NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE TỪ ĐẤT RUỘNG TẠI KHU VỰC XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

HÀ THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE TỪ ĐẤT RUỘNG
TẠI KHU VỰC XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

HÀ THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE TỪ ĐẤT RUỘNG
TẠI KHU VỰC XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC
Chuyên ngành: Sinh thái học
Mã số: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2013

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung
đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề
tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa
Sinh- KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ.
Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và
hoàn thành đề tài. Tôi xin cảm ơn thầy cô và bạn bè đã động viên, tạo mọi
điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Lời cảm ơn sâu sắc nhất
tôi xin dành cho gia đình và những người thân yêu đã động viên và giúp đỡ
tôi.

Hà Nội, ngày 12 tháng 07 năm 2013
Tác giả

Hà Thị Thu Hằng


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết
quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong luận văn là trung thực và không
trùng với công trình của các tác giả khác.

Hà Nội, ngày 12 tháng 07 năm 2013
Tác giả

Hà Thị Thu Hằng


CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADP

: Diaminopimelic Acid

CFU

: Colony Forming Unit

CMC

: Cacboxyl methyl cellulose

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

HSCC

: Hệ sợi cơ chất

HSKS

: Hệ sợi khí sinh

ISP

: International Streptomyces Project

RNA

: Ribonucleic Acid

rRAN

: Riboxom Ribonucleic Acid

PG

: PeptidoGlycan

m

: meso


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................. 3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................... 3
5. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 3
6. Điểm mới của đề tài ................................................................................... 3
NỘI DUNG .................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1. Vị trí và phân loại xạ khuẩn ..................................................................... 4
1.1.1. Vị trí xạ của khuẩn trong hệ thống sinh sinh giới ........................ 4
1.1.2. Phân loại xạ khuẩn ..................................................................... 4
1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn............................................................ 10

1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn .............................................. 10
1.2.2. Cấu tạo của xạ khuẩn ............................................................... 11
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn .................................. 11
1.2.4. Sinh sản của xạ khuẩn ............................................................. 13
1.3. Cellulose và cellulase ............................................................................ 13
1.3.1. Cellulose ................................................................................... 13
1.3.2. Cellulase ................................................................................... 14
1.3.3. Hệ enzyme phân giải cellulose .................................................. 15
1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose ở Việt Nam và trên
thế giới ......................................................................................................... 15
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 18
2.1. Vật liệu và vi sinh vật ............................................................................ 18


2.1.1.Vi sinh vật .................................................................................. 18
2.1.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................... 18
2.2. Môi trường ............................................................................................ 19
2.2.1. Môi trường phân lập xạ khuẩn.................................................. 19
2.2.2. Môi trường bảo quản và giữ giống ........................................... 19
2.2.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme .............................................. 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu ............................................................... 20
2.3.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski ................... 22
2.3.3. Phương pháp bảo quản chủng giống ........................................ 22
2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn ................................ 22
2.3.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của xạ khuẩn ................ 23
2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn........... 23
2.3.7. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả ................................... 24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 25
3.1. Sơ lược đặc điểm tự nhiên khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc ... 25

3.2. Phân lập xạ khuẩn từ đất ruộng khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc .... 27
3.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc .................................................................. 27
3.2.2. Đặc điểm hệ sợi ........................................................................ 31
3.2.3. Nghiên cứu sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn đã phân lập ..... 34
3.2.4. Xác định khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn ........................ 37
3.3. Đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử của chủng T5, T9 ............ 41
3.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh cellulase của
các chủng xạ khuẩn ...................................................................................... 43
3.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon................................................... 43
3.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ........................................................ 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 48


DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
BẢNG

Trang

Bảng 3.1. Các loại cây trồng trên đất ruộng khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên,
Vĩnh Phúc .................................................................................... 26
Bảng 3.2. Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất ruộng khu vực Xuân Hòa,
Phúc Yên, Vĩnh Phúc ……………………………………………28
Bảng 3.3. Đặc điểm HSKS, HSCC của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu ...... 31
Bảng 3.4. Sự phân bố xạ khuẩn theo nhóm màu ......................................... 32
Bảng 3.5. Đặc điểm sắc tố tan của 18 chủng xạ khuẩn nghiên cứu .............. 34
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa CMC ……..37
Bảng 3.7. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa bột giấy…...38
Bảng 3.8. Hoạt tính cellulase của 18 chủng xạ khuẩn đã phân lập………….39
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tự nhiên đến hoạt tính cellulase của

chủng T5 và T9 ........................................................................... 43
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính
cellulase của chủng T5 và T9........................................................ 45


HÌNH

Trang

Hình 2.1. Bản đồ phường Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc .......................... 21
Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ các loại cây trồng trên đất ruộng khu vực
Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc .................................................. 26
Hình 3.2. Khuẩn lạc xạ khuẩn .................................................................... 29
Hình 3.3. Một số chủng xạ khuẩn phân lập ................................................. 30
Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ các chủng xạ khuẩn theo nhóm màu ........ 33
Hình 3.5. Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập được ................... 36
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính cellulase của 18 chủng xạ khuẩn phân
lập ............................................................................................... 39
Hình 3.7. Hoạt tính cellulose của chủng T5, T9............................................ 40
Hình 3.8. Cuống sinh bào tử và bào tử chủng T5, T9 ................................... 42
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn trên
môi trường chứa nguồn cacbon tự nhiên ....................................... 44
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính cellulase
của 2 chủng T5 và T9 .................................................................. 45


1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành và tạo độ phì

cho đất, chúng tham gia rất tích cực vào các quá trình chuyển hóa và phân
giải nhiều chất hữu cơ phức tạp và bền vững như cellulose, chất mùn, kitin,
keratin, lignin…. Ngày nay xạ khuẩn được ứng dụng rộng rãi trong các ngành
công nghiệp lên men (sản xuất axit hữu cơ như lactat, axetat, glutamat…), chế
biến tạo các sản phẩm enzyme. Một số chủng xạ khuẩn còn có khả năng sinh
enzyme như: cellulase, proteinase, amylase… Hầu hết các loài xạ khuẩn
thuộc giống Actinomycetes đều có khả năng hình thành kháng sinh
(Streptomyxin, Oreomyxin…), vitamin nhóm B (B1, B2 B5 B6 B12), chính vì
vậy chúng được ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, y học…[1]
Trong vài thập kỉ trở lại đây cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công
nghệ sinh học các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được
ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, chăn nuôi, y tế và
bảo vệ môi trường…
Cellulose là thành phần chủ yếu tạo nên bộ khung xương tế bào thực
vật. Trung bình mỗi năm ước tính có khoảng 30 tỉ tấn chất hữu cơ được cây
xanh tổng hợp trên trái đất trong đó có tới 70% là cellulose. Hàng năm trái đất
phải nhận về một lượng chất thải khổng lồ (chất thải sinh hoạt, xác thực vật,
xác động vật, chất thải công nghiệp,…). Thành phần chủ yếu của các loại chất
thải này là cellulose. Để phân giải lượng lớn cellulose trên trái đất, khu hệ vi
sinh vật trong đất đóng vai trò rất quan trọng trong việc khép kín các chu trình
chuyển hóa vật chất, đặc biệt chu trình cacbon. Cellulase còn được ứng dụng
sản xuất thức ăn cho gia súc, xử lý chất thải nông nghiệp, sản xuất các loại
đường probiotin mà nguyên liệu dùng ở đây chủ yếu là dùng vi sinh vật sống.


2
Trong đời sống, sản phẩm thải của quá trình sản xuất nông nghiệp
chiếm tỷ lệ không nhỏ mà thành phần chính của chất thải này là cellulose.
Con người đã ứng dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
cellulase vào việc phân giải cellulose, trong đó có xạ khuẩn. Xạ khuẩn, đặc

biệt là chi Streptomyces được sử dụng trong việc phân hủy rác nông nghiệp,
chúng thuộc nhóm ưa nóng, sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở 45 - 50oC, rất
thích hợp với quá trình ủ rác thải nông nghiệp. Do quá trình ủ rác thải, các vi
sinh vật sinh trưởng và phát triển làm tăng nhiệt độ trong lòng khối cơ chất so
với nhiệt độ bên ngoài môi trường (nhiệt độ bên ngoài môi trường khoảng
30oC thì trong lòng khối cơ chất khoảng 45 - 50oC). Theo nghiên cứu của
Tăng Thị Chính [4] trên đối tượng vi sinh vật phân lập từ mẫu ủ rác thải hiếu
khí lấy từ xí nghiệp chế biến phế thải Cầu Diễn Hà Nội thì số lượng chủng vi
sinh vật ưa nhiệt (45oC) có hoạt tính cellulase cao là: vi khuẩn 40%, xạ khuẩn
90%, nấm mốc 36,37%. Như vậy trong số các chủng xạ khuẩn có mặt trong
bể để phân giải cellulose thì có đến 90% số chủng có hoạt tính cellulase cao.
Vậy nếu có một chế phẩm vi sinh vật bổ sung xạ khuẩn vào quá trình ủ rác
hiếu khí, thì chắc chắn hiệu quả phân giải cellulose trong rác thải tăng lên
cùng một lượng cơ chất được phân giải triệt để trong một khoảng thời gian rút
ngắn. Sản phẩm thu được từ quá trình phân giải cellulose trong rác là phân
hữu cơ, đem bón vào đất sẽ làm tăng độ phì nhiêu cho đất. Chính vì vậỵ,
chúng tôi chọn và nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có
khả năng sinh cellulase từ đất ruộng tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh
Phúc”.
2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh
cellulase từ đất ruộng tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.


3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Sơ lược đặc điểm tự nhiên khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
3.2. Phân lập xạ khuẩn từ đất ruộng tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh
Phúc.
3.3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của cuống sinh bào tử, bào tử của chủng

xạ khuẩn tuyển chọn.
3.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh cellulase
của chủng xạ khuẩn tuyển chọn.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase từ đất đất ruộng tại
khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
5. Phương pháp nghiên cứu
5.1. Phương pháp lấy mẫu
5.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski
5.3. Phương pháp bảo quản chủng giống
5.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn
5.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn
5.6. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn
5.7. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả bằng toán học
6. Những đóng góp mới của đề tài
Đây là kết quả khảo sát đầu tiên về sự có mặt của một số chủng xạ
khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase trong đất ruộng tại khu vực Xuân
Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.


4
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Vị trí và phân loại xạ khuẩn
1.1.1. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi sinh vật Gram+ lớn trong
giới bacteria. Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn được tách thành một lớp
riêng gồm có xạ khuẩn bậc cao có hệ sợi phát triển, có cơ quan sinh sản riêng
và nhóm xạ khuẩn bậc thấp có hệ sợi kém phát triển, tế bào có dạng hình que
hoặc hình cầu. Xạ khuẩn có hệ sợi ngắn như họ Mycobacteriaceae và

Actinomycetaceae, hoặc hệ sợi dài như họ Streptomycetaceae [7].
Xạ khuẩn được Bergey xếp vào bộ riêng Actinomycetales (Bergey’s
Manual. 1989) thuộc siêu giới nhân sơ (Prokaryota), giới Bacteria, ngành
Firmicutes, lớp Actinobacteria, lớp phụ Actinobacteriaceae.
Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật
nhân nguyên thủy (Prokaryota) thuộc giới khởi sinh (Monera) trong hệ thống
phân loại năn giới hay bảy giới thì xạ khuẩn đều thuộc giới vi nấm chuẩn
(Eubacteria) thuộc siêu giới nhân sơ. Bộ xạ khuẩn gồm 10 họ: Actinomycetaceae,
Actinoplanceae, Permatophilaceae, Frankiaceae, Micromonosporaceae,
Thermonosporaceae, Micobacteriaceae, Mycobacteriaceae, Norcarddiceae,
Streptomycetaceae. Trong đó Streptomycetaceae là loại xạ khuẩn có hệ sợi
giống nấm và được nghiên cứu khá kỹ.
1.1.2. Phân loại xạ khuẩn
1.1.2.1. Lược sử phân loại xạ khuẩn
Trước thế kỉ XIX, xạ khuẩn được xếp vào giới nấm (Fungi). Về sau các
nghiên cứu cho thấy chúng có nhân nguyên thủy, kích thước bề ngang nhỏ
như vi khuẩn nên người ta xếp vào giới vi khuẩn (Eubacteria).


5
Fosters là người đầu tiên phân lập một số xạ khuẩn có tuyến mắt của
người và được Jonh miêu tả năm 1874. Đến năm 1977, Harze mô tả đầu tiên
một loại xạ khuẩn có hệ sợi rất điển hình, được phân lập từ bệnh nấm sao của
trâu bò và đặt tên là Actinomyces bovis.
Năm 1914, Krainski lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân
loại các loài khác nhau và sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomycetes.
Ông coi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là mấu chốt cơ bản trong nguyên tắc
phân loại. Waksman và Curtis (1919) đã đề cập đến những dạng trung gian
trong mô tả phân loại của mình và coi đặc điểm hình thái bào tử là đặc tính
quan trọng nhất của các cá thể và đưa ra một số loài mới có ý nghĩa.

Năm 1926, Millard và Burr tìm ra 17 loài trong đó có 7 loài còn tồn tại
đến bây giờ. Jensen (1930 - 1931) tìm ra hai loài mới, đến năm 1934 Dutche
tìm ra 3 loài mới [14]. Baldacci và cộng sự đã nghiên cứu xạ khuẩn từ năm
1930 - 1953 đã công bố một khóa phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ sở
HSKS, HSCC và một số đặc điểm trung gian khác. Waksman và Henrici
(1953) đã đưa ra một hệ thống phân loại và đến năm 1961 đã được sửa đổi lại.
Trong hệ thống phân loại này, xạ khuẩn được xếp vào nhóm gồm 3 họ, chia
nhỏ thành 10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi Streptomyces. Hệ
thống phân loại này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng bào tử, chuỗi
bào tử...
Krassinilcov từ năm 1941 - 1949 đã phát hiện trên 38 loài mới. Năm
1970, ông công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa vào hệ thống công bố
năm 1949, trong đó xạ khuẩn được phân thành 6 họ gồm 26 chi.
Năm 1957, Gause và cộng sự đã phân bố hệ thống phân loại mới. Hệ
thống phân loại này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng màng bào tử
và cuống sinh bào tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này được chỉnh lý và tái
bản năm 1983. Trong những năm gần đây, hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày


6
càng nhiều như hệ thống phân loại của Prihan (1972), Nonomura (1972) và
đáng chú ý hơn là hệ thống phân loại của Goodfellow Stackebradt (1988). Để
thống nhất cách mô tả, ISP đã nêu lên các phương pháp và môi trường mô tả
(Shirling và Gottlieb, 1966) [15].
1.1.2.2. Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn
Dựa vào sự phát triển của khoa học kĩ thuật, số lượng xạ khuẩn được
mô tả ngày càng nhiều và chính xác trên cơ sở sự phát triển của sinh học phân
tử, hóa sinh học, lý sinh học... Để phân loại nhanh chóng và chính xác các xạ
khuẩn đến loài, người ta đã sử dụng phương pháp phân loại số (Numberical
taxonomy), nghiên cứu chủng loại phát sinh (Phylogeny taxonomy). Tuy

nhiên, vì nhiều lý do và trong thực nghiệm, người ta vẫn chủ yếu dựa vào các
đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch
học và sinh học phân tử.
Hiện nay có rất nhiều khóa phân loại xạ khuẩn nhưng có thể gộp thành
hai hệ thống phân loại chính sau:
Hệ thống phân loại dựa chủ yếu vào đặc điểm hình thái để phân loại
nhóm lớn như họ, giống. Các phân loại thấp hơn loài thì dùng đặc điểm nuôi
cấy, sinh lý, sinh hóa để phân loại [15].
Hệ thống phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sinh lý như màu sắc
hệ sợi... để phân nhóm, sau đó dùng các đặc điểm nuôi cấy để phân loại đến
loài. Nhóm hệ thống này của Waksman, Gause... các tác giả đều thống nhất
lấy dặc điểm sử dụng nguồn nitơ, cacbon làm yếu tố bổ sung cho phân loại
đến loài.
• Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy người ta chia xạ
khuẩn làm 4 nhóm chính:
Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử
và phân hóa thành HSKS, HSCC.


7
Nhóm 2: Gồm xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hướng
vuông góc với nhau tạo thành cấu trúc tương tự nang bào tử.
Nhóm 3: Gồm xạ khuẩn có dạng Norcadia, sinh sản bằng phân đốt hệ sợi.
Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào
có hình chữ T, V và thường không có hệ sợi.
Theo tài liệu của ISP được nêu bởi Shirling và Gottlieb (1968, 1969 và
1972) và trong cuốn “Bergey’s Manual” được xuất bản lần thứ 8, người ta
chia hình dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn thành 6 kiểu:
Kiểu S: Type “Spira” - chuỗi bào tử xoắn.

Kiểu SRA: Type “Spira- Rectinaculum- Apertum” - chuỗi bào tử xoắn
có dạng móc câu hay xoắn không hoàn toàn.
Kiểu SRF: Type “Spirina - Rectus - Flexibilis” - chuỗi bào tử xoắn,
cong đến thẳng.
Kiểu RA: Type “Rectinaculum - Apertum” - chuỗi bào tử có móc có khóa.
Kiểu RA - RF: Type “Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis” chuỗi bào tử có dạng móc hay xoắn không hoàn toàn.
Kiểu RF: Type “Rectus - Flexibilis” - chuỗi bào tử thẳng đến lượn song.
Trước đây, các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy được coi là dữ
liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên, xạ khuẩn là vi sinh vật
rất dễ biến dị tự nhiên dẫn đến sự khác nhau về kiểu hình của cùng một loài
hay giống nhau về kiểu hình giữa các loài khác nhau. Vì vậy, ngày nay trong
phân loại xạ khuẩn phải dùng thêm các chỉ tiêu bổ sung khác như đặc điểm
sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử.
• Đặc điểm hóa phân loại
Phương pháp hóa phân loại dựa vào các dữ liệu về định tính, định
lượng các thành phần hóa học trong tế bào vi sinh vật để phân loại, chủ yếu
dựa vào các đặc điểm sau:


8
Type thành tế bào: dựa trên cơ sở phân tích acid amin trong thành phần
dây nối peptide, đường trong thành tế bào hay các polysaccaride gắn vào
thành tế bào.
Type Peptidoglucan (PG)
Acid mycolic
Acid béo
Menaquinon
Type photpholipid
Trong các đặc điểm trên, type thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất
trong phân loại xạ khuẩn. Theo hướng phân loại hóa sinh, người ta chia thành

tế bào thành 4 dạng sau:
Type I: thành tế bào có L - ADP và glixin
Type II: thành tế bào có m - ADP và gilixin
Type III: thành tế bào có m - ADP
Type IV: thành tế bào có m - ADP, đường arabinose, galactose
Trong type peptidoglucan người ta chia xạ khuẩn thành:
Type

Type phụ

A (3-4)

A1

Liên kết peptide trực tiếp.

A2

Chuỗi peptit bên.

A3

Glycerol hoặc các acid monocacboxylic

A4

Acid dicacboxylic

B1

Acid được diamine hóa

B2

Các acid amin được diamine hóa

B (2-4)

Cầu liên kết

• Phân loại số
Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về mức độ giống nhau giữa các
vi sinh vật trong một số lớn các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so
sánh các chủng với nhau theo từng đôi một, hiện nay có một số công thức tính


9
hệ số giống nhau.Trong đó công thức của Sokal và Mitchener (SSM) và công
thức của Jaccard (SJ) được sử dụng nhiều nhất.
Công thức của Sokal và Michener (SSM)
SSM (AB)= (Ns + + Ns-)* 100/ (Ns + + Ns- + Nd)
Trong đó:
SSM (AB) : Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%).
Ns +

: Số các tính trạng giống nhau.

Nd

: Số các tính trạng khác nhau.

Ns-

: Số các tính trạng đối lập nhau.

Công thức của Jacard (SJ)
SJ(AB)= Ns * 100/ (Ns + Nd)
Trong đó:
SJ(AB) : mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%).
Ns

: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng so sánh.

Nd

: Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương tính của

chủng này và âm tính của chủng kia).

Kết quả của sự so sánh số học được biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tùy
thuộc mức độ giống nhau mà các vi sinh vật được xếp vào các nhóm. Bằng
phương pháp phân loại số học Streptomyces được chia ra làm các nhóm lớn
(major clusters), nhóm nhỏ (minor clusters) và các nhóm đơn thành viên
(single member clusters).
•

Nghiên cứu về chủng loại phát sinh

Nhờ sự sắp xếp chủng loại phát sinh mà các vi sinh vật được sắp xếp
vào hệ thống phân loại gần tự nhiên hơn.

Các nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm xây dựng cây phát sinh
chủng loại bằng cách tiến hành so sánh các cao phân tử DNA, RNA, protein
mà quan trọng hơn cả là sự sắp xếp các nucleotide của rRNA 16S. Mức độ
giống nhau giữa hai cá thể so sánh càng lớn thể hiện mối quan hệ giữa chúng
càng chặt chẽ.


10
1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Tùy loại môi trường mà xạ khuẩn có hình thái khác nhau. Trên môi
trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc. Tùy theo loài, môi
trường nuôi cấy mà kích thước màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau như đỏ,
da cam, hồng, vàng, nâu, xám... Khuẩn lạc xạ khuẩn có thường chắc, xù xì,
dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo và có cấu trúc 3 lớp: lớp ngoài có cấu trúc
sợi bện chặt, lớp giữa có dạng cấu trúc tổ ong và lớp trong cùng có cấu trúc
tương đối xốp. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn có hướng sinh trưởng trong môi
trường tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trường tạo ra HSKS. Đường kính hệ
sợi xạ khuẩn thay đổi theo trong khoảng 0,02 - 0,1 µm đến 2 - 3 µm. Đa số
các xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh, không có vách ngăn. Màu sắc hệ
sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng, da cam, nâu, tím, đen... HSCC
có thể sinh sắc tố tan trong nước hoặc tan trong dung môi hữu cơ. HSKS ở tận
cùng thường là các chuỗi bào tử xoắn, lượn sóng, thẳng, vòng... Đây là đặc
điểm khá quan trọng để phân loại xạ khuẩn [1].
Các bào tử xạ khuẩn có thể có hình tròn, bầu dục, hình que, hay hình
trụ... Cấu trúc bề mặt bào tử có thể nhẵn (Smooth), có gai (Spinny), khối u
(Warty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hairy). Hình dạng, kích thước, cấu
trúc bề mặt bào tử cũng là một trong những tiêu chí quan trọng để định loại xạ
khuẩn [1].
Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc

thành dạng màng hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy. Trên bề mặt môi
trường hay dạng bọt hoặc kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy
lắc hoặc nồi lên men được khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi
bông hoặc cặn xốp. Nhưng thường gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành
những quả cầu nhỏ chứa đầy môi trường, kích thước từ 0,1 mm đến 3 mm.


11
1.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu tạo tương đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào,
màng tế bào, vật chất nhân sơ, các hạt dự trữ. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh
vật Gram+. Thành tế bào dày khoảng 20 nm có vai trò duy trì hình dạng hệ sợi
và bảo vệ tế bào, được cấu tạo chủ yếu gồm các lớp glycopeptide gồm các
gốc N- AcetylGlucosamine liên kết với N- AcetylMuramic.
Căn cứ vào kết cấu hóa học của thành tế bào xạ khuẩn có thể chia thành
thành 4 nhóm sau:
Nhóm 1 (Type I): có chứa L- ADP (L- diaminopimelic và glixin). Gồm
các chi Streptomyces, Norcarsioider...
Nhóm 2 (Type II): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic) và glixin.
Gồm các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella...
Nhóm 3 (Type III): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic). Gồm có
Actinomadura, Actinobigfida, Micromobispora...
Nhóm 4 (Type IV): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic), đường
araninose, galactose. Gồm có Norcardia, Pseudonocardia, Microbacterium...
Khuẩn lạc xạ khuẩn tuy có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau
nhưng toàn bộ hệ sợi chỉ là một tế bào có nhiều nhân, không có vách ngăn
ngang. Giống như vi khuẩn, nhân thuộc loại đơn giản, không có màng nhân.
Thành tế bào xạ khuẩn giống thành tế bào vi khuẩn Gram+. Màng tế bào chất
dày khoảng 50 nm và có cấu trúc tương tự màng tế bào chất của vi khuẩn.
Nhân không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng

nhân. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thế sau đó hình thành
nhiều hạt rải rác trong toàn bộ khuẩn ty (gọi là hạt cromatin) [10].
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu,
acid hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon,


12
còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt...để là nguồn nitơ. Ở các
loài khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là khác nhau. Phần lớn
xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và
phát triển là 25 - 300C. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt nhất trong môi trường
pH là 6,8 - 7,0, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trường kiềm [22].
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram+, đặc biệt khác với các vi sinh vật
khác của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao (trên 70%), trong khi đó ở vi khuẩn
tỷ lệ này khá thấp (25 - 45%). Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ
khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp
lại trong phân tử DNA. Điều này gây ra tính đa dạng về hình thái, tính chất sinh
lý, sinh hóa của xạ khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính
kháng sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose...) [22].
Đặc điểm của chi xạ khuẩn Streptomyces
Chi Streptomyces có số lượng loài mô tả lớn nhất, chi này có HSKS,
HSCC phát triển và phân nhánh, khuẩn lạc thường không lớn, đường kính
khuẩn lạc từ 1- 5 mm. Khuẩn lạc chắc dạng da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề
mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn HSCC và đôi
khi không thấm nước. Chuỗi bào tử được tạo thành trên cuống sinh bào tử,
chúng có thể thẳng, lượn sóng hoặc xoắn. Bề mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì, có
thể lông hoặc có gai. Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác nhau,
sắc tố này có thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi trường.
Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo tế bào của vi khuẩn Gram+, là

vi sinh vật hiếu khí, dị dưỡng. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 25 - 300C, pH tối
ưu là 6.5 - 8.0. Một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn
(xạ khuẩn ưa nhiệt và xạ khuẩn ưa ẩm). Bên cạnh các đặc điểm hình thái, nuôi
cấy trên xạ khuẩn thuộc chi này còn có đặc điểm hóa phân loại sau:
Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin


13
Type Peptidoglycan
Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15 - 17 C với số lượng
ít và số lượng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15 - 17 Canteiso
Dạng menaquinon: MK-9 (H6) hoặc MK-9 (H9)
Dạng photpholipit : PII
Không có axit mycolic [21].
1.2.4. Sinh sản của xạ khuẩn
Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử. Bào tử được hình thành trên
các nhánh phân hóa từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh
bào tử ở các loài xạ khuẩn có kích thước và hình dạng khác nhau. Có loài dài
tới 100 - 200 nm, có loài chỉ dài 20 - 30 nm. Có cấu trúc theo hình lượn sóng.
Có loài hình lò xo hay xoắn ốc. Sắp xếp các cuống sinh bào tử cũng khác
nhau mọc đơn, mọc đối, mọc vòng hoặc từng chùm. Bào tử được hình thành
từ cuống sinh bào tử theo kiểu kết đoạn (fragmentation) hoặc cắt khúc
(Segmentation). Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn còn có hình
thức sinh sản bằng khuẩn ty. Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trường phát triển
thành hệ khuẩn ty [13].
1.3. Cellulose và cellulase
1.3.1. Cellulose
Cellulose là một polysaccarite mạch thẳng gồm từ 1400 - 12000 gốc β D - glucose liên kết với nhau bởi các liên kết β -1,4-glucoside. Trong phân tử
cellulose các phân tử β - D-glucose có cấu trúc không gian dạng ghế bành.
Hai phân tử khác nhau góc quay 1800. Cellulose là loại hợp chất hữu cơ dồi

dào trong tự nhiên chiếm tới 40 - 50% hydratcacbon.
Cellulose có cấu trúc dạng sợi song song, dài khoảng 5 µm với đường
kính 3 nm. Các sợi này liên kết với nhau bởi các liên kết hydro và các liên kết
Vandervan tạo thành các bó sợi nhỏ có đường kính 10 - 40 nm gọi là các vi


14
sợi (microfibrin). Các vi sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc
mixen của cellulose. Cellulose dạng mixen gồm 2 vùng:
Vùng kết tinh (Crystolline regions): có các sợi chặt chẽ, đậm đặc ngăn
cản sự hấp thụ nước và ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm 3/4cấu
trúc cellulose.
Vùng vô định hình (Amorphous regions): có cấu trúc kém chặt chẽ, dễ
bị trương lên và dễ bị phân giải.
Trong tự nhiên cellulose khá bền vững, không tan và không bị trương
lên khi hấp thụ nước. Cellulose bị phân hủy khi đun nóng với acid kiềm ở
nồng độ khá cao, hoặc bị phân giải bởi các cellulase sinh ra từ nhiều loại sinh
vật [20].
Ứng dụng trong quá trình thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển
hóa các vật chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo lên nguồn
năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản
phẩm giàu năng lượng khác. Ví dụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản
phẩm từ bột giấy và giấy có thể thu nguồn năng lượng như ethanol.
1.3.2. Cellulase
Enzyme cellulase xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành các
sản phẩm hòa tan dễ sử dụng. Hệ thống cellulase gồm 3 loại chính sau:
Endo-β-glucanase hay 1,4- β- D- Glucanhydronase, cellobiohydrolase
(CBH), CMC-ase (Cx): enzyme này tấn công vào các điểm khác nhau trên
chuỗi cellulose của CMC, cellulose trương phồng, các cello- oligosaccaride.
Chúng phân cắt các chuỗi cellulose một cách ngẫu nhiên, sản phẩm tạo thành

là glucose và các oligosaccaride (có thể từ 3 - 6 C hoặc nhiều hơn). Sự phân
cắt này hình thành các đầu khử tự do, tạo điều kiện cho exoglucanase hoạt
động. Bởi vậy cellulose vùng kết tinh được phân giải triệt để và hiệu quả.


15
Exo- β-glucanase hay 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase, Avicelase:
enzyme này tấn công vào những đầu không khử (non-reducing end) của
cellulose và kết quả là tạo ra các cellobiose.
β - glucosidase hay cellobiase: thủy phân cellobiose và một vài cellooligosaccaride thành glucose. Hoạt tính của β-glucosidase mạnh nhất trên
cellobiose và giảm dần theo chiều dài của chuỗi [20].
1.3.3. Hệ enzyme phân giải cellulose
Một số vi sinh vật phân giải được cellulose là nhờ phức hệ enzyme
cellulase gồm 4 enzyme khác nhau tác dụng với các mối liên kết của
cellulose.
Đầu tiên enzyme cellobiohydrolase có tác dụng cắt đứt liên kết hydro,
biến cellulose tự nhiên có cấu hình không gian dạng cellulose vô định hình
không có cấu trúc lớp. Enzyme thứ hai là endogluconase có khả năng cắt đứt
liên kết β-1,4-glucoside tạo thành những chuỗi dài. Enzyme thứ ba là
exogluconase tiến hành phân giải các chuỗi trên thành disaccaride gọi là
cellobinose. Enzyme thứ tư là β- glucosidase tiến hành thủy phân cellobinose
thành glucose.
Hệ enzyme cellulase còn gọi là enzyme thủy phân vì nó tiến hành thủy
phân cellulose. Mặt khác nó còn được goi là enzyme ngoại bào, vì trong quá
trình sống của vi sinh vật phân giải cellulose, enzyme này được tổng hợp bên
trong tế bào và được tiết ra bên ngoài, tiến hành thủy phân cellulose bên ngoài
tế bào được glucose, glucose được hấp thụ vào bên trong tế bào phục vụ cho
mọi hoạt động sống của vi sinh vật phân giải cellulose [20].
1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase ở Việt Nam và trên thế
giới

Hằng năm hoạt động trong ngành nông nghiệp đã thải ra môi trường
hàng ngàn tấn phế phẩm và đang là một trong những nguyên nhân gây ô


16
nhiễm môi trường. Nếu lượng phế phẩm này được xử lý làm thức ăn gia súc
hoặc phân bón vi sinh thì sẽ là một nguồn lợi lớn. Vì vậy trê thế giới và Việt
Nam đã có những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của các vi sinh vật
trong đất để phân giải cellulose từ các phế phẩm nông nghiệp. Đặc biệt xạ
khuẩn là một loài vi sinh vật có khả năng sinh cellulase khá mạnh và có thể
cho nguồn enzyme dồi dào phục vụ cho việc xử lý rác thải, chế biến ức ăn gia
súc probiotin...
Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật
nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở mức
cao nhất. Người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ sung vào khẩu phần thức
ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các enzyme có sẵn trong đường
tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn giúp cho con vật tiêu
hóa được tốt hơn. Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi gia súc. Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế
phẩm enzyme này mà thường bổ sung với các enzyme khác như: amylase,
protease, xylanase... tạo ra một chế phẩm chứa nhiều enzyme. Việc bổ sung
nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải được nhiều loại cơ chất, vật nuôi sẽ
hấp thụ tốt hơn các nguồn thức ăn khác nhau.
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về xạ khuẩn và khả năng sinh cellulase
của nó vẫn còn khá mới. Đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong
thức ăn chăn nuôi nhưng đối tượng nghiên cứu chủ yếu lại là nấm mốc, nấm
men... như: Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn bằng cách sử dụng
Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho
trâu, bò. Chu Thị Thanh Bình và cộng sự (2002) đã ứng dụng các chủng nấm
men trong bã thải sinh hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia súc. Đặng Minh

Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng
sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006). Những nghiên cứu này chủ