Sử dụng kỹ thuật PCRRFLP trong nghiên cứu mối tương quan của đoạn Gene GH đến sinh trưởng của lợn rừng lai

viii
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

NGUYỄN THỊ QUYÊN
Tên đề tài:
SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP TRONG NGHIÊN CỨU MỐI
TƢƠNG QUAN CỦA ĐOẠN GENE GH ĐẾN SINH TRƢỞNG CỦA
LỢN RỪNG LAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH & CNTP

Khóa học

: 2011-2015

Thái Nguyên, năm 2015

viii
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

NGUYỄN THỊ QUYÊN
Tên đề tài:
SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP TRONG NGHIÊN CỨU MỐI
TƢƠNG QUAN CỦA ĐOẠN GENE GH ĐẾN SINH TRƢỞNG
CỦA LỢN RỪNG LAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: 43 – CNSH

Khoa

: CNSH & CNTP

Khóa học

: 2011 – 2015

Giảng viên hƣớng dẫn : 1. TS.Dƣơng Văn Cƣờng
2. PGS.TS Ngô Xuân Bình
Thái Nguyên, năm 2015


viii

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành đƣợc khóa
luận tốt nghiệp này bên cạnh sự nỗ lực của bản thân em đã nhận đƣợc sự
chỉ bảo, giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình và những lời động viên từ thầy cô, bạn
bè và gia đình.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Dƣơng Văn
Cƣờng và ThS. Ma Thị Trang, ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ em
trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng nhƣ trong quá trình hoàn chỉnh
luận văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong Khoa Công Nghệ
Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ em trong suốt
thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ, anh chị làm việc tại Viện
Khoa học sự sống – ĐH Thái Nguyên đã tạo điều kiện để em học tập và hoàn
thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân, bạn bè đã
luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ em những lúc khó khăn trong quá trình học
tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày

tháng

Sinh viên

Nguyễn Thị Quyên

năm 2015


viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Vị trí cắt của enzyme giới hạn DdeI ............................................... 12
Bảng 3.1: Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong đề tài ........................... 24
Bảng 3.2: Các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm........................................ 25
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gene GH............................ 31
Bảng 3.4: Sản phẩm PCR của đoạn gene GH đƣợc xử lý bởi enzyme giới hạn
DdeI ................................................................................................................. 32
Bảng 4.1: Tỉ số OD260 nm/OD280 nm và nồng độ của DNA................................ 37
Bảng 4.2: Tỷ lệ các kiểu gene GH ở các quần thể lợn nghiên cứu ................. 41
Bảng 4.3: Tần số các alen D1 và D2 của đoạn gene GH ở các quần thể lợn . 43
Bảng 4.4: Sinh trƣởng tích lũy của lợn rừng lai và lợn Yorkshire đối chứng
(kg) .................................................................................................................. 44
Bảng 4.5: Sinh trƣởng tuyệt đối của lợn rừng lai và lợn Yorkshire đối chứng
(g/con/ngày) .................................................................................................... 46


viii
DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 2.1: Chu kỳ thứ nhất của phản ứng PCR.................................................. 9
Hình 2.2: Hình ảnh mô phỏng kiểu gene GH ở lợn ........................................ 13
Hình 2.3: Kích thƣớc các alen có trong quần thể lợn ..................................... 14
Hình 2.4: Kích thƣớc các đoạn DNA dự kiến thu đƣợc khi phân tích đa hình
đoạn gene GH bằng DdeI ................................................................................ 15
Hình 2.5: Hình ảnh mô phỏng vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI trên đoạn
gene GH........................................................................................................... 16
Hình 2.6: Đoạn gene GH nghiên cứu, vị trí cắt của enzyne DdeI và trình tự
dich mã sang protein của đoạn gene GH......................................................... 17
Hình 3.1: Sơ đồ quy trình phân tích đa hình gene GH bởi enzyme DdeI ....... 27
Hình 3.2: Sơ đồ các quy trình chiết DNA tổng số ......................................... 30
Hình 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene GH ...... 31
Hình 4.1: Hình ảnh 2 giống lợn nghiên cứu: Lợn rừng lai và Lợn Yorkshire 35
Hình 4.2: Sản phẩm DNA tách chiết từ mẫu mô tai lợn ................................. 36
Hình 4.3: Sản phẩm PCR nhân lên từ cặp mồi GH ........................................ 39
Hình 4.4: Kết quả phân tích đa hình đoạn gene GH bằng DdeI ..................... 40
Hình 4.5: Biểu đồ tần số các kiểu gene ở lợn rừng lai và giống Yorkshire đối
chứng ............................................................................................................... 42
Hình 4.6: Biểu đồ tần số alen D1 và alen D2 của đoạn gene GH ................... 44


viii
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Bp

: Base paire

DNA

: Deoxyribonucleic acid

dNTP

: Deoxyribonucleoside triphosphate

EtBt

: Ethidium bromid

TBE

: Tris boric acid – EDTA

TE

: Tris – EDTA

RNA

: Ribonucleic acid

PCR

: Polymerase chain Reaction

RFLP

: Restriction Fragment Length Polymorphism DNA

OD

: Optical density

v/p

: Vòng/phút

Cs

: Cộng sự

CIAA

: 24 Chloroform: 1 Isoamylacohol


viii

MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU ........................................................................................... 2
1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 2
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ...................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa của đề tài ........................................................................................... 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ..................................................................................2
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn .........................................................................3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4
2.1. Đặc điểm chung của lợn rừng lai .................................................................. 4

2.2. Đặc điểm chung của lợn Yorkshire ............................................................... 5
2.3. Cơ sở khoa học ............................................................................................... 5
2.3.1. Khái niệm về sinh trƣởng và phát triển ................................................5
2.3.1.1. Khái niệm về sinh trƣởng ........................................................... 5
2.3.1.2. Khái niệm về phát triển .............................................................. 6
2.3.1.3. Mối quan hệ giữa sinh trƣởng và phát triển ............................... 6
2.3.2. Các chỉ tiêu liên quan đến khả năng sinh trƣởng của lợn ....................6
2.3.3. Khái niệm về đa hình gene ...................................................................6
2.3.4. Khái quát về phần mềm Vector NTI ....................................................7
2.3.5. Phƣơng pháp tách chiết DNA ...............................................................8
2.3.6. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ...............................9
2.3.7. Kỹ thuật PCR-RFLP ...........................................................................10
2.4. Gene hormone sinh trƣởng GH (Growth Hormone).................................. 12
2.5. Các kiểu gene trong phân tích đa hình đoạn gene GH bằng enzyme DdeI 14
2.6. Vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI trên gene GH ..................................... 15
2.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc................................................. 18


viii
2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .....................................................18
2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .......................................................20
PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 23
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 23
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu .........................................................................23
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................23
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành................................................................... 23
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ...........................................................................23
3.2.2. Thời gian tiến hành .............................................................................23
3.3. Vật liệu, hóa chất và trang thiết bị............................................................... 23
3.3.1. Vật liệu ................................................................................................23

3.3.2. Hóa chất...............................................................................................24
3.3.3. Trang thiết bị .......................................................................................25
3.4. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 26
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi ...................................... 26
3.5.1. Quy trình thực hiện .............................................................................27
3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi ...........................................................................27
3.5.2.1. Các chỉ tiêu nghiên cứu đa hình gene ....................................... 27
3.5.2.2. Các chỉ tiêu theo dõi về sinh trƣởng ......................................... 27
3.5.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................28
3.5.3.1 Lấy mẫu mô tai .......................................................................... 28
3.5.3.2. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch DNA tổng số .................. 28
3.5.3.3. Phƣơng pháp PCR .................................................................... 30
3.5.3.4. Phƣơng pháp PCR-RFLP ......................................................... 32
3.5.3.5. Phƣơng pháp phân tích kết quả ................................................ 32
3.5.4. Sinh trƣởng tuyệt đối và sinh trƣởng tƣơng đối của lợn thí nghiệm .33
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 35


viii
4.1. Đặc điểm hình thái cơ bản của đối tƣợng nghiên cứu và đối chứng......... 35
4.2. Kết quả phân tích đa hình đoạn gene GH ................................................... 36
4.2.1. Tách chiết DNA tổng số .....................................................................36
4.2.1.1. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số ................................... 36
4.2.1.2. Kết quả đo OD260nm/OD280nm và nồng độ của DNA ................. 37
4.2.2. Kết quả PCR đoạn gene GH bằng cặp mồi đặc hiệu ......................38
4.2.3. Kết quả phân tích đa hình đoạn gene GH bằng DdeI ........................39
4.3. Kết quả phân tích mối tƣơng quan của đoạn gene GH đến khả năng sinh
trƣởng của lợn rừng lai. ....................................................................................... 44
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................. 49
5.1. Kết luận ......................................................................................................... 49

5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 51
I. Tiếng Việt ......................................................................................................... 51
II. Tiếng Anh........................................................................................................ 52
III. Các tài liệu tham khảo từ Internet................................................................49


2

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Những năm qua chăn nuôi lợn của nƣớc ta đã có những bƣớc phát
triển nhanh chóng và đóng góp khoảng 70% tổng sản phẩm tiêu thụ của
ngành chăn nuôi (Cục chăn nuôi, 2012) [1]. Hiệu quả của ngành chăn nuôi
lợn phụ thuộc rất nhiều vào tốc độ tăng trọng, sản lƣợng thịt và khả năng
sinh sản. Hơn nữa, theo xu hƣớng hiện nay, thị hiếu ngƣời tiêu dùng đã quan
tâm hơn tới chất lƣợng sản phẩm và các giá trị dinh dƣỡng nhằm đảm bảo
vấn đề sức khỏe thay vì chỉ quan tâm đến giá cả sản phẩm nhƣ trƣớc đây

.

Trƣớc nhu cầ u của thị trƣờng , các nhà chọn giống đã chú ý đến chọn lọc
giống vâ ̣t nuôi để nâng cao chất lƣợng thịt : tỷ lệ nạc, độ mềm, màu sắc và độ
ngọt của thịt cũng nhƣ khả năng tăng trọng.
Một hƣớng đi mới trong chăn nuôi hiện nay đó là thuần hóa lợn
rừng, lai tạo với lợn nhà đƣợc nhiều hộ gia đình miền núi nuôi phổ biến
theo hình thức bán hoang đã đang hứa hẹn trở thành hƣớng làm kinh tế
hiệu quả cao. Lợn rừng lai mang ƣu thế lai cao của cả bố và mẹ, do đƣợc
nuôi chăn thả tự do, vận động cả ngày nên lợn có sức đề kháng và khả năng

chịu đựng kham khổ với môi trƣờng tự nhiên cao, ít dịch bệnh, thịt nhiều
nạc, ít mỡ, thịt lợn thơm ngon rất đặc trƣng, hàm lƣợng Cholesteron thấp...
(Trung Tâm Khuyến Nông Lâm Đồng, 2010) [12].
Trong những thâ ̣p kỷ vừa qua việc chọn lọc giống vâ ̣t nuôi chủ yếu
dựa vào kiểu hình . Ngày nay, với sự phát triển của các kỹ thuâ ̣t h iện đại các
nhà nghiên cứu đã chọn lọc giống vâ ̣t nuôi dựa vào các chỉ thị phân tử , tăng
khả năng chính xác, rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả chọn lọc. Trong


2

đó, nghiên cứu các mối liên quan về đa hình gene với các tính trạng sinh
trƣởng là rất quan trọng trong công tác chọn giống (Nguyễn Văn Nơi, Trần
Văn Phùng et al, 2010) [6]. Gene GH (Growth Hormone – Hormone sinh
trƣởng) là một trong những gene liên quan đến khả năng sinh trƣởng của lợn
đã đƣợc các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu. Hormone sinh trƣởng
(GH) là một trong những nhân tố quan trọng nhất cho sự tăng trƣởng và phát
triển của tế bào động vật (Mariusz Pierzchała, Tadeusz Blicharski et al,
2004) [22]. Số lƣợng hormone sinh trƣởng ở lợn có liên quan đến khả năng
vỗ béo, thành phần thân thịt, chất lƣợng thịt và khả năng chống lại các stress
(C. Knorr, G.Moser et al, 1997) [15]. Sự đa hình gene hormone sinh trƣởng
còn ảnh hƣởng đến khả năng tăng trọng hằng ngày, tỷ lệ nạc, mỡ và nồng độ
hormone sinh trƣởng trong huyết thanh (Nielsen, Larsen et al, 1995) [24].
Xuất phát từ những cơ sở khoa học trên, với mục đích ứng dụng những
tiến bộ của kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử vào trong chăn nuôi lợn rừng lai
để có đƣợc hiệu quả kinh tế cao nhất cho ngƣời chăn nuôi mà sản phẩm vẫn giữ
đƣợc phẩm chất và hƣơng vị đặc trƣng, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Sử dụng
kỹ thuật PCR-RFLP trong nghiên cứu mối tƣơng quan của đoạn gene GH
đến sinh trƣởng của lợn rừng lai”.

1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
- Nghiên cứu đa hình đoạn gene GH trên lợn rừng lai.
- Nghiên cứu mối tƣơng quan của phân đoạn gene GH đến khả năng
sinh trƣởng của lợn rừng lai và lợn Yorkshire đối chứng.

1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Xác định đƣợc đa hình đoạn gene GH là cơ sở khoa học cho việc
nghiên cứu mối tƣơng quan giữa kiểu gene GH tới tốc độ sinh trƣởng của
lợn rừng lai và lợn Yorkshire.


3

1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
- Xác định đƣợc đa hình trên đoạn gene GH liên quan tới khả năng
sinh trƣởng là cơ sở bƣớc đầ u cho chọn lọc giống lợn ở mức độ phân tử.
- Kết quả nghiên cứu về sinh trƣởng của lợn rừng lai là cơ sở tạo tiền
đề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm ứng dụng công nghệ hiện đại vào
công tác chọn tạo giống lợn rừng lai mang những đặc điểm nổi trội nhằm
mang lại hiệu quả kinh tế cao cho ngƣời chăn nuôi, phát triển loại lợn này
phục vụ nhu cầ u của thị trƣờng và phát triển kinh tế xã hội ở địa phƣơng.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đặc điểm chung của lợn rừng lai
Nguồn gốc của lợn rừng lai: Lợn rừng lai là con lai giữa lợn rừng đực

với lợn nái là lợn địa phƣơng thả rông của ngƣời đồng bào dân tộc thƣờng
nuôi (giống lợn gần nhƣ hoang dã) tạo ra con lai với ƣu thế lai cao của cả bố
và mẹ (Trung Tâm Khuyến Nông Lâm Đồng, 2010) [12].
Đặc điểm chung của lợn rừng lai
Vóc dáng: Lợn rừng lai cân đối, nhanh nhẹn, di chuyển linh hoạt,
hơi gầy, dài đòn, lƣng thẳng, bụng thon, chân dài và nhỏ, cổ dài, đầu nhỏ,
mõm dài và nhọn, tai nhỏ vểnh và thính, răng nanh phát triển mạnh, da,
lông màu hung đen hay xám đen, một gốc chân lông có ba ngọn, lông dọc
theo sống lƣng và cổ dày, dài và cứng hơn, ánh mắt lấm lét, hoang dã.
Trọng lƣợng lúc trƣởng thành (con đực thƣờng lớn hơn con cái), con đực
nặng 50 - 70kg, con cái nặng 30 - 40kg.
Tập tính sinh hoạt và môi trƣờng sống: Lợn rừng lai hơi nhút nhát,
thính giác, khứu giác tốt, sinh hoạt bầy đàn và chọn lọc tự nhiên thể hiện
tính hoang dã. Thích sống theo bầy đàn nhỏ vài ba con, lợn đực thƣờng
thích sống một mình (trừ khi lợn cái động dục).
Môi trƣờng sống thích hợp là vƣờn cây, trảng cỏ gần ao hồ… Thích
hoạt động về ban đêm, ban ngày tìm nơi yên tĩnh, kín đáo để ngủ.
Chất lƣợng thịt: Thịt lợn rừng lai màu hơi nhạt, không đỏ nhƣ thịt
lợn nhà, nhƣng nhiều nạc, ít mỡ, tỷ lệ hao hụt rất thấp, da mỏng, thịt thơm
ngon rất đặc trƣng, hàm lƣợng Cholesteron thấp (Trung Tâm Khuyến Nông
Lâm Đồng, 2010) [12].


5

2.2. Đặc điểm chung của lợn Yorkshire
Nguồn gốc xuất xứ: Vào những năm đầu thế kỷ XVI, nhiều ngƣời chú
ý đến việc phát triển chăn nuôi lợn ở Anh. Đến năm 1770, lợn Trung
Quốc đƣợc nhập vào Anh theo chủng Sus indicus và R cho lai tạo với Sus
scrofa. Mãi cho tới năm 1851 Joseph BL. Luley, là ngƣời đã tạo giống lợn

Yorkshire ở vùng Bắc Shires. Trong thời gian này, nhà chọn giống
Bakewell đã cải tạo lợn Leicestershire, của giống lợn đại phƣơng Bắc
Shires, Yorkshire và Lancashire, của Lincolnshire và Leicestershire để tạo
ra giống lợn Yorkshire ngày nay nhƣng đến năm 1884, Hội đồng giống
Hoàng gia Anh mới công nhận giống lợn Yorkshire.
Đặc điểm ngoại hình: Toàn thân có màu trắng, lông có ánh vàng, đầu
nhỏ, dài, tai to dài hơi hƣớng về phía trƣớc, thân dài, lƣng hơi vồng lên, chân
cao khỏe và vận động tốt, chắc chắn, tầm vóc lớn.
Chỉ tiêu năng xuất: lợn đực trƣởng thành nặng tới 330 - 380 kg, lợn
cái trƣởng thành nặng 220 - 280 kg. Lợn nái đẻ từ 10-12 con/ lứa, nuôi con
khéo. Lợn nuôi thịt đạt khối lƣợng 90 kg ở 165 - 185 ngày tuổi. Lợn thuộc
giống lợn cho nhiều nạc, tỷ lệ nạc đạt 52-55 % (Nguyễn Thanh Sơn, Phạm
Văn Duy et al, 2008) [7].
Lợn Yorkshire là giống lợn phổ biến nhất trên thế giới. Đến 1964,
lợn đƣợc nhập vào miền Bắc thông qua Liên Xô cũ. Những năm sau 1990,
Yorkshire đƣợc nhập vào ta qua nhiều con đƣờng của nhà nƣớc, công ty và
từ nhiều dòng khác nhau nhƣ Yorkshire Pháp, Bỉ, Anh, Úc, Mỹ, Nhật [29].
2.3. Cơ sở khoa học
2.3.1. Khái niệm về sinh trưởng và phát triển
2.3.1.1. Khái niệm về sinh trưởng
Sinh trƣởng là sự gia tăng về kích thƣớc và khối lƣợng cơ thể (ở mức
độ tế bào, mô, cơ quan và toàn bộ cơ thể) theo thời gian.
Đặc điểm:


6

- Tốc độ sinh trƣởng không đồng đều qua các giai đoạn.
- Tốc độ sinh trƣởng các bộ phận, cơ quan, hệ cơ quan không giống nhau.
- Quá trình sinh trƣởng của cơ thể đạt tối đa khi cơ thể trƣởng thành.

2.3.1.2. Khái niệm về phát triển
Phát triển là quá trình tăng lên về khối lƣợng, kích thƣớc, thể tích
trong từng giai đoạn khác nhau và các tế bào mới sinh hình thành nên các cơ
quan tổ chức với một chức năng mới.
2.3.1.3. Mối quan hệ giữa sinh trưởng và phát triển
Sinh trƣởng và phát triển của cơ thể có liên quan mật thiết với nhau,
đan xen lẫn nhau và luôn luôn liên quan đến môi trƣờng.
- Sinh trƣởng tạo tiền đề cho phát triển.
- Phát triển làm thay đổi tốc độ sinh trƣởng.
2.3.2. Các chỉ tiêu liên quan đến khả năng sinh trưởng của lợn
Các chỉ tiêu sinh trƣởng thƣờng dùng khi nghiên cứu khả năng sinh
trƣởng của vâ ̣t nuôi là:
- Sinh trƣởng tích luỹ : là khối lƣợng , kích thƣớc , thể tích của vâ ̣t
nuôi tích luỹ đƣợc qua thời gian khảo sát . Các thông số thu đƣợc qua các lầ n
cân đo là biểu thị sinh trƣởng tích luỹ của vâ ̣t nuôi .
Sinh trƣởng tuyệt đối (A): là khối lƣợng, kích thƣớc, thể tích của vâ ̣t
nuôi tăng lên trong một đơn vị thời gian. Đối với lợn, đơn vị sinh trƣởng
tuyệt đối thƣờng là g/con/ngày.
Sinh trƣởng tƣơng đối (R): là tỷ lệ % của phầ n khối lƣợng (thể tích,
kích thƣớc) tăng lên so với khối lƣợng (thể tích, kích thƣớc) thời điểm cân
đo. Đơn vị sinh trƣởng tƣơng đối thƣờng là %.
2.3.3. Khái niệm về đa hình gene
Đa hình là sự tồn tại ở nhiều dạng khác nhau của một tính trạng trong
quầ n thể. Đa hình cũng đƣợc định nghĩa nhƣ là các dạng khác nhau của một
gene trong quầ n thể (Phạm Thành Hổ, 2008) [4].


7

Trong chọn giống động vật nuôi dựa vào tính trạng, cần phải lƣu ý tới

sự đa hình, đây là khái niệm mô tả một hiện tƣợng biểu hiện di truyền mà ở
đó, nhiều tính trạng khác nhau của một đặc tính nào đó cùng biểu hiện ở vật
nuôi. Trong sinh học, sự đa hình có thể định nghĩa nhƣ là sự xảy ra hai hay
nhiều dạng (hình) của cùng một tính trạng.
Sự đa hình DNA là những biến đổi trong trình tự DNA của một cá thể,
sự biến đổi đó có thể, hay không thể ảnh hƣởng lên kiểu hình. Sự biến đổi này
thƣờng đƣợc phát hiện qua nhiều phƣơng pháp sinh học phân tử khác nhau.
Những biến đổi đƣợc phát hiện có ảnh hƣởng lên kiểu hình đƣợc xem nhƣ
một marker đặc hiệu cho biến đổi đó. Điều đó có nghĩa là nếu một cá thể có
cùng sự đa hình đó, có thể sẽ biểu hiện một vài đặc điểm tƣơng tự khác.
Các marker DNA đƣợc thiết lập nhằm phát hiện sự đa hình DNA của
từng cá thể. Sự đa hình này sẽ đƣợc chọn là marker cho những biểu hiện tính
trạng. Vì thế, trong công nghiệp, ngƣời ta sử dụng chúng trong chọn giống,
chọn các đối tƣợng mạng tính trạng tốt. Có thể chia thành các nhóm chính sau:
Các marker cổ điển: phân tích DNA ty thể (mtDNA), các DNA marker dựa vào
PCR (PCR-base marker), marker dựa vào phƣơng pháp lai (Hybridization
based marker), các marker dựa vào giải trình tự (Sequencing based marker)
(Phạm Thành Hổ, 2008) [4].
2.3.4. Khái quát về phần mềm Vector NTI
Phần mềm Vector NTI đƣợc phát triển bởi hãng Invirogen. Phần mềm
này có một số chức năng sau:
- Phân tích trình tự đã lựa chọn và thiết kế mồi PCR cho trình tự
đó, dựa trên các thông số nhƣ: nhiệt độ nóng chảy, %GC và chiều dài
đoạn khuếch đại.
- Phân tích phân tử DNA/RNA và xác định khung đọc mở (ORFs).
- Phân tích phân tử DNA/RNA và xác định các vị trí giới hạn trên
phân tử đó.


8

- Sắp xếp thành hàng các trình tự của hai hoặc nhiều phân tử DNA/RNA.
- Sử dụng để lắp ghép các đoạn DNA (cả các trình tự nguyên bản và
sắc phổ) thành trình tự tiếp giáp dài hơn.
2.3.5. Phương pháp tách chiết DNA
Tách chiết DNA là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ
gene đều tiến hành với DNA. DNA là phân tử có kích thƣớc lớn, do đó
trong quá trình thao tác cần tránh mọi tác nhân cơ học hoặc hóa học mạnh
để đảm bảo độ nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện đƣợc các khâu nghiên
cứu tiếp theo.
Các phƣơng pháp tách chiết cơ bản đều đƣợc tiến hành theo bốn bƣớc:
Bƣớc 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote).
Thông thƣờng tế bào, mô đƣợc nghiền trong nitơ lỏng -196oC hoặc dùng
hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) và proteinase K. Khi đó màng tế bào,
màng nhân sẽ bị phá vỡ và giải phóng DNA ra môi trƣờng và phân hủy
các protein liên kết với DNA.
Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ
yếu là các protein. Mẫu đƣợc bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol:
chloroform: isoamine tỷ lệ 25:24:1) và lắc mạnh, dung dịch này có tác dụng
làm biến tính và kết tủa protein đồng thời không hòa tan DNA, sau khi ly
tâm sẽ tủa thành lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol/chloroform. Pha
nƣớc có chứa DNA đƣợc thu nhận lại.
Bƣớc 3: Kết tủa DNA. Mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận
DNA dƣới dạng cô đặc, một phần nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của
các enzyme. Việc kết tủa DNA đƣợc thực hiện bằng một chất alcohol, phổ
biến nhất là ethanol và isopropanol, với sự có mặt của các cation hóa trị một
(Na+, K+, hay NH4+). DNA kết tủa đƣợc thu lại bằng ly tâm. Một số muối lẫn
trong dung dịch sẽ đƣợc loại bỏ bằng cách rửa với cồn 70%.

9

Bƣớc 4: Hòa tan DNA. Kết tủa DNA sau khi rửa bằng cồn và để khô
tự nhiên đƣợc hòa tan trong TE hoặc nƣớc cất để bảo quản DNA phục vụ cho
các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.6. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phƣơng pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985.
Phƣơng pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo ra số lƣợng bản sao rất lớn của gene
trong một thời gian ngắn. Phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi
tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA. Trên cơ sở trình tự của đoạn DNA
khuôn, đoạn mồi, các nucleotide tự do và enzyme DNA polymerase có thể tổng
hợp đƣợc đoạn DNA đích mong muốn (Khuất Hữu Thanh, 2006) [8].

Hình 2.1: Chu kỳ thứ nhất của phản ứng PCR
Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen đích mong muốn đƣợc lặp lại
nhiều lần các chu kỳ nhân gen, trong một thời gian ngắn số lƣợng bản sao
DNA tạo thành sẽ tăng theo cấp số nhân.


10

 Nguyên lý chung của phương pháp PCR

PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau,
mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: Biến tính: Hai mạch đơn của phân tử DNA đƣợc tách
đôi dƣới tác dụng của nhiệt độ. Ở nhiệt độ cao 90-95oC sẽ làm đứt các liên
kết hydro của phân tử DNA, hai mạch DNA tách rời nhau thành hai mạch
đơn, làm khuôn cho quá trình tổng hợp. Giai đoạn này kéo dài khoảng 30
giây đến 1 phút.

Giai đoạn 2: Gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng đƣợc hạ thấp. Trong hỗn
hợp phản ứng lúc này có mặt hai mạch đơn DNA vừa tách khỏi nhau và hai
mồi. Mỗi đoạn mồi sẽ nhận biết và bám vào một sợi DNA mạch đơn theo
nguyên tắc bổ sung. Cặp mồi đƣợc thiết kế ở hai đầu của trình tự đích và do
đó sự tổng hợp DNA mới chỉ xảy ra với đoạn DNA đích nằm giữa hai mồi.
Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào độ dài và trình tự của mồi, thông thƣờng nằm
trong khoảng 40-70oC và kéo dài khoảng 30 giây đến 1 phút.
Giai đoạn 3: Kéo dài: Nhiệt độ 70-72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt
động của enzyme DNA polymerase. Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt
động tổng hợp các nucleotide tự do vào cuối đoạn mồi theo nguyên tắc bổ
sung và cuối cùng một đoạn DNA mới đƣợc tổng hợp.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, thông thƣờng thực hiện
khoảng 20-40 chu kỳ (Khuất Hữu Thanh, 2006) [8].
2.3.7. Kỹ thuật PCR-RFLP
Sau khi PCR ra đời, có hàng nghìn công trình nghiên cứu liên quan
đến PCR. Các nhà khoa học đã xây dựng thành công nhiều phƣơng pháp
khác nhau ứng dụng trong di truyền phân tử dựa trên nguyên tắc của PCR.
Những phƣơng pháp di truyền dựa trên nguyên tắc PCR là con số chƣa có


11

giới hạn (Ngô Xuân Bình, 2004) [2]. Hiện nay việc ứng dụng phƣơng pháp
PCR-RFLP trong nghiên cứu đa hình di truyền là rất phổ biến.
Phƣơng pháp PCR-RFLP: Là phƣơng pháp nghiên cứu đa hình chiều
dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn . Kỹ thuật này dựa trên đặc
điểm của các loại enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt DNA
khác nhau phân biệt bằng điện di đồ. Các đoạn cắt còn đƣợc gọi là các “dấu
vân tay (Fingerprinting)” đặc trƣng cho từng phân tử DNA. Phƣơng pháp
này đƣợc sử dụng để xác định sự khác biệt về cấu trúc gene quan

tâm giữa các mẫu nghiên cứu.
Nguyên lí: Các mẫu nghiên cứu đƣợc tách chiết, tinh sạch DNA, sau
đó thực hiện phản ứng PCR nhân đoạn gene mong muốn, rồi xử lý bằng
emzyme giới hạn khác nhau . Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhâ ̣n biết và cắt đặc
hiệu DNA ở những vị trí xác định. Do đó, các bộ gene có cấu trúc khác nhau
tạo nên số lƣợng đoạn cắt DNA khác nhau, và có thể có kích thƣớc khác
nhau. Ngƣợc lại, những bộ gene hoàn toàn giống nhau tạo nên số lƣợng và
kích thƣớc các đoạn cắt DNA giống nhau, có thể phát hiện nhờ điện di đồ
(Khuất Hữu Thanh, 2012) [9].
Sau khi nhân đoạn DNA nhờ một cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR
đƣợc cắt bằng một hoặc một số enzyme giới hạn. Sau khi phân tích các sản
phẩm cắt bằng enzyme giới hạn, điện di trên gel có thể thấy đƣợc sự thay thế
các bazơ nitrơ tại vị trí cắt trên DNA đƣợc nhân lên (Nguyễn Văn Nơi, Trần
Văn Phùng et al, 2010) [6].
Kỹ thuật PCR-RFLP có thể phát hiện một số thay đổi trong trình tự
nucleotide liên quan đến vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, phƣơng pháp
này hiện nay đƣợc ƣa thích và sử dụng phổ biến trong nhiều phòng thí
nghiệm trên thế giới do tính đơn giản và chi phí thấp, có khả năng tiến hành
phân tích đồng thời với số lƣợng mẫu lớn, thời gian cho kết quả nhanh
(Wang, Zhang et al, 2009) [27].


12

Trong nghiên cứu này tôi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân đoạn gene GH
với kích thƣớc 605 bp và sử dụng enzyme cắt giới hạn DdeI để nghiên cứu đa hình
gene GH trong quần thể lợn nghiên cứu. Vị trí cắt của enzyme giới hạn DdeI đƣợc
mô tả nhƣ bảng sau:

Bảng 2.1: Vị trí cắt của enzyme giới hạn DdeI

Cặp mồi

Nguồn gốc
Vi khuẩn

GH/DdeI

Desulfovibrio
desulfuricans

Trình tự
5’...CTNAG...3’
3’...GANTC...5’

Vị trí cắt
5’...C TNAG...3’
3’...GANT C...5’

2.4. Gene hormone sinh trƣởng GH (Growth Hormone)
Hormone sinh trƣởng (GH) là một trong những nhân tố quan trọng nhất
cho sự tăng trƣởng và phát triển của tế bào động vật (Mariusz Pierzchała,
Tadeusz Blicharski et al, 2004) [22]. Growth Hormone (GH) là một protein đƣợc
tiết ra bởi các tế bào ƣa acid hoặc somatotropic của thùy trƣớc tuyến yên (Kato,
Shimokawa et al, 1990, Yerle, Lahbib-Mansais et al, 1993) [20,28]. Gene GH
nằm trên cánh tay p của nhiễm sắc thể số 12 của lợn (Yerle, Lahbib-Mansais et
al, 1993, Chowdhary, Thomsen et al, 1994) [28,18], vùng mã hóa gồm 5 exon
với tổng chiều dài phiên mã là 1,7 kb (Vize PD and Wells JR, 1987) [26].
Cogan JD và Phillips JA (1998)[16] nghiên cứu cho thấy gene GH có
vai trò quan trọng và liên quan tới đặc điểm tăng trọng của lợn (Cogan and
Phillips, 1998) [16]. Số lƣợng hormone sinh trƣởng ở lợn có liên quan đến khả

năng vỗ béo, thành phần thân thịt, chất lƣợng thịt và khả năng chống lại các
stress (C. Knorr, G.Moser et al, 1997) [15]. Cheng và cs (2000)[17] đã xác nhận
ảnh hƣởng của khả năng sinh trƣởng ở lợn (Duroc, Yorkshire, Tao-Yoan) có
tƣơng quan với kiểu gene GH (Cheng, Lee et al, 2000) [17]. Nielsen và Larsen
(1991)[23] đã quan sát những thay đổi mức độ GH trong máu cho thấy biến thể


13

di truyền trong các locus GH có thể ảnh hƣởng trực tiếp đến sự biểu hiện của
protein liên quan. Sự đa hình hormone tăng trƣởng còn ảnh hƣởng đến khả
năng tăng trọng hằng ngày, tỷ lệ nạc, mỡ và nồng độ hormone tăng trƣởng
trong huyết thanh (Nielsen VH and Larsen NJ, 1991) [23].
Trình tự gene GH đã đƣợc công bố trong ngân hàng gene (GenBank
accession: M17704.1).
Trong nghiên cứu này tôi sử dụng phần mềm Vector NTI để mô phỏng
kiểu gene GH. Gene đƣợc mô phỏng một cách khái quát trong hình dƣới đây:
Phân đoạn gene
GH (605 bp)

Hình 2.2: Hình ảnh mô phỏng kiểu gene GH ở lợn


Trình tự nucleotide của gene GH đƣợc trình bày ở phụ lục 1
* Gene GH ở lợn có 5 vùng exon:
- Vùng exon 1 từ nucleotide 240 đến nucleotide 249.
- Vùng exon 2 từ nucleotide 492 đến nucleotide 652.
- Vùng exon 3 từ nucleotide 863 đến nucleotide 979.
- Vùng exon 4 từ nucleotide 1177 đến nucleotide 1338.
- Vùng exon 5 từ nucleotide 1617 đến nucleotide 1817.

Phân đoạn gene GH (605 bp) nghiên cứu nằm ở đầu 3’ của gene GH
(2231 bp), đoạn gene GH chứa exon 1 và exon 2.


14

2.5. Các kiểu gene trong phân tích đa hình đoạn gene GH bằng enzyme DdeI
Phân tích đa hình đoạn gene GH bằng enzyme DdeI thu đƣợc các
dạng alen đƣợc tƣơng ứng nhƣ sau:
Alen D1: 335 bp; 148 bp; 122 bp
Alen D2: 457 bp; 148 bp
Từ đó ta có các kiểu gene tƣơng ứng nhƣ sau:
- Kiểu gene D1D1: những cá thể mang kiểu gene D1D1 là những cá
thể đồng hợp tử cắt về gene GH. Khi điện di trên gel agarose sẽ thu đƣợc 3
băng tƣơng ứng với kích thƣớc: 335 bp; 148 bp; 122 bp.
- Kiểu gene D1D2: những cá thể mang kiểu gene D1D2 là những cá
thể dị hợp tử. Khi điện di trên gel agarose sẽ thu đƣợc 4 băng tƣơng ứng với
kích thƣớc: 457 bp; 335 bp; 148 bp; 122 bp.
- Kiểu gene D2D2: những cá thể mang kiểu gene D2D2 là những cá
thể đồng hợp tử cắt về gene GH. Khi điện di trên gel agarose sẽ thu đƣợc 2
băng tƣơng ứng với kích thƣớc: 457 bp; 148 bp.
Sơ đồ mô phỏng 2 alen D1 và D2 đƣợc thể hiện ở hình 2.3
a) Alen D1

148 bp
335 bp
122 bp

b) Alen D2
148 bp

457 bp
Hình 2.3: Kích thƣớc các alen có trong quần thể lợn
Sơ đồ mô phỏng 3 kiểu gene D1D1; D1D2 và D2D2 tƣơng ứng đƣợc
thể hiện ở hình 2.4


15

1) Kiểu gene D1D1
148 bp
335 bp
122 bp
2) Kiểu gene D1D2
148 bp
335 bp
122 bp
457 bp
3) Kiểu gene D2D2
148 bp
457 bp

Hình 2.4: Kích thƣớc các đoạn DNA dự kiến thu đƣợc khi phân tích đa
hình đoạn gene GH bằng DdeI
2.6. Vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI trên đoạn gene GH
Trình tự đoạn gene GH sau khi đƣợc lấy trên ngân hàng GeneBank
(Mã số M17704.1) đƣợc đƣa vào phần mềm Vector NTI. Bằng phần mềm
Vector NTI cùng với một số thao tác cơ bản vị trí cắt giới hạn của enzyme
DdeI trên đoạn gene GH đã đƣợc xác định. Vị trí cắt giới hạn của enzyme
DdeI đƣợc thể hiện trên hình 2.5.

16

Phân đoạn gene
GH (605 bp)

Hình 2.5: Hình ảnh mô phỏng vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI trên
đoạn gene GH
Hình 2.5 cho thấy, trên phân đoạn gene GH (605 bp) chỉ chứa một vị
trí cắt duy nhất của enzyme DdeI. Theo kết quả nghiên cứu của Franco MM
(2005) [19] trên phân đoạn gene GH, đoạn gene GH sau khi cắt bằng
enzyme DdeI thu đƣợc 2 kiểu gene D1D1 với các băng kích thƣớc là: 335
bp, 148 bp, 122 bp và kiểu gene D1D2 với các băng 457 bp, 335 bp, 148 bp,
122 bp (Franco, Antunes et al, 2005) [19]. Để xuất hiện kiểu gene D1D2 thì
trên đoạn gene GH phải có hai vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI. Điều này
có thể giải thích rằng: Các cá thể lợn có sự đa hình khác nhau, do cá thể
đƣợc nhà khoa học nghiên cứu và giải trình tự gene GH là một cá thể khác
mà trên đoạn gene GH chỉ chứa một vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI, do
đó mạch chỉ bị cắt tại một điểm duy nhất.
Trình tự đoạn gene GH nghiên cứu, vị trí cắt của enzyne DdeI và
trình tự dịch mã sang protein đƣợc thể hiện chi tiết ở hình dƣới đây: