.
Bước 2: Chọn vector phù hợp

Vector cần chọn sao cho phù hợp với tế bào vật chủ, với mục đích của tạo
dòng, kích thước DNA mục tiêu. Sau đó vector được xủ lý bằng enzym giới hạn
cùng loại với enzym đã cắt DNA cần chèn, vector cần được khử nhóm phosphat để
tránh hai đầu vector nối lại.
Bước 3: Tạo vector tái tổ hợp
Nối DNA mục tiêu với vector để tạo vector tái tổ hợp bằng enzym nối.
Bước 4: Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ
Chuyển vector tái tổ hợp và tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp hoặc tải
nạp. Công đoạn này nhằm sử dụng bộ máy của vật chủ để sao chép vector tái tổ hợp
thành số lượng bản sao lớn.
Bước 5: Tuyển chọn dòng tái tổ hợp
Sàng lọc tế bào vật chủ mang vector tái tổ hợp. Vi khuẩn sau chuyển gen có
ba khả năng: Tế bào vi khuẩn không nhận vector tái tổ hợp, tế bào vi khuẩn nhận
vector nhưng không có gen lạ, tế bào vi khuẩn nhận được vector tái tổ hợp (Nguyễn
Hoàng Lộc, 2007).
Kiểm tra tạo dòng bằng phương pháp khử hoạt tính bằng xen đoạn dùng cho
các plasmid mang hai hoặc nhiều marker (ví dụ ampicilin, lacZ). DNA ngoại lai và
DNA plasmid được thủy phân cùng một loại enzym hạn chế và tinh sạch sau đó gắn
hai DNA với nhau, hỗn hợp gắn dùng để biến nạp vào E. coli mẫn cảm với Amp để
chọn lọc biến nạp nhờ tính kháng ampicilin của plasmid và hoạt tính
β-galactosidase của gen lacZ. Các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp sinh trưởng
trên môi trường có mặt ampicilin và isopropyl-thiogalactoside (IPTG) cùng với cơ
chất nhiễm sắc thể X-gal sẽ có màu trắng do đoạn gen xen vào giữa gen lacZ làm