Định lượng Paraquat bằng phương pháp sắc ký lỏng, W14, E45

TUYỂN TẬP BÀI TẬP PHỔ THÔNG, ĐẠI HỌC, SAU ĐẠI HỌC
LUẬN ÁN-ĐỒ ÁN-LUẬN VĂN-KHOÁ LUẬN-TIỂU LUẬN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT
TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO


DANH SÁCH BẢNG BIỂU


DANH SÁCH HÌNH
Chương 1.
Chương 3.


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
% RSD
% RSDR
ACN
AS
ATP
BN
DAD
DQ
EPQ
GC - MS
HP

HPLC
LC - MS
LOD
LOQ
MeOH
ppm
PQ
R
ROC
RP-HPLC
SD
SIPP
TCA
tR
UV-VIS

Tên tiếng anh
% Relative standard deviation
% Reproducibility standard

Tên Tiếng việt
% Độ lệch chuẩn tương đối
% Độ lệch chuẩn tái lặp

deviation
Acetonitrile
Asymmetry factor
Adenosin Triphophate
Patient
diode-array detector

Diquat
Ethylparaquat
Gas chromatography - Mass

tương đối
Acetonitril
Hệ số đối xứng pic
Adenosin Triphophat
Bệnh nhân
detector mảng diode
Diquat
Ethylparaquat

spectroscopy
Hemoperfusion
High performance liquid
Chromatography
Liquid Chromatography - Mass
Spectroscopy
Limit of Detection
Limit of Quantification
Methanol
Parts per million
Paraquat
Relative coefficient
Receiver operating characteristics
Reverse phase-HPLC
Standard deviation
Severity Index of Paraquat
Poisoning

Trichloroacetic acid
Retention time
Ultraviolet-Visible

Sắc ký khí khối phổ
Lọc máu hấp phụ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng khối phổ
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Methanol
Phần triệu
Paraquat
Hệ số tương quan
Đường cong ROC
Sắc ký lỏng pha đảo
Độ lệch chuẩn
Chỉ số độ nặng của ngộ độc
Paraquat
Acid Tricloacetic
Thời gian lưu
Tử ngoại và khả kiến


ĐẶT VẤN ĐỀ
Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ giá thành rẻ,
hiệu quả diệt cỏ dại nhanh chóng, ít ảnh hưởng tới môi trường do đóhiện đang được sử
dụng rộng rãi ở Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau. Tuy nhiên, paraquat (PQ)
lại là một chất hóa học vô cùng độc với người. Liều tử vong của PQ ước tính là khoảng 10 ml
dung dịch 20%. Tại nhiều nước phát triển, PQ đã bị cấm sử dụng nhưng ở Việt Nam việc

thiếu các chính sách và biện pháp quản lý sử dụng hóa chất này nên trong những năm vừa qua
có rất nhiều trường hợp ngộ độc PQ đến cấp cứu [1]. Trên thế giới, nhiều ca tử vong do ngộ
độc PQ đã được báo cáo [10][19][27]. Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong
những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một
vấn nạn vô cùng nghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca trong năm 2013 và năm 2014 lên tới 391
ca. Tỉ lệ tử vong do ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80% theo nhiều nghiên cứu của
các tác giả nước ngoài [29][32]. Tại Trung tâm chống độc (TTCĐ) bệnh viện Bạch Mai, tỉ lệ
tử vong năm 2007 là 72,5% [4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu tại bệnh viện Chợ Rẫy
thành phố Hồ Chí Minh là 85%.
Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ trong
huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc,
tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị, đặc biệt là
lọc máu hấp phụ. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếu các biện pháp điều trị
hiệu quả. Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác giả nước ngoài và một số tác giả Việt
Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọc máu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc
cột resin nhằm tăng cường đào thải PQ cho kết quả khả quan, cứu sống một số không nhỏ
bệnh nhân ngộ độc cấp PQ. Xét nghiệm định lượng nồng độPQ huyết tương cung cấp
công cụ quan trọng để đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này.
Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng ở mức độ định
tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc PQ mà
chưa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độPQ máu với kết
quả đáng tin cậy. Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn đoán, tiên lượng
cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu làm cho việc điều trị ngộ độc PQ
tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên cả nước gặp rất nhiều khó
khăn.


Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phương pháp sắc
ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)... Tại
Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng

cao để xét nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình chuẩn định lượng PQ huyết
tương. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu định lượng Paraquat
trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai
mục tiêu:
1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và
phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat.
2. Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong
huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch
Mai, Hà Nội.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về paraquat
1.1.1. Công thức paraquat
Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'dimethyl-4,4' bipyridilium là thuốc diệt cỏ phổ biến nhất hiện nay do đặc tính diệt cỏ
nhanh và triệt để. PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium, được tổng
hợp đầu tiên vào năm 1882, ứng dụng trong nông nghiệp làm thuốc trừ cỏ từ những
năm 1950 [42].
PQ có khối lượng phân tử tương đối 186,2 có công thức hóa học như hình 1.1:

Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat
1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat
PQ thường có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20 oC là 1,240 - 1,260,
điểm chảy 175 - 180oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ trong nước 6,5 7,5.
PQ thường ở dạng dimethylsulphate hoặc dichloride. Dạng dichloride tinh thể
trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa. PQ ổn định trong dung dịch môi trường acid hoặc
trung tính và không ổn định trong môi trường kiềm.
PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20 oC), ít tan trong cồn và hầu như không
tan trong các dung môi hữu cơ khác.
PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề mặt

anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc vớiđất. PQ không bay hơi.
Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [43].
PQ được sản xuất bởi nhiều công ty khác nhau với các tên thương mại và hàm
lượng khác nhau, nói chung thường đều ở dạng dung dịch màu xanh. Một số tên gọi
thường gặp của PQ như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone, Owen... [42].
Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các nước phát triển đều đã cấm sử


dụng PQ như là một loại hóa chất bảo vệ thực vật (Mỹ và các nước Châu Âu). Một số
nước như Nhật Bản chỉ cho phép lưu hành PQ dạng dung dịch với hàm lượng thấp 4,5%
sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ nếu bị ngộ độc. Thực tế hiện nay trên thế giới vẫn có gần 130
nước cho phép sử dụng PQ trong đó có Việt Nam [42]. Hiện ở Việt Nam thuốc từ cỏ PQ
được lưu hành dạng dung dịch 20% do đó nguy cơ ngộ độc cấp tính rất lớn.
Một điều đáng nói là công ty sản xuất PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là
Syngenta hay còn gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc và Anh. Trên đất nước họ đã
cấm hoàn toàn PQ, hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nước thứ ba [39].
1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat
Cơ chế gấy độc của PQ được mô tả theo sơ đồ sau [37]:

Hình 1.2. Cơ chế gây độc của paraquat [15]
Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ 2+ cùng với NADPH trải qua một
phản ứng tạo ra ion paraquat bị khử (PQ+) và NADP+. PQ+ phản ứng hầu như ngay lập tức
với oxy tái tạo lại PQ2+ và gốc superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu trình oxy hoá - khử
của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và không ngừng tạo ra gốc
superoxid. Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bản thân nó để tạo ra peroxid hydro
(H2O2), và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự do hydroxyl [18] [31]. Cạn kiệt NADPH
dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy hoá - khử tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ
chế làm tổn thương tế bào: phản ứng với lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA
và các protein tối cần thiết cho tế bào sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy
[12] [39] [40].

Hậu quả lên tế bào do việc hình thành các gốc tự do (superoxid và các gốc tự do
khác) là đối tượng của rất nhiều nghiên cứu. Các thử nghiệm điều trị nhằm vào việc thay
đổi các gốc tự do bằng các chất như desferioxamin, superoxid dismutase, α-tocopherol và
vitamin C cùng với bài niệu cưỡng bức. Tuy nhiên, cho đến hiện nay không có chất nào
trong số này được khuyến cáo dùng.
Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các gốc tự do do PQ sinh ra vẫn chưa
được biết nhưng những gì người ta đã biết về cơ sở để ngộ độc là sự tương tác giữa PQ,
NADPH và oxy. Sau đó, ở mức độ tế bào, oxy là yếu tố tối cần thiết cho việc hình thành
bệnh lý do PQ. Đây là cơ sở cho việc hạn chế cung cấp oxy trong việc điều trị ban đầu
bệnh nhân ngộ độc PQ.
PQ có tính ăn mòn và gây tổn thương giống như kiềm khi tiếp xúc với da, mắt và
các niêm mạc. Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc toàn thân PQ là đường tiêu hoá,
thận và phổi. Dạ dày, ruột bị tổn thương nặng nề do tác dụng ăn mòn trực tiếp khi bệnh
nhân uống PQ có chủ ý với nồng độ cao. Thận là cơ quan đào thải PQ và DQ và có nồng
độ bipyridyl cao hơn so với các cơ quan khác. Riêng ở phổi, PQ vào các phế bào týp I và
II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc
ATP.
Do vậy PQ gây tổn thương hầu hết tất cả các cơ quan trong cơ thể vì đều có liên
quan đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ hoặc liên
quan đến thải trừ PQ thì tổn thương đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là nguyên nhân hàng
đầu gây tử vong như tổn thương phổi gây suy hô hấp, suy thận, viêm gan, loét niêm mạc
đường tiêu hóa và biến chứng nhiễm trùng [6][13][37]. Việc tiếp xúc với lượng PQ ít hơn
sẽ làm chậm nguy cơ tử vong do xơ phổi tiến triển và suy thận [33]. Một số nghiên cứu
gần đây còn cho thấy phơi nhiễm PQ có liên quan với hội chứng Parkinson [21][23].
Trong ngộ độc cấp PQ, có thể tiên lượng bệnh dựa trên nồng độ PQ trong huyết
tương. Một số báo cáo cho thấy nồng độ PQ huyết tương vượt qua 2 µg/ml thì hầu hết tử
vong, tuy nhiên một vài trường hợp bệnh nhân vẫn hồi phục khi nồng độ trong máu cao
hơn 2 µg/ml[7][10][22].

1.1.4. Dược động học paraquat
1.1.4.1. Hấp thu
Ở đường tiêu hoá PQ được hấp thu rất nhanh nhưng ít (5-10%). Hấp thu chủ yếu ở
ruột non. Khi dạ dày ruột bị tổn thương lan rộng, số lượng chất độc được hấp thu sẽ tăng


lên. PQ không gắn với protein huyết tương. Nồng độ đỉnh của PQ trong huyết tương đạt
được trong vòng 2 giờ sau uống [6] [37]. Tiếp xúc qua da, hấp thu vào cơ thể nói chung
chỉ xảy ra khi tiếp xúc kéo dài hoặc da bị tổn thương. Tiếp xúc với PQ qua đường hô hấp
không làm cho lượng PQ được hấp thu đến mức đủ để gây nhiễm độc. Bởi vì kích thước
các hạt chứa PQ lớn (hầu hết trên 100 µm) làm cho PQ không đi sâu được xuống đường
hô hấp để hấp thu [11]. Mắt tiếp xúc với PQ sẽ bị tổn thương, nhưng không đủ để gây
nhiễm độc toàn thân.
1.1.4.2. Phân bố
Sau khi uống, PQ phân bố nhanh chóng nhất tới tất cả các cơ quan chính như phổi,
thận, gan và cơ, đặc biệt là phổi, PQ sẽ bị khử thành dạng gốc tự do hoạt tính cao [8][22].
Thể tích phân bố của PQ là 1,2 - 1,6 l/kg.
PQ đạt được nồng độ cao và tồn tại lâu hơn trong phổi, nồng độ trong phổi có thể
cao hơn so với nồng độ huyết tương gấp 50 lần. Sau uống 5-7 giờ, nồng độ PQ trong tổ
chức phổi đạt cao nhất. Tuy nhiên, lượng PQ huyết tương cũng cần đạt đến một ngưỡng
tới hạn để cho quá trình hấp thu ở phổi diễn ra [11].
PQ qua được nhau thai. Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch ối và máu
dây rốn, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 4-6 lần [11]. Không có bào thai nào sống
sót. Tuy nhiên nếu mẹ ngộ độc PQ còn sống thì đến lần có thai sau không nguy hiểm đến
bào thai.
1.1.4.3. Chuyển hoá, thải trừ
PQ được đào thải hầu như hoàn toàn qua thận nhờ cả quá trình lọc của cầu thận và
quá trình bài tiết tích cực của ống thận. Trong vòng 12-24 giờ sau uống, trên 90% PQ
được đào thải dưới dạng không đổi qua thận, nếu chức năng thận bình thường [11].Tuy
nhiên có thể xét nghiệm thấy PQ trong nước tiểu vài ngày sau do có sự tái phân bố PQ từ

các cơ quan. Thời gian bán thải của PQ có thể kéo dài 12-120 giờ hoặc lâu hơn khi có suy
thận. Ngoài ra PQ còn đào thải qua phân dưới dạng không đổi [8][22].
1.1.5. Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương.
Tiên lượng bệnh nhân uống PQ có thể dựa vào nồng độ PQ huyết tương theo thời
gian. Nồng độ PQ phải đo trước khi điều trị vì các biện pháp điều trị có thể làm giảm
nồng độ PQ (dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…). Proudfoot và cộng sự [29] lần đầu tiên
trình bày biểu đồ tiên lượng khả năng sống từ kết quả định lượng nồng độ PQ huyết tương
tại nhiều thời điểm khác nhau trên 79 bệnh nhân. Những BN sống có nồng độ dưới 2,0;


0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/l tương ứng ở 4, 6, 10, 16, và 24 giờ sau uống PQ. Schermann và
cộng sự [35]mở rộng đường cong tiên lượng BN này lên đến ngày thứ 7 sau nhiễm độc,
và nghiên cứu này cho thấy những BN nồng độ PQ huyết tương trên 10 mg/l (định lượng
trong vòng 8 giờ), thường chết vì sốc tim trong 24h, trong khi những BN có nồng độ thấp
hơn (nhưng vẫn trên đường tiên lượng), chết vì xơ phổi và suy hô hấp muộn hơn 24 giờ
sau uống. Suzuki và cộng sự (1991) [36]đã kết hợp dữ liệu của Proudfoot (1979),
Bismuth (1982), Scherrmann (1987), Sawada (1988) và thêm một nhóm 78 BN, kết luận
rằng đồ thị tiên lượng chính xác 101 trong 102 trường hợp tử vong và 61 trong 63 BN
sống được đánh giá trong vòng 24 h sau uống PQ. Mặc dù đồ thị khá chính xác, giúp xác
định mức độ nặng và tiên lượng tử vong nếu định lượng được PQ ngay lập tức, đồ thị này
cũng đôi khi tiên đoán sai. Nguyên nhân do ước tính thời gian từ khi uống PQ dễ sai, đặc
biệt trong vài giờ đầu tiên nồng độ PQ huyết tương giảm nhanh sai số về thời gian thậm
chí 0,5 đến 1h có thể thay đổi hoàn toàn mối quan hệ nồng độ và tiên lượng. Ngoài ra,
nồng độ PQ trong huyết tương có thể không hoàn toàn chính xác vì được phân tích bằng
một số phương pháp khác nhau và các nghiên cứu thường không trình bày rõ nồng độ của
ion hay là muối PQ, và thực tế có thể có khác biệt giữa các bệnh nhân về mức độ nhạy
cảm với tác dụng độc của PQ, tuy khác biệt này chưa được nghiên cứu.

Hình 1.3: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tương (µg/ml), thời gian sau
uống, và khả năng sống.

Năm 1988Sawada và cộng sự[34] báo cáo chỉ số tiên lượngngộ độc PQ dựa trên
nghiên cứu nồng độ PQ huyết thanh ở 30 bệnh nhân, 20 tử vong và 10 BN sống.Chỉ số độ
nặng của ngộ độc PQ (SIPP: severity index of PQ poisoning) tính bằng thời gian từ khi


uống (giờ) cho đến khi bắt đầu điều trịnhân với nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml) khi vào
viện.
SIPP = [nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)]× [thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị(h)]
Khi điểm SIPP ít hơn 10, bệnh nhân có thể sống sót; điểm 50 phân biệt tử vong
muộn do suy hô hấp (10 dù đây là nghiên cứu quan trọng, Sawada xét nghiệm định lượng dùng huyết thanh
không phải huyết tương. Suzuki và cộng sự (1991) đã so sánh SIPP với đồ thị tiên
lượng sống trên 167 BN nhập viện trong vòng 24 h sau uống PQ. Các kết cục của BN
dự đoán theo đồ thị của Proudfoot đã sai ở 1 trường hợp tử vong và 2 BN sống; trong
khi đó, SIPP sai ở 1 BN sống và 10 trường hợp tử vong. Những khác biệt này có ý
nghĩa thống kê, và tác giả kết luận rằng dựa trênnồng độPQtrong24h đầusau uống, đồ
thị của Proudfoot tiên lượng chính xác hơn SIPP [36].
1.2. Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương
1.2.1. Phương pháp quang phổ
Rai M.K và cộng sự [30] định lượng PQsử dụng NaBH4 để khử PQ trong môi
trường kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 600nm trong khi
Kato K. và cộng sự [20]lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester (TBPE) phản
ứng với PQ để tạo ra dung dịch hữu cơ PQ-TBPE màu xanh da trời, có thể chiết được
bằng dichloromethane. Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định lượng PQ trong huyết tương
dựa bằng đo quang phổ của dẫn xuất khi phản ứng với Na2S2O4 10% và NaOH 5M.
Ưu điểm của phương pháp khử PQ bằng NaBH4là độ nhạy cao, với các điều kiện
khử PQ là nhiệt độ 35-40°C, pH 10-11 thì màu có độ ổn định lên đến 12hvà không cần
đệm để ổn định màu, khoảng nồng độ 0,05 - 0,5 µg/ml tuân theo định luật Lambert –
Beer, trong khi giới hạn phát hiện là 0,03 µg/ml. Trong khi đó, phương pháp sử dụng
TBPE thì mẫu được phép để tối đa trong 20 phút. Cả 2 phương pháp này đều đề cập đến

DQ, trong khi Rai M.K [30]loại bỏ DQ thì Kato K. [20] lại định lượng đồng thời cả PQ và
DQ.
Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã loại được sự ảnh hưởng của các thuốc
trừ sâu thông thường và các ion kim loại khác. DQ, có cấu trúc gần giống PQ, sẽ gây ảnh
hưởng khi định lượng PQ. Tuy nhiên DQ, nếu có, sẽ bị loại khi thêm NaOH 0,2 N, trong
khi PQ không bị mất đi. Các ion kim loại như Fe3+ và Al3+, có thể ảnh hưởng do làm kết
tủa hydroxide, sẽ bị loại đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5% trước khi thêm dung dịch


NaOH [30]. Còn theo Kato K[20], DQ cũng có thể chiết được với TBPE trong
dichloromethane cũng giống như PQ nhưng PQ-TBPE có quang phổ hấp thụ hơi khác với
DQ-TBPE. Đo độ hấp phụ của PQ ở bước sóng 603 nm & DQ ở bước sóng 608 nm với
dãy nồng độ (4,5 - 45,0)×10-7 M. Giới hạn phát hiện 4,77.10-7 M.
Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH 4 đã được ứng dụng để định lượng PQ
trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân như máu, nước tiểu, sữa mẹ cũng như các mẫu thực
phẩm và các mẫu trong môi trường.
Với phương pháp đo quang phổ thông thường, không phát hiện được PQ tại bước
sóng 257 nm. Nên Chang-bin Li và cộng sự[24] đã định lượng nồng độ PQ trong huyết
tương dựa trên việc đo quang phổ dẫn xuất thứ 2 (tuân theo định luật Lambert Beer với
r=0,996). Dung dịch nước chuẩn PQ 10 μg/ml được quét bước sóng từ 200 đến 300 nm,
với mẫu trắng là nước cất. Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50
và 10 μg/ml được thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1, v/v). Lắc xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong
5 phút. Lấy dịch trong phần trên đi đo quét bước sóng từ 200 đến 300 nm. Sau khi xử lý
mẫu như trên, dịch trong phần trên được chuyển vào ống Eppendorf mới, bảo quản tránh
ánh sáng. Trước khi đo, 400 μl mẫu được lắc trộn nhẹ nhàng và hoàn toàn với 100 μl hỗn
hợp đồng thể tích Na2S2O4 10% và NaOH 5M. Làm tương tự với mẫu huyết tương trắng
đối chiếu và đo độ hấp thụ quang trong khoảng bước sóng từ 300 đến 500 nm (khoảng
bước sóng Δλ=0,5 nm). Từ đó dẫn xuất thứ 2 này có thể được tính toán theo công thức
Δ2Abs/(Δλ)2 (khoảng bước sóng dẫn xuất Δλ=4 nm) [24].
1.2.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ

Phương pháp GC-MS là phương pháp đơn giản có độ nhạy và độ tin cậy cao, từ
lâu đã được sử dụng để định lượng PQ trong dịch sinh học. L. Gao [16] và Almeida R. M.
[5] cùng sử dụng phương pháp GC-MS để định lượng PQ. Trong cả hai nghiên cứu, các
tác giả đã sử dụng hệ thống chọn lọc ion (selected ion monitoring – SIM)để nhận biết PQ,
đồng thời cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn, khí He được dùng như là khí mang để đưa
chất phân tích vào cột. Dung dịch mẫu phân tích đều được khử bằng NaBH 4 trước khi
đem phân tích trên hệ sắc ký khí. Tuy nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân
tích khác nhau.
Tác giả L. Gao và cộng sự [16] lại sử dụng cột mao quản (10m 0,18 mm, độ dày
màng 0,25 µm). Nhiệt độ của bơm tiêm, interface và nguồn ion lần lượt là 280, 280,
200oC. Khí mang được bơm đẳng dòng với tốc độ là 1,01 ml/phút. Mẫu được đưa vào


bằng chế độ tiêm chia dòng (10:1) và nhiệt độ giải hấp phụ lúc đầu là 70 oC trong 1 phút
và tăng đến 295oC với tốc độ 25oC/phút. Nhiệt độ 295oC được duy trì trong 10 phút.
Trong đó các mảnh ion 196 và 224 được dùng để định lượng PQ & EPQ. Độ thu hồi của
mẫu máu và nước tiểu lần lượt là 94,00 - 99,85% và 95,00 - 100,34%, khoảng tuyến tính
0,1 - 50 µg/ml. Giới hạn phát hiện (S/N = 3) là 0,01 µg/ml đối với cả máu và nước tiểu.
Phương pháp này đã được áp dụng để phân tích các mẫu sinh học thu được từ các nạn
nhân chết do uống PQ.
Trong khi đó, Almeida R. M.và cộng sự[5] sử dụng trên hệ máy sắc ký GC-MS
(Gas chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972) với cột
mao quản fused-silica HP-5MS (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,1 µm) và chế độ
đẳng dòng với tốc độ 0,6 ml/phút. Nhiệt độ của bơm và interface (bộ phận ghép nối giữa
GC và MS) là 270oC. Bơm hoạt động ở chế độ chia dòng. Nhiệt độ cột duy trì 80 oC trong
1 phút, tăng nhiệt 10oC/phút đến 200oC và 20oC/phút đến 270oC và duy trì 270oC trong 4
phút. Số khối của các mảnh ion được chọn cho các hợp chất là: m/z 108, 135, 190 (DQ);
m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220 (EPQ), trong đó các mảnh ion 192 và 162
được dùng để định lượng PQ & EPQ.
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Hai tác giả ZhaohongWang và Proenca P.đều định lượng PQ trong mẫu sinh học
bằng sắc ký lỏng - ion hóa tia điện - khối phổ [28] [41].
ZhaohongWang sử dụng hệ thống Waters UPLC với. Tiêm mẫu 5 μl với cột
ACQUITY BEH HILIC (50 mm × 2,1 mm × 1.7 μm) ở 30 oC. Còn Proenca P.sử dùng hệ
thống sắc ký LC Water 2695 Alliance System và cột silica HILIC (150 × 2,1 mm × 5
µm). Nhiệt độ cột duy trì 35 oC. Bơm mẫu 10 µl. Detector mảng photodiode Water 996
hoạt động từ bước sóng 210-400 nm với độ phân giải 1,2 nm. Độ hấp thụ UV được đo ở
258 nm.
Cả hai tác giả đều sử dụng pha động là ammonium formate và acetonitrile. Trong
khi ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (điều chỉnh đến pH 3,7 bằng acid
formic) và acetonitrile. Và chạy pha động theo chế độ gradient với tốc độ dòng 0,3
ml/phút. Ngay sau khi tiêm mẫu, % acetonitrile giảm từ 60% đến 20% trong 0,5 phút, sau
đó tăng tới 60% ở 1,5 phút và duy trì 60% ở 1,5 phút tiếp. Tổng thời gian chạy là 3 phút.
Thì tác giả Proenca P. dùngpha động gồm acetonitrile và đệm ammonium formate (200
mM) pH 3,6 với chế độ đẳng dòng (30:70, v/v) và tốc độ 300 µl/phút.


Các tác giả trên đều sử dụng nguồn ion hóa tia điện dương để ion hóa PQ và chuẩn
nội nhưng có khác nhau về điều kiện khối phổ.
Tác giả ZhaohongWang sử dụng bộ phân tích phổ khối ACQUITY
BSM_SM_Quattro Premier XE MS. Tối ưu hóa điều kiện MS-MS bằng cách tiêm dòng
PQ và ethyl viologen trong acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250 mM (40:60,
v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc độ dòng khí làm khô là 651 l/h ở 350 oC. Điện áp
mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là 4,0 V và điện áp thấu
kính RzFl à 0,5 V. Định lượng bằng kỹ thuật quét ion (multi-reaction monitoring, MRM),
bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sản phẩm có m/z 155 và 171 đối với PQ;
mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sản phẩm có m/z 158 và 185 đối với chuẩn nội
ethyl viologen [41].
Còn với tác giả Proenca P [28]phát hiện phổ (MS) được thực hiện trên máy khối
phổ tứ cực Water ZQ 2000. Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120 oC; nhiệt độ làm khô

400oC; tốc độ dòng khí cone (N2) 0l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N2) 600 l/h. Điện thế
capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lượng ion 0,5 V; Quét phổ từ
m/z 130-500, thời gian quét 0,5 s và thời gian trễ (interscan) 0,1s. Đường chuẩn độ PQ
trong máu tuyến tính từ 0,010-2,0 µg/ml trong máu (y=0,0142x+0,1497 với r2=0,9994) và
tuyến tính từ 0,025-10,0 µg/ml trong nước tiểu (y = 0,0141x + 1,347 với r2 = 0,9994).
Giới hạn phát hiện của PQ trong máu và nước tiểu lần lượt là 0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml
(LOD, S/N = 3) và giới hạn định lượng (LOD, S/N = 10) là 0,0012 µg/ml trong máu và
0,024 µg/ml trong nước tiểu. Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng không có pic
nào trùng thời gian lưu với PQ và chất chuẩn nội
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ trong dịch
sinh học [7][17][26].
Arys K.và cộng sự [7] sử dụng hệ thống HPLC. Gồm bơm model 126 và tiêm
mẫu type 210A với vòng tiêm mẫu 50 µl. Bước sóng hoạt động là 230 nm. Cột phân
tích Aluspher 100 RP-select B (125 mm × 4,0 mm, kích thước hạt 5 µm) với cột bảo
vệ 100 RP-select B (4 mm × 4,0 mm, kích thước hạt 5 µm). Pha động là hỗn hợp dung
dịch NaOH 0,0125 M trong nước (dung dịch A) và dung dịch NaOH 0,0125 M trong
methanol (dung dịch B), tốc độ dòng 1ml/phút. Chạy pha động chế độ gradient, dung


dịch A từ 90% đến 10% trong thời gian 15 phút. Sau khi chạy xong, chạy lại điều kiện
ban đầu trong 5 phút trước khi chuyển sang chạy mẫu mới. Giới hạn phát hiện PQ của
phương pháp trong máu và nước tiểu lần lượt là 63 và 32 µg/l.
Paixão P.[26] định lượng PQ trong huyết thanh và huyết tương người được làm
đơn giản và nhanh bằng phương pháp HPLC sử dụng 1,19-diethyl-4,49-bipyridyldiylium
(diethyl paraquat) làm nội chuẩn. Hệ thống HPLC gồm bơm mẫu model 1100, ổn định
nhiệt, detector UV-VIS.Vòng bơm mẫu 50 µl, cột NovaPar C18 (150×4,6 mm, 5µm).
Tiền cột C18 (100×4,6 mm, 10µm). PQ và chất nội chuẩn được rửa giải ở 25 oC với tốc độ
dòng 0,8 ml/phút và bước sóng hấp thụ 258 nm. Pha động gồm acid 1 - octanesulphonic
3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến

3,0 bằng diethylamine. Acetonitrile nồng độ 10% (v/v). Kết quả: Thời gian lưu của PQ và
chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút. Giới hạn phát hiện (LOD) 0,1 µg/ml, giới hạn định lượng
(LOQ) 0,4 µg/ml trong huyết tương và huyết thanh. Độ đúng trong ngày không vượt quá
3,5%; 3,2% đối với huyết tương, huyết thanh. Độ đúng trong khác ngày không vượt quá
4,7%; 3,1% đối với huyết tương, huyết thanh. Độ thu hồi trong huyết tương và huyết
thanh lần lượt là 98,9% và 98,7%.
Shuuji Hara [17] định lượng đồng thời PQ và DQ trong huyết tương bằng phương
pháp HPLC. Hệ sử dụng bơm L-7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơm mẫu (20 µl)
Rheodyne 7125. PQ, DQ, IS được tách trên cột pha đảo Capcell PaK C18 UG120 (1504,6 mm, cỡ hạt 5µm, của Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dung dịch rửa giải của
methanol và 200 mM axit phosphoric với diethyl amine 0,1M và sodium 1-heptane
sulphonate 12 mM (1:4, v/v). Tốc độ dòng của pha động 0,5 ml/phút và nhiệt độ cột trong
khoảng từ 15-20oC. Dịch rửa từ cột HPLC được trộn với dung dịch kiềm của Sodium
hydrosulfite bằng thiết bị trộn. Tốc độ dòng 0,4 ml/phút. Hỗn hợp được dẫn vào sợi dây
(1 m x 0,5 mm) và được làm ấm trong bể nước SB-9 (EYELA, Tokyo, Nhật) ở nhiệt độ
20oC và đo ở bước sóng 391 nm bằng detector UV Hitachi L- 7405. Độ cao của pic được
dùng để định lượng bằng máy C-R6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật). Giới hạn
phát hiện của PQ và DQ là 50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết tương.
Định lượng PQ trong huyết tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo cặp
ion đã được Brunetto M.R.thực hiện trên hệ thống sắc ký được sử dụng có 2 bơm, 1 bơm
2 nòng để chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model 64 để chuyển pha


động vào cột chiết. Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100 hoặc 200 µl để đưa
mẫu vào cột chiết. Sử dụng các cột 25 - 4 mm được lấp đầy các hạt LiChrospher RP-18
ADS (kích thước hạt 25 µm) và cột VARIAN ODS C-18 (25 cm × 4,6 mm, hạt 5 µm) lần
lượt là cột chiết và cột phân tích. Cột chiết và cột phân tích được gắn với van xoay 6 cửa
Rheodyne được điều khiển bằng bơm 2 nòng. Sử dụng detector UV-DAD Perkin-Elmer
LC 235 ở bước sóng 258 nm với flowcell 12 µm để phát hiện các tín hiệu.

Các pha động:

-

Pha động để chiết (Pha động 1): chứa natri octane sulfonate (SOS) 10mM và
acid orthophosphoric 0,05 M được pha bằng nước cất 2 lần, và lọc màng 0,45

-

µm. Điều chỉnh pH đến 2,8 bằng TEA và thêm 2-propanol nồng độ 3% (v/v).
Pha động để phân tích (Pha động 2): methanol 40 % và SOS 10 mM trong acid
orthophosphoric 0,05 M. Điều chỉnh đến pH 2,8 bằng TEA.

Các dung dịch và pha động được lọc màng 0,45 µm và loại khí trong bể siêu âm
trước khi sử dụng. Giới hạn phát hiện, tỉ lệ tín hiệu (Signal) / Nhiễu đường nền (Noise)
với S/N > 3, là 0,005 µg/ml PQ với thể tích tiêm mẫu 200 µg [9].
Chen Lu và cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để
xác định PQ trong huyết thanh người. Trong thí nghiệm này, các mẫu huyết thanh đã
được kết tủa protein lần lượt 30% acid perchloric, acetonitrile và dichlormethane, thu
được 50 ml dung dịch. Pha động acetonitrile-đệm (10:90), dung dịch đệm chứa natri
heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 0,26 M, điều chỉnh pH đến 2,0 bằng
triethylamine. Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước sóng phát hiện 256 nm, nhiệt độ cột 40 oC.
Đường chuẩn tuyến tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1 - 40 mg/l (r = 0,9999). Giới
hạn phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3). Độ lệch chuẩn (RSD) của các mẫu chứng nồng độ
thấp, trung bình và cao là trong vòng 3,061% - 6,149%, độ lệch chuẩn giữa các lô 0,705%
- 2,796%, và độ thu hồi của phương pháp xử lý mẫu 96,79 % - 100,07%, và độ thu hồi
phương pháp là 91,66% - 108,49%. Phương pháp này là đơn giản, nhạy cảm, chính xác,
nhanh chóng và cũng chỉ ra rằng có thể được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng.
* Ngoài ra, một vài phương pháp khác cũng đã được nghiên cứu để định lượng PQ
trong máu như: miễn dịch phóng xạ [14], điện di mao quản [38]…

1.3. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat
Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định lượng đó là
phương pháp xử lý mẫu.
Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu sinh học trong
phân tích PQ [5][16][20][28][41]. Một số tác giả dùng đệm phosphate để thêm vào mẫu
thử trước khi cho qua cột chiết pha rắn [5][16][41].
Cột chiết pha rắn C18 thường được dùng để chiết PQ & DQ trong mẫu thử [20].
Dung dịch mẫu đã loại protein được chỉnh pH đến 11 bằngNaOH. Cột được hoạt hóa bằng
5 ml nước, 5 ml methanol và 20 ml nước trước khi bơm mẫu vào cột. 3 ml nước cất được
bơm qua cột để loại bỏ hoàn toàn các hợp chất khác trong máu. Sau đó, 3 ml acid
hydrochloric 0,2 M và 1 ml × 3 nước khử khoáng được cho qua cột để rửa giải PQ & DQ.
Với dịch thu được thêm 3 ml dung dịch NaOH 0.2 M. Mẫu này được mang đi đo quang
[20].
Chang-bin Li[5] cũng dùng cột C18 để chiết PQ, cột được rửa với 2 ml methanol
và 2 ml đệm phosphate (pH 8,0). Dung dịch mẫu được đưa qua cột rồi rửa với 2 ml nước
khử khoáng. Cuối cùng, rửa giải với 2 ml methanol và dịch rửa giải được bay hơi ở nhiệt
độ phòng dưới dòng khí nitrogen. Hòa tan cắn trong 100 µl methanol và bơm 1 µl vào hệ
thống GC-MS.
Zhaohong Wang[41] xử lý 1,0 ml máu, thêm 3 ml đệm phosphate 0,1M (pH 7) và
dung dịch chuẩn nội 100ng/ml. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút. Các cột Waters
Oasis WCX 3 ml được cho chạy qua lần lượt 3 ml methanol, 3 ml nước khử khoáng và 1
ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7). Sau khi cho mẫu chạy qua cột, rửa cột với 3 ml đệm
phosphate 0,1 M (pH 7), 3 ml nước khử khoáng và 3 ml methanol. Sấy khô chân không
cột trong 10 phút. Chất phân tích được rửa giải bằng 2 ml dung dịch acid formic 2% trong
acetonitrile 80%. Bay hơi dịch rửa giải bằng dòng khí nitrogen ở 45 oC. Hòa tan cắn bằng
50 μl pha động (dung dịch acetonitrile và ammonium formate 250 mM tỉ lệ 1:1).
Proenca P [28]xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml máu hoặc 1 ml nước tiểu thêm 50 µl
chuẩn nội (10 µg/ml) và 2 ml acetonitrile. Lắc, ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút. Cột
chiết pha rắn (Oasis, 3 cc) được rửa với lần lượt 1 ml methanol và 1 ml nước khử khoáng.
Đưa mẫu qua cột chiết pha rắn. Rửa cột với 1 ml đệm phosphate pH 7,1 ml nước khử

khoáng và 1 ml methanol. Sau khi làm khô 10 phút trong chân không, rửa giải cột với 1,5
ml acetonitrile/water/TFA (84:14:2, v/v/v). Dịch rửa giải được bay hơi đến cắn dưới dòng


khí nitrogen ở 40oC. Cắn được hòa tan trong 100 µl methanol và bơm 10 µl vào hệ thống
LC-ESI-MS.
Kyoko KATO, P. Paixão đều dùng acid perchloric để loại protein [20][26].Tuy
nhiên, một số công trình khác sử dụng acid trichloracetic để kết tủa protein trong mẫu
huyết tương [7][17][24][30] rất đơn giản và cho hiệu quả cao vì vậy có thể áp dụng rộng
rãi ở các đơn vị xét nghiệm.
Phương pháp này được Rai M.K. và cộng sựáp dụng để định lượng PQ trong máu,
nước tiểu và sữa mẹ. Thêm 1 ml dung dịch EDTA 5% và 1ml acid trichloracetic 1% vào
để loại sự ảnh hưởng của các ion kim loại và loại protein. Ly tâm 1850 vòng/phút trong
10 phút. Lấy phần dịch trong ở trên đem đo quang [30].
Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml được
thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1). Lắc xoáy, li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch trong
phần trên đi đo quét bước sóng từ 200 đến 300 nm [24].
Arys K [7]xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml (hoặc 1 g) mẫu, thêm 50 µl chuẩn nội và
thêm nước vừa đủ 4 ml. Tủa protein bằng acid trichloroacetic là bước làm sạch đầu tiên
của các mẫu máu, gan, thận. Thêm 1,5 ml dung dịch acid trichloroacetic 25%, lắc 10 phút,
ly tâm 400 vòng/phút trong 5 phút. Sau khi chuyển dịch trong ở trên sang ống nhựa sạch,
phần tủa protein phía dưới được hòa tan lại bằng 2,5 ml dung dịch acid trichloroacetic
5%, lắc 10 phút, ly tâm 1100 vòng/phút trong 5 phút, gộp phần dịch trong lại, chuyển
sang ống silan hóa. Tuy nhiên ở một số trường hợp đã được chứng minh cần thêm
bước ly tâm nữa (2200 vòng/phút trong 10 phút) để thu được phần dịch sạch hoàn
toàn. Đối với nước tiểu và dịch dạ dày, bước loại protein có thể bỏ qua và làm ngay
bước tiếp theo là khử PQ bằng natri borohydride. Điều chỉnh pH của dung dịch đến pH
lớn hơn 10 bằng 1 ml NaOH 1M (đối với nước tiểu và dịch dạ dày) hoặc 1 ml NaOH
5M (đối với các mẫu khác). Sau đó, thêm 250 mg bột NaBH 4 và lắc ở 60 oC trong 25
phút. Sau khi làm mát ở nhiệt độ phòng, chiết dung dịch với 8 m l diethyl ether bằng

máy trong 15 phút. Sau khi ly tâm (1100 vòng/phút trong 10 phút), chuyển lớp hữu cơ
phía trên sang ống silan hóa hình nón. Bay hơi dịch chiết đến khô bằng dòng khí
nitrogen. Cắn được hòa tan trong 60 µl pha động (dung dịch A : dung dịch B là 50:50,
v/v) và tiêm 50 µl vào hệ thống HPLC.


Theo nghiên cứu của Shuuji Hara và cộng sự [17]chỉ cần lấy 200 µl huyết thanh
trộn với 20 µl dung dịch nội chuẩn (10 µg/ml) và 120 µl TCA 10% và lắc xoáy trong 20
giây, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, lấy 20 µl dịch nổi ở trên bơm vào máy.
Tóm lại, tổng quan tài liệu tham khảo cho thấy việc định lượng PQ trong mẫu
huyết tương chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp HPLC. Trong đó mẫu huyết
tương được loại bỏ protein bằng cách kết tủa với TCA và định lượng trên hệ HPLC cột
tách C8 dung môi pha độngtheo thể tích (5:95) gồm ACN – Đệm photphat pH=2,5 gồm
(natri heptanesulfonate;KCl;PEG; triethylamine; MeOH).


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Để xây dựng và xác định giá trị sử dụng củaphương pháp phân tích PQ trong huyết
tương người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng sau:
-

Mẫu trắng: là huyết tương người của viện Huyết học và truyền máu trung ương.
Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm lượng xác định PQ tạo thành mẫu.
Mẫu thử: là huyết tương bệnh nhân ngộ độc PQ thu được từ mẫu máu, ly tâm
lấy phần huyết tương.

2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị
2.2.1 Chất chuẩn
Chất chuẩn Paraquat dichloride.x-hydrate của hãng Sigma - Aldrich độ tinh khiết

99,5%; Exp date: 14.Dec.2016.
2.2.2 Hoá chất
- Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN ....) của hãng
Merck.
- KCl tinh thể, độ tinh khiết: 99,5% của hãng Merck.
- Acid trichloroacetic tinh khiết 98,5% của hãng Merck.
- Acid phosphoric (H3PO4) đặc (d=1,685 g/cm3) của hãng Merck.
- Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu của hãng Merck và đạt tiêu chuẩn tinh
khiết phân tích (P.A.)
- Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá.
- Dung dịch đệm pha động pH = 2,5 được chuẩn bị bằng cách sau: gồm 1,1 g natri
heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 200 ml MeOH; 0,5 ml
triethylamine thêm nước xấp xỉ 1000 ml. Điều chỉnh pH của pha động bằng H 3PO4 đến
các giá trị pH mong muốn. Định mức vừa đủ 1000 ml bằng nước deion.
- Pha dung dịch chuẩn gốc PQ: Hòa tan 100 mg chất chuẩn paraquat dichloride
(C12H14Cl2N2.xH2O), hòa tan trong 100 ml nước để được dung dịch gốc. Từ đó pha thành
các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,1 - 20 µg/ml trong nước. Trộn các nồng độ
dung dịch chuẩn thứ cấp với huyết tương trắng để có nồng độPQ 0,02 - 10 µg/ml để khảo
sát và xác định giá trị sử dụng của phương pháp.
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ
• Thiết bị


- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, gồm bơm trộn dung môi
gradient áp suất cao, bộ đuổi khí trực tuyến bằng chân không, buồng ổn nhiệt, thiết bị
tiêm mẫu tự động, detector mảng Diode (DAD), thư viện phổ độc chất sử dụng detector
mảng Diode, máy tính, máy in.
- Cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x
4,0 mm, 5 μm).
- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ đọc của cân 0,0001 g.

- Bể siêu âm. Model: S30/H. Hãng ELMA, Đức.
- Máy đo pH Meter 744, giá trị đọc ± 0,01, khoảng đo pH = 0,00 – 14,00
- Máy ly tâm Universal 320 hãng Hettich, Đức, tốc độ tối đa 4000 vòng/phút.
- Máy lắc xoáy model: 3005 của hãng GFL, Đức.
- Tủ sấy model: 500 của hãng Memmert, Đức.
- Máy cất nước hai lần. Model: A4000D/Aquatron hãng Stuart - Barloworld
Scientific, 4 l/h, Anh.
- Bộ lọc nước siêu sạch. Model: WaterPro PS/HPLC/UF hybrid - Labconco,
115V, 60Hz, Mỹ.
• Dụng cụ
- Bình định mức dung tích: 5, 10, 25, 50, 100 ml.
- Pipetman các loại từ 0 - 1000 µl.
- Bộ lọc dung môi của hãng Agilent, Mỹ.
- Ống nghiệm lấy máu chứa EDTA và ống nghiệm có nút xoáy.
Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sau đó
tráng bằng MeOH và để khô, tráng n-hexan 3 lần sau đó sấy ở 105 oC trong vòng 1 giờ,
lấy ra để nguội trước khi sử dụng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat.
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn
Theo như tính chất đã biết của paraquat dichloride là tan tốt trong nước và ít tan
trong dung môi hữu cơ như EtOH, MeOH… Tham khảo các tài liệu và so sánh về độ
phân cực của nước và các dung môi, chúng tôi lựa chọn nước để hòa tan PQ vì nước
không độc hại, thân thiện với môi trường hơn EtOH, MeOH.


2.3.1.2. Phương pháp tách PQ từ huyết tương
Dựa theo tính chất lý hóa của PQ, theo các tài liệu đã công bố và trang thiết bị
phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện để tách PQ từ huyết tương
như sau:

Với 1 ml mẫu huyết tương, thêm dung dịch TCA để loại protein, lắc xoáy và ly tâm
với nồng độ dung dịch TCA thay đổi là: 2,0%; 4,0%; 5,0%; 6,0% và thời gian lắc xoáy:
30 giây, 1 phút, 2 phút.
2.3.1.3. Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ trong huyết tương
Để đánh giá khả năng tách PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương, các mẫu chuẩn chiết
PQ trong nền mẫu được chuẩn bị bằng cách cho TCA, lắc xoáy, ly tâm, lọc rồi chạy sắc
ký. Dựa trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù hợp của điều kiện đo.
* Cột sắc ký: Cột tách có vai trò quan trọng trong việc quyết định quá trình tách có
độ phân giải tốt hay không [3]. Để chọn loại pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc
phân tử và độ phân cực của chất phân tích. Dựa trên khảo sát các tài liệu tham khảo và
điều kiện cơ sở vật chất sẵn có tại Trung tâm Chống độc, chúng tôi sử dụng cột pha đảo
Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm) trong
nghiên cứu này.
* Bước sóng (λ): là cực đại hấp thụ của PQ trong mẫu thử, xác định cực đại hấp
thụ của PQ dựa vào phổ hấp thụ UV trong khoảng 210 - 400 nm theo máy sắc ký lỏng
hiệu năng cao Agilent 1200, detector DAD.
* Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm mẫu từ 10 - 50 µl.
* Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các hệ pha động có
khả năng tách, thời gian lưu phù hợp và cho các pic cân đối thuận lợi cho phân tích định
lượng gồm các hệ pha động sau:
- Hệ A: Kênh 1 là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125M trong nước và kênh 2 là dung
dịch NaOH 0,0125M trong methanol. Tốc độ dòng 0,5 ml/phút. Tỷ lệ thể tích 2 kênh
tương ứng là 90 : 10.
- Hệ B: Gồm kênh 1 là ACN kênh 2 là dung dịch đệm pH = 3 (10:90, v/v). Thành
phần đệm gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900
ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine.


- Hệ C: ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) pH = 2,5 gồm 1,1 g natri
heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 0,5 ml triethylamine; 200 ml

MeOH thêm nước xấp xỉ 1000 ml. Điều chỉnh pH bằng H 3PO4 đặc. Định mức vừa đủ
1000 ml bằng nước deion.
* Sau khi chọn được hệ dung môi pha động phù hợp chúng tôi tiến hành khảo sát
thành phần của pha động. Giá trị pH pha động cũng được khảo sát trong khoảng từ 2,5
đến 4,5.
* Khảo sát thành phần dung dịch đệm: nồng độ natri heptanesulfonate, KCl
&polyethylenglycol.
* Tốc độ dòng: thay đổi tốc độ pha động từ 0,2 - 0,8 ml/phút để xác định được tốc
độ phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu.
* Các kết quả thu được ứng với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian
lưu của các chất phân tích (tR), độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS). Phương pháp
đánh giá này dựa trên lý thuyết Van Deemter sao cho 0,9 < A S< 1,2, tR của các chất phải
không quá lớn nhưng đảm bảo phải tách xa nhau.
2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương
2.3.2.1. Tính chọn lọc
Chuẩn bị mẫu huyết tương trắng không có PQ và mẫu huyết tương trắng có PQ.
Tiến hành xử lý và phân tích mẫu, đánh giá hiệu quả tách PQ ra khỏi nền mẫu.
2.3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính
Chuẩn bị các mẫu huyết tương trắng, thêm PQ để thu được các mẫu chuẩn có nồng
độ PQ từ 0,02 - 10 µg/ml. Chúng tôi xây dựng đường chuẩn với 8 nồng độ PQ được them
vào mẫu huyết tương trắng lần lượt là 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 và 10 µg/ml. Sau đó
xử lý mẫu và tiến hành phân tích.
2.3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Tiến hành xử lý các mẫu huyết tương trắng và mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 0,01
- 0,1 µg/ml và phân tích trên hệ thống HPLC, tính độ lệch chuẩn của phương trình hồi
quy và xác định LOD theo quy tắc 3ϭ, LOQ theo quy tắc 10 ϭ.
2.3.2.4. Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại)
- Độ đúng: chuẩn bị các mẫu PQ trong huyết tương trắng ở5 nồng độ khác nhau,
mỗi nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký rồi so sánh giá trị trung bình giữa
các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị chất thêm vào trong mẫu.

- Độ lặp lại:
+ Độ lặp lại trong ngày: chuẩn bị các mẫu PQ trong huyết tương trắng ở 3 nồng độ
khác nhau, mỗi nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký như phần độ đúng, đánh
giá độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu theo từng nồng độ.
+ Độ lặp lại khác ngày : tiến hành tương tự như trên nhưng làm ở 5 ngày khác
nhau.
2.3.2.5. Độ ổn định
Xác định độ ổn định của chất phân tích trong dịch sinh học trong thời gian phân
tích và thời gian bảo quản.
- Độ ổn định trong thời gian phân tích: chuẩn bị 3 mẫu PQ nồng độ 1 µg/ml trong
huyết tương, xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký ngay và tiếp tục cứ mỗi giờ 1 lần trong vòng
5 giờ, xác định RSDr.
- Độ ổn định trong thời gian bảo quản: chuẩn bị 3 mẫu như trên, lấy 1 phần ra xử
lý và tiến hành sắc ký ngay, phần còn lại bảo quản ở -30 oC trong 21 ngày. Lấy các mẫu
đang bảo quản ra để xử lý và tiến hành sắc ký ngay vào các ngày thứ 7, 14 và 21.
2.3.3.Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng
bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ
2.3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
31 bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai từ
tháng 3 đến tháng 5 năm 2015.
Chẩn đoán ngộ độc PQ dựa vào: bệnh nhân có 1 trong 2 tiêu chuẩn:
- Bệnh nhân uống thuốc trừ cỏ PQ và có biểu hiện lâm sàng ngộ độc PQ.
- Xét nghiệm định tính độc chất nước tiểu tìm thấy PQ.
2.3.3.2. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân
- Bệnh nhân có tiền sử bệnh phổi, thận, gan.
- Những bệnh nhân ngộ độc đồng thời các chất độc khác.
Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu loạt ca bệnh.
Tiến hành nghiên cứu:

* Thu thập các số liệu bệnh nhân khi nhập viện từ bệnh án (theo đánh giá của bác
sĩ điều trị):
- Tên loại thuốc trừ cỏ có PQ, hàm lượng PQ trong thuốc trừ cỏ, lượng PQ uống,
thời gian đến viện, thời gian bắt đầu điều trị.