Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại

Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010


J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology
Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi
1
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC DÙNG TRONG CHẾ
BIẾN VÀ BẢO QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG
NGHIỆP CHO GIA SÚC NHAI LẠI

Đào Thị Lƣơng, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên,
Dƣơng Văn Hợp
Viện Vi sinh vật và CNSH-Đại học Quốc Gia Hà Nội
Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền
Viện Chăn nuôi

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bảo quản thức ăn cho gia súc ở quy mô
lớn là vấn đề đang được các nhà chăn nuôi
quan tâm. Nó giúp thức ăn cho động vật
không bị hỏng và giữ được dinh dưỡng
trong thời gian dài. Bảo quản thức ăn cho
gia súc bằng phương pháp ủ chua có bổ sung
vi khuẩn lactic dựa vào khả năng ức chế các
vi khuẩn gây thối, gây bệnh của axit lactic
và kháng sinh bacterioxin do chúng sinh ra
là một phương pháp bảo quản được nhiều
quốc gia trên thế giới ứng dụng.
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có
hoạt tính sinh học cao nhằm ứng dụng trong
bảo quản thức ăn gia súc, giúp cho quá trình

lên men hiệu quả hơn. Phân loại bằng sinh
học phân tử kết hợp với các đặc điểm sinh lý
sinh hoá của các chủng vi khuẩn sinh axit
lactic góp phần quan trọng trong việc lựa
chọn ra các chủng có các đặc tính tốt và an
toàn về mặt sinh học.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Nguồn vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập
từ 30 mẫu cỏ, ngô, dưa, cà muối chua, nước
bún.
- Các vi sinh vật kiểm định: Escherichia
coli, Micrococcus luteus, Salmonella typhi,
Shigella flexneri được lữu giữ tại Bảo tàng
giống Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật
và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia
Hà Nội
2.1.2. Môi trường nghiên cứu
- Môi trường MRS thạch (g/l): Glucoza-
20,0; K
2
HPO4-2,0; CaCO
3
-5,0;
CH
3
COONa-5,0; Cao thịt- 10,0; Triamoni
xitrat-2,0; Pepton-10,0; MgSO

4
.7H
2
O- 0,58;
Cao nấm men-5,0; MnSO
4
.4H
2
O- 0,28;
Tween 80- 1 ml; Thạch- 15,0; Nước cất vừa
đủ- 1lít; pH= 6,0; khử trùng 121
o
C/15 phút.
- Môi trường MRS dịch thể (g/l): Có thành
phần như trên ngoại trừ thạch và CaCO
3
.
- Môi trường canh thang nuôi vi sinh vật
kiểm định(g/l): Cao thịt - 3,0; Pepton- 5,0;
NaCl- 1,0; Thạch-15,0; Nước cất vừa đủ-1
lít; pH 7,0; khử trùng 121
o
C/15 phút.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp định tính và định
lượng
- Định lượng axit theo Therner (Emanuel và
cộng sự, 2005)
- Xác định hàm lượng axit lactic bằng sắc ký
lỏng cao áp (Bevilacqua và Califano, 1989)

2.2.2. Phương pháp phân lập và tuyển
chọn vi khuẩn lactic
- Phân lập: Sử dụng phương pháp pha loãng
giới hạn (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự,
1972)
- Tuyển chọn: Xác định khả năng lên men
đồng hình; chịu nhiệt; kháng khuẩn; sinh
bacterioxin; sinh enzyme ngoại bào phân
giải các cơ chất (tinh bột, casein, pectin,
xylan, CMC) và khả năng đối kháng theo
các phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và
cộng sự (1972).
2.2.3. Phương pháp phân loại
- Xác định các đặc điểm sinh lý sinh hoá
(Kozaki et al., 1992)
- Phân loại dựa trên giải trình tự ADNr 16S
Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010


J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology
Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi
2
Xác định trình tự ADNr 16S của các
chủng vi khuẩn theo phương pháp của
Sakiyama và cộng sự (2009). Sản phẩm
PCR được tinh sạch và xác định trình tự trên
máy đọc trình tự tự động (ABI
PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer-
Mỹ). Kết quả đọc trình tự được xử lý trên
phần mềm Clustal X của Thompson và cộng

sự, 1997. Các trình tự được so sánh với trình
tự ADNr 16S của các loài đã công bố từ dữ
liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát
sinh được xây dựng theo Kimura (1980), sử
dụng phương pháp của Saitou và Nei
(1987); phân tích Bootstrap (Felsenstein,
1985) được thực hiện từ 1000 lần lặp lại
ngẫu nhiên.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi
khuẩn lactic lên men đồng hình
3.1.1. Phân lập vi khuẩn sinh axit
Từ 30 nguồn cỏ, ngô, nước dưa cà,
nước bún, 134 chủng vi khuẩn đã được phân
lập và tinh sạch trên môi trường MRS, sau 2
ngày ở nhiệt độ 30
o
C.
3.1.2. Tuyển chọn các vi khuẩn lactic
- Xác định khả năng sinh axit lên men đồng
hình của các vi khuẩn phân lập
Các chủng phân lập được nuôi trên môi
trường MRS dịch thể có đặt ống Durham.
Sau 3 ngày nuôi cấy, trong số 134 chủng
phân lập có 131 chủng không sinh khí trong
ống Durham là lên men đồng hình.
- Xác định khả năng chịu nhiệt của các vi
khuẩn sinh axit
Các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống
khởi động phải có khả năng sinh trưởng

được ở nhiệt độ cao, vì nhiệt độ thường tăng
trong quá trình ủ chua thức ăn, và sinh
trưởng được ở nhiệt độ trong dạ cỏ của động
vật. Dựa vào tiêu chí này, 131 chủng lên
men đồng hình được nuôi trên môi trường
MRS ở 37
o
C và đã lựa chọn được 70 chủng
có khả năng phát triển tốt tại nhiệt độ này
dùng cho nghiên cứu tiếp theo.
- Xác định khả năng sản sinh axit của các vi
khuẩn sinh axit
Bảy mươi chủng vi khuẩn sinh axit chịu
nhiệt được nuôi trên môi trường MRS dịch
thể trong 48 giờ, hàm lượng axit tổng số của
dịch nuôi cấy được xác định. Kết quả cho
thấy 18 chủng có khả năng sinh axit cao từ
20-21 mg/ml, 43 chủng sinh axit từ 15-19
mg/ml và 9 chủng còn lại có hàm lượng axit
từ 8-14 mg/ml.
- Xác định khả năng sản sinh axit lactic và
kháng khuẩn của dịch nuôi vi khuẩn
Để xác định khả năng sinh axit lactic của
18 chủng có hàm lượng axit cao, dịch nuôi
cấy của các chủng này được định lượng axit
lactic trên thiết bị sắc ký lỏng cao áp, đồng
thời cũng xác định khả năng kháng một số
vi khuẩn gây bệnh trên dịch này. Kết quả
thu được cho thấy hàm lượng axit lactic do
các chủng sinh ra tương đối đồng đều, trải

dài trong khoảng từ 15,3 đến 21 mg/ml dịch
nuôi. Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm
định của dịch nuôi vi khuẩn cũng rất mạnh.
Kích thước vòng kháng (D-d) của dịch nuôi
các chủng đối với E. coli từ 20-30 mm, M.
luteus từ 14-20 mm, Salmonella typhi từ 20-
34 mm và Shigella flexneri 10-34 mm.
Khả năng sinh bacterioxin của dịch nuôi
các chủng nghiên cứu cũng được xác định.
Dịch nuôi được trung hòa về pH-6 và được
kiểm tra khả năng kháng với vi khuẩn kiểm
định. Kết quả chỉ rõ cả 18 chủng đều có khả
năng sinh bacterioxin kháng lại các vi khuẩn
kiểm định. Kích thước vòng kháng (D-d) đối
với E. coli từ 8-12 mm, M. luteus từ 2-6
mm, Salmonella typhi từ 3-6 mm và Shigella
flexneri 10-12 mm.
Từ các kết quả trên, 8 chủng vi khuẩn
(2-9; 2-10; 3-5; 3-10; 4-4, 8-10; 9-17 và
L10) có hoạt tính cao và là các chủng đại
diện cho các mẫu khác nhau sẽ được kiểm
tra một số đặc tính sinh học và tiến hành
phân loại.
- Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các
chủng lựa chọn
Tám chủng lựa chọn được nuôi trên môi
trường MRS trong 3 ngày ở nhiệt độ 37
o
C,
hoạt tính enzyme ngoại bào của dịch nuôi

cấy được xác định bằng phương pháp
khuếch tán trên thạch có chứa các cơ chất.
Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010


J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology
Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi
3
Khả năng sinh enzyme được đánh giá qua vòng phân giải cơ chất.
Bảng 1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải cơ chất của dịch nuôi vi khuẩn

STT
Ký hiệu
chủng
Hoạt tính enzym (D-d, mm)
Amylase CMC-ase Pectinase Protease Xylanase
1. 1 2-9 9 12 8 8 13
2. 2 2-10 7 10 0 0 12
3. 3 3-5 8 10 11 5 11
4. 4 3-10 9 8 3 7 10
5. 5 4-14 9 10 9 6 10
6. 6 8-10 7 9 0 8 12
7. 7 9-17 13 11 6 12 13
8 L01 0 0 0 0 0
Chú thích: D-Đường kính vòng phân giải, d- Đường kính lỗ khoan (5 mm)
Kết quả bảng trên cho thấy 7 chủng
nghiên cứu đều có khả năng sinh các enzym
ngoại bào phân giải các cơ chất (trừ chủng
L01). Như vậy, ngoài khả năng sinh axit
cao, các chủng nghiên cứu còn có khả năng

sinh enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất
có trong thành phần ủ thức ăn chăn nuôi.
- Xác định khả năng đối kháng giữa các
chủng lựa chọn
Tám chủng nghiên cứu được nuôi trên
môi trường MRS bằng phương pháp cấy
vạch tiếp xúc giữa các chủng với nhau. Sau
3 ngày, ở nhiệt độ 37
o
C, ở tất cả các mẫu
đều sinh trưởng tốt. Kết quả này cho thấy 8
chủng không đối kháng nhau và hoàn toàn
có thể được sử dụng kết hợp với nhau trong
quá trình lên men chế biến thức ăn gia súc.
3.2. Phân loại các chủng đƣợc tuyển chọn
3.2.1. Xác định trình tự 16S ADNr và xây
dựng cây phân loại
ADN hệ gen của 8 chủng nghiên cứu
được tách chiết. Đoạn gen mã cho ARNr
16S được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử
dụng cặp mồi phổ biến 27F và 1525R, sau
đó được tinh sạch và dùng làm khuôn trong
phản ứng đọc trình tự với các mồi xuôi và
mồi ngược. Kết quả đọc trình tự được xử lý
bằng phần mềm Clustal X và so sánh với dữ
liệu của DDBJ, EMBL, GenBank bằng công
cụ Blast Search để xác định đến tên loài.
Trình tự ADNr 16S của 8 chủng nghiên
cứu được xác định. Cây phả hệ được xây
dựng dựa trên trình tự ADNr 16S từ 1400 bp

của các chủng nghiên cứu với các loài gần
gũi nhất với các loài đó biết thuộc các chi
Enterococcus và Lactobacillus. Pediococcus
acidilactici được sử dụng làm nhóm ngoài.
Quan sát trên cây phả hệ, có 7 chủng
nghiên cứu nằm cùng vị trí với các loài của
nhóm Lactobacillus plantarum
(Lactobacillus pentosus, Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus paraplantarum);
chủng L01 tạo nhánh khác cùng vị trí với
Enterococcus lactis (hình 1). So sánh trình
tự ADNr 16S của các chủng nghiên cứu với
các chủng chuẩn của các loài đã biết cho
thấy: 7 chủng 2-9, 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4
và 9-17 có mức tương đồng 99,7-100 % với
các loài của nhóm Lactobacillus plantarum;
chủng L01 có mức tương đồng 99,9 % với
Enterococcus lactis.

Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010


J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology
Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi
4

Hình 1. Vị trí phân loại của các chủng nghiên cứu với các loài có quan hệ họ hàng gần

3.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá
của các chủng vi khuẩn

Qua nghiên cứu các đặc điểm hình thái,
sinh lý và sinh hoá của 8 chủng vi khuẩn
cho thấy tất cả 08 chủng này đều thuộc
nhóm vi khuẩn Gram dương, phản ứng
catalaza âm tính, không có khả năng di
động, lên men đồng hình, có khả năng đông
tụ sữa, sinh trưởng ở pH 4-8,5; nhiệt độ 20-
40
o
C và nồng độ muối 0-8%. Hình thái tế
bào có 2 dạng: hình que (chủng 2-9, 2-10, 3-
5, 3-10, 4-14, 8-4 và 9-17) và hình cầu
(chủng L01). Các chủng có khả năng lên
men và tạo axit từ các nguồn cacbon:
glucose, L-arabinose, D-fructose, galactose
(trừ chủng 4-14), D-lactose (trừ chủng 8-
10), maltose, D-mannitol, D-raffinose (trừ
chủng 4-14), D-ribose, sucrose, D-sorbitol,
và trehalose (trừ chủng 4-14 và 8-10). Sáu
trong số các chủng nghiên cứu không lên
men từ các nguồn glycerol và D-xylose (trừ
chủng 2-9 và L01).
Chưa thể kết luận được 7 chủng nghiên
cứu có tế bào hình que thuộc chính xác loài
nào nếu chỉ dựa trên trình tự gen 16S rRNA
vì chúng có độ tương đồng là 99.7% -100%
so với các loài thuộc nhóm Lactobacillus
plantarum. Tuy nhiên, theo một số nghiên
cứu trước đây, L. pentosus thường lên men
glycerol và xylose trong khi L. plantarum và

L. paraplantarum không lên men các nguồn
này (Kandler & Weiss, 1986; Zanoni và
cộng sự, 1987; Swezey và cộng sự, 2000;
Bringel và cộng sự, 1996; Curk và cộng sự,
1996). Khác với L. plantarum, L.
paraplantarum thường không đồng hóa
arabinose và sorbitol (Curk và cộng sự,
Pediococcus acidilactici_ EF059987
Lactobacillus brevis_M58810
Lactobacillus acidifarinae_AJ632158
Lactobacillus parabuchneri_AB205056
100
Lactobacillus malefermentans_AM113783
54
Lactobacillus versmoldensis_AJ496791
Lactobacillus vaccinostercus_AJ621556
Lactobacillus paraplantarum_AJ306297
3-10
Lactobacillus plantarum_AJ965482
Lactobacillus pentosus_D79211
64
4-14
9-17
2-9
3-5
8-10
56
2-10
75
63

72
66
72
62
100
53
Enterococcus lactis_DQ255948
L01
Enterococcus faecium_AJ301830
86
Enterococcus durans_AJ276354
Enterococcus hirae_Y17302
94
64
Enterococcus mundtii_AF061013
82
Enterococcus pseudoavium_ AF061002
98
Enterococcus gallinarum_ AF039900
Enterococcus faecalis_AB012212
54
56
52
100
55
0.02
Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010


J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology

Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi
5
1996). Kết hợp các đặc điểm sinh học phân
tử và đặc điểm sinh lý, sinh hoá có thể xếp
chủng 2-9 thuộc loài Lactobacillus pentosus.
Các chủng 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4, 9-17
thuộc loài Lactobacillus plantarum. Chủng
L01 có tế bào hình cầu, có các đặc điểm
thuộc loài Enterococcus lactis.











Hình 2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng 2-9 nuôi 2 ngày trên môi trường MRS

Các chủng được lựa chọn đều là những
chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh
và được sử dụng rất phổ biến trong các chế
phẩm probiotic. Đây là các chủng nằm trong
danh sách các loài vi sinh vật được AAFCO
(American Feed Control Officials) Mỹ cho
phép sử dụng trong chế biến thức ăn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợn,
Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch,
Phạm Văn Ty (1976), Một số phương
pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2,
Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
Bevilacqua A.E., Califano A.N. (1989).
Determination of organic acids in dairy
products by high performance liquid
chromatography. J. Food Sci. 54: 1076-
1079 (1989).
Bringel, F., Curk, M. C. & Hubert, J. C.
(1996). Characterization of lactobacilli by
Southern-type hybridization with a
Lactobacillus plantarum pyrDFE probe.
Int J Syst Bacteriol 46: 588–594.
Curk M.C., Hubert J.C. & Bringel F.
(1996). Lactobacillus paraplantarum sp.
nov., a new species related to
Lactobacillus plantarum. Int J Syst
Bacteriol 46: 595–598.
Emanuel, V., Adrian, V., Ovidiu, P.,
Gheorghe, C. (2005). Isolation of a
Lactobacillus plantarum strain used for
obtaining a product for the preservation of
fodders. African Journal of Biotechnology
4(5): 403-408.
Felsenstein J. (1985). Confidence limits on
phylogenies: an approach using the
bootstrap. Evolution 39: 783-791

Kandler O. & Weiss N. (1986). Regular,
nonsporing Gram-positive rods. In
Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology, vol. 2, pp. 1208–1234.
Edited by P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M.
E. Sharpe & J. G. Holt. Baltimore:
Williams & Wilkins.
Kimura M. (1980). A simple method for
estimating evolutionary rate of base
substitutions through comparative studies
of nucleotide sequences. J Mol Evol 16:
111-120.
Kozaki M., Uchimura T. & Okada S.
(1992). Experimental manual of lactic acid
bacteria. Asakurasyoten, Tokyo, Japan.
Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-
joining method: a new method for
reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol
Evol 4: 406-425.