Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÀN THỊ NGÂN
Tên đề tài:
“ NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN TK1178 MÃ HÓA CHO ENZYME
AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT
Thermococcus kodakarensis KOD1”.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ Sinh học
: CNSH- CNTP
: 2012- 2016

Thái Nguyên- Năm 2016


TRƢỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÀN THỊ NGÂN
Tên đề tài:
“ NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN TK1178 MÃ HÓA CHO ENZYME
AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT
Thermococcus kodakarensis KOD1”.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Khoa
: CNSH- CNTP
Khóa học
: 2012- 2016
Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Phạm Bằng Phƣơng

Thái Nguyên- Năm 2016


i
LỜI CẢM ƠN
Được sự nhất trí của Ban Giám hiệu Nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp
em đã thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho
enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis
KOD1”.
Qua sáu tháng thực tập tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử, Bộ môn Công
nghệ sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại
học Nông lâm Thái Nguyên em đã thu được những kết quả thiết thực phục vụ cho
việc hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Để đạt được kết quả đó em xin chân thành cảm ơn
chị Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình
thực tập tốt nghiêp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Bằng Phƣơng, bộ môn
Công nghệ Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường
Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian

thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ,giúp
đỡ và động viên em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Do thời gian thực
hiện đề tài có hạn nên không thể tránh khỏi sai sót, em rất mong nhận được sự đóng
góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày tháng

năm 2016

Sinh viên thực hiện

Bàn Thị Ngân


ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 : Danh mục các thiết bị ..............................................................................18
Bảng 3.2 : Thành phần môi trường nuôi cấy Thermococcus kodakarensis KOD1 .19
Bảng 3.3: Một số thành phần khoáng sử dụng trong nuôi cấy..................................21
Bảng 3.4: Thành phần một số vitamin sử dụng trong quá trình nuôi cấy .................22
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR .......................................................................28


iii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 ...........................4
Hình 2.2 : Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus ............................................5

Hình 2.3: Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 8
Hình 2.4: Cấu tạo hóa học của aminopeptidase ........................................................12
Hình 2.5 : Kiểm tra và so sánh trình tự protein của gen Tk 1178 với một số trình tự
khác trong ngân hàng dữ liệu NCBI .........................................................................14
Hình 3.1 : Màu sắc môi trường thay đổi khi bổ sung thêm lưu huỳnh .....................20
Hình 3.2 : Môi trường nuôi cấy Thermococcus kodakarensis KOD1 sau khi đã bổ
sung lưu huỳnh và hấp khử trùng dưới dòng ni tơ trong 5 giờ .................................20

Hình 3.3 : Trình tự gen tk1178 trên trang NCBI ........................................... 25
Hình 3.4 : Bản đồ enzyme cắt giới hạn gen Tk1178...................................... 26
Hình 3.5 : Kết quả kiểm tra trình tự đoạn mồi dựa trên chương trình Tm
Calculator ....................................................................................................... 27
Hình 3.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen Tk 1178 ...........29
Hình 4.1: Kết quả điện di kiểm tra DNA genome ....................................................32
Hình 4.2 : Kết quả so sánh trình tự protein của gen TK1178 với một số gen thuộc
giới Achaea ...............................................................................................................33
Hình 4.3: Kết quả khuếch đại đoạn gen Tk1178 dưới điều kiện nhiệt độ tối ưu ......34
Hình 4.4: Mức nhiệt độ tương ứng với thứ tự các giếng ..........................................35
Hình 4.5 : Kết quả điện điện di sản phẩm PCR đoạn gen Tk1178 dưới các mức nhiệt
độ khác nhau .............................................................................................................35


iv
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Ý nghĩa từ, cụm từ viết tắt

Các từ, cụm từ viết tắt
Dal

Dalton

DNA

Deoxyribonucleic acide

dNTPs

Deoxynucleotide trytophate

Bp

Base pair

Kb

Kilobase

PCR

Polymerase chain reaction

EDTA

Etilenduamin tetraacetic acide

TE

Tris- EDTA

TK

Thermococcus kodakarensis

IPTG

Isopropyl- β- D- Thiogalactopyranosidase

SDS

Sodium dodecyl sulfate

NCBI

National center for biotechnology infor
mation

TAE

Tris- acetate- EDTA


v
MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................1
1.1.Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2.Mục tiêu và yêu cầu của đề tài .................................................................................2
1.3.Ý nghĩa của đề tài....................................................................................................2
1.3.1 Ý nghĩa khoa học ...............................................................................................2

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................4
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 ...............................4
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại.....................................................................................4
2.1.1.1. Nguồn gốc ......................................................................................................4
2.1.1.2. Phân loại ........................................................................................................5
2.1.2. Đặc điểm chung cho sự phát triển và tồn tại .....................................................6
2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy.............................................................................................9
2.2. Đặc điểm của enzyme aminopeptidase do gen Tk1178 tổng hợp .....................10
2.2.1.Khái niệm enzyme, proteae, ý nghĩa và ứng dụng ...........................................10
2.2.1.1..Enzyme .........................................................................................................10
2.2.1.2. Khái niệm, phân loại và đặc tính ứng dụng của protease ............................11
2.2.1.3. Ý nghĩa và ứng dụng ....................................................................................12
2.2.2. Protease của Tk1178 .......................................................................................13
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..16
3.1.Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................16
3.2.Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................16
3.2.1.Nội dung 1: Nghiên cứu tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Thermococcus
kodakarensis KOD1 ..................................................................................................16
3.2.2. Nội dung 2: So sánh trình tự protein của gen Tk1178 với một số trình tự
protein khác trong cùng họ. .......................................................................................16


vi
3.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu và khuếch đại đoạn gen Tk1178 mã hóa cho enzyme
aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 ...........16
3.2.4. Nội dung 4: Kiểm tra sự ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến sự khuếch đại
đoạn gen Tk 1178 ......................................................................................................16
3.3.1.Hóa chất ...........................................................................................................16
3.3.2.Thiết bị, dụng cụ ..............................................................................................16

3.4.Phương pháp........................................................................................................17
3.4.1.Phương pháp nuôi cấy ......................................................................................17
3.4.2.Phương pháp tách chiết DNA genome .............................................................21
3.4.3.Phương pháp điện di ........................................................................................22
3.4.4. Phương pháp PCR ...........................................................................................23
3.4.4.1.Thiết kế mồi cho gen Tk1178 .......................................................................23
3.4.4.2.Tiến hành PCR ..............................................................................................27
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.....................................29
4.1.Kết quả tách chiết DNA genmome của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1 ........................................................................................................................29
4.2.Kết quả so sánh trình tự protein của Tk1178 với một số protein của gen khác
trong giới Archaea ....................................................................................................30
4.3.Kết quả khuếch đại đoạn gen Tk1178 bằng kỹ thuật PCR .................................33
4.4.Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự khuếch đại gen Tk1178 ..........34
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................36
5.1.Kết luận ...............................................................................................................36
5.2.Kiến nghị .............................................................................................................36

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 38


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 là một chủng vi khuẩn thuộc giới
vi khuẩn cố Archea đươc các nhà khoa học phân lập từ miệng núi lửa gần bờ biển
thuộc đảo Kodakara của Nhật Bản, có khả năng sống trong điều kiện nhiêt độ từ 60100 0C ( tối ưu ở 85 0C ) và khả năng sống trong dải pH rộng ( từ 5- 9, tối ưu ở 5,5 )
[7]. Theo cây phân loại ( Hình 2.2 ) trình tự 16s rRNA quết định sự phân loại khác nhau
của các loài theo bộ Thermococcales, các nghiên cứu cho thấy KOD1 có trình tự 16s RNA

do đó nó là một thành viên của chi Thermococcus, các nghiên cứu về trình tự 16S DNA
ribosome dẫn đến các khả năng phân loại khác nhau bao gồm Thermococcus peptonophilus
và Thermococcus , kết quả lai DNA- DNA và sự khác biệt trong đặc tính phát triển với
việc sử dụng chất nền để phân lập chủng KOD1 từ T. peptonophilus và T. stetteri ở mức độ
loài chỉ ra rằng trình tự KOD1 đại diện cho một loài mới của Thermococcus, mà chúng ta
biết đến như Thermococcus kodakaraensis KOD1 sp [10].
Hệ gen của KOD1 có trên hai nghìn đoạn gen khác nhau ( 2434 gen ) trong đó có
đoạn gen Tk1178 có khả năng mã hóa cho enzyme aminopeptidase, được các nhà khoa học
trường đại học Khoa Hóa tổng hợp và sinh học Hóa học, Trường Đại Học Kỹ thuật, Đại học
Kyoto, Katsura, Nishikyo-ku, Kyoto, Nhật Bản và Cục Chất liệu và Khoa học đời sống,
trường Kỹ thuật, Đại học Osaka, Yamadaoka, Suita, Osaka, Nhật Bản công bố cụ thể trên
trang NCBI [7]. Aminopepdidase là enzyme xúc tác sự phân cắt của các axit amin từ các
amino của các protein hay peptide. Chúng có mặt cả ở động vật và thực vật và được tìm
thấy trong nhiều bào quan dưới tế bào, trong bào tương, và là thành phần của màng tế bào.
Một số aminopeptidases là monome, khối lượng tương đối cao (50 kDa) giúp tiêu hóa
enzyme của protein do đó đóng vai trò vô cùng quan trọng do khả năng bền với nhiệt độ
cao khó bị biến tính trong khi các enzyme khác lại biến tính rất nhanh khi thay đổi nhiệt độ
lên mức cao, dễ tham gia phản ứng do đó nó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp và các
lĩnh vực nghiên cứu khoa học [6].


2
Chính vì những ứng dụng quan trọng của enzyme nên ngày càng có nhiều công trình
nghiên cứu về enzyme và khả năng tổng hợp enzyme từ sinh vật ( động vật, thực vật và cả
vi sinh vật ) [4]. Đoạn gen Tk 1178 của vi khuẩn Thermococcus korakadensis KOD1 (T.
korakadensis ) có khả năng mã hóa enzyme aminopeptidase, ứng dụng nhiều trong công
nghiệp và sản xuất thực phẩm ( sản xuất bột giặt, các loại bánh mỳ…), y học…Trong suốt
quá trình thực tập tốt nghiệp tai phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc khoa Công nghệ
Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, dưới sự hướng
dẫn của TS. Phạm Bằng Phƣơng, tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu và khuếch đại

gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus
kodakarensis KOD1” với mục tiêu chính là có thể khuếch đại được đoạn gen này và tìm ra
nhiệt độ tối ưu cho phản ứng khuếch đại- phản ứng PCR, phục vụ cho các nghiên cứu tạo
dòng, tinh sạch và kiểm tra hoạt tính của enzyme do gen Tk1178 mã hóa.

1.2.Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
- Mục tiêu :
+ Nghiên cứu được những đặc điểm của protein của gen Tk1178.
+ Khuếch đại được đoạn gen TK1178 từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus
kodakarensis KOD1.

-Yêu cầu :
+ Nghiên cứu, nắm bắt đặc điểm của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1
và của gen TK1178.
+ Khuếch đại đoạn gen TK1178 bằng kỹ thuật PCR.
+ So sánh được trình tự của TK1178 với trình tự một số gen trong cùng nhóm.

1.3.Ý nghĩa của đề tài
1.3.1 Ý nghĩa khoa học
- Nghiên cứu khuếch đại thành công gen TK1178 mã hóa cho enzyme
aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 thuận lợi cho
việc nghiên cứu tạo dòng gen sau này.
- Cung cấp tài liệu cho các nghiên cứu của sinh viên về nghiên cứu khuếch
đại các đoạn gen tương tự hoặc nghiên cứu mở rộng ra việc tạo dòng gen.


3
- Sinh viên củng cố, hệ thống lại kiến thức đã học và thông qua hoạt động
thực tiễn làm giàu thêm hiểu biết của bản thân về những gì được học.
- Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đại học.

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả của nghiên cứu sẽ góp phần làm tiền đề cho việc tạo dòng, biểu
hiện protein do gen Tk1178 mã hóa từ đó tinh sạch và kiểm tra hoạt tính của enzyme
aminopeptidase.


4
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
2.1.1.1. Nguồn gốc
Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 là một vi khuẩn chịu nhiệt sống
trong điều kiên nhiệt độ cao từ 60- 100 0C, nhiệt độ tối ưu là 85 0C, có khả năng sinh
trưởng, phát triển trong dải pH rộng ( từ 5- 9, tối ưu là 6,5 ), độ muối cao ( từ 1- 5% )
tối ưu ở 3 %, phát hiện đầu tiên ở khu vực miệng núi lửa gần bờ đảo Kodakara,
Kagoshima, Nhật Bản, ban đầu được đặt tên là Pyrococcus kodakarensis KOD1 sau đó
được phân loại vào loài Thermococcus dựa vào trình tự 16sRNA [7], [9].

Hình 2.1: Vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1
Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 có kích thước trong khoảng từ 12 µm, tồn tại chủ yếu ở dạng hình cầu, cấu trúc dạng sợi [10], thiếu màng trong và bào
quan, cấu trúc gồm màng sinh chất và thành tế bào, màng tế bào được tạo thành từ
những phân tử phospholipid, lớp lipide kép thay bằng lớp lipide đơn và 2 phân tử
lipide được nhập làm 1tạo thành 1 phân tử lipide có 2 đầu cực, giúp tăng khả năng
thích nghi với môi trường biến đổi [11].


5

2.1.1.2. Phân loại
Đầu tiên Fiala and Stetter 1986 [12] xây dựng một cây phát sinh loài với các
loài khác nhau sử dụng Thermococcus Pyrococcus furiosus như một nhóm. Các trình
tự gen 16S rRNA của chủng thể hiện trong Hình 2.2 được lựa chọn cho nhiều liên kết
và xây dựng một cây phả hệ bằng cách sử dụng phương pháp neighbor-joining [13].
Các vị trí phát sinh loài của giống KOD1 đã nằm trong chi Thermococcus, với các
trình tự KOD1 nhóm với T. peptonophilus [14] và T. stetteri (99%) [15]. Khi áp dụng
phương thức maximum-likelihood [16], vị trí phát sinh loài của một số chủng thay
đổi, nhưng các phân nhóm trong T. peptonophilus và T. stetteri và KOD1 không thay
đổi gì. Kết quả chỉ ra rằng KOD1 là thành viên của Thermococcus và cho rằng nó có
liên quan chặt chẽ với T. peptonophilus và T. stetteri [15] được thể hiện cụ thể bởi cây
phân loại

Hình 2.2 : Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus


6
Dựa vào các nghiên cứu phân loại [17] có thể thấy vi khuẩn Thermococcus
kodakarensis KOD1 được phân loại như sau:

- Giới

: Archaea

- Ngành

: Euyarchaeota

- Lớp

: Thermococci

- Bộ

: Thermococcales

- Họ

: Thermococcaceae

- Chi

: Thermococcus

- Loài

: Thermococus kodakarensis KOD1

Do được phân loại trong giới Achaea nên Thermococcus kodakarensis KOD1
cũng mang những đặc trưng của khuẩn cổ Achaea , vi khuẩn, vi khuẩn cổ và sinh vật
nhân chuẩn là những dòng giống riêng biệt được rẽ nhánh khởi đầu từ một tập hợp các
cá thể tổ tiên sơ khai [18], tuy nhiên các nhà sinh vật học lại cho rằng vi khuẩn, vi
khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn được rẽ ra từ một nhóm vi khuẩn [19], có thể tổ tiên
của chúng cũng là một sinh vật ưa nhiệt đặc biệt trong điều kiện môi trường thay đổi
cực đoan như ngày nay [20].
T.kodakarensis được phân loại dựa vào trình tự 16s DNA ribosome của loài
Thermococcus khác nhau có sẵn từ các cơ sở dữ liệu EMBL / GenBank / DDBJ . Khu
vực trải dài 1231 bp (giữa 83-GGCGGACGG và GCGTGTCAT-1313 trong chuỗi các
Thermococcus kodakaraensis) đã được sử dụng để tính toán phát sinh loài. Các liên
kết nhiều trình tự DNA được thực hiện bằng cách sử dụng chương trình ALIGN chứa

trong các chương trình ClustalW (Thompson et al., 1994) được cung cấp bởi ngân
hàng dữ liệu ADN của Nhật Bản (DDBJ). Cây phát sinh loài được xây dựng theo
phương pháp neighbor-joining (Saitou và Nei 1987) và theo phương pháp tối đalikelihood (Felsenstein, 1981) với chương trình fastDNAmL (Olsen et al., 1994) được
thực hiện 1000 lần [7]. Cây phát sinh loài đã được hình tượng với chương trình
TreeView.

2.1.2. Đặc điểm chung cho sự phát triển và tồn tại
Để có thể tồn tại trong điều kiện môi trương khắc nghiệt thì bản thân vi khuẩn
Thermococcus kodakarensis KOD1 phải có những đặc điểm khác biệt nhất là hệ gen,


7
hệ gen của Thermococcus kodakarensis được ước lượng khoảng 2,09 triệu bp chứa
khoảng 2434 gen, toàn bộ trình tự genome của Thermococcus kodakarensis KOD1 đã
được nhóm tác giả thuộc Viện Nghiên Cứu Hóa Sinh Tổng Hợp Và Hóa Sinh Học
thuộc Đại Học kỹ thuật Kyoto, Nhật Bản nghiên cứu và giải trình tự [8].
Một số nghiên cứu mô tả sự so sánh giữa hai loài Archaea hyperthermophilic có
quan hệ họ hàng là Thermococcus barophilus chủng MP và

Thermococcus

kodakarensis KOD1 đã cho thấy có tổng cộng có 378 gene khác nhau được biểu hiện
trong tế bào của T. barophilus tăng trưởng 0,1, 40 và 70 MPa, trong khi 141 gen khác
trong tế bào T. kodakarensis tăng trưởng 0,1 và 25 MPa. Trong T. Barophilus- tế bào
nuôi cấy trong điều kiện (0,1 và 70 MPa), 178 gen được phân bố trong ba cụm thuộc
nhóm Orthologous (COG): sản xuất năng lượng và chuyển đổi (C); vận chuyển ion vô
cơ và trao đổi chất (P); vận chuyển carbohydrate và trao đổi chất (G), trong khi 156
gen được phân bố trong 3 nhóm: vận chuyển axit amin và trao đổi chất (E); sao chép,
tái kết hợp và sửa chữa (L); vận chuyển nucleotit và trao đổi chất (F). Những biểu hiện
của 141 gen đã được quy định trong các tế bào T. kodakarensis phát triển trong điều

kiện khắc nghiệt (25 MPa); 71 gen thuộc về ba COG: sản xuất năng lượng và chuyển
đổi (C); vận chuyển axit amin và trao đổi chất (E); phiên mã (K), trong khi đó 70 gen
được kết hợp với sao chép, tái kết hợp và sửa chữa (L), vận tải coenzyme (H ) và cơ
chế phòng vệ (V) [21], như vậy genome của Thermococcus kodakarensis KOD1 có vai
trò vô cùng quan trọng trong việc tham gia các hoạt ðộng chuyển hóa và trao đổi chất
Thermococcus kodakarensis KOD1, đã thích nghi với sự phát triển tối ưu trong
điều kiện nhiệt độ cao và độ mặn. Tuy nhiên, các điều kiện môi trường cho sự tác động
không phải luôn luôn ổn định, và tác động này có thể phải đối mặt với tác động khác
nhau trong cùng môi trường. Nghiên cứu của Lamosa và cs, 1998 [22] đã so sánh
phản ứng chịu nhiệt, oxy hóa protein của T. kodakarensis và ảnh hưởng của muối
bằng cách điện di hai chiều, và các điểm protein đã được xác định thông qua MALDITOF / MS. Năm mươi chín, bốn mươi hai, hai mươi chín điểm đã gây ra dưới nhiệt,
oxy hóa, và ảnh hưởng của muối tương ứng. Trong số các protein dưới họ hàng có bốn
protein (một loại protein giả, sinh tổng hợp lyase pyridoxal, peroxiredoxin, và protein
disulphide oxidoreductase) có liên quan với cả ba protein, phân tích Gene Ontology
cho thấy các protein này được chuyển hóa chủ yếu tham gia vào các quá trình của tế


8
bào. Các phân tích cho rằng con đường chuyển hóa chính liên quan đến các enzyme có
liên quan đến quá trình chuyển hóa carbohydrate, tổng hợp chất chuyển hóa cơ sở, và
sinh tổng hợp axit amin. Những dữ liệu này có thể nâng cao sự hiểu biết của chúng ta
về các chức năng và cơ chế phân tử của ưa nhiệt Archaea để tồn tại và thích ứng trong
môi trường khắc nghiệt.
Trình tự genome của thermococcus đã được phân loại cụ thể với trên 2.000 gen
khác nhau có chung đặc điểm của Achaea và những chức năng tổng hợp mã hóa quan
trong khác được trình bày trong NCBI (Hình 2.3) .

Hình 2.3: Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1
Chú thích :
-Vòng tròn ngoài cùng: bản đồ vật lý thu nhỏ trong dữ liệu cơ sở.

-Vòng tròn thứ 2: dự đoán các vùng mã hóa protein trong chiều kim đồng hồ.
-Vòng tròn thứ 3 : dự đoán các vùng mã hóa ngược chiều kim đồng hồ.
-Các gen biểu thị được phân màu theo nhóm phân loại chức năng, cụ thể:
+ Màu hồng: phiên mã


9
+ Màu hồng nhạt: sao chép DNA, tái tổ hợp hoặc sửa chữa
+ Xanh lá cây: vùng phân chia tế bào, nhiễm sắc thể
+ Vàng nhạt: lớp bên ngoài tế bào
+ Xanh da trời: thực hiện hóa sinh tổng hợp, dị hóa
+ Xanh nhạt: tế bào nhu động, vận chuyển ion, trao đổi chất
+ Xanh lam: cơ chế truyền tín hiệu, trao đổi các coenzyme
+ Màu tím: sản xuất năng lượng, chuyển đổi
+ Tím nhạt: chuyển hóa lipide
+ Màu xám: chức năng chỉ mới được đề xuất
+Màu đen: không rõ chức năng
- Vòng tròn thứ 4: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều kim đồng hồ (màu đỏ
trong vòng thứ 4).
- Vòng tròn thứ 5: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều ngược chiều kim đồng
hồ (màu xanh vòng tròn thứ 5).
- Vòng tròn thứ 6: dự báo các yêu tố di động theo chiều kim đồng hồ ( màu đỏ
vòng thứ 6).
- Vòng tròn thứ 7: dự báo các yếu tố di động theo chiều ngược kim đồng hồ (
màu xanh vòng thứ 7 ).
- Đường thẳng đứng thể hiện viêc dự đoán gen chuyển và chỉ ra vùng virus liên
quan
- Vòng tròn trong cùng: % (G+ C) trong vòng 10 kb và thay đổi gia tăng tới các
giá trị cao hơn trong khoảng ít nhất là 38 %.

2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy
Đặc điểm của Thermococcus kodakarensis KOD1 là vi khuẩn chịu nhiệt, có khả
năng sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ 60- 100 0C, nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng
là 95 0C và trong khoảng pH từ 6- 9 ( tối ưu là 5,8 ) [7] , có sự trao đổi chất và phản
ứng hóa học đa dạng và sử dụng nhiều nguồn năng lượng đặc biệt là năng lượng từ các
hợp chất vô cơ như lưu huỳnh, amoniac, năng lượng giải phóng thông qua quá trình
thẩm thấu hóa lọc . Sau quá trình nghiên cứu lâu dài các nhà khoa học đã kết luận môi


10
trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 là môi
trường đặc biệt có bổ sung khoáng và vi lượng, đặ biệt là sử dụng khí lưu huỳnh và
nuôi trong điều kiện kỵ khí [22].
Thông tin từ phép lai DNA-DNA giữa chủng KOD1 và Thermococcus
peptonophilus JCM9653T, Thermococcus gorgonarius JCM10552T, Thermococcus
fumicolans JCM10128T và Thermococcus guaymasensis JCM10136T Tiến sĩ Takashi
Itoh tại trung tâm trưng bày sinh vật Nhật Bản của các vi sinh vật (JCM), RIKEN,
Saitama, Nhật Bản và Tiến sĩ . Francesco Canganella tại Sở Sinh lý thực vật và hóa
sinh học, Đại học Tuscia, Ý. Đối với thí nghiệm riêng do nhóm tác giả lai tạo,
Thermococcus stetteri JCM8559T, Thermococcus profundus JCM9378T (Kobayashi et
al., 1994) và Thermococcus fumicolans JCM10128T (Godfroy et al. 1996) đã thu được
từ JCM. Thermococcus ATCC35543T celer (Zillig et al. 1983) đã thu được từ Type
Culture Collection Mỹ (Manassas, VA). Tất cả các thao tác nuôi cấy được thực hiện
trong một buồng kỵ khí. Môi trường đã được thêm 0,5% lưu huỳnh, vừa bị kỵ khí kín
và ủ ở 85 hoặc 95 ° C cho 24-40 h. Các tế bào được thu hoạch và ly giải với chất tẩy
rửa (1% N-lauroylsarcosine, Nacalai Tesque), và nhiễm sắc thể DNA đã được tinh chế
bằng mật độ CsCl Gradient siêu ly tâm (Optima XL-90, Beckman, Fullerton, CA). Các
thí nghiệm lai DNA-DNA được thực hiện tại Higeta Shoyu (Chiba, Nhật Bản) sử dụng
phương pháp mô tả ở nơi khác (Ezaki et al. 1989).

2.2. Đặc điểm của enzyme aminopeptidase do gen Tk1178 tổng hợp
2.2.1.Khái niệm enzyme, proteae, ý nghĩa và ứng dụng
2.2.1.1..Enzyme
- Enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học
trong và ngoài cơ thể, có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dal (có kích thước
nhỏ nhất là Ribonuclease 12.700 dalton), có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong
chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật
chất, enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số
enzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn, tan
trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các dung


11
môi không phân cực. Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị
biến tính. Môi trường axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động [2].
- Enzym có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các
dạng: cation, anion hay trung hòa điện.
- Enzym chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin,
amylase... và các enzym hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein).
Trong phân tử enzym hai cấu tử có hai phần
+apoenzym: phần protein (nâng cao lực xúc tác của enzym, quyết định tính đặc
hiệu).
+coenzym: phần không phải protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzym),
bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp.

2.2.1.2. Khái niệm, phân loại và đặc tính ứng dụng của protease
- Một protease (còn gọi là peptidase hoặc proteinase) là bất kỳ loại enzyme nào có
khả năng phân giải protein, bắt đầu quá trình dị hóa protein bằng cách thủy phân liên
kết peptide và liên kết axit amin với nhau trong một chuỗi polypeptide. Protease đã có
nhiều biến đổi, và các lớp khác nhau của protease có thể thực hiện những phản ứng

tương tự bởi cơ chế xúc tác hoàn toàn khác nhau. Proteases có thể được tìm thấy trong
động vật, thực vật, vi khuẩn, vi khuẩn cổ và vi rút (Lê Ngọc Tú và cs, 2002) [2].

Hình 2.4: Cấu tạo hóa học của aminopeptidase


12
- Phân loại: protease được phân thành 7 nhóm lớn
+ protease serine - sử dụng một rượu serine
+ protease cystein - sử dụng một thiol cysteine
+ protease Threonine - sử dụng một thứ rượu threonine
+ protease Aspartic - sử dụng một axit cacboxylic aspartate
+ protease glutamic - sử dụng một axit cacboxylic glutamate
+ Metalloproteases - sử dụng một kim loại, thường là kẽm
+ Asparagin peptide lyases - sử dụng một asparagin để thực hiện một phản ứng
loại bỏ (không cần nước)

2.2.1.3. Ý nghĩa và ứng dụng
- Protease có ý nghĩa rất quan trọng do có liên quan đến việc chuyển hóa chuỗi
protein dài thành những đoạn ngắn hơn bằng cách tách các liên kết peptide liên kết
amino acid. Một số tách các axit amin từ các chuỗi protein (exopeptidases, như
aminopeptidases, carboxypeptidase A) [3].
- Các lĩnh vực nghiên cứu protease rất rộng, protease được sử dụng trong công
nghiệp, y học và là một công cụ nghiên cứu sinh học cơ bản ( protease là một phần
của nhiều bột giặt và cũng được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp bánh mì
làm bánh) [4]. Một loạt các protease được sử dụng y tế cho chẳng hạn kiểm soát đông
máu hoặc cho các chức năng hoàn toàn nhân tạo như sự loại trừ đích bám của các
protein gây bệnh, protease bậc cao thể như TEV, protease và thrombin thường được sử
dụng để tách protein phản ứng tổng hợp và các thể ái lực một cách có kiểm soát).
- Protease dùng để chỉ một nhóm các enzyme có chức năng xúc tác là để thủy

phân protein. Họ còn được gọi là enzyme phân giải protein hoặc enzym hệ thống,
enzyme thủy phân protein rất quan trọng trong việc tiêu hóa vì chúng c [4].
Ký sinh trùng, mẫu nấm, và vi khuẩn là protein. Virus là những ký sinh trùng tế
bào bao gồm các axit nucleic được bao phủ bởi một màng protein. Enzyme có thể phá
vỡ các protein không tiêu hóa được, mảnh vỡ tế bào, và các độc tố trong máu, dành


13
phần hệ thống miễn dịch của nhiệm vụ này. Sau đó hệ thống miễn dịch có thể tập trung
hành động đầy đủ của nó về cuộc xâm lược của vi khuẩn hoặc ký sinh trùng [5].
- Aminopeptidases là enzyme xúc tác sự phân cắt của các axit amin từ các
amino của các protein hay peptide. Chúng có mặt cả ở động vật và thực vật và được
tìm thấy trong nhiều bào quan dưới tế bào, trong bào tương, và là thành phần của màng
tế bào. Một số aminopeptidases là monome, khối lượng tương đối cao (50 kDa) giúp
tiêu hóa enzyme của protein [24].

2.2.2. Protease của Tk1178
Trình tự protein của gen tk1178:
MRVILIVPIGYIPEWLIKDVAEFVDSYYSRRGVSVKAGDSLSESLFLSAY
HPFRRQFLGGAFLPTLSEIG
RRAGALATVGITKVDLYEKGMNFVFGVASEKLRSAVVSIHRLRPEFYG
RPSNDELLIERTVKEVMHELGH
VFGLSHCPNVRCVMHFSNSVDDTDIKLPYYCPNCERKLLRNLEVVL

Hình 2.5 : Kiểm tra và so sánh trình tự protein của gen Tk 1178 với một số trình tự
họ hàng trong ngân hàng dữ liệu NCBI

2.3. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới
2.3.1.Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Hiện các nghiên cứu trong nước về vi khuẩn Thermococcus kodarensis KOD1

và các gen đặc trưng là không có, các nghiên cứu xuất hiện chỉ liên quan đến
việcnghiên cứu tạo vector T bắt nguồn từ vi khuẩn suối nước nóng phục vụ cho việc
biến nạp và tạo dòng, nổi bật trong các công trình nghiên cứu là sản phẩm chế tạo
vector T-TUAF của TS. Dương Văn Cường- Phó Khoa Công nghệ Sinh học và Công


14
nghệ Thực phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên. Một số công ty công ty
hoạt động trong lĩnh vực công nghệ sinh học tập trung vào việc thiết kế mồi dặc hiệu
cho viêc bắt cặp đặc hiệu từng đoạn gen trong hệ gen của Thermococcus kodakarensis
KOD1 ( công ty trách nhiệm hữu hạn một thành viên sinh hóa Phù Sa, Tỉnh Vĩnh
Long).
Các nghiên cứu về gen TK1178 và khả năng mã hóa cho enzyme
aminopeptidase hầu như không có.

2.3.2.Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về Thermococcus và đoạn gen TK1178,
như nghiên cứu hoàn thiện trình tự genome của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1, của viện nghiên cứu hóa sinh tổng hợp, Trường Đại Học Kyoto, thuộc Katsura,
Nashikyo- ku, Nhật Bản, tháng 3 năm 20005. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chi
Thermococcus, bao gồm các vi khuẩn cổ Hyperthermophilic, các thành viên của
Thermococcus có mặt ở khắp nơi trong môi trường nhiệt độ cao, và đóng một vai trò
quan trọng trong hệ sinh thái và trao đổi chất hệ vi sinh vật hoạt động trong hệ sinh
thái nước nóng. Fukui T và cs, 2005 đã xác định và ghi chú các bộ gen 2.088.737- cơ
sở hoàn chỉnh của Thermococcus kodakaraensis KOD1, theo sau là sự so sánh với ba
bộ gen hoàn chỉnh của Pyrococcus spp. Tổng cộng có 2306 trình tự DNA mã hóa
(CDS) đã được xác định, trong đó một nửa (1165 CDS) là chú thích, trong khi các
chức năng của 41% (936 CDS) không thể được dự đoán từ các cấu trúc chính. Bộ gen
chứa bảy gen chuyển có thể xảy ra và bốn khu vực có liên quan đến virus. Một trong
số protein di truyền cho thấy sự tương đồng cao với nhóm Pyrococcus spp. Sự sắp xếp

Thermococcales, genomics trong so sánh làm rõ sự có mặt 1.204 của protein khác
nhau, bao gồm những thông tin và trao đổi chất cơ bản, được chia sẻ giữa T.
kodakaraensis và Pyrococcus spp. Mặt khác, còn cho thấy nhiệm vụ của các protein
khác như tham gia vào quá trình chuyển hóa pyruvate, chuyển hóa nucleotide, vận
chuyển kim loại ion [7].
Gần đây nhất là nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc phòng thí nghiệm vi
sinh, trường đại học Wageningen, Phần Lan vào tháng 7 năm 2015 [25] với nội dung


15
trình bày về số lượng nhiễm sắc thể của Thermococcus kodakarensis KOD1, các nhà
khoa học đã nghiên cứu và đưa ra nhận định rằng các euryarchaeon Thermococcus
kodakarensis là sinh vật kỵ khí dị dưỡng Hyperthermophilic đặc trưng và do sự sẵn có
của các hệ thống kỹ thuật di truyền nó đã trở thành một trong những sinh vật mẫu cho
giới Archaea. Mặc dù vai trò nổi bật này trong số các euryarchaeota, không sẵn có dữ
liệu về mức độ sắp đăt trình tự của loài này. Cấu tạo thể đa bội có nhiều trong
euryarchaeota, đặc biệt là Halobacteria, số lượng bản sao nhiễm sắc thể của loài thuộc
một trong các đơn vị trong đơn vị cấu tạo nên giới đó, nghĩa là các Thermococcales
(bao gồm Thermococcus spp. và Pyrococcus spp.) chưa bao giờ được xác định. Trong
nghiên cứu này, các nhà khoa học chứng minh rằng T. kodakarensis là sinh vật có cấu
tạo đa bội với một số lượng bản sao nhiễm sắc thể mà thay đổi trong khoảng 7- 19 bản
sao, tùy thuộc vào giai đoạn tăng trưởng [25].
Còn rất nhiều các nghiên cứu khác trên thế giới về chủng vi khuẩn
Thermococcus kodakarensis KOD1, giải trình tự các đoạn gen của nó và ứng dụng của
nó trong nghiên cứu khoa học được đề cập trên các bài báo, tạp chí khoa học được
công bố rộng trên các trang web đặc biệt là NCBI


16
PHẦN 3

ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Đối tƣợng nghiên cứu
- Gen Tk1178 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1
3.2.Nội dung nghiên cứu

3.2.1.Nội dung 1: Nghiên cứu tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn
Thermococcus kodakarensis KOD1
3.2.2. Nội dung 2: So sánh trình tự protein của gen Tk1178 với một số trình
tự protein khác trong cùng họ.
3.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu và khuếch đại đoạn gen Tk1178 mã hóa cho
enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis
KOD1
3.2.4. Nội dung 4: Kiểm tra sự ảnh hƣởng của điều kiện nhiệt độ đến sự
khuếch đại đoạn gen Tk 1178
3.3. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ
3.3.1. Hóa chất
- Hóa chất tách chiết DNA gồm CTAB, CIAA, TE1X, ethanol, βmercaaptoethanol, isoamyl alcohol, NaCl.
- Hóa chất thực hiện phản ứng PCR gồm buffer, dNTPs, Taq polymerase, mồi,
nước khử ion,.
- Hóa chất điện di gồm có agarose; TAE1X,0,5X; marker, ethidium bromide,
EDTA, loading dye.

3.3.2. Thiết bị, dụng cụ
Dụng cụ cần sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài gồm có: bình thủy tinh
chịu nhiệt, bình tam giác, đầu type các loại, ống eppendorf, găng tay, khẩu trang y tế,
dao, giá để ống eppendorf...


17

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài cần sử dụng những thiết bị sau:
Bảng 3.1 : Danh mục các thiết bị

STT

Tên thiết bị

Nguồn gốc xuất xứ

1

Bộ điện di

China

2

Bộ soi gel

China

3

Nồi hấp khử trùng

Germani

4

Cân phân tích

UK

5

Tủ lạnh

Hãng Panasony

6

Máy ly tâm

China

7

Máy vortex

China

8

Bể ổn nhiệt

US

9

Máy PCR

Germani

10

Lò vi song

Hãng Panasony

11

Bộ micropipete

UK

12

Tủ sấy

Germani

13

Bể ổn nhiệt

UK

14

Tủ hood

China

3.4.Phƣơng pháp
3.4.1.Phƣơng pháp nuôi cấy
Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 được nuôi cấy trong môi trường
phức hợp giàu dinh dưỡng [26] chứa các thành phần sau: