tách dòng và biểu hiện gen pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh pseudoalteromonas haloplanktis ant505 trong e. coli và nghiên cứu tính chất của chúng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM





ĐỖ THỊ THU HẰNG




TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE TỪ
VI KHUẨN CHỊU LẠNH PSEUDOALTEROMONAS
HALOPLANKTIS ANT/505 TRONG E. COLI VÀ
NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA CHÚNG





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM




ĐỖ THỊ THU HẰNG



TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE TỪ
VI KHUẨN CHỊU LẠNH PSEUDOALTEROMONAS
HALOPLANKTIS ANT/505 TRONG E. COLI VÀ
NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA CHÚNG


Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70


LUẬN VĂN THẠC SĨ DI TRUYỀN HỌC



Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Lê Văn Trƣờng

Thái Nguyên, năm 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn
chân thành và sâu sắc tới TS. Lê Văn Trƣờng - phó trưởng phòng Di truyền
vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị cán bộ phòng Di truyền
vi sinh vật đã giúp đỡ, truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Sinh,
trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Lãnh đạo Viện Công nghệ
sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu
tại Trường và Viện.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã
tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể
hoàn thành bản luận văn này.
Tác giả


Đỗ Thị Thu Hằng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng
sự nghiên cứu phòng Di truyền vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học thực
hiện từ tháng 9 năm 2010 tới tháng 8 năm 2011.

Thái Nguyên, ngày 24 tháng 09 năm 2011
Tác giả


Đỗ Thị Thu Hằng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i
MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Vi khuẩn ưa lạnh 3
1.2. Nơi sống của vi khuẩn ưa lạnh 4
1.3. Enzyme thích ứng lạnh 4
1.4. Ứng dụng của enzyme thích ứng lạnh vào sản xuất công nghiệp 6

1.5. Pectin và pectinase 8
1.5.1. Pectin 8
1.5.2. Pectinase 9
1.5.2.1. Phân loại pectinase 9
1.5.2.2. Sự phân cắt cơ chất pectin bằng pectinase 11
1.6. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp 14
1.6.1. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây 14
1.6.2. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp dệt may 14
1.6.3. Ứng dụng pectinase trong công nghệ sinh học 14
1.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15
1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15
1.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 17
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 17
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid 17
2.1.2. Hóa chất, máy móc và thiết bị 17
2.2. Địa điểm nghiên cứu 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1. Phương pháp tách DNA tổng số của chủng vi khuẩn chịu lạnh
Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 18
2.3.2. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 19
2.3.3. Phương pháp PCR khuếch đại gen 20
2.3.4. Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 21
2.3.5. Phương pháp giải trình tự gen 25
2.3.6. Phương pháp biểu hiện gen 25
2.3.7. Phương pháp thu enzyme ngoại bào, nội bào 25

2.3.8. Phương pháp thử hoạt tính enzyme pectinase 26
2.3.9. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 26
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 29
3.2. Kết quả khuyếch đại gen pelC tách chiết từ chủng vi khuẩn
Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505 29
3.3. Kết quả tách dòng gen pelC trong E. Coli 30
3.4. Kết quả đọc trình tự gen pelC 31
3.5. Thiết kế vector biểu hiện gen pelC 33
3.5.1. Chuẩn bị vector pET43b và gen biểu hiện pelC 33
3.5.2. Phản ứng gắn đoạn gen pelC vào pET43b và biến nạp vào
chủng E. coli BL21 34
3.5.3. Kiểm tra hoạt tính pectinase của các thể biến nạp trên môi
trường thạch 34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii
3.5.4. Kiểm tra sự có mặt pelC trong các thể biến nạp BL21/pET43pelC 35
3.6. Biểu hiện enzyme tái tổ hợp PelC (rPelC) trong môi trường lỏng 36
3.7. Nghiên cứu một số tính chất của rPelC 37
3.7.1. Hoạt tính pectate lyase của rPelC 37
3.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới hoạt tính của enzyme 38
3.7.3. Ảnh hưởng của ion Ca²
+
và Na
+
đến hoạt tính pectinase của rPelC 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT
Chữ viết tắt
Chữ viết đầy đủ
1.
ARN
Ribonucleic Acid
2.
bp
Base pair
3.
Cs
Cộng sự
4.
CTAB
Cetyl trimethylammonium bromide
5.
dH
2
O
Nước khử ion
6.
DNA
Deoxyribonucleic acid
7.

dNTP
Deoxyribonucleotide
8.
E. coli
Escherichia coli
9.
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetace Axit
10.
EtBr
Ethydium bromide
11.
IPTG
Isopropylthio--D-galactoside
12.
Kb
Kilobase
13.
kDa
Kilo Dalton
14.
LB
Luria and Bertani
15.
PCR
Polymerase Chain Reaction
16.
SDS
Sodium dodecyl sulfate
17.

TAE
Tris - acetate - EDTA
18.
v/p
Vòng / phút
19.
VSV
Vi sinh vật


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

v
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Ứng dụng công nghiệp các enzyme ở nhiệt độ thấp (Ohgiya, 1999) 7
Bảng 1.2. Phân loại các pectinolytic enzyme (Whitaker, 1990) 10
Bảng 2.1. Chu kỳ phản ứng PCR 20
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR 21
Bảng 2.3. Công thức pha gel tách (12%) 27
Bảng 2.4. Công thức pha gel cô (5%) 27
Bảng 3.1. Hoạt tính pectinase của rPelC khi biểu hiện ở các nhiệt độ
khác nhau 36
Bảng 3.2. Phát hiện liên kết đôi trong sản phẩm sau phản ứng phân cắt
pectin acid của rPelC 38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vi
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Ba nhóm enzyme thích ứng lạnh của VSV 5
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin 9
Hình 1.3. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases. 11
Hình 1.4. Thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase. 12
Hình 2.2. Sơ đồ vector tách dòng pJET1.2/blunt 21
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của chủng Psedoalteromonas
haloplanktis ANT/505 29
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pelC 30
Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc các thể biến nạp E.coli DH5α trên môi
trường chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicilin 31
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid chứa gen pelC 31
Hình 3.5. Trình tự nucleotide và amino acid của gen pelC 32
Hình 3.6. Kết quả điện di plasmid pET43b sau khi cắt bằng các enzym
hạn chế 33
Hình 3.7. Kết quả biến nạp vector biểu hiện pET43/pelC vào tế bào E.
coli BL21(DE3) 34
Hình 3.8. Kết quả kiểm tra khả năng tạo vòng thủy phân pectin của các

thể biến nạp 35
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra sự có mặt của pelC trong các chủng
BL21/pET43pelC 35
Hình 3.10. Kết quả biểu hiện rPelC trong E. coli BL21(DE3) ở 30
o
C 37
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rPelC 39
Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme rPelC 39
Hình 3.13. Ảnh hưởng của ion Ca²
+
đến hoạt tính enzyme rPelC 40
Hình 3.14. Ảnh hưởng của ion Na
+
đến hoạt tính enzyme rPelC 40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Pectinase là một thuật ngữ chung cho các enzyme có khả năng phân
hủy cơ chất pectin, một loại polysaccharide có nhiều trong tế bào thực vật.
Enzyme pectinase thường được sử dụng trong các quá trình liên quan đến sự
biến đổi của nguyên liệu thực vật như đẩy nhanh tiến độ khai thác nước ép
trái cây từ trái cây chín và được sử dụng trong sản xuất rượu vang từ những
năm 1960. Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều ứng dụng của enzyme
pectinase trong các ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, dược
phẩm, công nghiệp dệt may, đặc biệt thể hiện rõ trong ngành công nghiệp
tẩy trắng sợi bông [45].
Tuy nhiên, đối với một số ngành công nghiệp như ngành công nghiệp

gỗ, bơ sữa, phản ứng với enzyme phải thực hiện ở nhiệt độ thấp chính vì vậy
mà việc sử dụng enzyme lạnh đóng vai trò quan trọng giúp nâng cao chất
lượng sản phẩm. Một trong những enzyme lạnh được các nhà công nghệ quan
tâm là pectinase từ các vi sinh vật sinh trưởng ở nhiệt độ thấp do các ưu điểm
của chúng như: tham gia xúc tác phản ứng ở nhiệt độ thường (20-30
o
C) nên
không cần phải tốn năng lượng ủ ấm; bảo vệ được các chất dễ phân hủy trong
dịch quả như vitamin, hương vị; dễ biến tính bởi nhiệt độ.
Gen mã hóa cho pectinase (pelC) là một trong những gen có nguồn
gốc từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505
đã được TS. Lê Văn Trường và cộng sự (Viện Công nghệ Sinh học) tạo
dòng và giải trình tự trong những nghiên cứu trước đây. Tuy nhiên cho đến
nay enzyme này vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ tính chất cũng như khả
năng xúc tác phân hủy cơ chất pectin. Chính vì vậy, để hiểu rõ tính chất của
enzyme này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng và biểu hiện
gen pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis
ANT/505 trong E. coli và nghiên cứu tính chất của chúng”.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
Mục tiêu, nội dung nghiên cứu của đề tài
Mục tiêu:
- Biểu hiện được enzyme pectinase PelC tái tổ hợp hoạt động ở nhiệt
độ thấp, phân lập từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas
haloplanktis ANT/505 và nghiên cứu được tính chất của pectinase tái tổ hợp.
Nội dung nghiên cứu:
1. Tách dòng gen pectinase (pelC) từ chủng vi khuẩn chịu lạnh
Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505.

2. Thiết kế vector biểu hiện gen pelC trong E. coli.
3. Biểu hiện gen pelC trong chủng vi khuẩn E. coli BL21.
4. Nghiên cứu tính chất của PelC tái tổ hợp.
Ý nghĩa của đề tài:
Ý nghĩa khoa học: Làm sáng tỏ tính chất của enzyme pectinase có
nguồn gốc từ vi sinh vật chịu lạnh khi tham gia xúc tác phản ứng phân hủy cơ
chất pectin.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vi khuẩn ƣa lạnh
Trên trái đất, các môi trường có nhiệt độ thấp chiếm ưu thế. Hơn 80%
sinh quyển là môi trường lạnh giá, và khoảng 90% đại dương lạnh hơn mức
5
o
C [19]. Rất nhiều vi sinh vật trong môi trường đại dương thích nghi với điều
kiện nhiệt độ thấp đó và được phân loại như là các sinh vật ưa lạnh hay sinh
vật có khả năng chịu lạnh.
Thuật ngữ “sinh vật ưa lạnh” được nhắc đến lần đầu tiên năm 1902 bởi
Schmidt-Nielsen để miêu tả những vi khuẩn có khả năng sống ở mức 0
o
C [27].
Trong thực tế, không có nguyên do cụ thể nào để giới hạn việc sử dụng thuật
ngữ ưa lạnh hay chịu lạnh đối với vi khuẩn hay sinh vật nhân sơ. Sinh vật ưa
lạnh có thể là nhiều loài nấm, tảo [20], [23], côn trùng [22], cá [12] và có thể cả

thực vật, nếu chúng trải qua điều kiện sống ở nhiệt độ thấp, ví dụ ở mức nào đó
dưới 5
o
C. Trong số các VSV có thể sinh trưởng ở khoảng 20
o
C hoặc hơn, cần
phải phân biệt sinh vật ưa lạnh với sinh vật chịu lạnh bởi vì sự khác biệt trong
phân bố sinh thái và sự thích nghi sinh hóa của cả hai nhóm [33], [34]. Khái
niệm được Morita đề xuất như sau: sinh vật ưa lạnh là những vi sinh vật có khả
năng sinh trưởng ở nhiệt độ dưới 0
o
C, và nhiệt độ sinh trưởng tối ưu dưới 15
o
C.
Sinh vật ưa lạnh không có khả năng sinh trưởng ở mức 20
o
C trở lên. Trong khi
đó, sinh vật chịu lạnh sinh trưởng tốt hơn ở mức nhiệt độ trên 20-25
o
C và có
thể có giới hạn sinh trưởng trên ở mức 40
o
C [27].
Khái niệm cổ điển đó của Morita được sử dụng thường xuyên trong
nhiều tài liệu. Tuy nhiên, định nghĩa này không được rõ ràng ở ba điểm chính.
Thứ nhất, mức nhiệt độ giới hạn được lựa chọn khá tùy ý và không tương ứng
với sự phân chia rõ ràng của bất kỳ quá trình sinh học hoặc điều kiện môi
trường nào. Thứ hai, định nghĩa của Morita không thể áp dụng được với hầu
hết các sinh vật nhân chuẩn. Cuối cùng, VSV giống như các đơn vị nhiệt động:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
nhiệt độ nuôi cấy tăng thì tốc độ phản ứng tăng và tốc độ sinh trưởng tăng [13].
Vì những nguyên do đó, các tác giả gần đây bắt đầu sử dụng thuật ngữ chung
sinh vật ưa lạnh đối với tất cả các VSV mà sinh trưởng tốt ở mức nhiệt độ
quanh điểm đóng băng của nước thay vì sử dụng thuật ngữ vi sinh vật ưa lạnh
và chịu lạnh riêng rẽ [10], [35].
1.2. Nơi sống của vi khuẩn ƣa lạnh
VSV ưa lạnh đã thống trị thành công các môi trường lạnh vĩnh cửu từ
biển sâu cho tới vùng núi và vùng cực. Hoạt động của vi khuẩn ở nhiệt độ trên
rất hạn chế bởi chỉ lượng nhỏ nước không bị đông cứng bên trong tầng đất bị
đóng băng vĩnh cửu hoặc lớp băng, và bởi các dòng biển. Ở những nơi đó có
nồng độ muối, các chất chất nhày hoặc chất hạt cao, và dòng chảy chất lỏng
được duy trì bởi chênh lệch nồng độ và nhiệt độ. Mặc cho các khó khăn đó, sự
sống vẫn phát triển mạnh trong những môi trường đó với sự đa dạng sinh học
đáng chú ý của chính các vi khuẩn, nấm (đặc biệt là nấm men) và vi tảo. Trong
số các vi khuẩn đã được tìm thấy, thường gặp nhất là các vi khuẩn Gram âm α-,
β-, γ-proteobacteria (Pseudomonas spp. và Vibrio spp.) và ngành Cytophaga-
Flavobacterium-Bacteriodes. Các chủng vi khuẩn Gram dương thường được
phát hiện là vi khuẩn họ Coryne (Arthrobacter sp. và Micrococus sp.) [29].
Hầu hết chúng được phân lập dễ dàng từ môi trường lạnh giá tự nhiên và được
nuôi cấy với methanogen trong phòng thí nghiệm. Chúng được phân lập từ một
hồ ở Nam cực [15], [16], hồ nước ngọt ở Thụy Sỹ [40], lớp trầm tích đại dương
ở Alaska [9] và ở biển Baltic [41], [46].
Để có thể sinh trưởng, các vi sinh vật ưa lạnh phải có các enzyme có
hoạt tính sinh học cao trong điều kiện nhiệt độ thấp. Những enzyme đó được
gọi là enzyme thích ứng lạnh.
1.3. Enzyme thích ứng lạnh
Enzyme thích ứng lạnh là những enzyme có hoạt tính sinh học cao ở

nhiệt độ thấp. Hoạt tính riêng biệt của enzyme thích ứng lạnh ở khoảng nhiệt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
độ 0-30
o
C cao hơn hoạt tính của các enzyme ưa nhiệt trung bình ở cùng nhiệt
độ. Các enzyme thích ứng lạnh bị biến tính ở mức nhiệt độ cao hơn [17].
Jones và cs đã có báo cáo rằng fructose-1,6-bisphosphate aldolase và gluco-6-
phosphate dehydrogenase của Vibrio marinus sẽ mất 100% hoạt tính sau 30
phút ở 35-36
o
C [21]. Theo Morita, malic dehydregenase bán tinh sạch của
chủng Vibrio marinus MP-1 sẽ mất hoạt tính khi nhiệt độ trên 20
o
C, trong khi
nhiệt độ hoạt động tối ưu là khoảng 15-20
o
C [27]. Hay như lactate
dehydrogenase của VSV ưa lạnh V. marinus, có hoạt tính tối đa ở 10-15
o
C và
mất hoạt tính ở 40
o
C [26].
Ohgiya là người đầu tiên đề xuất phân loại những enzyme thích ứng
lạnh của VSV vào ba nhóm (hình 1.1):
Nhóm I: Nhạy cảm nhiệt. Đặc tính của chúng tương tự với enzyme ưa
nhiệt trung bình.

Nhóm II: Nhạy cảm nhiệt và có hoạt tính cao hơn tương đối so với
enzyme ưa nhiệt trung bình khi ở điều kiện nhiệt độ thấp.
Nhóm III: Bền với nhiệt như các enzyme ưa nhiệt trung bình nhưng
hoạt tính cao hơn enzyme ưa nhiệt trung bình ở điều kiện nhiệt độ thấp.

Hình 1.1. Ba nhóm enzyme thích ứng lạnh của VSV
(A) Nhóm I, (B) Nhóm II (C) Nhóm III. Đường gạch đứt: enzyme của VSV
ưa nhiệt trung bình, VSV ưa nhiệt. Đường gạch liền: enzyme của VSV ưa
lạnh (Theo Ohgiya và cs, 1999).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
1.4. Ứng dụng của enzyme thích ứng lạnh vào sản xuất công nghiệp
Phần lớn các enzyme ứng dụng trong công nghiệp là có nguồn gốc từ
VSV. Hầu hết các enzyme của vi khuẩn dùng trong công nghiệp được sản
sinh bởi các sinh vật ưa nhiệt trung bình. Các enzyme sinh vật ưa nóng có vai
trò quan trọng trong công nghiệp bởi vì với tính bền nhiệt biến chúng thành
chất xúc tác sinh học lý tưởng cho nhiều phản ứng. Tuy nhiên, trong một vài
trường hợp (ví dụ như công nghiệp gỗ và bơ sữa), phản ứng với enzyme phải
được thực hiện ở nhiệt độ thấp. Ứng dụng enzyme thích ứng lạnh sẽ mang lại
nhiều lợi ích hơn enzyme từ sinh vật ưa nhiệt trung bình. Ứng dụng sinh học
của enzyme thích ứng lạnh còn rất nhiều tiềm năng, bởi vì:
- Tiết kiệm năng lượng: Sử dụng enzyme hoạt tính lạnh giúp tiết kiệm
năng lượng.
- Hạn chế sử dụng các hợp chất dễ bay hơi, không bền: Sử dụng các
enzyme thích ứng lạnh ở nhiệt độ thấp giúp tiết kiệm sử dụng các hợp chất
không bền hay dễ bay hơi ở quá trình chuyển hóa sinh học trong sản xuất
thực phẩm.
- Ngăn ngừa nhiễm khuẩn: Sản xuất thực phẩm ở nhiệt độ thấp giúp

ngăn chặn sự phát triển của các sinh vật ưa nhiệt trung bình gây hại.
- Bất hoạt enzyme: Điều chỉnh nhiệt độ để bất hoạt các enzyme nhạy
nhiệt một cách dễ dàng.
Một vài ứng dụng điển hình của enzyme thích ứng lạnh được tóm
tắt trong bảng 1.1.




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
Bảng 1.1. Ứng dụng công nghiệp các enzyme ở nhiệt độ thấp
(Ohgiya, 1999)
Ứng dụng
Enzyme
Ƣu điểm
Chất giặt tẩy
Protease, lipase,
cellulose
Sử dụng với nước máy
Công nghiệp thực
phẩm


- Thay đổi thành phần
Β-Galactosidase, lipase
Giữ gìn sự tươi ngon
- Cải thiện hương vị
Protease, lipase, v.v

Giữ gìn sự tươi ngon
- Loại bỏ phần vảy cá
Protease
Bảo quản chất lượng sản
phẩm
- Gạn lọc nước ép trái
cây
Pectinase, cellulose
Giữ hương vị
- Bảo quản
Lysozyme, glucose
oxidase
Nâng cao hiệu quả bảo quản
Tổng hợp enzyme
Lipase, Nitrit hydratase
Với nguyên liệu nhạy nhiệt,
dễ bay hơi
Xử lý nước thải
Catalase
Tiêu tốn ít năng lượng hơn
Công nghệ sinh học


- Tạo tế bào trần
Enzyme phá hủy thành tế
bào
Khả năng sống sót cao
- Sinh học phân tử
Phosphatase, uracil DNA
glycosylase

Hoàn toàn bất hoạt nhiệt
Những enzyme dùng trong công nghiệp giặt tẩy là protease, lipase,
α-amylase và cellulase. Lợi ích nó mang lại là giảm tiêu tốn năng lượng và
giảm hư hỏng, hao mòn khi giặt giũ. Hạn chế của enzyme thích ứng lạnh là
chúng không bền khi được thêm vào sản phẩm cuối cùng sau thời gian dài lưu
kho. Tuy nhiên, những enzyme đó thường là enzyme tái tổ hợp và tính ổn
định của enzyme thích ứng lạnh ngày càng tăng bởi vì chúng ta ngày càng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
hiểu biết rõ hơn về cấu trúc cơ bản enzyme và kỹ thuật gây đột biến điểm
định hướng, cũng như tạo đột biến ngẫu nhiên có thể thực hiện được [28],
[43]. Trong sản xuất tơ sợi, các sợi bông thường nhô ra khỏi sợi chính, làm
giảm độ mượt mà và thay đổi diện mạo trang phục [17]. Sử dụng các enzyme
cellulase thích ứng lạnh có thể làm tăng độ mượt và mềm của vải bằng cách
loại bỏ các sợi bông thừa và có thể nhanh chóng bất hoạt các enzyme này sau
khi dùng. Để làm giảm hàm lượng lactose trong sữa, người ta có thể sử dụng
enzyme β-galactosidase thích ứng lạnh. Ứng dụng pectinase trong sản xuất
nước ép trái cây giúp nâng cao hiệu quả quá trình tách chiết và giảm độ sệt của
sản phẩm. Pectinase thích ứng lạnh cũng tạo điều kiện cho phép quá trình sản
xuất nước ép diễn ra ở nhiệt độ thấp. Điều đó giúp giữ chất lượng nước ép và
cho phép bất hoạt enzyme bằng cách điều chỉnh nhiệt độ thích hợp sau xử lý.
1.5. Pectin và pectinase
1.5.1. Pectin
Pectin là các đại phân tử polysaccharide phức tạp có nhiều trong tế bào
thực vật bao gồm: pectin (polymethylgalacturonate), axit pectin (polygalacturonate)
và oligogalacturonate. Pectin có khả năng tan trong nước và có ít nhất 75%
các nhóm carboxyl của galactoronate bị este hóa với methanol. Axit pectin là
chất đa phân tử có khả năng hòa tan trong nước và có ít hơn 75%

galacturonate bị methyl hóa. Oligogalacturonate là chất đa phân tử nhỏ hơn,
chỉ gồm hai hoặc vài đơn phân galacturonate. Oligomethylgalacturonate cũng
là chất đa phân tử gồm hai hoặc vài galacturonate, có thể một phần hoặc hoàn
toàn bị methyl hóa với C-6 [48].
Hợp chất pectin tiêu biểu cho nhóm polysaccharide có mối liên hệ gần
gũi với nhau [18]. Hai thành tố cơ bản tạo thành hợp chất pectic là
galacturonan và rhamnogalacturonan trong đó carbon ở vị trí C-6 của galactose bị

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
oxy hóa tạo nhóm carboxyl, ngoài ra còn có arabinan, galactan và
arabinogalactan I. Rhamnogalacturonan là thành phần chính trong hợp chất
pectin. Chuỗi sơ cấp gồm các đơn vị α-D-galacturonate liên kết (1-4) với 2-4%
L-rhamnose liên kết β-(1-2) và β-(1-4) với D-galacturonate. Chuỗi bên của
rhamnogalacturonan có thành phần và độ dài đa dạng. Chuỗi bên kéo dài thường
là các polymer đồng nhất của axit D-galacturonic hoặc L-arabinose [48].

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin
Cấu trúc hóa học đặc trưng của pectin được thể hiện ở hình 1.2. Các
đơn vị D-galactorunate liên kết với nhau bằng các liên kết α-1-4 glycosidic.
Một số D-galacturonate bị methyl-este hóa vị trí O-6 của nhóm carboxyl hoặc
acetyl-este hóa ở vị trí O-2 hoặc O-3 của nhóm hydroxyl [11], một số khác bị
biến đổi thành dạng COO
-
hoặc –COOH phụ thuộc vào độ pH. Mức độ
methyl hóa và acetyl hóa rất đa dạng, phụ thuộc vào nguồn pectin [36].
1.5.2. Pectinase
1.5.2.1. Phân loại pectinase
Các enzyme xúc tác phân hủy pectin được gọi chung là pectinase. Dựa

vào cơ chế tác động và cơ chất chúng tham gia xúc tác phân cắt mà pectinase
được phân chia thành các loại như sau: (bảng 1.2).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
Bảng 1.2. Phân loại các pectinolytic enzyme (Whitaker, 1990)
Loại enzyme
số EC
Chất nền
Sản phẩm
Cơ chế xúc tác
Esterase
- Pectin methylesterase
(pectin esterase)
- Pectin acetylesterase*

3.1.1.11


- Pectin

- Pectin

- Pectin acid + Methanol


- Thủy phân

Polygalacturonase

- Protopectinase
- Endopolygalacturonases
- Exopolygalacturonases
- Oligogalacturonate hydrolases
- 4:5 Oligogalacturonate
hydrolase không no
- Endopolymethylgalacturonases

3.2.1.15
3.2.1.82




- Protopectin
- Pectin acid
- Pectin acid
- Trigalactoronate
- 4:5
(galacturonate)
n
- Pectin

- Pectin
- Oligogalacturonates
- Monogalacturonate
- Monogalacturonate
- Monogalacturonate không no
và saturate (n- 1)

- Methyloligogalacturonates

- Thủy phân
- Thủy phân
- Thủy phân
- Thủy phân
- Thủy phân
- Thủy phân
Lyase
- Endopolygalacturonate lyases
- Exopolygalacturonate lyase
- Oligogalacturonate lyase
- Endopolymethylgalacturonate
lyase

4.2.2.2
4.2.2.9
4.2.2.6
4.2.2.10

- Pectin acid
- Pectin acid
- Digalacturonates
không no
- Pectin

- Oligogalacturates không no
- Digalacturonates không no
- Monogalacturonate không no
- Methyloligogalacturonates

không no

- Phân cắt chuyển liên kết
- Phân cắt chuyển liên kết
- Phân cắt chuyển liên kết
- Phân cắt chuyển liên kết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
1.5.2.2. Sự phân cắt cơ chất pectin bằng pectinase
Pectinase có hai cơ chế phản ứng cơ bản: thủy phân và phân cắt chuyển
liên kết (trans –element) (bảng 1.2). Cơ chế thủy phân đòi hỏi sự có mặt của
nước. Ngược lại, cơ chế chuyển liên kết diễn ra trong điều kiện không cần
nước và tạo ra sản phẩm có một nối đôi [48].
Pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) tác động vào pectin để loại bỏ
nhóm methoxyl từ nhóm carboxyl C-6 của galacturonate bằng con đường
thủy phân (hình 1.3). Sản phẩm cuối cùng của phản ứng là axit pectin,
methanol và H
+
từ sự ion hóa các nhóm carboxyl. H
+
giải phóng ra từ nhóm
carboxyl mới hình thành sẽ làm giảm độ pH của môi trường phản ứng. Do
vậy, có thể tiến hành đo pH của dung dịch sau phản ứng để xác định hoạt tính
pectin methylesterase [48].

methylesterases
2
Polymethylgalacturonates +nH O oligogalacturonates galacturonate 

Hình 1.3. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases
Pectin acetylesterase thủy phân pectin bằng cách loại bỏ nhóm acetyl
khỏi nhóm hydroxyl C-2 và C-3 của đơn vị galacturonate. Searle-van
Leeuwen, Vincken và cs 1996 lần đầu phát hiện pectin acetylesterase ở
Aspergillus niger [38]. Shevchik và Hugouvieux-Cotte-Pattat (1997) tìm thấy
hai pectin acetylesterase khác ở Erwinia chrysanthemi 3937 [39]. Tuy nhiên,
các nghiên cứu về pectin acetylesterase còn rất hạn chế.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) và exopolygalacturonase (EC
3.2.1.67) thủy phân liên kết glycosid bên trong polygalacturonate (hình 1.4).
Sản phẩm phản ứng là một loạt polygalacturonate cỡ trung bình (đối với
endopolygalacturonate) hoặc galacturonate (với exopolygalacturonate). Hoạt
tính của hai enzyme này có thể được đo bằng cách xác định mức độ hình
thành nhóm khử với 3,5-dinitrosalycylate [7].

endopolygalacturonase
2
Polygalacturonates+nH O oligogalacturonates galacturonate 

   
exopolygalacturonase
2
n n 1
Polygalacturonate + nH O polygalactoronate galacturonate

 

Hình 1.4. Thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase
Endopolymethylgalacturonase thủy phân polymethylgalacturonate
ngẫu nhiên thành oligomethylgalacturonate [5], [14]. Phản ứng được xúc tác
bởi lớp enzyme bên dưới:
 
Endopolymethylgalacturonase
2
n
Polymethylgalacturonate + nH O Oligomethylgalacturonates
Hoạt tính của endopolymethylgalacturonase cũng có thể được đo bằng cách
xác định tỷ lệ nhóm khử hình thành bởi sự thủy phân các liên kết glycosid.
Endopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.2), chỉ được tìm thấy ở VSV,
nó khác với endogalacturonase. pH tối ưu trong khoảng 8-10, cao hơn nhiều
so với các enzyme phân giải pectin khác. Để hoạt động chúng cần sự có mặt
của Ca
2+
và chúng phân cắt liên kết glycosid bằng cơ chế trans tạo thành liên
kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate [48]. Phương pháp tốt nhất để xác

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
định hoạt tính enzyme này là phân tích liên kết đôi với máy đo quang phổ ở
bước sóng 232nm [25]. Cũng có thể xác định hoạt tính bằng phương pháp
đường khử [42], [7]. Phản ứng xúc tác bởi endopolygalacturnate lyase như sau:

Endopolygalacturonate lyase
Polygalacturonate 4 : 5 oligogalacturonates
không no

Exopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.9) được phát hiện chỉ ở một vài
loài vi khuẩn Clostridium multifermentans [24], [25]; Erwinia aroideae [31],
[32]; Erwinia disolvens [8]. Cơ chất ưa thích không phải polymethylgalacturonate
mà là polygalacturonate. Sản phẩm tạo thành thường là Δ4:5 digalacturonate
không no. Độ pH tối ưu của các enzyme này trong khoảng 8,0 – 9,5. Hoạt tính
của exopolygalacturonate lyase có thể được xác định giống với cách tiến hành
đối với endopolygalacturonate lyase. Phản ứng xúc tác bởi enzyme
exopolygalacturonate lyase như trong hình 1.5.

Exopolygalacturonate lyase
Polygalacturonate 4 : 5 galacturonates kh«ng no


Hình 1.5. Sự phân giải polygalacturonate bởi exopolygalacturonate lyase
Endomethylgalacturonate lyase (EC 4.2.2.10) phân giải pectin ở
dạng bất kỳ thành sản phẩm cuối cùng tetramethylgalacturonate. Phản ứng
xúc tác bởi Endomethylgalacturonate lyase như sau:
Endomethylpolygalacturonate lyase
Polymethylgalacturonate Methyloligogalacturonate kh«ng no

Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định bằng phương pháp
đường khử [42], [7], hoặc đo quang phổ phát hiện các liên kết nối đôi ở bước
sóng 232nm [25].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
1.6. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp
1.6.1. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây
Trái cây có thể được dùng để sản xuất nước ép thường hoặc nước ép cô

đặc. Thêm pectinase giúp quá trình tách chiết nước ép sẽ dễ dàng hơn. Người
ta thêm pectinase vào hỗn hợp trái cây (khoảng 40-200g enzyme/tấn) trong
30-60 phút ở điều kiện 15-30
o
C để thủy phân pectin làm giảm độ sệt và do đó
tăng hiệu suất. Pectinase cũng được thêm vào nước ép sau quá trình ép để khử
pectin. Pectinase thủy phân pectin và hemicellulose thừa, phản ứng này tạo
điều kiện cho quá trình cô đặc của đường trong nước ép tăng lên 70-72
o
Brix,
cũng như tăng khả năng bảo quản và tránh xâm nhiễm của vi sinh vật [18].
1.6.2. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp dệt may
Sợi bông chín có thành tế bào gồm vách sơ cấp mỏng và vách thứ cấp
dày. Mục tiêu của quá trình xử lý bông là loại bỏ vách sơ cấp thành tế bào.
Thành phần hóa học của sợi bông gồm ~95% cellulose và ~5% không phải
cellulose. Phần lớn các hợp chất không phải cellulose thuộc vách sơ cấp, có
cấu tạo gồm một hệ thống lưới pectin phức tạp (một phần axit methoxylate
polygalacturonic), protein, cellulose, hemicellulose, và chất sáp. Vách sơ cấp
thành tế bào gần như toàn bộ là cellulose [6], [37]. Enzyme phân giải chính
xác pectin sợi bông giúp làm giảm hoặc loại bỏ việc sử dụng các chất hóa học
độc hại, giảm gánh nặng môi trường trong khi vẫn đảm bảo tính nguyên vẹn
và độ chắc chắn của sợi bông.
1.6.3. Ứng dụng pectinase trong công nghệ sinh học
Trong chu trình sinh sản của thực vật, người ta không thể dùng phương
pháp thao tác gen truyền thống để đưa nhiều tổ hợp các đặc tính mong muốn
vào tế bào. Ngày nay, người ta sử dụng một phương pháp hiệu quả đối với
thực vật bậc cao là dung hợp giữa các tế bào trần (protoplast) cô lập từ tế bào
sinh dưỡng (tế bào soma) trong điều kiện in vitro và sau đó phát triển nó

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
thành thực vật lai. Đây có thể là một công cụ hữu hiệu để làm tăng sự đa dạng
gen và tổ hợp các đặc điểm không có trong tự nhiên. Chính vì vậy mà việc sử
dụng enzyme pectinase thích ứng lạnh tác động loại bỏ thành tế bào thực vật
để tạo ra tế bào trần (protoplast) có ứng dụng quan trọng trong công nghệ sinh
học thực vật [30].
1.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng pectinase vào
việc xử lí vỏ cà phê để sản xuất thức ăn cho gia súc, ứng dụng lên men tạo
phân bón, sản xuất hương thơm tự nhiên.
Ứng dụng pectinase vào việc xử lí phế thải vì pectin là thành phần quan
trọng trong rác thải hữu cơ. Trên cơ sở lựa chọn 100.000 gen khác nhau của nấm
(Fungus) Aspergillus japonicus người ta đã tách được các enzyme phân giải pectin
pectinolytic enzyme) như Pectinase, Pectinesterase (Pectinmethylesterase 3.1.1.11).
Pectinase kiềm tổng hợp từ vi khuẩn Bacillus subtillis đã thay thế các
chất hóa học trong quá trình tẩy trắng giấy và bột giấy, giảm thiểu tác động
tiêu cực đến môi trường và cải thiện chất lượng giấy [4].
Ứng dụng pectinase và cellulase xử lý rễ của cây con Lotus
corniculatus phóng thích các tế bào trần của đầu rễ lông hút để thu nhận tế
bào trần, dùng trong sinh học phân tử. Xử lý rễ của cây con Lotus
corniculatus với cellulase và pectinase phóng thích các tế bào trần của đầu rễ
lông hút khi ủ trong môi trường có enzym khoảng 1 phút. 10% của tế bào trần
phân chia để tạo ra một tập đoàn tế bào mà sau đó tạo được chồi non. Cây tái
tạo có kiểu hình và tế bào bình thường.
1.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về enzyme pectinase ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau như các nghiên cứu ứng dụng các enzym
pectinase vào công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.