Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase của vi khuẩn chịu nhiệt Thermonococcus kodakarensis KOD1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ TRÀ MI

Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU VÀ KHUYẾCH ĐẠI GENE TK 1284 MÃ HÓA ENZYME
AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT THERMOCOCCUS
KODAKARENSIS KOD1”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ Sinh học
: CNSH - CNTP
: 2012 - 2016

Thái Nguyên, năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ TRÀ MI

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU VÀ KHUYẾCH GENE TK 1284 MÃ HÓA ENZYME
AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT THERMOCOCCUS
KODAKARENSIS KOD1”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Khoa
: CNSH - CNTP
Lớp
: K44 - CNSH
Khóa học
: 2012 - 2016
Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Phạm Bằng Phƣơng

Thái Nguyên, năm 2016


i

LỜI CẢM ƠN
Đƣợc sự đồng ý của khoa Khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực
Phẩm, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên. Em đã thực tập tốt nghiệp
tại Phòng Nuôi Cấy Mô Tế Bào Thực Vật - Khoa Công Nghệ Sinh Học và
Công Nghệ Thực Phẩm- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài:
“Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase của vi
khuẩn chịu nhiệt Thermonococcus kodakarensis KOD1”.
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này ngoài sự nỗ lực của bản thân em
còn nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ của ban giám hiệu Nhà trƣờng Đại Học Nông

Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ sinh học và công nghệ
thực phẩm, cùng sự tận tình giảng dạy của các thầy cô trong suốt 4 năm học.
Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Ban
chủ nhiệm khoa và toàn thể các thầy cô giáo. Đặc biệt, em xin đƣợc bày tỏ
lòng kính trọng, lòng biết ơn tới thầy giáo TS. Phạm Bằng Phƣơng ngƣời đã
tận tình hƣớng dẫn em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn chị Ma Thị Hoàn, cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ tế
bào thực vật khoa Công Nghệ Sinh Học và công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại
HọcNông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực
hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp tại đây.
Em xin gửi lời biết ơn đến gia đình, ngƣời thân bạn bè đã động viên giúp
đỡ em trong suốt thời gian qua.
Do điều kiện và thời gian có hạn nên không thể tránh khỏi những thiếu
sót, kính mong các thầy cô đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài của em đƣợc
hoàn thiện.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016
Sinh viên thực hiện
Lê Thị Trà Mi


ii
DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng ................................................................. 18
Bảng 3.2: Trình tự mồi ................................................................................... 18
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR ............................................................ 27
Bảng 3.4: Chu trình nhiệt PCR ...................................................................... 27
Bảng 4.1: Dải nhiệt độ chạy PCR .................................................................. 35

iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Nơi phân lập ...................................................................................... 4
Hình 2.2: Vi khuẩn T. Kodakarensis kod1........................................................ 5
Hình 2.3: Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus ................................... 5
Hình 2.4: Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1 ........................................................................................................ 7
Hình 2.5: Enzyme protease ............................................................................. 10
Hình 2.6: Cấu trúc enzyme.............................................................................. 11
Hình 2.7: Sơ đồ phân loại enzyme protease.................................................... 12
Hình 3.1: Môi trƣờng nuôi cấy phân lập VK .................................................. 23
Hình 3.2: Phân tử Ethidium bromide .............................................................. 25
Hình 4.1a: Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn T. Kodakarensis ........................... 31
Hình 4.1b: Ảnh điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số ............................ 32
Hình 4.2a: Thiết kế mồi .................................................................................. 32
Hình ảnh 4.2b: Kết quả điện di sản phẩm PCR .............................................. 33
Hình 4.3: Ảnh điện di kiểm tra nhiệt độ gắn mồi PCR ................................... 34
:


iv

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

DNA

:Axit deoxiribonucleic

ARN

: Axit ribonucleic

ARNase : Ribonuclease
dNTP

: Deoxynucleoside triphosphate

EDTA : Ethylene diamine tetra – acetic acid
OD

: Optical Density (Mật độ quang học)

PCR

: polymerase chain reaction

SDS

: Sodium Dodecyl Sulphate

TAE

: Tris- acetate- EDTA

E.coli

: Escherichia coli

Amp

: Ampicillin

EtBr

: Ethydium bromide

Bp

: base pair

Kb

: kilo base pair


v

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT................................................ iv
MỤC LỤC ......................................................................................................... v
PHẦN I: MỞ ĐẦU ........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1

1.2. Mục đích và nội dung của đề tài ................................................................ 2
1.2.1. Mục đích.......................................................................................... 2
1.2.2. Nội dung .......................................................................................... 3
1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................ 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................. 3
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................. 4
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 .................... 4
2.1.1. Nguồn gốc ....................................................................................... 4
2.1.2. Phân loại .......................................................................................... 5
2.1.3. Đặc điểm chung về hệ gen .............................................................. 6
2.1.4. Đặc điểm sinh trƣởng và phát triển ................................................. 9
2.2. Tổng quan về protein của TK 1284 ........................................................... 9
2.2.1. Enzyme proteae ............................................................................... 9
2.2.2. Hệ thống phân loại enzyme protease ............................................ 12
2.2.3. Ứng dụng ....................................................................................... 13
2.2.4. Aminopeptidase do gene Tk1284 của vi khuẩn T. Kodakarensi
KOD1 mã hóa.......................................................................................... 15


vi

2.3. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới ................................... 15
PHẦN 3: Đối tƣợng , nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ......................... 17
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................... 17
3.2.Nội dung ............................................................................................ 17
3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................... 18
3.5. Thiết bị ..................................................................................................... 18
3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 19
3.5.1.phƣơng pháp so sánh trình tự protein……………………………21

3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy ................................................................... 24
3.5.3. Phƣơng pháp tách chiết AND tổng số......................................... 234
3.5.5. Phƣơng pháp PCR ......................................................................... 26
3.5.4. Phýõng pháp ðiện di ...................................................................... 24
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28
4.3. Kết quả kiểm tra nhiệt độ mồi ảnh hƣởng đên phản ứng PCR. ............... 34
4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số .............................................................. 31
4.2. Nhân gene TK 1284 từ chủng vi khuẩn Thermococcus kodakaren KOD1
bằng phản ứng PCR......................................................................................... 32
4.4. Kết quả so sánh trình tự TK 1284 với các protein đã biết trên ngân hàng
NCBI bằng phần mềm Runblast và bioedit .................................................... 28
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................ 35
5.1. Kết luận .................................................................................................... 36
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 1
I. Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................... 1
II. Tài liệu tiếng Anh ......................................................................................... 1
PHỤ LỤC .......................................................................................................... 4


1

PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các
chế phẩm enzyme đƣợc sản xuất càng nhiều và đƣợc sử dụng trong hầu hết
các lĩnh vực nhƣ: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…[1]
Hàng năm lƣợng enzyme đƣợc sản xuất trên thế giới đạt khoảng 300
nghìn tấn với giá trị trên 500 triệu USD, đƣợc phân phối trong các ngành khác
nhau[1]. Phần lớn enzyme đƣợc sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc

loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy[2]. Khoảng 75% chế
phẩm là enzyme thủy phân, đƣợc sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự
nhiên. Ngành sản xuất các hóa chất công nghiệp dựa trên xúc tác sinh học đã
cho thấy có nhiều lợi thế so với tổng hợp hóa học, ví dụ nhƣ sản xu ất có chọn
lọc các đồng phân quang học hay là sử dụng sinh khối, hỗn hợp phức tạp các
phân tử hữu cơ, làm nguyên liệu[3]. Việc sử dụng enzyme chịu nhiệt nhƣ là
chất xúc tác khi thiết kế quy trình chuyển hóa, chứa toàn bộ hệ thống enzyme
chịu nhiệt, cấu tạo nên chuổi phản ứng mà chúng ta muốn, sẽ làm biến tính
các enzyme nội sinh của tế bào và vì thế chúng ta chỉ cần một bƣớc chuẩn bị
để có thể có một hỗn hợp các enzyme chịu nhiệt. Thêm vào đó, do đặc tính
bền của enzyme chịu nhiệt nên chúng ta có thể hạn chế bất lợi cơ bản của sinh
chuyển hóa in vitro, là không có khả năng tổng hợp và tái tạo protein.
Protease là enzyme đƣợc sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản
xuất nhƣ: chế biến thực phẩm (làm đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt,
bổ sung để làm tăng chất lƣợng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ
phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế. Qua
nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nhƣ là một nguồn cung cấp
protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều


2

hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế
việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Protease phân bố ở thực vật, động
vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở chế phẩm thu đƣợc sau quá trình
nuôi cấy sản xuất enzyme chƣa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein
chỉ chiếm từ 20-30 %[1]. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong
hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả
hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có
khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Đặc biệt là

các vi khuẩn cổ sống môi trƣờng khắc nghiệt, có tính chống chịu với cả nhiệt
hay axít và kiềm, là nguồn tạo ra các enzyme có thể hoạt động dƣới những điều
kiện khắc nghiệt. Những enzyme phát hiện đƣợc tạo ra từ các vi khuẩn có khả
năng chịu nhiệt trên 130˚C, có thể tồn tại và phát triển ở những nơi có nồng độ
acid cao…. [1]với những khả nhƣ vậy nó rất có ý nghĩa trong nghiên cứu khoa
học, cho sự phát triển của các ngành sản xuất.
Chính vì vậy, việc nghiên cứu tạo enzyme từ vi khuẩn này là cấp thiết,
đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme protease trong nghiên cứu nói chung và
công nghiệp xuất nói riêng là quan trọng và cấp thiết, xuất phát từ lý do trên,
tôi xin tiến hành đề tài: “Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa
enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis
KOD1” hy vọng sẽ khuyếch đại đƣợc dòng gene Tk 1284 mã hóa enzyme
aminopeptidase của vi khuẩn T. Kodakarensis đáp ứng nhu cầu cần thiết.
1.2. Mục đích và nội dung của đề tài
1.2.1. Mục đích
 Nghiên cứu gene Tk 1284 và enzyme peptidase do gen Tk 1284 của
vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 mã hóa.
 Nhân nhanh gene Tk1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1 bằng phản ứng PCR.


3

1.2.2. Nội dung
Nội dung 1: Nhân gene Tk1284 của vi khuẩn Thermococcus
kodakarensis KOD1 bằng kỹ thuật PCR
Nội dung 2: so sánh trình tự gene của vi khuẩn T. kodakarensis KOD1
bằng phần mềm tin sinh học.
Nội dung 3: Xác định nhiệt độ PCR tối ƣu, cho phản ứng khuyếch đại
gene Tk1284 của vi khuẩn T. kodakarensis KOD1 bằng phản ứng PCR.

1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
 Nghiên cứu gene Tk1284 và enzyme peptidase của gen Tk 1284 của
vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 mã hóa.
 Nhân nhanh gene Tk 1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1 bằng phản ứng PCR.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đóng góp một phần vào việc nghiên cứu và tìm ra enzyme có khả năng
chịu đƣợc điều kiện khắc nghiệt. Là tiền đề tạo dòng enzyme do gene Tk1284
mã hóa của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1, từ đó tinh sạch và
kiểm tra hoạt tính enzyme.


4

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1
2.1.1. Nguồn gốc
Thermococcus kodakaraensis là một loài cổ khuẩn ƣa nhiệt, trong đó
T.kodakarensis KOD1 là chủng đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong các chủng
của chi Thermococcus[4]. Thermococcus kodakaraensis KOD1, đã đƣợc
phân lập tại một miệng núi lửa (khí lƣu huỳnh trào ra từ một lỗ thủng) trên
hòn đảo Kadakara, Nhật Bản[5]. Lần đầu tiên phân lập ngƣời ta đặt tên là
Pyrococcus sp. KOD1, với khả năng chịu đƣợc nhiệt độ và các điều kiện khắc
nghiệt của môi trƣờng, tuy nhiên dựa vào hệ thống cây phân loại loài, thì nó
thuộc giống Thermococcus, dựa trên trình tự chuỗi 16S RNA giữa các loài
khác nhau và chủng KOD1 là đại diện mới của Thermococcus, đƣợc gọi là
Thermococcus kodakaraensis KOD1[6].

Hình 2.1: Nơi phân lập

Tế bào T. Kodakarensis có đƣờng kính cầu khuẩn không đều kích
thƣớc 1-2µm và có khả năng di chuyển dễ dàng nhờ lông roi[7]. Cấu tạo
thành tế bào bao gồm: một lớp di-ether, tetra-ether lipids, và lớp glycoprotein
ngoài cùng[7]. T. Kodakarensis là vi khuẩn yếm khí bắt buộc, dị dƣỡng và
phát triển mạnh trên môi trƣờng có sự hiện diện của nguyên tố lƣu huỳnh, tạo


5

khí huydrogen sulfide[8]. Trong điều kiện tối ƣu thời gian thế hệ của vi khuẩn
T.kodakarensis là 40 phút 1 thế hệ[9]. Các điều kiện về lƣu huỳnh cần cho sự
tăng trƣởng và phát triển của vi khuẩn. Trong trƣờng hợp không có lƣu
huỳnh, hydrogen sẽ đƣợc sản xuất thay vì hydrogen sulfide.

Hình 2.2: Vi khuẩn T. Kodakarensis kod1
2.1.2. Phân loại

Hình 2.3: Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus


6

Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 đƣợc phân loại nhƣ sau:
- Giới

: Archaea

- Ngành

: Euyarchaeota

- Lớp

: Thermococci

- Bộ

: Thermococcales

- Họ

: Thermococcaceae

- Chi

: Thermococcus

- Loài

: Thermococus kodakarensis KOD1

2.1.3. Đặc điểm chung về hệ gen
Kích thƣớc gene T. Kodakarensis dài 2.088.737 bp chứa khoảng 2358
gen, toàn bộ trình tự đã đƣợc Đại học Kyoto, Nhật Bản giải trình tự, phát
hành trên tạp chí khoa học tháng 03 năm 2005, có duy nhất một NST dạng
vòng, không có màng nhân, vùng mã hóa protein chiếm 92,1 %, tỉ lệ G-C là
52% với một cụm 16S-23S rRNA[10]. Trong tất cả, 46 gen tRNA nằm rải rác
trên hệ gen, trong đó tRNA Met và tRNA Trp đƣợc dự đoán là chứa trình tự
intron[11].Bằng sự kết hợp của mã hóa dự đoán chức năng và so sánh tƣơng
đồng, 2306 trình tự DNA mã hóa (CDS) với chiều dài trung bình của 833 bp,

bao gồm 92% bộ gen tổng thể 77% protein của T. kodakarensis protein cho
thấy sự tƣơng đồng cao nhất đối với các protein từ lớp Thermococci, bao gồm
240 loại protein đƣợc xác định là Thermococcales cụ thể[12].
So sánh với ba bộ gen hoàn chỉnh của Pyrococcus spp. Tổng cộng có
2306 trình tự DNA mã hóa (CDS) đã đƣợc xác định[13]. Bộ gen chứa bảy
gen chuyển có thể xảy ra và bốn khu vực có liên quan đến virus. Một trong
số protein di truyền cho thấy sự tƣơng đồng cao với nhóm Pyrococcus spp.
Sự sắp xếp Thermococcales, genomics trong so sánh làm rõ sự có mặt 1.204
của protein khác nhau, bao gồm những thông tin và trao đổi chất cơ bản,
đƣợc chia sẻ giữa T. kodakaraensis và Pyrococcus spp., còn cho thấy nhiệm


7

vụ của các protein khác nhƣ tham gia vào quá trình chuyển hóa pyruvate,
chuyển hóa nucleotide, vận chuyển kim loại ion
Thermococcus kodakaraensis, một chủng của Thermococcales, kỵ khí
dị dƣỡng bắt buộc, giống nhƣ hyperthermophiles khác phụ thuộc vào sulfur,
T. kodakaraensis có thể phân giải proteinaceous chất nền để thu đƣợc cacbon
và các axit amin thiết yếu[14]. Để làm nhƣ vậy, nó sản xuất một số enzyme
ngoại bào để thủy phân polypeptide bên ngoài tế bào
Kích thƣớc bộ gen là là 2.088.737 base pair, với 92,1% vùng mã hóa.
Năng lƣợng phân giải protein đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp nhanh
chóng các protein điều hòa.Sự hiện diện của peptidase phụ thuộc ATP, đƣợc
thấy trong tất cả các sinh vật nhân sơ: bao gồm hyperthermophiles, bộ gen
đã đƣợc giải trình tự. Một số peptidase vi khuẩn đã đƣợc xác định. Trình tự
bộ gen của T. kodakaraensis chỉ ra sự hiện diện của hai loại peptidase nội
bào phụ thuộc vào ATP là protease và proteasome[13]. Các gen tƣơng ứng
với protease là FtsH và CLP.

Hình 2.4: Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1


8

Chú thích:
-Vòng tròn ngoài cùng: bản đồ vật lý thu nhỏ trong dữ liệu cơ sở.
- Vòng tròn thứ 2: dự đoán các vùng mã hóa protein theo chiều kim
đồng hồ.
- Vòng tròn thứ 3: dự đoán các vùng mã hóa protein ngƣợc chiều kim
đồng hồ.
 Các gen biểu thị đƣợc phân màu theo nhóm phân loại chức năng, cụ
thể:
+ Màu hồng: phiên mã
+ Màu hồng nhạt: sao chép DNA, tái tổ hợp hoặc sửa chữa
+ Xanh lá cây: vùng phân chia tế bào, nhiễm sắc thể
+ Vàng nhạt: lớp bên ngoài tế bào
+ Xanh da trời: thực hiện hóa sinh tổng hợp, dị hóa
+ Xanh nhạt: tế bào nhu động, vận chuyển ion, trao đổi chất
+ Xanh lam: cơ chế truyền tín hiệu, trao đổi các coenzyme
+ Màu tím: sản xuất năng lƣợng
+ Tím nhạt: chuyển hóa lipide
+ Màu xám: chức năng chỉ mới đƣợc đề xuất
+ Màu đen: không rõ chức năng
- Vòng tròn thứ 4: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều kim đồng hồ
(màu đỏ trong vòng thứ 4).
- Vòng tròn thứ 5: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều ngƣợc chiều
kim đồng hồ (màu xanh vòng tròn thứ 5).
- Vòng tròn thứ 6: dự báo các yêu tố di động theo chiều kim đồng hồ

(màu đỏ vòng thứ 6).
- Vòng tròn thứ 7: dự báo các yếu tố di động theo chiều ngƣợc kim
đồng hồ (màu xanh vòng thứ 7).


9

- Đƣờng thẳng đứng thể hiện viêc dự đoán gen chuyển và chỉ ra vùng
virus liên quan
- Vòng tròn trong cùng: % (G+ C) trong vòng 10 kb và thay đổi gia
tăng tới các giá trị cao hơn trong khoảng ít nhất là 38 %.
2.1.4. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển
Thermococcus kodakarensis KOD1, thuộc hyperthermophiles, vi
khuẩn yếm khí bắt buộc, nhiệt độ tăng trƣởng của Thermococcus khác nhau,
nằm trong khoảng nhiệt độ 60 - 100˚C, nhiêt độ tăng trƣởng tối ƣu là
95˚C[15]. Cũng nhƣ các sinh vật biển khác, nồng độ muối cao là cần thiết
cho sự tăng trƣởng tối ƣu, và biện pháp gây ly giải tế bào bằng cách pha
loãng nồng độ. Một số loài có khả năng sản xuất CO2, H2, và H2S là sản
phẩm của quá trình chuyển hóa và hô hấp, Thermococcus tƣơng tác với các
sinh vật khác thông qua trao đổi chất chuyển hóa nhờ sự hỗ trợ, sự phát triển
của vi sinh vật tự dƣỡng, Thermonococcus kodakarensis KOD1 tạo H2 với
việc sử dụng nhiều hydronagene đƣợc xem là các biocatalyst tiềm năng cho
các phản ứng chuyển nƣớc và khí. Nồng độ pH và NaCl cho KOD1 tăng
trƣởng, biến đổi tƣơng ứng là 7% và 3%.
2.2. Tổng quan về protein của TK 1284
2.2.1. Enzyme proteae
- Enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng
hóa học trong và ngoài cơ thể, có phân tử lƣợng từ 20.000 đến 1.000.000 dal
(có kích thƣớc nhỏ nhất là Ribonuclease 12.700 dalton), có thể tham gia hàng
loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn

năng lƣợng hóa học có trong vật chất, enzym có bản chất là protein nên có tất
cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số enzym có dạng hình cầu và không đi
qua màng bán thấm do có kích thƣớc lớn, tan trong nƣớc và các dung môi hữu
cơ phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực.


10

Không bền dƣới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính[1].
Môi trƣờng axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động.
Enzyme protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá
trình thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein và peptid thành
các phân tử acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton[1].

Hình 2.5: Enzyme protease
Cơ chế thủy phân:

Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ
phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến
sản phẩm cuối cùng là các axit amin[16].


11

Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và
vận chuyển axit amin[1]. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng
về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên đƣợc phân bố rất rộng
rãi trên nhiều đối tƣợng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật
(đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê…)[8]. So với protease động vật và
thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trƣớc hết hệ

protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất
giống nhau về cấu trúc, khối lƣợng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra
dƣới dạng tinh thể đồng nhất[17].

Hình 2.6: Cấu trúc enzyme
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh
vật thƣờng có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để.


12

2.2.2. Hệ thống phân loại enzyme protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).

Hình 2.7: Sơ đồ phân loại enzyme protease
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase đƣợc phân
chia thành hai loại[1]:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase đƣợc chia thành bốn
nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động
xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và
subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật nhƣ

13

chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi
khuẩn nhƣ subtilisin… Các serine proteinase thƣờng hoạt động mạnh ở vùng
kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tƣơng đối rộng[18].
+ Cysteine proteinase: Cá c proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật nhƣ papayin,
bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng[19]. Các
cystein proteinase thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ
chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin, chymosin,
cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung
tâm hoạt động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH trung tính[20].
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase đƣợc tìm
thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo
proteinase thƣờng hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dƣới
tác dụng của EDTA[19].
Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành ba
nhóm:
– Protease acid: pH 2-4
– Protease trung tính: pH 7-8
– Protease kiềm: pH 9-11
2.2.3. Ứng dụng
Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ
công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dƣợc phẩm và nông
nghiệp…
Trong công nghiệp chế biến thịt: protease đƣợc dùng làm mềm thịt nhờ sự
thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm

14

thích hợp và có vị tốt hơn. Protease đƣợc sử dụng để làm mềm thịt và tăng
hƣơng vị thịt. (ngâm thịt vào dinh dƣỡng protease ở pH và nhiệt độ xác địnhphƣơng pháp này phổ biến và thuận lợi nhất, tẩm hỗn hợp làm mềm thịt
(enzyme, muối, bột ngọt). Tiêm dung dịch enzyme vào thịt; tiêm dung dịch
enzyme vào con vật trƣớc khi giết mổ). Sử dụng protease để sản xuất dịch
đạm: từ Streptomyces fradiae tách đƣợc chế phẩm keratineza thuỷ phân
keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ. Nếu dùng axit để
thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin chứa lƣu huỳnh, nếu dùng kiềm
để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm giảm giá trị sinh
học của axit amin)[21]. Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên
cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao
và tác dụng rộng, muốn vậy ngƣời ta thƣờng dùng phối hợp cả 3 loại protease
của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lƣợng
protein cần thuỷ phân[22]. Ƣu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme
là bảo toàn đƣợc vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ,
không làm sẫm màu dịch thuỷ phân. Trong chế biến thuỷ sản khi sản xuất
nƣớc mắm (và một số loài mắm) thƣờng thời gian chế biến thƣờng là dài nhất,
hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phƣơng, phƣơng
pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nƣớc mắm
ngắn ngày đã đƣợc hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật
(bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện
hƣơng vị của nƣớc mắm. Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn
thiện thêm về công nghệ.
Trong công nghiệp sữa: protease đƣợc dùng trong sản xuất phomat nhờ
hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật nhƣ A.
candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… đƣợc dùng trong sản xuất phô mát [.

15

Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy… protease làm giảm thời gian
trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn[23].
2.2.4.peptidase do gene Tk1284 của vi khuẩn T. Kodakarensi KOD1 mã hóa
Peptidases là enzyme xúc tác sự phân cắt các axit amin từ các amino của
các protein hay peptide. Chúng có mặt cả ở động vật và thực vật và đƣợc tìm
thấy trong nhiều bào quan dƣới tế bào, trong bào tƣơng, và là thành phần của
màng tế bào. Một số peptidases là monome,enzyme khối lƣợng tƣơng đối cao
(50 kDa) giúp tiêu hóa protein[24]. Các aminopeptide của vi khuẩn T.
kodakarensis KOD1do đƣợc phân lập từ những nơi có điều kiện khắc nghiệt
nhƣ miệng núi lửa hay ở suối nƣớc nóng hoặc nƣớc biển mặn[25]… nên có
hoạt tính tốt, phản ứng chống chịu đƣợc trƣớc các điều kiện bất thƣờng,thông
thƣờng khi các enzyme để ở nhiệt độ bình thƣờng sẽ mất hoạt tính và hỏng
nhƣng đối với enzyme này thì nó có khả năng biến đổi để không bị mất hoạt
tính và có thể ở để ở nhiệt độ thƣờng trong một khoảng thời gian[26]. Mặt
khác enzyme aminopaptidase thuộc nhóm serine nên có khả năng hoạt động ở
dải PH rộng và có tính đặc hiệu cơ chất cao. T. kodakarensis là sinh vật có
cấu tạo đa bội với một số lƣợng bản sao nhiễm sắc thể khoảng 7- 19 bản sao,
tùy thuộc vào giai đoạn tăng trƣởng[26].
2.3. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới
Enzyme aminopeptidase của vi khuẩn T. kodakaren KOD1 đã biết đến
từ lâu với những đặc điểm vƣợt trội và có ích trong cả sản xuất và nghiên
cứu, tuy vậy nhƣng tính đến thời điểm hiện nay, các công trình nghiên cứu
trong nƣớc chƣa có báo cáo cụ thể nào về enzyme aminopeptidase do gene
Tk1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 mã hóa, và cũng
chƣa có bài báo khoa học trong nƣớc nào cụ thể nói về nghiên cứu[27].
Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về Thermococcus, nhƣ nghiên
cứu hoàn thiện trình tự genome của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis

16

KOD1, của viện nghiên cứu hóa sinh tổng hợp, Trƣờng Đại Học Kyoto,
thuộc Katsura, Nashikyo- ku, Nhật Bản, tháng 3 năm 2005[24]. Nghiên cứu
đã chỉ ra rằng các chi Thermococcus, bao gồm các vi khuẩn cổ
Hyperthermophilic, các chủng của Thermococcus có mặt ở khắp nơi trong
môi trƣờng nhiệt độ cao[28],.
Gần đây nhất là nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc phòng thí
nghiệm vi sinh, trƣờng đại học Wageningen, Phần Lan vào tháng 7 năm
2015 với công trình nghiên cứu về số lƣợng nhiễm sắc thể của
Thermococcus kodakarensis KOD1[29]. Nghiên cứu đặc tính chịu nhiệt ở
dải nhiệt độ cao của Lysophospholipase từ vi khuẩn Thermococcus
kodakarensis KOD1 vào năm 2012 do nhóm tác giả Cui, Z., Y. Wang, B. P.
Phạm, F. Bình, H. Pan, G. W. Cheong, S. Zhang, và B. Jia thực hiện[27].
Nghiên cứu so sánh toàn bộ chuỗi gene của vi khuẩn

archaeon

hyperthermophilic

bộ

Thermococcus

kodakaraensis

KOD1

và

gen

Pyrococcus vào năm 2005 do Fukui, T., H. Atomi, T. Kanai, R. Matsumi, S.
Fujiwara, và T. Imanaka tiến hành nghiên cứu[28]. Ngoài ra còn rất nhiều các
nghiên cứu khác nhƣ: phân tích trình tự gene và tính chịu nhiệt ,của các
enzyme chịu nhiệt vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1, phân tích
trình tự, cấu trúc và khả năng liên kết của enzyme cyclodextrinase[30] ,vv…..
đó là một số công trình nghiên cứu đang còn rất nhiều các nhóm tác giả thực
hiện các đề tài nghiên cứu khác nhau Thermococcus kodakarensis KOD1 và
đăng trên các tạp chí khoa học và các công cụ dữ liệu trên NCBI.


17

PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Gene TK1284 có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1.
3.2. Nội dung
Nội dung 1: Nhân gene Tk1284 của vi khuẩn Thermococcus
kodakarensis KOD1 bằng kỹ thuật PCR
Nội dung 2: so sánh trình tự gene của vi khuẩn T. kodakarensis KOD1
bằng phần mềm tin sinh học.
Nội dung 3: Xác định nhiệt độ PCR tối ƣu, cho phản ứng khuyếch đại
gene Tk1284 của vi khuẩn T. kodakarensis KOD1 bằng phản ứng PCR.
3.3. Vật liệu và hóa chất
Gene TK 1284 của vi khuẩn T. kodakarensis KOD1 TS. Phạm Bằng
Phƣơng phân lập.

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR:
+ H2O khử ion.
+ dNTP
+ Buffer 10X
+ Primer F, R
+ Enzyme Taq polymerase
+ AND template
Hóa chất điện di:
+ Dung dịch đệm TAE 0.5X: đƣợc pha từ dung dịch TAE 50X
+ Agarose 0.8 – 1.5%, loading dye, Ethydium Bromide, thang chuẩn
AND.
Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật