VAI TRÒ CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG

VAI TRÒ CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO
VỆ MÔI TRƯỜNG

1. CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT TÁI TỔ
HỢP GEN ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
1.1. Công nghệ sinh học cổ điển (hay CNSH đại phân tử) và công nghệ sinh học
hiện đại (hay CNSH phân tử)
CNSH đại phân tử là lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng sinh vật và vi sinh
vật (VSV) ở mức độ nguyên trạng, tức là chưa đi sâu vào tìm hiểu và ứng dụng
ở mức độ cấu trúc phân tử mà chỉ tận dụng những đặc tính kiểu gen (genotype)
và kiểu hình (phenotype) của chúng để sử dụng và chọn lọc loại tối ưu cho mục
đích đặt ra.
CNSH phân tử (Molecular Biotechnology) là một lĩnh vực tổng hợp có
liên quan rất lớn đến các ngành di truyền phân tử, tế bào học, VSV học, sinh
hoá học....
CNSH phân tử có hai lĩnh vực chính là CNSH phân tử cơ bản và CNSH
phân tử ứng dụng.
• CNSH phân tử cơ bản: bao gồm các thao tác DNA ở mức độ phân tử như
cắt, nối, ghép, chuyển nạp, dẫn truyền các loại gen ngoại lai hữu ích vào
các dòng tế bào chủ thích hợp để duy trì gen đó.
• CNSH phân tử ứng dụng: chọn lọc, nhân lên, sản xuất...những dòng tế bào
đã được tái tổ hợp để thu được những sản phẩm có ích cho con người.
CNSH phân tử cơ bản và CNSH ứng dụng là hai bước kế tiếp nhau để đưa
nguyên lý tái tổ hợp gen thành hiện thực, sản xuất các thành phẩm hữu ích theo
công nghệ mới- Công nghệ sinh học.
1.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật tái tổ hợp gen ứng dụng trong CNSH
1.2.1. Mở đầu và khái niệm:
Năm 1970, lần đầu tiên, Baltimore và Temin độc lập phát hiện loại
enzyme có tác dụng sao chép ngược (reverse transcriptase) có tác dụng tham gia
hoạt hoá cho quá trình tổng hợp ngược DNA từ khuôn RNA (reverse
transcription). Điều này cho phép một khi đã có một RNA thông tin (mRNA)

của một gen ở dạng sợi đơn, chúng ta có thể chuyển đổi thành 1 gen hoàn toàn
(ở dạng DNA chuỗi xoắn kép) theo cơ chế bổ sung sao chép ngược, có sự tham
gia của enzyme nói trên. Đây chính là nguyên lý tạo DNA bổ sung
(complementary DNA-cDNA) từ mRNA.
Cũng trong năm 1970, Smith và Wilcon công bố đã tách chiết được một
loại enzyme nội bào từ vi khuẩn Haemophills influenzae, có khả năng cắt DNA
ở những điểm nhất định, tạo nên nhiều đoạn DNA rời nhau, đã mở hướng cho
một kỹ thuật thao tác mới ở mức độ phân tử, đó là có thể cắt và nối các đoạn
DNA thích hợp để tạo nên các hỗn hợp lai DNA khác nhau. Về sau một loạt các
loại enzyme có hoạt tính như trên đã được phân lập, người ta gọi đó là các
enzyme hạn chế (restriction enzyme)
Cũng trong những năm 70 tiếp theo, song song với sự phát triển và hoàn
thiện những kỹ thuật thao tác vật liệu thông tin di truyền, việc phát hiện và sử
dụng một số thực thể vi sinh sống cộng sinh trong các loại tế bào vi sinh vật như
nấm men, vi khuẩn...có một ý nghĩa ứng dụng hết sức to lớn. Đó chính là các
loại plasmid. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền các gen
ngoại lai đã được tái tổ hợp vào tế bào vi sinh vật chủ tương ứng của chúng.
Gần đây, trong những năm 80, phản ứng nhân bản gen (Polymerase
Chain Raction-PCR) đã được phát hiện trên nguyên lý: deoxyribonucleic acid
(DNA) có cấu trúc chuỗi xoắn kép, gồm hai mạch nucleotide bổ sung cho nhau
theo quy luật A-T và G-C bằng các mối liên kết hydro. Giữa A-T có 2 và G-C
có 3 mối liên kết hydro. Liên kết này không phải là liên kết hoá học bền vững,
do đó dưới một tác dụng nào đó (ví dụ nhiệt độ cao trên 90
o
C, gần đến 100
o
C)
thì hai mạch nucleotide sẽ tách nhau ra, nhưng khi hạ nhiệt thì hai mạch lạ xoắn
trở lại. Sự phát hiện này đã nâng cao hơn nữa kỹ thuật tái tổ hợp DNA và ứng
dụng thành quả của kỹ thuật đó.

Như vậy, bằng enzyme hạn chế, ta có thể cắt một chuỗi DNA nào đó
thành nhiều đoạn, rồi ghép một đoạn nào đó vào plasmid cũng đã bị cắt bằng
một enzyme tương tự để tạo nên một plasmid mới mang đoạn DNA ngoại lai.
Nếu đoạn DNA đó là một gen hoàn chỉnh chúng ta có một plasmid mới mang
gen ngoại lai. Kỹ thuật cắt-nối-ghép và tạo nên một thực thể vi sinh mới, mang
một hay nhiều đoạn DNA ngoại lai, được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA
(recombinant DNA technology). Plasmid mang DNA ngoại lai đó được gọi là
plasmid tái tổ hợp (recombinant plasmid). Khi pla smid đó được đưa vào tế bào
vi sinh vật chủ, quá trình đó được gọi là quá trình chuyển nạp (transformation).
Plasmid mang DNA ngoại lai đóng vai trò chuyển DNA vào trong tế bào chủ
được gọi là vector dẫn truyền (cloning vector).
Vector dẫn truyền có thể là plasmid hay bất kỳ một loại thực thể vi sinh
khác, như virus chẳng hạn. Khi một vi sinh vật chủ (nấm men hay vi khuẩn...)
đã tiếp nhận vector dẫn truyền để thực hiện những quá trình sinh học tiếp theo
với DNA ngoại lai đã được chuyển nạp, thì dòng VSV đó được gọi là VSV tái
tổ hợp (recombinant microorganism).
Khi nuôi cấy VSV tái tổ hợp, nếu DNA ngoại lai là một gen hoàn chỉnh,
được bố trí trong điều kiện có cấu trúc vector dẫn truyền thích hợp, thì gen đó
có thể tổng hợp được protein ở trong tế bào vật chủ. Vector dẫn truyền có cấu
trúc đặc biệt này được gọi là vector biểu thị gen (expression vector).
1.2.2. Các thành phần tham gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen
Kỹ thuật tái tổ hợp gen bao gồm nhiều công đoạn khác nhau,có thể được tóm
tắt như sau:
• Cắt DNA bằng enzyme hạn chế (RE)
• Phân lập đoạn DNA đã được cắt
• Cắt plasmid tương ứng bằng enzyme hạn chế thích hợp
• Nối ghép đoạn DNA ngoại lai vào plasmid
• Chuyển nạp vào tế bào VSV chủ thích ứng
• Chọn lọc dòng đã được tái tổ hợp theo nguyên tắc kháng kháng sinh
• Nhân dòng đã chọn lọc

• Kiểm tra xác định kết quả
Vì vậy, các thành phần tham gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen rõ ràng có liên
quan đến:
a) Nguồn cung cấp DNA
Nguồn cung cấp DNA bao gồm tất cả các loại hình có chứa DNA của vi
sinh vật, nấm men, thực vật, động vật bậc cao. Các loại DNA này cần
phải được làm sạch khỏi các thành phần khác của tế bào và bảo quản ở
nhiệt độ -20
o
C. Cũng có thể là mRNA nhưng phải được chuyển sang
dạng cDNA. Ngoài ra, nguồn cung cấp DNA cho kỹ thuật tái tổ hợp gen
có thể là sản phẩm PCR tinh khiết. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ
thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận các phân tử này ở trạng thái
nguyên vẹn tối đa không bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị
gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hoá học (phân tử bị thuỷ giải bởi các
enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các
nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế
hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease-DNase và
ribonuclease-RNase)
- Phương pháp tách chiết DNA: gồm 3 bước cơ bản sau:
§ Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào eucaryote). Thông
thường, tế bào, mô được nghiền trong một hỗn hợp chất tẩy (detergent
như SDS, sarcosyl) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ
màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời
phân huỷ các protein liên kết với DNA.
§ Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ
yếu là các protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch phenol
và chloroform. Dung dịch phenol và chloroform có tác dụng làm biến
tính protein đồng thời không hoà tan nucleic acid. Protein khi biến tính
sẽ không còn hoà tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly

tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform.
Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại.
§ Bước 3: Tủa các nucleic acid. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận
nucleic acid dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân
huỷ của các enzyme, mặt khác để có thể hoà tan chúng trở lại trong dung
dịch theo nồng độ mong muốn. Phương pháp thông dụng là tủa trong
isopropanol với tỉ lệ thể tích isopropanol/thể tích mẫu là 1/1. Các DNA
có TLPT thấp không bị tủa, do đó có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa
trong isopropanol. Sau đó, nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm.
Tiếp theo, cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các dấu
vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Bảo quản ở nhiệt độ -20
o
C.
- Phương pháp tách chiết RNA toàn phần và mRNA
Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ bởi các enzyme
ribonuclease (RNase). Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng bao gồm
các bước cơ bản như đối với DNA:
Tế bào, mô được nghiền trong một dung dịch gồm một chất tẩy
mạnh (SDS, sarcosyl) ở nồng độ cao, một tác nhân gây biến tính
protein biến tính mạnh (guanidinium thiocyanate), một chất khử (2-
mercaptoethanol). Hai loại chất sau có tác dụng ức chế hoạt động
của các Rnase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử
RNA.
Các protein được loại bỏ khỏi mẫu qua xử lý phenol:chloroform
và li tâm.
RNA hoà tan trong pha nước được kết tủa bằng ethanol và được
thu nhận lại qua li tâm. RNA có thể được bảo quản trên một năm
dưới dạng tủa trong dung dịch ethanol hoặc đông lạnh ở -70
o
C trong

nước có chứa RNasine (một chất ức chế RNase)
Sau khi một mRNA được phân lập khỏi tế bào, để có thể đưa chúng tham
gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen, trước hết chúng phải được chuyển sang dạng
cDNA bằng kỹ thuật DNA bổ sung. Chỉ ở dạng DNA mới có thể cắt nối bằng
enzyme hạn chế và ghép vào plasmid được.
- Phản ứng nhân bản gen PCR (Polymerase Chain Reation)
Như đã nói ở trên, nguồn cung cấp DNA cho kỹ thuật tái tổ hợp gen còn có
thể là sản phẩm PCR tinh khiết.
Phản ứng PCR là một phản ứng nhân tạo thực hiện trong PTN với sự tham
gia của các thành phần sau:
DNA làm khuôn
Oligonucleotide (hay còn gọi là primer): là hai chuỗi nucleotide
ngắn, được tổng hợp nhân tạo, có thể bám vào những vùng đặc hiệu trên
sợi DNA làm khuôn và trượt theo chiều tiến lại gần nhau.
Taq DNA polymerase: là loại enzyme rất bền và hoạt động tốt đến
nhiệt độ 96
o
C, được chiết xuất từ Thermus aquaticus (Taq)- một loại vi
khuẩn sống trong suối nước nóng.
Hỗn hợp deoxyribo-nucleotide triphosphate (dNTP): bao gồm các
thành phần deoxyribo-adenine triphosphate (dATP), deoxyribo- thymine
triphosphate (dTTP), deoxyribo-guanine nucleotide triphosphate (dGTP),
deoxyribo-cytosine triphosphate (dCTP) được hỗn hợp theo một tỷ lệ
thích hợp. Hỗn hợp này có nhiệm vụ cung cấp nguồn nucleotide cho quá
trình tổng hợp DNA xảy ra trong PCR.
Môi trường đệm (buffer): đảm bảo độ pH cần thiết.
Mg
2+
với hợp chất cung cấp là MgCl
2

với nồng độ 1.5-2.0 mM trong
phản ứng PCR.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm 3 bước:
Bước 1: trong một dung dịch phản ứng bao gồm tất cả các thành phần
cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao
hơn Tm của phân tử, thường là 94-95
o
C trong vòng 30 giây đến 1-2 phút.
Chuỗi DNA bị bung mối liên kết hydro và tạo nên hai sợi DNA làm
khuôn. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation)
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp xuống khoảng 37-65
o
C (thấp hơn Tm
của các primer), thông thường là 45-55
o
C (mà cho phép các primer bắt
cặp với các sợi DNA làm khuôn ở những vị trí thích hợp của chúng ),
trong khoảng từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization)
hay gắn (annealing)
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72
o
C giúp cho DNA polymerase
hoạt hoá các primer để chúng trượt trên các sợi khuôn, lấy các dNTP
trong môi trường bổ sung vào sợi mới và tạo nên DNA mới. Thời gian
của bước này tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại,
thường kép dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay
kéo dài (elongation)
Một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, thường sau 25-
35 chu kỳ là tốt nhất.

Sản phẩm PCR là một đoạn DNA có độ dài từ vài chục đến vài chục nghìn
nucleotide, thông thường đến 3000. Vì lẫn tạp nhiều thành phần khác tham gia
phản ứng PCR, nên sau khi được sản phẩm PCR, trước hết cần kiểm tra độ dài
của đoạn DNA trong sản phẩm có đúng với đoạn ước định cần có không bằng
phương pháp điện di khuếch tán trên thạch (agarose gel electrophoresis). Sau
đó, cần thiết phải được tinh khiết trước khi sử dụng làm vật liệu DNA cho kỹ
thuật tái tổ hợp gen.
- Phương pháp điện di:
Sau quá trình tách chiết, các nucleic acid có thể được tinh sạch nhờ một
số kỹ thuật như siêu ly tâm, sắc ký, hay điện di.
Phương pháp điện di được sử dụng cả trong phân tích định tính và thu
nhận mẫu nucleic acid. Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính
cấu trúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên
khắp bề mặt, nên khi chịu tác động của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực
dương của điện trường. Tính linh động của phân tử trong bản thạch (gel) dưới
tác động của điện trường được tính theo công thức:
Log u = Log u
o
- K
r
C
Trong đó: Log u
o
là tính linh động của phân tử trong môi trường lỏng, K
r
là hằng số làm chậm do cấu trúc gel đồng thời cũng phụ thuộc vào khối lượng
của phân tử nucleic acid, C là nồng độ của gel.
Vì vậy, tính linh động của phân tử phụ thuộc vào hai yếu tố: khối lượng
phân tử tức là số lượng nucleotide hay cặp nucleotide (DNA mạch đôi) và nồng
độ các chất cấu thành gel. Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu nucleic

acid là gel polyacrylamide và gel agarose. Việc chọn loại gel cũng như nồng độ
các chất tạo thành gel tuỳ thuộc kích thước trung bình của các đoạn nucleic acid
cần phân tách.
Bảng 1. Tương quan giữa nồng độ gel và kích thước các đoạn cần phân tách
% acrylamide

4
5
8
11
Kích thước các đoạn cần phân tách
(cặp nucleotide)
200-800
80-200
40-100
10-50
% agarose

0.6-0.8
0.9-1.2
1.2-1.5
Kích thước các đoạn cần phân tách
(kb)
1-20
0.5-7
0.2-5
§ Gel agarose:
Là loại gel thông dụng nhất bởi thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách
những đoạn có kích thước 0.5-20 kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang
và điện di được thực hiện thep phương nằm ngang. Sau điện di, các nucleic acid

trong gel agarose sẽ hiện hình ở dạng những vạch màu đỏ cam dưới tia tử ngoại
(UV có λ=300 nm) nhờ sự có mặt của ethidium bromide (được cho vào gel
trước khi đổ)-có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dưới
tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Bên cạnh đó, để ước lượng kích
thước của các trình tự nucleic acid trong gel agarose, thường dùng một yếu tố
đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker). Đây là một tập hợp
nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết trước được gọi là thang DNA (DNA
ladder), thông thường sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể λ được thuỷ giải
bởi enzyme giới hạn Hind III.
§ Gel acrylamide:
Được dùng để tách các đoạn kích thước nhỏ (dưới 1000 cặp base. Thao tác
với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose, nên chỉ được sử dụng cho
những mục đích đặc hiệu như:
- Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp
- Xác định trình tự DNA
- Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base.
Gel được đổ giữa 2 tấm thuỷ tinh và phương của điện di là phương thẳng
đứng. Nguyên tắc của loại điện di này là dựa vào sự thay đổi hướng điện trường
trong quá trình điện di. Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA
phải tự định hướng lại. Phân tử có kích thước càng lớn thì thời gian tự đinh
hướng càng lớn khiến cho nó di chuyển chậm hơn một phân tử kích thước nhỏ.
Một DNA đơn giản có thể tạo ra chỉ một ít băng. Nếu DNA ban đầu là rất
lớn và phức tạp, việc nhuộm gel sẽ cho thấy một băng đại diện cho sự biến thiên
hầu như là liên tục về kích thước của đoạn. Băng hay là phần chứa đoạn mong
muốn sẽ được định vị với kỹ thuật Southern blotting và được chuyển ra. Bởi vì
một một băng có thể đại diện cho một hỗn hợp vài đoạn, nó được điện di trên
một gel với một nồng độ khác nhau để tách các đoạn có kích thước tương tự.
- Thu nhận acid nucleic:
Điện di trên gel agarose còn được sử dụng để thu nhận mẫu. Sau khi điện
di, các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận lại

theo một trong các phương pháp sau:
Phương pháp 1: phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và DNA
được thu nhận sau khi đã khuếch tán từ gel agarose vào một dung dịch
đệm thích hợp.
Phương pháp 2: Một giếng nhỏ được khoét trong agarose ngay trước
vạch DNA. Giếng này được bơm dầy dung dịch đệm và điện trường được
tái lập. DNA di chuyển vào giếng chứa đầy dung dịch đệm và được thu
nhận lại.
Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trong một gel agarose đặc
biệt có điểm nóng chảy rất thấp (65
o
C). Sau điện di, vạch DNA được cắt
ra, ủ ở trong một dung dịch đệm ở nhiệt độ 65
o
C. Khi agarose đã hoàn
toàn tan chảy, DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và
tủa.
b) Các enzyme thông dụng trong kỹ thuật di truyền
Các enzyme giới hạn (Restriction enzyme-RE)
Các thực khuẩn thể (phage) xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn và sinh sôi
nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số luợng phage tăng lên đến hàng
triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên trong một số trường
hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiên tượng
này có thể là do DNA của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt
khi vừa mới xâm nhập. Hệ thống bảo vệ này là các RE. DNA vi khuẩn không
bị chính các RE của chúng cắt là nhờ cơ chế gắn nhóm methyl vào A hay C ở
các vị trí cắt của các RE bởi enzyme methylase . Khi đó RE không còn nhận
biết được các vị trí cắt. Đây chính là hiện tượng giới hạn và các RE hợp thành
hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote.
Các RE là các endonuclease có khả năng nhận biết và cắt DNA mạch đôi

một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định, và được ứng dụng chủ yếu
trong phương pháp tạo dòng.
•....... Ví dụ về RE:
EcoRI là enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E.coli