Phân lập và sàng lọc vi khuẩn biển định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan từ rong nâu việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
---------------o0o---------------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẨN BIỂN ĐỊNH HƯỚNG
SINH ENZYME THỦY PHÂN FUCOIDAN TỪ RONG NÂU
VIỆT NAM

Giảng viên hướng dẫn :Th.S Văn Hồng Cầm
Th.S Cao Thị Thúy Hằng
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Duy Hoài An

Mã số sinh viên

: 54130064

Khánh Hòa: 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

CÔNG NGHỆ SINH HỌC
---------------o0o---------------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẨN BIỂN ĐỊNH HƯỚNG
SINH ENZYME THỦY PHÂN FUCOIDAN TỪ RONG NÂU
VIỆT NAM

Giảng viên hướng dẫn :Th.S Văn Hồng Cầm
Th.S Cao Thị Thúy Hằng
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Duy Hoài An

Mã số sinh viên

: 54130064

Khánh Hòa, tháng 07/2016


1

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới ThS. Văn Hồng Cầm và ThS.
NCS Cao Thị Thúy Hằng Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã vô
cùng tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn toàn thể ban lãnh đạo, các cán bộ của Viện Nghiên
cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, đặc biệt là cán bộ phòng Hóa phân tích và
phòng Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện hỗ trợ và giúp đỡ em để em có đủ điều
kiện thực hiện đồ án.
Em xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban
Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, phòng đào tạo Đại học và sau Đại
học cùng các thầy cô Trường đại học Nha Trang đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn

trong suốt quá trình học và làm đồ án.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã
luôn luôn ở bên, quan tâm, chia sẻ những khó khăn, động viên, đốc thúc và là nguồn
động lực to lớn để em hoàn thành đồ án này.

Nguyễn Duy Hoài An


2

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

1

MỤC LỤC

2

DANH MỤC VIẾT TẮT

4

DANH MỤC HÌNH

5

DANH MỤC BẢNG

6

MỞ ĐẦU

7

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN

9

1.1. Giới thiệu về fucoidan

9

1.1.1. Khái niệm

9

1.1.2. Cấu trúc

9

1.1.3. Hoạt tính sinh học của fucoidan

13

1.2. Giới thiệu về fucoidanases

18

1.2.1. Khái niệm

19

1.2.2. Nguồn thu fucoidanases

19

1.2.2.1. Nguồn thu từ vi sinh vật

19

1.2.2.2. Nguồn thu từ động vật không xương sống biển

20

1.2.3. Cấu trúc

22

1.2.4. Cơ chế tác động của fucoidanase

24

1.2.5. Các yếu tố dinh dưỡng của môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng
hợp enzyme

26

1.2.6. Một số phương pháp xác định hoạt tính enzyme fucoidanases

29

1.2.7. Ứng dụng của fucoidanase

31

1.2.8. Một số phương pháp tinh sạch fucoidanase

32

1.2.9. Tình hình nghiên cứu và sử dụng fucoidanase trên thế giới và ở Việt Nam

34


3

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

36

2.1. Vật liệu và thiết bị

36

2.1.1. Mẫu vật

36

2.1.2. Hóa chất

36

2.1.3. Môi trường nuôi cấy

36

2.1.4. Thiết bị

36

2.2. Phương pháp nghiên cứu

36

2.2.1. Phân lập vi khuẩn bằng phương pháp khuẩn lạc

38

2.2.2. Sàng lọc vi khuẩn định hướng sinh enzyme bằng đĩa thạch

38

2.2.3. Khảo sát hoạt tính dịch chiết enzyme thô tách chiết từ dịch lên men vi
khuẩn định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan

39

2.2.4. Định danh vi khuẩn bằng gen 16s rDNA

41

2.2.5. Khảo sát các điều kiện lên men tối ưu cho vi khuẩn sinh enzyme có hoạt
tính mạnh nhất

42

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN

46

3.1. Phân lập vi khuẩn bằng phương pháp khuẩn lạc

46

3.2. Sàng lọc vi khuẩn định hướng sinh enzyme fucoidanase

46

3.3. Khảo sát hoạt tính dịch chiết enzyme thô từ dịch lên men vi khuẩn định hướng
sinh enzyme thủy phân fucoidan

48

3.4. Định danh chủng vi khuẩn 16NT 215

50

3.5. Khảo sát điều kiện lên men tối ưu của chủng 16NT 215

52

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ

62

4.1. Kết luận

62

4.2. Kiến nghị

62

TÀI LIỆU THAM KHẢO

63

PHỤ LỤC

69


4

DANH MỤC VIẾT TẮT
APS

Ammonium persulphat

BSA

Bovine serum albumin

DNA

Deoxyribonucleic acid

kDa

Kilo Dalton

M

Marker

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction

rRNA

Ribosome ribonucleic acid

C-PAGE

Carbohydrate–polyacrylamide gel electrophoresis

UI

Unit international

v/v

Volume/volume

w/v

Weight/volume

IR

Infrared spectroscopy

GC – EIMS

Gas Chromatography with Electron Impact Mass Spectrometry

LDL – C

Low Density Lipoprotein-Cholesterol

HDL – C

High Density Lipoprotein-Cholesterol

HGF

Human Hepatocyte Growth Factor

HIV

Human Immunodeficiency Virus

DVT

Deep Vein thrombosis

PE

Pulmonary Embolism

RPM

Rounds Per Minute

PBS

Phosphate Buffered Saline

ANOVA

Analysis Of Variance

GC/MS

Gas chromatography/mass spectrometry

ESI – MS

Electrospray Ionisation Mass Spectrometry


5

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1

Mô hình cấu trúc fucoidan từ Fucus vesiculosus của Pankter

12

Hình 1.2

Mô hình cấu trúc fucoidan từ Ascophyllum nodosum

12

Hình 1.3

Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum swartzii ở Việt Nam

13

Hình 1.4

Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum polycystum ở Việt Nam

13

Hình 1.5

Số lượng bài công bố về fucoidan và fucoidanases trên thế giới

34

Hình 2.6

Sơ đồ tóm tắt toàn bộ qui trình thực hiện

37

Hình 2.8

Sơ đồ tóm tắt qui trình tách chiết thu enzyme thô

40

Hình 2.9

Sơ đồ tóm tắt qui trình khảo sát điều kiện lên men tối ưu

43

Hình 3.10

Sàng lọc vi khuẩn định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan bằng
phương pháp đĩa thạch trên cơ chất fucoidan từ rong S. mcclurei
47

Hình 3.11

Kết quả thử nghiệm hoạt tính dịch chiết enzyme thô chủng 16NT 215 49

Hình 3.12

Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1%

Hình 3.16

Thử nghiệm đĩa thạch sự ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme của chủng 16NT 215
55

Hình 3.17

Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ pepton đến khả năng sinh
tổng hợp enzyme của chủng 16NT 215
57

Hình 3.18

Thử nghiệm đĩa thạch sự ảnh hưởng của nồng độ pepton đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme của chủng 16NT 215
57

Hình 3.19

Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ nuôi lắc đến khả năng sinh tổng
hợp enzyme của chủng 16NT 215
59

Hình 3.20

Thử nghiệm đĩa thạch sự ảnh hưởng của tốc độ nuôi lắc đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme của chủng 16NT 215
59

Hình 3.22

Thử nghiệm đĩa thạch sự ảnh hưởng của thời gian nuôi lắc đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme của chủng 16NT 215
61

50


6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng đường, sulfate và uronic acid theo tỷ lệ mol của fucoidan từ năm
loại rong mơ ở Khánh Hòa (Nguyễn Duy Nhứt, 2008)

11

Bảng 1.2 Hoạt tính fucoidanases ở một số động vật không xương sống

21

Bảng 1.3 Sự đặc hiệu đối với cơ chất của một số loại fucoidanases từ vi khuẩn biển 25
Bảng 1.4 pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của một số enzyme thủy phân fucoidan
từ vi sinh vật (Kusaykin và cs., 2016)

28

Bảng 3.5 Bảng khảo sát hoạt tính enzyme thủy phân fucoidan trên

48

Bảng 3.6 Bảng so sánh trình tự tương đồng của 16S rRNA của chủng 16NT 215 trên
ngân hàng gen NCBI

51


7

MỞ ĐẦU
Fucoidan từ rong Nâu Việt Nam ngày nay đã được biết đến rộng rãi như một
loại thực phẩm chức năng với đặc tính sinh học đa dạng và thú vị của nó. Fucoidan có
những hoạt tính đáng quí như chống đông cục máu, kháng khuẩn, kháng virus (kể cả
HIV) (Bui Huu Tai và cs., 2011), chống nghẽn tĩnh mạch, chống ung thư (Nguyễn
Duy Nhứt và cs., 2008), chống viêm khớp, giảm mỡ máu đã được tiến hành lâm sàng
trên người. (Nguyễn Duy Nhứt và cs., 2008)
Nguồn tài nguyên biển phong phú trong bờ biển dài hơn 3000 km của nước ta là

một tài sản vô cùng đáng giá. Việt Nam là một nước có điều kiện thuận lợi cho rong
biển phát triển, riêng thành phần loài rong biển của Việt Nam đến nay đã xác định lên
đến 800 loài, gồm các ngành rong Nâu, rong Đỏ, rong Lục. Trong đó, đa số các chi
trong ngành rong Nâu có sản lượng tự nhiên lớn là các chi Sargassum, Hormophysa,
Hydroclathrus (Lê Như Hậu và cs., 2009). Riêng tính sản lương rong Mơ – Sargassum
thì sản lượng hằng năm đã lên đến 20.000 tấn khô/năm (Lê Như Hậu và cs., 2009).
Fucoidan trong rong Nâu chiếm từ 4 – 8% trọng lượng khô (Lê Như Hậu và cs., 2009).
Do đó, việc khai thác được nguồn polysaccharide đáng quí này là vô cùng to lớn và ý
nghĩa.
Fucoidan là tên được đặt riêng cho một sulfate polysaccharide chỉ có trong
thành phần của ngành rong Nâu mà không có trong thành phần của các loài thực vật
hay động vật khác. Fucoidan có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính đa dạng của liên kết
glycosidic và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate được sắp xếp không
theo quy luật trên mạch polymer. Dựa vào những lí do trên, người ta cần có một
phương pháp hữu hiệu để cắt mạch fucoidan, một phần là để nghiên cứu về cấu trúc
của chúng, về ý nghĩa của nhóm sulfate đặc trưng trong các hoạt tính sinh học. Phần
còn lại để phục vụ cho mục đích chữa trị của fucoidan vì các mạch nhỏ fucoidan sẽ
được hấp thụ dễ dàng hơn cả phân tử lớn mà vẫn giữ được hoạt tính của mình vì còn
nguyên gốc sulfate. Hơn nữa, việc fucoidan có phân tử khối lớn sẽ dẫn đến tính nhớt
của chúng trong dung dịch có thể hạn chế các hoạt tính sinh học của nó.
Các phương pháp hóa học có thể dùng acid đặc, kiềm đặc hay nhiệt độ cao để
cắt mạch fucoidan dẫn đến khả năng biến tính fucoidan và mất đi hoạt tính đáng quí
vốn có (Cao Thị Thúy Hằng, 2011). Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp sinh học mà


8

cụ thể là sử dụng enzyme để cắt mạch sẽ trở nên hiệu quả hơn với mục đích sử dụng
fucoidan của các nghiên cứu.
Enzyme phân cắt fucoidan có thể được tìm thấy ở nhiều loài sinh vật biển bao

gồm động vật không xương sống hay vi sinh vật biển. Chúng có khả năng sử dụng
fucoidan như một cơ chất để phục vụ cho mục đích sinh trưởng và phát triển của mình.
Đặc biệt đối với việc thu enzyme từ vi sinh vật sẽ có nhiều thuận lợi. Vi sinh vật sinh
sản phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng
tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá
dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Lượng enzyme có thể được sản xuất ra trong một thời
gian ngắn.
Vì những lí do trên, trong khuôn khổ đồ án tốt nghiệp này, được sự hỗ trợ của
Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Nha Trang, em thực hiện đề tài: “Phân lập và sàng lọc
vi khuẩn biển định hướng sinh enzyme thủy phân fucoidan từ rong Nâu Việt Nam”
Nội dung bao gồm:
 Phân lập vi khuẩn biển từ các nguồn sinh vật biển thuộc vùng biển Nha Trang.
 Sàng lọc vi khuẩn biển sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan
 Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử.
 Lựa chọn và khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để chủng vi khuẩn sinh
enzyme có hoạt tính cao.


9

1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về fucoidan
1.1.1. Khái niệm
Fucoidan lần đầu tiên được Kylin mô tả và đặt tên là fucoidin vào năm 1913.
Tác giả đã tách chiết được fucoidin bằng phenylhydrazone vào năm 1915 từ loài rong
Nâu Laminaria digitata, cho thấy rằng methyl pentose có mặt trong dung dịch thuỷ
phân fucoidin (Black và cs., 1952). Năm 1937 Lunde, Heen và Öy kết tủa dịch chiết
fucoidin bằng cồn, xác định được cấu trúc của chúng là: (R.R1.O.SO2.O.M)n, trong đó
R là fucose, R1 không biết là gì, M có thể là K, Na, Ca hoặc Mg, tổng sulfate khoảng
35.5 – 37.5%. Percival và Ross vào năm 1950 đã chiết fucoidin bằng nước sôi trong 24

giờ, xác định được trong dịch thuỷ phân fucoidin từ Fucus vesiculosus, F. spiralis,
Himanthalia lorea, L. cloustoni, ngoài fucose còn có uronic acid, galactose, xylose,
tổng sulfate 32.4%, đó là polysulfatefucose, với liên kết 12 glycosidic và sulfate ở vị
trí C – 4, cấu trúc này được khẳng định lại một lần nữa bởi O Neill (1954), Côte
(1959) và nó tồn tại đến 40 năm sau. (Mulloy, 2003)
Năm 1959, McNeely đổi tên fucoidin thành fucoidan trong khi phân loại
polysacaride (Mulloy, 2003). Năm 1948, Vasseur tìm thấy methyl pentose sulfate cũng
có trong các loài động vật nhuyễn thể dưới biển, mặc dù vậy cho mãi đến năm 1987
không có nghiên cứu cấu trúc nào cho dạng fucan sulfate của động vật này. Theo
IUPAC định nghĩa fucan sulfate là polymer của fucose sulfate (polymer có thành phần
đơn phân tử là đường thì khi tạo thành polymer hậu tố -ose được đổi thành -an), và
thường chỉ dùng cho polysaccharide trong động vật, còn fucoidan được đặt tên riêng
cho dạng polysaccharide sulfate tách chiết từ rong Nâu (Mulloy, 2003) trong đó fucose
khoảng chừng 20 – 60% (Maria và cs., 2006), 18.6 – 32.8% (Maria và cs., 2001) các
tác giả đã dùng tên này đặt cho các sản phẩm chiết từ rong Nâu của mình bên cạnh các
tên khác như fucogalactan sulfate, fucoglucuronomannan sulfate, xylofucoglucuronan
sulfate,… (Mulloy, 2003)
1.1.2. Cấu trúc
Những loại fucoidan được tách chiết từ các loại rong khác nhau thì có cấu trúc
khác nhau. Bởi vậy, mặc dù fucoidan đã được phân lập lần đầu tiên bởi Kylin gần 100


10

năm trước, nhưng cho đến nay mới chỉ có rất ít cấu trúc được xác lập. Để xác định cấu
trúc của fucoidan thì những thông số cơ bản sau cần được xác định (i) thành phần các
gốc đường và nhóm sulfate (ii) vị trí nhóm sulfate trong các gốc đường (iii) vị trí liên
kết giữa các gốc đường (iv) trật tự sắp xếp các gốc đường. (Nguyễn Duy Nhứt, 2008)
Một số các loài rong Mơ thuộc chi Sargassum tại Việt Nam đã được nghiên cứu
về thành phần đường trung tính, lượng uronic acid và NaSO3 cho thấy sự đa dạng về

cấu trúc của fucoidan từ những loài rong khác nhau, được thể hiện ở bảng 1.1


11

Bảng 1.1 Hàm lượng đường, sulfate và uronic acid theo tỷ lệ mol của fucoidan từ năm
loại rong mơ ở Khánh Hòa (Nguyễn Duy Nhứt, 2008)

Thành phần mol đường trung tính
Loài rong

S.denticarpum
S. mcclurei
S. oligocystum
S. polycystum
S. swartzii

Fuc

Xyl

Rha

Man

Glu

Gal

1

0.24

0.44

0.39

0.34

1.05

28.9%

6.9%

9.8%

30.35%

1

0.05

0.08

0.11

50.5%

2.5%

4.0%

5.56%

1

0.15

0.18

0.81

32.8%

4.9%

5.9%

26.64%

1

0.19

0.13

0.92

35.9%

6.8%

4.6%

33.09%

1

0.19

0.22

1

29.1%

5.5%

6.4%

29.15%

12.7% 11.2%
0.5

0.24

25.2% 12.1%
0.36

0.54

11.8% 17.7%
0.27

0.27

9.71% 9.71%
0.48

0.54

13.9% 15.7%

SO3
-Na
(%)
w/w

Uro
nic acid
(%) w/w

25.69

21.20

33.15

17.87

22.46

21.54

25.6

23.74

20.40

14.28

Fucoidan từ rong Fucus vesiculosus được thương mại hóa tại thời điểm hiện
nay có thành phần gồm 44.1% fucose, 26.3% sulfate và 31.1% tro cùng một lượng ít
aminoglucose (Bo và cs., 2008). Dựa trên kết quả của quá trình methyl hóa và xử lí
bằng kiềm, Conchie và O’Neil đã tìm ra được thành phần chính của fucoidan này là
đường α – 12 – fucose và một số các nhóm sulfate ở vị trí C - 4 của đơn vị fucose.
Bằng phương pháp khối phổ IR, Anno và cs. đã phân lập được L – fucose 4–sulfate từ
loại rong trên và báo cáo rằng nhóm sulfate là nhóm thế ở vị trị axial C – 4 của đơn vị
L – fucopyranose (Anno và cs., 1970). Mô hình cấu trúc của Conchie được chấp nhận
trong vòng bốn mươi năm. Vào năm 1993, dữ liệu GC/MS của quá trình methyl hóa
do Pankter và cs. đã cho ra một mô hình cấu trúc mới, giả thiết rằng mạch chính của
fucoidan là một polymer của fucose có liên kết α – 13 với nhóm sulfate thế ở vị trí C
– 4 trong một vài gốc fucose, fucose thì được đính vào mạch để hình thành nên mạch
nhánh và cứ mỗi 2 – 3 đơn vị fucose thì có một nhóm thế. Cấu trúc được thể hiện ở
hình 1.1

12

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc fucoidan từ Fucus vesiculosus của Pankter
(Bo và cs., 2008)
Một số các nghiên cứu khác đã được công bố, vào năm 2001, Maria và các cs.
đã tìm ra cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Ascophyllum nodosum, mạch fucan có liên kết
α – 13, α – 14, mạch nhánh có liên kết α – 12 và nhóm sulfate ở vị trí C – 2, C
–3.

Hình 1.2

Mô hình cấu trúc fucoidan từ Ascophyllum nodosum
(Maria và cs., 2001)

Fucoidan có thể có mạch nhánh, trong phân tử có sự hiện diện của một số các
gốc đường khác nhau và có thể có các gốc acetyl cũng như sulfate phân bố không theo
một qui luật nào, kết quả của phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân cũng chỉ cho biết
một phần thông tin về cấu trúc của chúng mà thôi (Maria và cs., 2006). Vì vậy, cho


13

đến nay việc mô tả hoàn chỉnh cấu trúc của fucoidan rong biển là việc vô cùng khó
khăn (Silva và cs., 2005).
Fucoidan Việt Nam, ngoài thành phần sulfate fucose, còn có mặt nhiều thành
phần đường đơn khác như mannanose, glucose, galactose, xylose.., vì vậy chúng có
cấu trúc phức tạo hơn nữa. Một vài ví dụ về cấu trúc của fucoidan Việt Nam đã được
công bố, chẳng hạn như fucoidan từ rong Nâu Sargassum swartzii vào năm 2009.
(Hình 1.3) (Nguyễn Duy Nhứt và cs., 2009)

Hình 1.3 Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum swartzii ở Việt Nam
Và cấu trúc của fucoidan từ rong Nâu Sargassum polycystum vào năm 2008.
(Hình 1.4) (Nguyễn Duy Nhứt, 2008)

Hình 1.4 Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum polycystum ở Việt Nam
Hình 1.5 Cấu trúc fucoidan từ rong Nâu Sargassum polycystum ở Việt Nam
Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan tập trung vào việc xác định
từng thành phần có trong chúng. Cụ thể là, thành phần đường sẽ được xác định bằng
phương pháp sắc kí; tương tự như vậy đối với uronic acid; vị trí nhóm sulfate sẽ được
xác định bằng phổ IR; vị trí và trật tự liên kết đường xác định bằng phổ khối ESI –
MS. (Nguyễn Duy Nhứt, 2008)
1.1.3. Hoạt tính sinh học của fucoidan
Fucoidan có hoạt tính chống đông cục máu, kháng khuẩn, kháng virus (kể cả
HIV), chống nghẽn tĩnh mạch, chống ung thư, chống viêm khớp, chống viêm nhiễm,


14

giảm mỡ máu, hạ cholesterol, ức chế miễn dịch có thể sử dụng cho ghép phủ tạng (Bo
và cs., 2008)… Fucoidan không gây độc cho người, đã được FDA cho phép sử dụng
làm thực phẩm chức năng vào năm 2001. (Bo và cs., 2008)
Hoạt tính chống đông máu
Sự đông máu là một quá trình phức tạp qua đó tạo ra các cục máu đông. Đông
máu là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu. Khi thành mạch máu bị tổn
thương, máu được cầm nhờ chỗ tổn thương được che phủ bởi cục máu đông chứa tiểu
cầu và sợi huyết. Rối loạn đông máu có thể làm tăng nguy cơ chảy máu và/hoặc tạo
cục máu đông và huyết tắc. Những nơi thông thường nhất để hình thành cục máu đông
là chân (nghẽn tĩnh mạch sâu hay DVT) hoặc là phổi (tắc phế quản hay PE). (Qiu và
Amarasekara, 2006)
Hoạt tính này có liên quan đến hàm lượng và vị trí gốc sulfate cũng như thành

phần và khối lượng của phân tử đường (Qiu và Amarasekara, 2006). Đa số các hoạt
động chống đông của fucoidan thông qua trung gian thrombin bằng cách ức chế
cofactor heparin II. (Qiu và Amarasekara, 2006)
Hoạt tính chống đông máu qua trung gian ức chế cofactor heparin II của fucans
sulfate hóa quá độ tăng lên rõ rệt khi hàm lượng gốc sulfate được tăng lên. (Nishino và
Nagumo, 1992). Qiu và cs. báo cáo rằng fucoidan cho thấy hoạt tính chống đông cao
gấp bốn lần, tăng gấp đôi thời gian prothrombin của huyết tương người được citrate
hóa so với fucoidan thuần khiết. (Qiu và Amarasekara, 2006)
Hoạt tính kháng virus
So với các thuốc kháng virus hiện có, fucoidan dường như có ít độc tính hơn
nên đang được các nhà khoa học đưa vào một số loại thực phẩm chức năng hỗ trợ điều
trị bệnh. (Bo và cs., 2008)
Fucoidan không trực tiếp bất hoạt hoạt động của virus mà ức chế sự hấp phụ
virus để ngăn cản sự hình thành hợp bào (Hemmingson, 2006). Fucoidan được hấp thụ
bằng đường uống có thể cho thấy hiệu quả bảo vệ rõ rệt qua việc ức chế sự nhân lên
của virus và kích thích cả hệ miễn dịch tự nhiên và đặc hiệu. Gốc sulfate cũng rất quan
trọng trong hoạt tính chống virus. Gốc sulfate ở vị trí C – 4 của gốc đường (1→3)–


15

fucopyranosyl cho thấy vai trò quan trọng trong việc chống lại virus Herpes của
fucoidan. (Mandal và cs., 2007)
Họat tính kháng khối u và điều hòa miễn dịch
Ung thư được xem là căn bệnh đáng quan tâm trong đời sống hiện nay. Các
phương pháp điều trị ung thư được biết đến ngày nay như xạ trị, phẫu trị và hóa trị.
Trong đó, các liều thuốc dành cho hóa trị ít nhiều đều gây ra những tác dụng phụ có
hại đến người điều trị như bị nhờn thuốc, gây độc cho các tế bào lành dẫn đến buồn
nôn, rụng tóc, … Do đó, việc tìm thấy một hợp chất thiên nhiên để ức chế các tế bào
khối u thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu hơn cả.

Fucoidan từ một số các loại rong như L. japonica, L. saccharina, L. digitata, F.
serratus, F. distuchus được công bố là có một số các hiệu ứng tích cực trong việc
kháng lại tế bào ung thư như ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan QGY7703, ức
chế sự tăng sinh và kích thích quá trình chết theo chu trình của dòng tế bào HS –
Sultan lympho người (Usui và cs., 1980) (Song và cs., 2000) (Shi và cs., 2000)
Cơ chế của hoạt tính kháng khối u đến nay vẫn chưa được hiểu rõ. Đối với tế
bào ung thư vú MDA – MB – 231, Liu và cs. đã đặt giả thiết về việc fucoidan ức chế
sự bám dính của tế bào lên fibronectin bằng các phương thức khác nhau. (Liu và cs., 2005).
Bên cạnh đó, fucoidan cũng có khả năng tác động lên hệ miễn dịch thông qua
việc kích thích chức năng một số dòng tế bào như tế bào lympho T, tế bào B, đại thực
bào và tế bào giết tự nhiên. Thông qua nhiều con đường, fucoidan có khả năng ngăn
chặn các tế bào ung thư thông qua việc tăng cường hoạt động điều hòa miễn dịch của
cơ thể. (Liu và cs., 2005)
Hoạt tính chống oxi hóa
Rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác động chống oxy hóa rõ rệt của fucoidan
trong các thí nghiệm in vitro. Đây là một chất chống oxy hóa tự nhiên rất tuyệt vời và
nó có khả năng giảm trừ những bệnh gây ra do các gốc tự do.
Fucoidan từ L. japonica có khả năng ngăn cản sự tăng lên của các gốc peroxide
(LPO) trong huyết thanh, gan và thận của chuột bị tiểu đường. Chúng có tác động quét
mạnh mẽ các gốc superoxide, còn đối với gốc hydroxyl thì tác động này dường như


16

yếu hơn (Zhang và cs., 2003). Bên cạnh đó, fucoidan từ F. vesiculosus và fucans
(heterofucans) từ Padina gymnospora có tác động ức chế sự hình thành gốc hydroxyl
và gốc superoxyl. (Micheline và cs., 2007)
Việc sở hữu hoạt tính sinh học này của fucoidan cũng có thể liên quan đến
lượng sulfate trong phân tử hay trọng lượng phân tử fucoidan, tỉ số lượng sulfate/lượng
fucose là một chỉ thị hiệu quả cho những thí nghiệm về hoạt tính chống oxy hóa.

(Wang và cs., 2008)
Hoạt tính giảm lipid máu
Rối loạn lipid máu được xem là có các triệu chứng như tăng cholesterol huyết
tương, tăng trigyceride trong máu và giảm lượng HDL-C. Việc rối loạn lipid máu có
thể dẫn đến hiện tượng lipid đóng mảng trong mạch máu do đó gây nên nhiều hậu quả
như cao huyết áp, tắt nghẽn mạch máu.
Fucoidan từ L. japonica đã được cho thấy là làm giảm lượng cholesterol,
triglyceride và LDL-C, tăng lượng LDL-C trong huyết thanh của chuột có quá nhiều
huyết thanh trong máu (hypercholesterolaemia) và chuột có quá nhiều lipid trong máu
(hyperlipidaemia). (Bo và cs., 2008)
Fucoidan cũng như sialic acid, nó có khả năng làm tăng điện tích âm của bề mặt
tế bào do đó, các cholesterol trong máu sẽ kết tụ lại, vì vậy, lượng cholesterol trong
huyết thanh sẽ giảm. (Bo và cs., 2008)
Tính năng chống bổ thể
Hệ thống bổ thể là thành phần chính trong hoạt động miễn dịch và nó tham gia
chủ yếu vào đáp ứng miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch thể loãng. Nó có thể
cho phép hệ thống miễn dịch tự nhiên liên kết với miễn dịch có điều kiện. Một khi quá
trình này xảy ra vượt mức kiểm soát thì sẽ gây hại cho vật chủ, như trường hợp thiếu
máu hay sốc phản vệ và việc từ chối cấy ghép ngoại lai. (Bo và cs., 2008)
Cấu trúc và đặc tính mang điệm âm của fucoidan cũng giống như heparin.
Heparin kích thích sự sản sinh ra nhân tố phát triển tế bào gan (HGF: hepatocyte
growth factor), nhân tố này là chìa khóa để tái tạo nên mô. Fucoidan và những
oligosaccharides có nguồn gốc fucoidan cũng có khả năng tương tự kích thích sản xuất


17

HGF giống như heparin và oligosaccharides có nguồn gốc từ heparin. Việc cảm ứng
HGF từ heparin hay fucoidan đều xảy ra ở mức sơ cấp, tức là thông qua quá trình dịch
mã, với chung một cơ chế. Fucoidan có thể trở nên hữu ích để bảo vệ mô và cơ quan

khỏi các chấn thương và bệnh tật với chung một cơ chế với heparin. (Fukuta và
Nakamura, 2008)
Ngoài ra, fucoidan còn có một số các đặc tính khác trong điều trị. Người ta đã
đề nghị sử dụng fucoidan để chữa trị bệnh thiếu máu cục bộ bằng phương pháp tạo
mạch. Fucoidan phân tử lớn sẽ bám dính vào yếu tố sinh trưởng như FGFs và từ đó
bảo vệ chúng khỏi bị phân hủy. Bên cạnh đó, fucoidan còn có thể góp phần trong công
tác chữa trị trong việc đặt stent trị hẹp động mạch vành ở người. Một nghiên cứu khác
cho thấy những fucan có khối lượng phân tử thấp sẽ trở nên hiệu quả trong quá trình
cấy ghép tim mạch allograft để chống lại ngăn ngừa tổn thương động mạch và nhu mô
để đáp ứng lại tổn thương do đồng dị miễn dịch. (Alkhatib và cs., 2006)
Hoạt tính kháng viêm
Fucoidan trong 09 loại rong Nâu trong nghiên cứu của Bo Li, 2008 đã có thể ức
chế sự tham gia của bạch cầu vào quá trình viêm của chuột. Người ta nhận thấy rằng
hàm lượng fucose và sulfate cũng như là các cấu trúc khác không ảnh hưởng đến hiệu
quả của fucoidans trong mô hình này. Fucoidan Mekabu có thể có tác dụng trong điều
trị viêm phổi và có thể trở nên hữu ích trong việc điều trị viêm cấp tính. (Bo và cs.,
2008)
Hoạt tính bảo vệ dạ dày
Fucoidan từ Cladosiphon okamuranus Tokida là một cơ chất an toàn với khả
năng bảo vệ dạ dày. Một loại thuốc chống loét dạ dày và ngăn cản sự bám dính của
Helicobacter pyoli có chứa fucoidan như một thành phần tích cực đã được cho ra đời.
Loại thuốc này có thể chữa trị hiệu quá và ngăn cản sự loét dạ dày cũng như niêm mạc
dạ dày, đồng thời, nó cũng có thể ngăn chặn sự bám dính của Helicobacter pyoli lên dạ
dày. (Itsuko và cs., 1995)
Ngoài ra, fucoidan còn một số hoạt tính như hoạt tính chống viêm gan
(fucoidan từ Laminaria sp., Sargassum fulvellum) cũng như hoạt tính chống lại bệnh


18

đường niệu và thận (fucoidan từ F. vesiculosus, L. japonica) đã được nghiên cứu. (Bo
và cs., 2008)
1.2. Giới thiệu về fucoidanases
Theo Dulaux (1898), enzyme có tên là cơ chất hoặc sản phẩm quá trình xúc tác
cắt mạch cộng thêm ase. Như vậy, enzyme cắt mạch fucoidan có tên gọi theo Dulaux
là fucoidanase. (King, 1969)
Năm 1972, King đã căn cứ trên kết quả nghiên cứu của (Natalie và Henry,
1967) đã đưa ra định nghĩa fucoidanase EC 3.2.1.44 là endo enzyme, xúc tác cắt đứt
liên kết 12  – L – fucosidic trong phân tử fucoidan có nhóm sulfate ở vị trí C – 4
(King, 1969). Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu sau năm 1967 cho thấy fucoidan không chỉ
có liên kết 12, mà còn có 13, 14 glycosidic [phần 1.1.2: Cấu trúc]
Năm 2006, nhóm nghiên cứu enzyme của Viện hàn lâm Nga tại Vladivostok đã
đặt tên fucoidanase cho enzyme thủy phân liên kết 13 fucosidic trong fucoidan.
(Kusaykin và cs., 2016)
Năm 2015, Silchenkoa và nhóm nghiên cứu của mình đã đặt tên fucodanase cho
enzyme thủy phân fucoidan có liên kết 14 fucosidic. (Silchenkoa và cs., 2015)
Như vậy, việc định nghĩa và tên gọi enzyme xúc tác thủy phân fucoidan đến
nay cần có sự thay đổi để đồng nhất. Fucoidanase có thể dùng để chỉ enzyme thủy
phân bất kỳ liên kết đường nào trong fucoidan, trở về định nghĩa nguyên thủy ban đầu
theo Dulaux.
Hiện nay, fucoidanase không có hàng thương phẩm. (Kim và Kim, 2008)


19

1.2.1. Khái niệm
Fucoidanases là enzyme có khả năng cắt mạch fucoidan mà không giải phóng
ra nhóm sulfate. Do đó, polysaccharide này vẫn giữ được đặc tính sinh học của mình
nhờ nhóm sulfate. Enzyme này có thể thu được từ những vi khuẩn như Vibrio sp.
(Furukawa và cs., 1992), Alteromonadaceae (Sakai và cs., 2004), Pseudoalteromonas

sp. (Bakunina và cs., 2002) hoặc Flavobacteriaceae (Descamp và cs., 2005) trong các
động vật nhuyễn thể (Kusaykin và cs., 2003; Wu và cs., 2011) và từ nấm như
Dendryphiella arenaria (Wu và cs., 2011).
1.2.2. Nguồn thu fucoidanases
Fucoidanases có thể được thu từ các nguồn khác nhau, từ các vi khuẩn, vi nấm
biển đến các động vật biển.
1.2.2.1. Nguồn thu từ vi sinh vật
Vi sinh vật là một nguồn thu enzyme to lớn và hiệu quả. Các nghiên cứu trước
đây đã tìm ra một số loài vi sinh vật biển (vi nấm, vi khuẩn) có khả năng sinh
fucoidanases. Enzyme thu được từ mỗi loài khác nhau là khác nhau về các đặc tính lý
hóa (pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, cơ chất đặc hiệu, liên kết đặc hiệu,…). Fucoidanases
có thể tồn tại ở ngoại bào hoặc nội bào tùy thuộc vào vi sinh vật.
Có rất ít những công bố về fucoidanases thu được từ nấm biển. Cho đến nay,
chỉ có hai loại fucoidanases từ Dendryphiella arenaria TM94 và Furasium sp. LD8
được phân lập và mô tả cụ thể hoạt tính xúc tác. Về pH tối ưu, pH của enzyme từ nấm
biển cho thấy hoạt tính tốt nhất ở pH 6.0 và nhiệt độ khoảng 50 - 60˚C (Kusaykin và
cs., 2006). Khối lượng phân tử của fucoidanases từ D. arenaria TM94 và Furasium sp.
LD8 lần lượt là 180 kDa và 64kDa (Wu và cs., 2011; Wu và cs., 2011). Fucoidanase từ
D. arenaria TM94 giữ được hoạt tính của mình trong khoảng pH từ 6.0 – 7.0, thời
gian mất đi một nửa hoạt tính là 1 giờ ở 56˚C. Trong khi đó, fucoidanase từ Furasium
sp. LD8 thì nhạy cảm với những thay đổi về nhiệt độ hơn, enzyme mất đi một nửa hoạt
tính trong thời gian 1 giờ ở 50˚C, pH ở 6.0. (Wu và cs., 2011; Wu và cs., 2011)
Fucoidanases thu được từ vi sinh vật biển đa số có pH hoạt động tối ưu ở pH
trung tính hoặc kiềm và chúng đa dạng ở dải nhiệt độ hoạt động (Kusaykin và cs.,
2016). Enzyme từ Vibrio sp. N-5 hoạt động ở 50 - 60˚C, trong khi fucoidanase từ


20

“Fucobacter marina” SA-0082 (Furukawa và cs., 1992) (Takashi và cs., 2010) lại mất

hoạt tính ở 30˚C. Các chủng vi khuẩn cho thấy có sự sinh tổng hợp fucoidanases
thường được phân lập từ các loại rong, trùng biển, hải sâm. (Kusaykin và cs., 2016)
Fucoidanases phân lập được đa số là fucoidanases nội bào. Các enzyme thu được từ ba
chủng vi khuẩn Pseudoalteromonas citrea (KMM 3296, KMM 3297, KMM 3298) xúc
tác thủy phân liên kết α – 13 – glycosydic trong fucoidan từ rong Fucus evanescens
và Laminaria cichorioides (Bakunina và cs., 2002). Trong khi đó Flavobacteriaceae
xúc tác thủy phân liên kết 14 – O – glycosidic trong fucoidan từ rong Nâu Delvetia
canaliculata (Descamp và cs., 2005). Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234 cho ra
enzyme thể hiện là dạng endo- α – L – fucoidanase (Takashi và cs., 2010).
Fucoidanase từ Fucoidanobacter marinus chủng SI-0098 cắt mạch polymer của
fucoidan từ rong Nâu Kjellmaniella crassifolia. (Urvantseva và cs., 2006). Ngoài ra,
cũng vẫn tồn tại fucoidanases ngoại bào thu được từ vi sinh vật biển, điển hình là
fucoidanases từ Alteromonas sp. SN-1009 do nhà khoa học Nhật Bản Sakai phát hiện
năm 2004.
Hiện chưa có công bố về fucoidanases phân lập từ vi sinh vật trên cạn.
1.2.2.2. Nguồn thu từ động vật không xương sống biển
Fucoidanases có thể được thu từ nhiều ngành động vật không xương sống biển
khác nhau, thể hiện ở bảng 2.2
Các enzymes thu được từ động vật không xương sống thường có pH tối ưu là
pH acid, trừ phân tử fucoidanase từ L. sitkana có pH tối ưu là 8.5. Fucoidanases phân
lập từ động vật thân mềm Haliotus sp., Mizuhopecten yessoensis (Patinopecten
yessoensis) và từ cầu gai biển Strongylocentreotus nudus có vùng pH tối ưu là từ 3.5 –
5.5. Fucoidanases từ các động vật không xương sống có nhiệt độ tối ưu trong khoảng
từ 38 – 45˚C và khối lượng phân tử trải dài từ 85 – 200 kDa (Kusaykin và cs., 2016).


21

Bảng 1.2 Hoạt tính fucoidanases ở một số động vật không xương sống
(Cao Thị Thúy Hằng, 2011)

Nguồn thu
Ngành ruột
khoang

COELENTERATA

Lớp san hô

Anthoazoa
Actinia sp.

Hoạt tính
Cơ quan
fucoidanases
tách chiết enzyme
(UI/mg)

Bộ máy tiêu hóa

43

Cnidopulus japonicus

Tất cả các cơ quan

19

Anthopleura orientalis

Tất cả các cơ quan

27

Tialia fellina

Tất cả các cơ quan

38

Tubulamus punctatus

Tất cả các cơ quan

28

Chaetoperus cautus

Tất cả các cơ quan

235

Eudistylial polymorpha

Tất cả các cơ quan

117

Ngành giun đốt

ANNELIDA

Giun nhiều tơ

Polichaeta

80
Sipunculida phascolosoma

Tất cả các cơ quan

NEMERTINI
Nemertini
Collarenemertes bimaculata

Proboscis

105


22

Động vật Chân khớp ARTHROPODA
Động vật giáp xác

Crustacea
Pandalus hypsiuotus

Gan tụy

0

Chiohoecetes
elongates

Gan tụy

0

Tất cả các cơ quan

32

Onchidiopsis sp.

Gan tụy

86

Tritia tratercula

Gan tụy

0

Plicifucus plicatus

Gan tụy

7

Neptunea bulbacea

Gan tụy

2

Neptunea lyrata

Gan tụy

0

Astarte borealis

Gan tụy

33

Lussiovolutopsius sp.

Gan tụy

18

Gan tụy

41

Sợi thủy tinh thể

14

Gan tụy

38

Bộ máy tiêu hóa

0

Bộ máy tiêu hóa

31

Bộ máy tiêu hóa
Bộ máy tiêu hóa

149
159

opilio

Pagurus beringanus
Động vật thân mềm

MOLLUSCA

Vỏ một tấm

Monoplacophora

Thân mềm hai mảnh
Bivalvia
vỏ
Cyclocardia rjabininae
Modiolus difficilus

Động vật da gai
Sao biển giòn
Cầu gai

Sao biển

ECHINODERMATA
Ophiuroidea
Ophiura sarsi
Echinoidea
Strongylocentrotus
pallidus
Asteroidea
Leptosterias arctica
Distolasterias aligans

1.2.3. Cấu trúc
Fucoidanases từ những nguồn thu khác nhau thì có cấu tạo khác nhau dẫn đến
hoạt tính xúc tác khác nhau. Sự khác nhau đó có thể là khác nhau về trật tự, thành phần
của các amino acid trong chuỗi polypeptide; khác nhau về khối lượng phân tử, về cấu


23

trúc không gian. Từ những sự khác nhau đó, fucoidanases trở nên đa dạng về trung
tâm hoạt động, cơ chế xúc tác. Có thể nói rằng, sự khác nhau về cấu trúc trong phân tử
fucoidanases đã dẫn đến những khác nhau về tính chất hóa lí của chúng.
Khối lượng phân tử của fucoidanases từ các chủng vi khuẩn thường khoảng 60
đến 100 kDa (Furukawa và cs., 1992). Trong khi các fucoidanases từ nấm mốc và
động vật không xương sống biển có khối lượng phân tử lớn hơn, thường từ 100 đến
200 kDa. (Furukawa và cs., 1992; Wu và cs., 2011)
Về khối lượng phân tử, fucoidanase từ Fusarium sp. LD8 có khối lượng là 64
kDa; khối lượng này gần tương tự như khối lượng của fucoidanases E1, E2, E3 từ
chủng Vibrio sp. N-5 (lần lượt là 39 kDa, 68 kDa, và 68 kDa), trong khi khối lượng
phân tử của fucoidanase tách từ gan tụy của Patinopecten yessoensis là từ 100–200
kDa và từ Dendryphiella arenaria TM94 là 180 kDa. (Furukawa và cs., 1992; Wu và
cs., 2011)
Về sự ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme thì đối với từng nguồn thu
fucoidanases khác nhau cũng sẽ cho fucoidanases có những điều kiện hoạt động tối ưu
khác nhau. Hoạt tính phân cắt của fucoidanases từ chủng LD8 là tối ưu ở pH 6.0, rất
gần với pH tối ưu cho hoạt động của fucoidanases từ Vibrio sp. N-5 và Dendryphiella
arenaria TM94. Tại pH = 5.0 và 7.0 thì hoạt tính enzyme chỉ còn lại lần lượt là 68.2%
và 86.4% so với tại pH = 6.0. (Furukawa và cs., 1992; Wu và cs., 2011)