Nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất mới hydroxamic acid trên cơ sở artemisinin và hoạt tính ức chế HDAC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

VŨ THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT MỚI
HYDROXAMIC ACID TRÊN CƠ SỞ ARTEMISININ VÀ
HOẠT TÍNH ỨC CHẾ HDAC

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
(Kỹ thuật hóa học)

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC :
PGS.TS. Trần Khắc Vũ

Hà Nội – Năm 2015


LỜI CAM ĐOAN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học với đề tài
“Nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất mới Hydroxamic acid trên cơ sở Artemisinin và
hoạt tính ức chế HDAC” được hoàn thành dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trần
Khắc Vũ – Bộ môn hóa dược và hóa chất bảo vệ thực vật –Viện Kỹ thuật Hóa học –
Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Tôi xin cam đoan các kết quả trong luận án này
là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu
nào khác.

Tác giả luận án

Vũ Thị Hà

2


LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại bộ môn Hóa dược, Trường Đại Học Bách
Khoa Hà Nội.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS. TS. Trần Khắc
Vũ đã giao cho tôi đề tài này và hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện
giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của thầy cô bộ môn Hóa
Dược và Hóa chất bảo vệ thực vật, các thầy cô giáo trong trường, và ban lãnh đạo
viện Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS. TS. Nguyễn Mạnh Cường và các anh chị em
phòng Hoạt chất Sinh học và ban lãnh đạo viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên
đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian tôi đi học.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Thảo và anh chị phòng Thử nghiệm
sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của luận án.
Cuối cùng tôi muốn cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã cổ vũ động viên tôi
trong suốt thời gian qua.
Luận văn được thực hiện với sự tài trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu cơ bản
của Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED), mã số đề
tài:104.01-2013.01. Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

Vũ Thị Hà

3

năm 2015


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT .............................................................. 6
DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ ....................................... 8
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ HDAC VÀ ARTEMISININ ............................ 11
1.1.

TỔNG QUAN VỀ ENZYM HISTON DEACETYLASE ......................11

1.1.1.

Định nghĩa về HDAC ........................................................................... 11

1.1.2.

Phân loại HDAC ................................................................................... 12

1.1.3.

Cấu tạo của HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa .......................... 15

1.1.4.

Mối liên hệ giữa ung thư và HDAC ..................................................... 17

1.1.5.

Các chất ức chế HDAC (HDACIs) ....................................................... 17

1.1.6.

Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACIs) ...................... 20

1.1.7.

Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC mang

cấu trúc acid hydroxamic. .................................................................................. 21
1.1.8.

Thiết kế các công thức cho HDACIs mới............................................. 22

1.1.9.

Một số nghiên cứu thiết kế , thí nghiệm các chất ức chế HDAC gần đây .. 23

1.2.

TỔNG QUAN VỀ ARTEMISININ .........................................................26

1.2.1.

Giới thiệu về artemisin.......................................................................... 26

1.2.2.

Các phương pháp sản suất artemisinin ................................................. 28

1.2.3.

Hoạt tính sinh học của artemisinin và dẫn xuất .................................... 29

1.2.4.

Một số dẫn xuất của artemisinin ........................................................... 31

CHƢƠNG 2: THIẾT BỊ DỤNG CỤ, PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM ....... 35
2.1.

Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong tổng hợp .....................................35

2.2.

Nội dung nghiên cứu ...................................................................................35

2.3.

Các phương pháp dùng trong tổng hợp và tinh chế....................................36

2.4.

Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc sản phẩm ........................................36

2.5.1 Thử tác dụng ức chế histon deacetylase ................................................. 37
2.5.2. Thử độc tế bào: ........................................................................................ 38
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM ............................................................................. 41
4


3.1.

Tổng hợp 10β-azidoartemisinin (3a) ...........................................................41

3.2.

Tổng hợp 10β-aminoartemisinin (4a) ..........................................................42

3.4.

Tổng hợp các hợp chất hydoxamic acid 10(a-g) .........................................49

3.5.

Thử nghiệm hoạt tính đánh giá sinh học .....................................................55

CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 56
4.1.

Về tổng hợp 10β-azidoartemisinin (3a)(sơ đồ 8 ) .......................................58

4.2.

Về tổng hợp 10β-aminoartemisinin (4a) .....................................................59

4.4.

Về tổng hợp các hợp chất acid hydroxamic ................................................62

4.5.

Về đánh giá hoạt tính sinh học ....................................................................64

CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................ 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 68
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 74

5


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic
Resonance spectroscopy)

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon 13 Nuclear
Magnetic Resonance spectroscopy)

δ (ppm)

Độ chuyển dịch hóa học (tính theo phần triệu)

MS

Phổ khối lượng

HRMS

Phổ khối phân giải cao

TLC

Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography)

UV

Ultraviolet

S

Singlet

D

Doublet

T

Triplet

Q

Quartet

Dd

double doublet

M

Multiplet

Δ

độ dịch chuyển hóa học

J

hằng số tương tác spin

NMR

Nuclear Magnetic Resonace

HRMS

High Resolution Mass Spectrometry

RT

Nhiệt độ phòng

CH3SiCl

Trimethylsilyl chloride

PPh3

Triphenyl photphin

THF

Tetrahydrofuran

H2N-O-THP

O-(Tetrahydropyran-2-yl)hydroxylamin

C-NMR

6


DMSO-d6

Dimethylsulfoxid deutri hóa

CDI

Carbonyl diimidazol

EDC

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)

DMAP

Dimethyl aminoprydin

TSA

Trichostatin A

SAHA

Suberoylanilid hydroxamic acid

CBHA

m-cacboxycinnamic acid bishydroxamid

HAT

Histon acetyltransferase

HDAC

Histon deacetylase

IC50

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển

CS

Khả năng sống sót của tế bào tính theo %

ADN

Acid deoxyribonucleic

HCV

Hepatitis C virus

HBV

Hepatitis B virus

HCMV

Human cytomegalovirus

∆

Solvent heated under reflux

TMS

Tetramethylsilane

7


DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 1: Bảng phân loại các chất ức chế HDAC......................................................18
Bảng 2: Một số hóa chất sử dụng trong tổng hợp và tinh chế .................................35
Bảng 3: Kết quả thử hoạt tính HDAC của chất 10(a-g) ..........................................64
Bảng 4: Hoạt tính gây độc tế bào các acid hydroxamic 10(a-g) và acid cacboxylic 9(a-g) . 65
Hình 1: Cấu trúc nucleosom, HAT & HDAC điều hòa quá trình phiên mã và kích
hoạt ............................................................................................................................11
Hình 2: Phân loại các lớp HDAC .............................................................................13
Hình 3: Cấu tạo của HDAC ......................................................................................16
Hình 4: Mối liên hệ giữa cấu trúc HDAC và acid hydroxamic ................................22
Hình 5: Docking của hai hợp chất 10a và 10g .........................................................66
Sơ đồ 1: Tổng hợp các dẫn xuất Benzothiazole acid hydroxamic ...........................24
Sơ đồ 2: Tổng hợp isatin-3-oxime hydroxamic acid ................................................24
Sơ đồ 3: Tổng hợp 2-oxospiro[1,3]dioxolane/dithiolane-2,3-indoline-based acid
hydroxamic ................................................................................................................25
Sơ đồ 4: Tổng hợp acid hydroxamic từ acid cacboxylic .........................................26
Sơ đồ 5: Quy trình tổng hợp dẫn xuất chalcone của ART ........................................33
Sơ đồ 6: Tổng hợp các acid hydroxamic 10(a-e) .....................................................57
Sơ đồ 7: Tổng hợp các acid hydroxamic (10f, 10g) .................................................58
Sơ đồ 8: Điều chế 10β-azidoartemisinin...................................................................59
Sơ đồ 9: Tổng hợp các hợp chất trung gian chứa nhóm acid cacboxylic 9(a-e) ......60
Sơ đồ 10: Tổng hợp các hợp chất trung gian chứa nhóm acid cacboxylic (9f, 9g) .61
Sơ đồ 11: Tổng hợp các hơp chất acid hydroxamic 10(a-g).....................................62

8


MỞ ĐẦU
Con người ngày càng tác động nhiều vào tự nhiên là cho môi trường ngày
càng biến đổi theo hướng không có lợi làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe,
phá vỡ cân bằng sinh thái, làm mất đi sự phát triển bền vững của nhân loại. Xã hội
ngày càng phát triển và đi kèm điều này là thiên tai, dịch bệnh ngày càng diễn biến
phức tạp và khó kiểm soát. Hiện nay, thế giới đang phải đối mặt với những căn
bệnh phức tạp, bệnh nan y và tình trạng lây lan và khó kiểm soát của những dịch
bệnh nguy hiểm, có khả năng lan rộng thành đại dịch ở quy mô toàn cầu. Bên cạnh
đó, tình trạng kháng thuốc của những dịch bệnh trước đây càng ngày càng phổ biến.
Có thế đưa ra một số ví dụ điển hình như HIV/AIDS, các căn bệnh ung thư, viêm
đường hô hấp cấp SARS, dịch cúm gia cầm và gần đây là dịch Ebola…. Từ những
thực tế này đã thúc đẩy chúng ta luôn tìm kiếm các thuốc chữa bệnh mới có hiệu
quả cao hơn, tác dụng chọn lọc và giá thành rẻ hơn.
Có nhiều con đường để tìm ra các hoạt chất có tác dụng chữa bệnh để phát
triển thành dược phẩm như tổng hợp hóa học từ các hóa chất cơ bản, thứ hai là bán
tổng hợp từ các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc sử dụng luôn các cây thuốc
đông y. Hiện tại và tương lai thì có lẽ con đường phát triển thuốc có nguồn gốc tự
nhiên là con đường hữu hiệu và hứa hẹn mở ra nhiều tương lai cho ngành hóa dược.
Thực tế đã chứng minh nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đã được sử dụng
trong lĩnh vực chữa bệnh như … artemisinin được chiết từ cây Thanh hao hoa vàng
(Artemisia annua) đã được sử dụng để làm thuốc sốt rét.
Artemisinin được các nhà khoa học Trung Quốc phân lập lần đầu tiên, sau đó
hợp chất này và các dẫn xuất của nó đã được ứng dụng hiệu quả trong điều trị sốt
rét. Những năn gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện và thử nghiệm thành công in
vitro hoạt tính gây độc tế bào ung thư của artemisinin (ART). Tuy nhiên do những
hạn chế như khả năng tan trong nước và trong dầu kém, độ nhờn thuốc cao, thời

gian bán hủy trong huyết tương ngắn và khả năng gây độc tế bào thần kinh nên hợp
chất này có những hạn chế khi sử dụng. Vì vậy hiện nay các nhà khoa học tập trung

9


nghiên cứu bán tổng hợp các dẫn xuất của ART để tìm ra các hợp chất mới có hoạt
tính cao trong điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư.
Một nghiên cứu mang tính khoa học rất lớn đó là việc tìm ra vai trò của
enzyme histon deacetylase trong sinh lý bệnh ung thư. Quá trình phiên mã hoặc
biểu hiện bất thường do những gen mã hóa histon deacetylase hay những phần gắn
chúng bị đột biến là một trong những nguyên nhân dẫn đến quá trình tấn công và
phát triển của ung thư. Các chất ức chế histon deacetylase có thể phục hồi lại sự
biểu hiện gen, ức chế sự phát triển và sống sót của tế bào ung thư. Một loạt các chất
ức chế histon deacetylase đã được nghiên cứu phát triển, các chất acid hydroxamic
là một trong những ví dụ điển hình.
Với khả năng ức chế trên in vitro hoạt tính gây độc tế bào ung thư của
artemisinin (ART) và vai trò to lớn của các dẫn xuất của acid hydroxamic. Ngoài ra
nguồn nguyên liệu artemisinin ở nước có thể tự sản xuất được vì vậy việc nghiên
cứu bán tổng hợp các dẫn xuất từ bộ khung của hợp chất này là điều hết sức thuận
lợi.
Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề xuất đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp
các dẫn chất mới Hydroxamic acid trên cơ sở Artemisinin và hoạt tính ức chế
HDAC”. Đề tài được thực hiện với hai mục tiêu:
 Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới acid hydroxamic trên cơ sở artemisinin
 Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym histon deacetylase và độc tế bào của các dẫn
xuất bán tổng hợp được.

10

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ HDAC VÀ ARTEMISININ
1.1.

TỔNG QUAN VỀ ENZYM HISTON DEACETYLASE

1.1.1. Định nghĩa về HDAC
Mỗi loài sinh vật đều có bộ nhiễm sắc thể đặc trưng, đơn vị cấu trúc cơ bản
của nhiễm sắc thể là các nucleosom. Một nucleosom được hình thành do chuỗi
ADN (khoảng 146 cặp) quấn quanhh lõi octomers protein gồm 4 cặp (8 phân tử
histon) 2H2A, 2H2B, 2H3 và 2H4. Các nucleosom nối với nhau nhờ phần amino
cuối của histon. Bốn cặp histon có 2 phần: phần đầu N với acids amin kết thúc là
lysin nằm bên ngoài nucleosom, phần đuôi C nằm trong lõi nucleosom (Hình
1A)[1]

Hình 1: Cấu trúc nucleosom, HAT & HDAC điều hòa quá trình phiên mã và kích hoạt
Chú thích của hình 1:
A: Cấu trúc của histon trong nucleosom; màu vàng: histon, màu đỏ đậm: đuôi histon, vòng tròn
đỏ: đuôi không có nhóm Acetyl (Ac), màu đỏ đậm (hình chuối): đuôi histon có nhóm (Ac).
B: HDAC và HAT điều hòa quá trình phiên mã và kích hoạt: vòng tròn màu vàng: octamers histon
lõi, ADN: màu xanh tím.

11


Histon acetyltransferase (HAT):
Histon acetyltransferase (HAT) xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl
coenzyme A đến liên kết với nhóm amino của lysin ở phần liên kết N của histon. Sự
acetyl hóa histon làm tháo xoắn nhiễm sắc thể bằng cách trung hòa điện tích dương
của phần đầu N của histon, điều này làm giảm ái lực của histon với phân điện tích

âm trên ADN. Vậy acetyl hóa histon làm nới lỏng cấu trúc nhiễm sắc thể và hoạt
hóa gen.
Histon deacetylase (HDAC):
Histon deacetylase (HDAC) là quá trình ngược với HAT, dưới tác dụng của
enzym HDAC gốc acetyl được tách khỏi N-acetyl lysin amino axit ở phần đuôi
histon và chuyển tới coenzyme A, làm tăng điện tích dương trên histon. Quá trình
này giúp đóng xoắn và ức chế quá trình phiên mã [2].
Các HDAC khác nhau tạo phức hợp khác nhau với các chất đồng ức chế
phiên mã khác, người ta đã nghiên cứu và phân loại như sau:
1.1.2. Phân loại HDAC
HDAC là một lớp enzyme được tìm thấy trong vi khuẩn, nấm, thực vật và
động vật. Hiện nay, con người tìm được 18 loại HDAC, được nhóm thành 4 lớp dựa
trên cấu trúc của chúng có tính tương đồng với HDAC của nấm men [3,4]. Hình 2 là
sơ đồ phân loại HDAC.

12


Hình 2: Phân loại các lớp HDAC

Lớp I: gồm HDAC1, HDAC2, HDAC3 và HDAC8 và có tính tương đồng
với men RPD3 ở tế bào nấm men, có chức năng ức chế phiên mã, chỉ hoạt động khi
nằm trong phức hợp protein.
HDAC 1 và HDAC 2 có enzymes rất giống nhau, chúng có sự tương đồng
tới 82% [1]. HDAC 1 và HDAC 2 không được tạo ra bằng các kỹ thuật tái tổ hợp,
điều đó chứng tỏ rằng các cofactors là rất cần thiết cho các hoạt động của HDAC.
Trong in vivo, HDAC1 và HDAC2 chỉ hoạt động trong phạm vi của phức hợp của
các protein như Sin 3, NuRD (Nucleosome remodelling and deacetylating) và
Co-REST. Ngoài các quy định của HDAC1 và HDAC2 bởi sự sẵn có của
Co-repressors, một cách thứ 2 điều tiết hoạt động thông qua HDAC 1 và HDAC 2

được phosphin hóa ở mức độ ổn định trong tế bào không hoạt động (resting cells).
HDAC3 có cùng cấu trúc vùng tương tự như các HDAC nhóm I, HDAC1 và
HDAC2 có vùng axit amin 181-333 tương tự như vùng axit amin của HDAC3 (93%
tính đồng nhất). Tuy nhiên, vùng tương đồng của HDAC3 so với HDAC 1 và
HDAC2 khoảng 68% [1]. Phần đuôi C- không đảo ngược của HDAC3 cần thiết cho

13


cả hai hoạt tính deacetylase hóa và ức chế phiên mã. Ngoài NLS chứa đựng như
trong lớp HDAC I thì NES có mặt trong HDAC, sự cân bằng giữa hai tín hiệu này
phụ thuộc vào loại tế bào hay điều kiện môi trường [5]. Phần HDAC3 có cấu trúc và
chức năng tương tự như lớp HDAC I nhưng ngoài ra nó còn tồn tại là vùng phức
hợp nhóm, đây cũng khác nhau giữa các nhóm HDAC. Điều này hàm ý mỗi nhóm
HDAC có chức năng khác nhau do sự phức hợp đặc biệt của nhóm.
HDAC8: Trong tất cả nhóm HDAC I thì HDAC8 có sự tương đồng với
HDAC3 hơn cả (34% sự tương đồng). Có sự khác biệt giữa HDAC8 và HDAC1,
HDAC2 đó là hoạt động của HDAC8 giảm khi phosphoryl hóa bởi protein kinase
A, trong khi HDAC 1 và HDAC 2 hoạt động bởi phosphoryl hóa [6]. HDAC 8 là
HDAC đầu tiên ở động vật có vú được xác định cấu trúc 3 chiều [7].
Lớp II: Gồm HDAC 4, HDAC 5, HDAC7, HDAC 9 hay còn gọi là nhóm IIa
có tính tương đồng với men HDAC 1. Lớp IIb gồm HDAC 6 và HDAC 10,
HDAC4, HDAC5 và HDAC 7 được tìm thấy trong cùng một lớp phát sinh và đại
diện cho một nhánh của lớp II. HDAC4 và HDAC5 có sự tương đồng đến 70% tổng
thể, nhưng HDAC7 chỉ tương đồng khoảng 58-57% với HDAC4,5. Cả 3 loại
HDAC này đều có vùng xúc tác ở nửa đầu C của protein (CtBP) và các NLS nằm
gần đuôi N-terminus [1]. Các HDAC nhóm IIa có đuôi N tương tác đặc hiệu với
phiên mã MEF2 (myogennic transcription factor 2), đây là yếu tố quan trọng trong
sự biệt cơ hóa. Các HDAC này kết hợp với MEF2 gây ức chế chức năng phiên mã
của MEF2 làm cho tế bào cơ không biệt hóa được. Các HDACs này có thế bổ sung

cho nhau để kiểm soát các quy định của gen trong các giai đoạn khác nhau của sự
biệt hóa trong tế bào cơ.
Khi được tìm thấy thì HDAC6 có liên quan chặt chẽ với HDAC10, HDAC6
là một enzym khá độc đáo trong họ HDAC bởi vì nó có chứa 2 vùng xúc tác nối
tiếp. Một điểm đặc biệt chỉ có ở HDAC6 là có sự hiện diện của một HUB (HDAC6,
USP3-, and Brap2-related zinc finger motif) trên đuôi C-terminus. Đặc điểm này là
dấu hiệu cho quá trình ubiquitin hóa và đây cũng là dấu hiệu cho thấy HDAC này
dễ bị thoái hóa. Miền xúc tác của HDAC6 tương tự như HDAC9, HDAC6 chủ yếu

14


có trong bào tương, ngoài ra nó còn được tìm thấy trong nhân phức hợp với
HDAC11 [1].
HDAC10 được phát hiện gần đây nhất so với các HDAC khác trong lớp II,
nó có sự tương đồng với HDAC6 khoảng 37%. HDAC10 có một vùng xúc tác ở
đuôi N-terminus và một vùng xúc tác được cho là ở đuôi C-terminus. HDAC10
được tìm thấy là có khả năng tương tác với HDAC1, 2, 3, 4, 5 và 7 nhưng không
tương tác với HDAC6.
Lớp III: (silent information regulator genes – sirtuins) gồm SIRT1-7 tương tự
như Sir2 ở tế bào nấm men. HDAC nhóm này không có mối liên hệ nào với các
nhóm khác, chúng có trong nhân (SIRT1,6,7). Trong bào tương (SIRT2) hoặc ty thể
(SIRT3,4,5). Nhóm III này ít được nghiên cứu ở người nhưng được xác định có cơ
chế hoạt động phụ thuộc vào cofactor NAD+, khác với HDAC nhóm cổ điển (I, II
và IV) phụ thuộc vào Zn2+ và bị ức chế tạo phức chelat với Zn2+[1, 8].
Lớp IV: gồm HDAC11 có trong nhân tế bào [3], và chỉ có ở người. Từ
những phân tích phát sinh loài cho thấy HDAC11 có liên quan chặt chẽ đến
HDAC3, 8 điều này có thể giả thuyết rằng HDA11 có liên quan mật thiết với lớp I
hơn là lớp II. HDAC11 chứa một vùng xúc tác ở đầu N-, hoạt động của HDAC11 đã
được chứng minh có thể ức chế bởi trapoxin (một TSA) HDAC11 không được tìm

thấy ở bất kỳ phức HDAC đã biết để có thể xác định chức năng sinh học [1, 9 ] .
Các chất ức chế histone deacetylase (HDAC) là tác nhân chống ung thư tiềm
năng và đã được chứng minh là chất có khả năng gây sự tự chết và ức chế sự di căn,
xâm lấn và sự hình thành mạch ở nhiều dòng tế bào ung thư. Ngoài ra, các hợp chất
này ức chế sự phát triển khối u ở động vật và cho thấy hoạt động chống khối u ở
bệnh nhân.
1.1.3. Cấu tạo của HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa
Hiện nay, người ta sử dụng phương kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X đã xác
định được cấu trúc 3D của các HDAC và các trung tâm hoạt động của nó [7, 10].
Việc xác định cấu trúc của HDAC rất có ý nghĩa, dựa trên cấu trúc có thể xác định

15


cơ chế tác dụng của HDAC, ngoài ra còn xây dựng các công thức cho các chất ức
chế enzyme HDAC.

Hình 3: Cấu tạo của HDAC

Cấu tạo của HDAC gồm:
-

Ion Zn2+ là coemzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác. Trong phân tử

HDAC, ion Zn2+ là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon
bằng liên kết phối trí. Zn2+ có 5 liên kết phối trí gồm: 4 liên kết với nguyên tử oxy,
nitơ của các axit amin, 1 liên kết với nguyên tử oxy của nhóm acetyl thuộc phân tử
acetyl-lysin ở phần đuôi N của histon, từ đó tách loại nhóm acetyl. Thông thường,
các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và
độc tính càng mạnh.

Kênh enzyme có dạng túi hình ống là nơi chứa đựng cơ chất và tạo liên kết
giữa lực Van der waal với cơ chất. Phần túi được được cấu tạo từ các axit amin thân
dầu: Phenylamin, Tyrosin, Prolin, Histidin, ngoài ra đáy túi còn có vài phân tử

16


nước. Cấu trúc túi khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất
khác nhau [11].
1.1.4. Mối liên hệ giữa ung thƣ và HDAC
Đột biến gen hay sự biến đổi bất thường do di truyền biển hiện qua gen là
nguyên nhân gây ra rất nhiều bệnh hiểm nghèo trong đó có ung thư. HAT và HDAC
là hai quá trình ngược nhau. HAT giúp tháo xoắn cấu trúc của nucleosom, nhờ đó
các nhân tố sao mã dễ dàng tiếp cận ADN. HDAC giúp đóng xoắn nhiễm sắc thể
dẫn đến ức chế quá trình phiên mã do ngăn cản các nhân tố sao mã đến đích của
chúng trên ADN. Như vậy, việc mất cân bằng hoạt động giữa HAT và HDAC có
thể dẫn đến những bất thường của gen từ đó có thể dẫn đến ung thư [4, 12].
Theo nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng biểu hiện của các mô ung thư có liên
quan đến các lớp HDACs. Cụ thể như: ung thư dạ dày, tuyến tiền liệt, đại trực tràng,
ung thư biểu mô (HDAC1, 2). Ung thư tụy, tế bào gan (HDAC1), ung thư dạ dày,
tiền liệt tuyến (HDAC3), ung thư vú (HDAC4), ung thư đại trực tràng
(HDAC5,7,9), ung thư vòm họng, ung thư vú (HDAC6) [8]. Bên cạnh đó, biểu hiện
quá mức HDAC1, 2, 6 còn gặp trong các bệnh bạch cầu, bệnh u lympho tế bào T
ngoại vi và u lympho tế bào B, u lympho tế bào da [13]. Hơn nữa, việc tìm ra cơ
chất của HDAC là các protein có liên quan đến bệnh ung thư đã cho thấy vai trò của
HDAC đối với các nghiên cứu về ung thư [14, 15]. Như vậy, mục tiêu trong điều trị
ung thư là tìm cách ức chế hoạt động của HDAC bằng hoạt chất hóa học. Hiện nay
trên thế giới, các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu tìm ra các chất có tác dụng ức
chế đặc hiệu cho từng loại HDAC để ứng dụng điều trị ung thư.
1.1.5. Các chất ức chế HDAC (HDACIs)

Kể từ khi chất ức chế HDAC đầu tiên là Trichostatin A (TSA) được phát
hiện vào năm 1990 do Yoshida và cộng sự. Đến nay, đã có nhiều công trình công bố
về việc tìm kiếm các chất ức chế HDAC có tác dụng điều trị ung thư. Một số hoạt
chất đã được thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư.
Các chất ức chế HDAC được chia làm 4 nhóm dựa vào cấu trúc hóa học theo
bảng 1 dưới đây [16].

17


Bảng 1: Bảng phân loại các chất ức chế HDAC
Lớp chất

Tên

Cấu trúc

Trichostatin (TSA)

Hydroxamat

acid suberoyl anilid
hydroxamic (SAHA)

CBHA

LAQ-824

PXD-101

Cyclic peptid

Depsipeptit (FK-228)

acid

acid valproic

Aaliphatic

Phenyl butyrat

18


Benzamid



MS-275

Các hydroxamate: Trichostatin A (TSA), acid subenoylanilid (SAHA),

CBHA, LAQ-824, PXD-101.


Các peptid vòng: Depsipeptid (FK-228)



Các axit béo: acid valproic, phenyl butyrate



Benzamide: MS-275

a.

Các hydroxamate và dẫn xuất:
Trichostatin A (TSA) là nhóm đầu tiên được phân lập từ Streptomyces

hygroscopicus, đây là chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên được phát hiện có tác dụng
ức chế HDAC.
Acid subenoylanilid hydroxamic (SAHA) có cấu trúc tương tự TSA và là chất ức
chế HDAC nhóm I và II ở nồng độ nanomol, cả SAHA và TSA đều không ức chế
HDAC nhóm III [17]. Bên đang cạnh đó, các dẫn xuất acid hydroxamic đang được
nghiên cứu rộng rãi.
b.

Các peptid vòng
Nhóm này có cấu trúc phức tạp nhất trong các HDACIs gồm depsipeptid

(FK-228), apicidin và các phần tử khác. Tất cả các chất này đề có tác dụng ức chế
HDAC ở nồng độ nanomol.
c.

Các axit béo
Các acid béo mạch ngắn như acid valproic, phenyl butyrate có tác dụng ức

chế HDAC tương đối yếu ở nồng độ micromol.

d.

Các benzamid
Nhóm này ức chế các HDAC bằng cách xâm nhập vào vị trí xúc tác và liên

kết với kẽm hoạt động.

19


1.1.6. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACIs)
Tác dụng chống ung thư của các HDACIs do tác động lên nhiều giai đoạn
quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa của tế bào ác tính. Yếu tố quyết
định khả năng chống ung thư của HDACIs là thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình
tế bào và thúc đẩy sự tự chết của tế bào.
a.

Các chất ức chế HDAC gây ra sự chết tế bào theo chương trình
Các chất ức chế HDAC khi tiếp xúc với tế bào ung thư có thể dẫn đến sự

chết theo chương trình với mục đích kiểm soát số lượng tế bào bất thường trong quá
trình phát triển. Người ta đã xác định hai con đường gây chết tế bào với chức năng
riêng biệt nhưng có mối liên hệ với nhau là cùng có sự tham gia của các enzym
cystein protease [18, 19]. Con đường thứ nhất hoạt hóa bởi các receptor và con
đường thứ 2 gây chết tế bào nội sinh bằng cách phá vỡ màng ty thể.
b.

Các chất ức chế HDAC thúc đẩy sự biệt hóa
Khi là tác nhân đơn độc, các chất ức chế HDAC thúc đẩy ức chết chu trình tế

bào làm cho tế bào ung thư thể hiện đặc tính biệt hóa và ngừng tăng sinh ở các bệnh
ung thư như các bệnh bạch cầu và các khối u rắn. Phân tích các số liệu về chu trình
tế bào của tế bào ung thư đã được sử dụng các HDACIs kết quả chỉ ra các tế bào
thường dừng ở pha G1 nhưng đôi khi tích tụ đến pha G2 của chu trình.
Xét ví dụ về sự biệt hóa của tế bào đối với bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp, sự
biệt hóa tế bào tủy phụ thuộc vào sự hoạt hóa phiên mã của RARα (receptor acid
retioic) với các protein gây ung thư PLZE-RARα làm ngắt quãng chương trình biệt
hóa bình thường. Các chất HDACIs ức chế chức năng của các protein gắn kết
AML1-ETO và TEL-AML1, khôi phục sự nhạy cảm của các tế bào ác tính với acid
retinoic. Bên cạnh đó, HDACIs còn có thể gây biệt hóa nhiều loại tế bào nhưng quá
trình này chưa được làm sáng tỏ.
Sau khi tiếp xúc với HDACIs, thường các tế bào dừng lại ở pha G1 để sao
chép ADN rồi đi đến sự chết tế bào. Tuy nhiên, đôi khi một số tế bào ung thư lại
tích tụ đến điểm kiểm soát G2, tại điểm này chu trình tế bào tạm dừng lại cho đến
khi gặp các điều kiện phù hợp mới tiếp tục. Tế bào thường qua điểm G2 thì tiếp tục

20


phát triển, còn tế bào ung thư tái tạo ADN thành dạng 4nADN (đa bội) và chuyển
sang sự chết tế bào, cơ chế này vẫn chưa được làm sáng tỏ [18, 20].
c.

Các chất ức chế HDAC ức chế sự tạo mạch
Ngoài việc tác động trực tiếp lên sự tồn tại và phát triển của khối u, các

HDACIs còn tác động gián tiếp đến sự phát triển của khối u. HDACIs có thế hoạt
hóa phiên mã các protein MHC nhóm I và nhóm II nhằm làm tăng mạnh sự nhận
biết và hoạt hóa của tế bào miễn dịch. Mặt khác, khi khối u ung thư tồn tại và phát
triển cần có dinh dưỡng và oxy để duy trì sự sống của khối u. HDACIs có thế ức

chế gây giảm oxy huyết của yếu tố gây phát triển màng trong mao mạch và triệt tiêu
sự hình thành mạch, điều này có thể ngăn chặn sự phát triển của các khôi u và sự di
căn [21].
1.1.7. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC mang
cấu trúc acid hydroxamic.


Cấu trúc của các HDACIs bao gồm 3 phần chính:



Phần A: nhóm gắn với Zn2+ (zinc binding group, ZBG) bao gồm các acid

hydroxamic, thiol, nhóm O-aminoanilin của benzamid…quyết định tính đặc hiệu và
hiệu lực của HDACIs.


Phần B: phấn cầu nối, thường là các hydrocacbon thân dầu, có thể tạo nhiều

liên kết Van der wall với enzym.


Phần C: nhóm nhận diện bề mặt, thường là vòng thơm, peptid vòng. Nhóm

này nằm trên bề mặt của enzym quyết định tính đặc hiệu của HDACIs.


Tác dụng ức chế HDAC của các chất hydroxamat và dẫn xuất:
Từ khi chất acid hydroxamic (trichostatin –TSA) được chứng minh có tác

dụng ức chế HDAC thì nhóm chất acid hydroxamic và dẫn xuất đã được nghiên cứu
rộng rãi.
TSA đã được chứng minh có tác dụng tốt trong việc giảm sự biết hóa trong
bênh bạch cầu Friend và ức chế chu trình tế bào bình thường ở pha G1 và G2 [22].
TSA có tác dụng ức chế mạnh đặc hiệu với HDAC. Tuy nhiên, việc sản xuất TSA

21


rất tốn kém mà hiệu suất thấp vì vậy ngày nay TSA dùng làm chất đối chiếu trong
việc tìm kiếm các chất ức chế HDAC mới [23].
SAHA (suberoylanilid hydroxamic acid) có cấu trúc tương tự TSA và là chất
ức chế HDAC nhóm I và II ở nồng độ nanomol. CBHA (m-cacboxycinnamic acid
bishydroxamid) là chất ức chế không chọn lọc HDAC nhóm I và II.
Các acid hydroxamic có tác dụng ức chế HDAC tốt nhưng chúng có tác dụng
ức chế không chọn lọc và bị chuyển hóa nhanh [24].
Dựa trên đặc điểm cấu trúc của các chất ức chế HDAC các nghiên cứu tiến
hành thay đổi công thức cho các HDACIs bằng một trong các cách: Thay đổi nhóm
chức tạo liên kết với Zn2+ của HDAC, thay đổi cầu nối, thay đổi nhóm nhận diện bề
mặt.
1.1.8. Thiết kế các công thức cho HDACIs mới

Hình 4: Mối liên hệ giữa cấu trúc HDAC và acid hydroxamic

Hình vẽ trên thể hiện mối liên quan giữa cấu trúc HDAC và tác dụng ức chế
của các dẫn chất acid hydroxamic (hình 4) [11]. Dựa trên mối liên hệ này các nhà
khoa học tiến hành xây dựng công thức cho các HDACIs mới dựa trên 3 cơ sở sau:
Thay đổi nhóm chức tạo liên kết với Zn2+ của HDAC
Các chất ức chế HDAC tạo phức với Zn2+ tại trung tâm hoạt động của HDAC
là yếu tố then chốt quyết định tính đặc hiệu và hoạt lực của chúng. Trong nhóm các

chất có thể liên kết với Zn2+ bền vững nhất phải kể đến các dẫn chất của acid

22


hydroxamic. Các dẫn chất này đều ức chế HDAC ở nồng độ nM, vì vậy nó là nhóm
chất quan trọng trong nghiên cứu về HDACIs.
Thay đổi cầu nối:
Phần cầu nối ảnh hưởng tới tác dụng ức chế chọn lọc HDAC, hiệu lực của
HDAC. Độ dài của cầu nối cần có độ dài tương thích với túi enzym của HDAC.
Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt
Nhóm nhận diện bề mặt chủ yếu là các vòng (vòng thơm hoặc peptid vòng)
1.1.9. Một số nghiên cứu thiết kế , thí nghiệm các chất ức chế HDAC gần đây
Tổng hợp acid hydroxamic từ este
Phương pháp tổng hợp thông qua hợp chất trung gian là ester được nhiều
nhóm nghiên cứu áp dụng. Nguyễn Hải Nam và cộng sự [25] (theo sơ đồ 1) trường
Đại học Dược đã công bố một số công trình tổng hợp acid hydroxamic theo hướng
này. Có 6 acid hydroxamic benzothiazole 14 và 15 được tổng hợp qua hai bước.
Bước thứ nhất acyl hóa các dẫn xuất của 2-aminobenzothiazole 11 với acid adipic
monomethyl ester hoặc acid suberic monomethyl ester sử dụng xúc tác CDI tạo
thành các sản phẩm trung gian 12 và 13. Bước thứ hai, chuyển hóa các hợp chất
trung gian thành acid hydroxamic 14 và 15 sử dụng tác nhân NH2OH.HCl trong
dung môi MeOH. Hiệu suất các phản ứng này đạt được từ 70-90%. Hoạt tính gây
độc tế bào thử trên dòng tế bào ung thư SW620, MCF-7, PC-3, AsPC-1 và NCIH460 cho thấy cả 6 hợp chất đều gây độc tế bào với giá trị IC50 = 0.59 – 11.08
µg/ml. Các hợp chất 14a-d thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với IC50 = 7.0-15.12
µg/ml. Hoạt tính ức chế HDAC được thử trên dòng tế bào SW620, kết quả cho thấy
các hợp chất (15a, 15c, 15f) thể hiện hoạt tính ức chế HDAC H3 và H4 với giá trị
IC50 từ 5.49 – 0.81 µg/ml ở nồng độ thử 1µg/ml. Trong khi đó, các hợp chất (14 a-f,
15d và 15e) không thể hiện hoạt tính ức chế HDAC ở cùng nồng độ thử. Điều này,
bổ xung thêm một nhận xét các chất có cầu nối giữa nhóm benzothyazole với gốc

acid hydroxamic có độ dài 5 đến 6 các bon có hoạt tính ức chế HDAC và độc tế bào
mạnh hơn các chất có độ dài cácbon ngắn hơn (4 liên kết các bon).

23


Sơ đồ 1: Tổng hợp các dẫn xuất acid hydroxamic benzothiazole
Tác nhân và điều kiện phản ứng: (A) axit adipic monomethyl ester (chất số 2/4) hoặc
suberic axit monomethyl ester (chất số 3/5), CDI, TEA, DMF, 4-5 h; (B): NH2OH.HCL,
NaOH, MeOH, 0 oC, 30 phút đến 1 giờ.

Cùng hướng nghiên cứu này, trong một công bố khác Nguyễn Hải Nam và
cộng sự [26] đã tổng hợp các acid hydroxamic 18 (theo sơ đồ 2) đi từ chất đầu là
dẫn xuất của isatin 16 qua phản ứng với ethyl 7-bromoheptanoate có mặt của xúc
tác K2CO3 và KI trong dung môi DMF ở 60 oC trong 24 giờ. Hợp chất trung gian 17
thu được sau đó phản ứng với hydroxylamine hydrochloride có mặt của NaOH,
trong hỗn hợp dung môi MeOH/THF ở -5 oC trong 30-60 phút. Kết quả thử hoạt
tinh độc tế bào cho thấy các chất này có khả năng gây độc tế bào mạnh đối với
4 dòng (SW620, MCF-7, PC-3 và AsPC-1) và gây độc yếu với dòng tế bào
NCI-H460. Tuy nhiên, kết quả thử HDAC trên dòng tế bào SW620 (ung thư ruột
kết) lại chưa thể hiện hoạt tính.

Sơ đồ 2: Tổng hợp isatin-3-oxime acid hydroxamic
a: ethyl 7-bromoheptanoate, K2CO3, KI, DMF, 60 oC, 24 giờ;
b: Hydroxylamine hydrochloride, NaOH, MeOH/THF, -5 oC, 30-60 phút.

24


Trong 1 công bố mới đây của Trần Thị Lan Hương và cộng sự [27] đã tổng

hợp 2-oxospiro [1,3]dioxolane/dithiolane-2,3-indoline-based acid hydroxamic
(sơ đồ 3). Ban đầu từ dẫn xuất isatin 19 phản ứng với ethylene glycol với sự có mặt
của xúc tác p-toluenesulfonic acid (p-TsOH) phản ứng đun hồi lưu trong toluen
khan thu được các sản phẩn trung gian dioxolane 20 a-h. Các hợp chất trung gian
này phản ứng với ethyl 7-bromoheptanoate có mặt của K2CO3 và xúc tác KI trong
DMF ở 60 oC trong 24 giờ thu được các hợp chất 21 a-h. Các hợp chất này được
sau đó được phản ứng với hydroxyamine trong điều kiện như trên cho các acid
hydroxamic 24 a-h với hiệu suất cao. Các hợp chất 25 a-h cũng thực hiện tương tự
như các hợp chất 24 a-h. Các hợp chất acid hydroxamic tổng hợp được thử hoạt
tính ức chế HDAC trên dòng tế bào SW620. Kết quả chỉ ra rằng các hợp chất thể
hiện hoạt tính ức chế HDAC và khi so sánh với khả năng ức chế của SAHA cho
thấy khả năng ức chế tương đương với SAHA khi thử với HDAC H4 và H3.

Sơ đồ 3: Tổng hợp acid 2-oxospiro[1,3]dioxolane/dithiolane-2,3-indoline-based
hydroxamic
a: ethylene glycol/ ethylene dithiol, p-TsOH, toluen, ∆, 24h;
b: ethyl 7-bromo heptanoate, K2CO3, KI, DMF, 60 oC, 24 giờ;
c: Hydroxylamine hydrochloride, NaOH, MeOH/THF, -5 oC, 30-60 phút.

Tổng hợp acid hydroxamic từ acid cacboxylic:
Wei Yang và cộng sự [28] đã tổng hợp các acid hydroxamic 4-anilinthione
[2,3-d] pyridine (sơ đồ 4) từ các hợp chất trung gian là acid cacboxylic với

25