Nghiên cứu và khuếch đại gene TK2017 mã hóa Osmotically Inducible Protein C ( OsmC) từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÝ THỊ LƢỢNG
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GENE TK2017 MÃ HÓA
OSMOTICALLY INDUCIBLE PROTEIN ( OsmC) TỪ VI KHUẨN CHỊU
NHIỆT THERMOCOCCUS KODAKARENSIS KOD1

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ Sinh học
: CNSH - CNTP
: 2012 - 2016

Thái Nguyên, năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÝ THỊ LƢỢNG
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GENE TK2017 MÃ HÓA
OSMOTICALLY INDUCIBLE PROTEIN ( OsmC) TỪ VI KHUẨN CHỊU

NHIỆT THERMOCOCCUS KODAKARENSIS KOD1

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa
: CNSH - CNTP
Lớp
: K44 - CNSH
Khóa học
: 2012 - 2016
Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Phạm Bằng Phƣơng

Thái Nguyên, năm 2016


i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận
tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ rất tận tình
của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn này:
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Phạm Bằng
Phƣơng - giảng viên, trưởng bộ môn Công nghệ Sinh học khoa Công nghệ
Sinh học và Công nghệ Thực phẩm ,Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
đã hướng dẫn trực tiếp đề tài, thầy đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện
thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài này.
Tôi xin được cảm ơn kỹ sư Ma Thị Hoàn, Cán bộ phòng trực thực hành

Sinh học phân tử và Kĩ thuật di truyền khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ
Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cùng các bạn sinh viên
khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm làm nghiên cứu tại phòng.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học
và Công nghệ Thực phẩm, các thầy cô trong khoa đã dạy dỗ chúng tôi trong
suốt thời gian qua, cảm ơn các cán bộ đang công tác tại phòng thí nghiệm
khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tạo môi trường thuận
lợi cho tôi học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bố mẹ, thầy cô, bạn bè đã ủng hộ về mặt vật
chất cũng như tinh thần giúp tôi hoàn thành đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 05 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Lý Thị Lƣợng


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Thermococcus kodakarensis KOD1.................................................................. 9
Bảng 2.2. Thành phần của khoáng chất vi lượng............................................ 12
Bảng 2.3. Thành phần của Trace vitamins ...................................................... 13
Bảng 2.4 : Danh sách các protein bị ảnh hưởng bởi stress thẩm thấu trong T.
kodakarensis KOD1 ........................................................................................ 22
Bảng 3.1: Cặp mồi sử dụng để nhân gene TK2017 ........................................ 29
Bảng 3.2: Thành phần của phản ứng PCR ..................................................... 36
Bảng 4.1: Sự tương đồng của các chuỗi Peptid ............................................. 41

iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1........................................... 4
Hình 2.2: Cây phân loại vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 . 5
Hình 2.3: Genome của vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 ... 6
Hình 2.4 .........................................................................................................................10
Hình 2.5 .........................................................................................................................10
Hình 2.6 .........................................................................................................................11
Hình 2.7 .........................................................................................................................11
Hình 2.8 .........................................................................................................................11
Hình 2.9 .........................................................................................................................12
Hình 2.10: Phân tích hình ảnh sử dụng phần mền PDQuest....................................19
Hình 2.11: Xác định các phiên bản beta chaperonin ( điểm 4) bằng phép đo phổ
khối ................................................................................................................................20
Hình 2.12: Phát hiện các protein up – redulated bởi OsmC sốc căng thẳng trên T.
kodakarensis KOD1 bởi phần mềm phân tích PDQuest..........................................21
Hình 2.13: Những kiểu thể hiện các điểm protein trong T. kodakarensis KOD1
stress thẩm thấu ............................................................................................................25
Hình 3.1: Nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR của gene TK2017 ........................30
Hình 3.2. Điểm đẳng điện và khối lượng phân tử của protein OsmC.....................30
Hình 3.3: Sau khi bổ sung các thành phần.................................................................32
Hình 3.4. Máy ly tâm ...................................................................................................32
Hình 3.5: Sau khi ly tâm ..............................................................................................33
Hình 3.6: Sau ly tâm lần 2 ...........................................................................................33
Hình 3.7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR............................................................37
Hình 4.1: Vùng bảo toàn và sơ bộ chức năng của protein chứa gene TK2017......40
Hình 4.2.: So sánh trình tự peptid bằng phần mềm Bioedit .....................................41

iv

Hình 4.3: Trình tự peptide của OsmC/Ohr family stress-inducible protein
[Thermococcus kodakarensis] ....................................................................................42
Hình 4.4: Trình tự peptide của OsmC/Ohr family stress-inducible protein
[Pyrococcus sp. NA2]..................................................................................................42
Hình 4.5: Trình tự peptide của OsmC/Ohr family stress-inducible protein
[Thermococcus zilligii] ................................................................................................43
Hình 4.6: Trình tự peptide của osmotically inducible protein OsmC
[Thermococcus eurythermalis] ...................................................................................43
Hình 4.7: Kết quả tách chiết DNA genome từ vi khuẩn Thermococcus
kodakarensis KOD1.....................................................................................................44
Hình 4.8: Sản phẩm PCR gene TK2017 từ vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1 ............................................................................................................................45


v

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Nghĩa đầy đủ
µl

: Microlit (1 µl = 10-3 ml)

DNA

: Deoxyribonucleic acid - Một trong 2 loại nucleic
acid

PCR

: Polymerase Chain Reaction

Bp

: Base pair (Cặp base nito)

dNTP

: Deoxynucleotide Triphotphate

Amp

: Ampicillin

BLAST

: Basic Local Alignement Search Tool

E. coli

: Escherichia coli

IPTG

: Isopropyl Thiogalactoside

Kb

: Kilo base -kilo base nito

SDS

: Sodium Dodecyl Sulfate

TAE

: Tris- acetate- EDTA

NCBI

: National center for biotechnology information

Dal

: Dalton

TK

: Thermococcus kodakarensis


vi

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ iii
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT .......................................................... v

MỤC LỤC ........................................................................................................ vi
Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề.................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
1.3. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 3
1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ........................................................................... 3
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 .................... 4
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 4
2.1.1.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 4
2.1.1.2. Phân loại ............................................................................................... 5
2.1.2. Đặc điểm chung về hệ gen ...................................................................... 6
2.1.3. Vai trò của vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 ..... 8
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................... 9
2.2. Tổng quan về protein OsmC do gene Tk2017 mã hóa ............................ 13
2.2.1. Protein ................................................................................................... 13
2.2.1.1.Khái niệm protein ................................................................................ 13
2.2.1.2. Tính chất protein ................................................................................ 13
2.2.1.3. Chức năng Protein .............................................................................. 15
2.2.1.4. Vai trò của protein .............................................................................. 16
2.2.2 Protein OsmC do gen Tk2017 mã hóa ................................................... 18
2.2.2.1. Trình tự protein OsmC do gene Tk2017 mã hóa ............................... 18


vii

2.2.2.2. Phân tích proteomic dưới tác dụng thẩm thấu trong T.kodakarensis
KOD1 .............................................................................................................. 19

2.3. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới ................................... 25
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................... 25
2.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 26
Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
......................................................................................................................... 28
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 28
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 28
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 28
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................... 28
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 28
3.2.2. Thời gian tiến hành ............................................................................... 28
3.3. Hóa chất, thiết bị và vật liệu .................................................................... 28
3.3.1. Hóa chất................................................................................................. 28
3.3.2. Thiết bị .................................................................................................. 29
3.3.3. Vật liệu .................................................................................................. 29
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 31
3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 31
3.4.1. Phương pháp nuôi phục hồi từ chủng gốc ............................................ 31
3.4.2. Phương pháp tách triết DNA tổng số [10] ............................................ 31
3.4.3. Phương pháp khuếch đại đoạn DNA bằng phản ứng PCR ................... 34
3.4.4. Phương pháp điện di trên gel Agarose[1] ............................................. 37
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 40
4.1. Kết quả so sánh trình tự protein do gene TK2017 mã hóa với trình tự protein của
3 vi khuẩn bất kì đã được công bố trên ngân hàng gene NCBI (Gene bank). .......... 40
4.2. Kết quả tách triết DNA genome từ vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1 .............................................................................................................. 44


viii

4.3. Kết quả khuếch đại gene TK2017 từ hệ gene của vi khuẩn Thermococcus
kodakarensis KOD1 ........................................................................................ 44
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 46
5.1. Kết luận .................................................................................................... 46
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Sự thích nghi của sinh vật với những tác động thay đổi của môi trường
đã được biết đến từ nhiều năm với số lượng lớn các sinh vật nhân sơ và nhân
thực. Khi điều kiện môi trường thay đổi dần dần, sinh vật có thể chống chịu
lại bởi sự thay đổi trình tự bao gồm sự biểu hiện của gene cho sự tổng hợp số
lượng lớn protein và sự trao đổi chất, nó có quan hệ phức tạp với sự chống lại
những căng thẳng của môi trường.
Từ khi sinh vật cổ chịu nhiệt sống sót trong điều kiện môi trường cực
đoan, sự cố tổng hợp bất thường và đặc điểm sinh lý biến đổi. Chúng được sử
dụng nhiều trong công nghiệp sinh học. Tuy nhiên, tất cả hiểu biết của sự thay
đổi vật lý của sinh vật trong việc trả lời lại sự biến đổi là không trọn vẹn. Vì
vậy nghiên cứu xa hơn về khả năng sống xót của sinh vật trong điều kiện môi
trường cực đoan là vô cùng cần thiết. Thực hiện về vấn đề này, chúng ta phân
tích xa hơn về mẫu protein với các giá trị căng thẳng bằng gel 2 –
dimensional. Tất cả kết quả cho thấy rằng protein OsmC đặc biệt được điều
chỉnh bởi căng thẳng do thẩm thấu.
Nói chung peroxit có độc cao và ảnh hưởng đến tế bào mức đại phân tử
ở vi khuẩn. Vì vậy giá trị của peroxit là quan trọng với sự sống sót của vi

khuẩn và chống chịu biến đổi.
Gene OsmC lần đầu tiên biểu hiện ở E.coli trả lời cho sự sốc thẩm thấu
và kết quả của protein vượt qua sự sốc đó. Số loài vi khuẩn có một hay hai
bản sao trong một gene. Sự điều chỉnh của gene này hoàn thiện cả Bacillus
subtilis


2

E.coli nói chung, cấu trúc vòng của OsmC từ mycoplasma pneumonia. E.coli
được báo cáo và trình bày là có cấu trúc bậc hai, bao gồm 2 monomers.
Sự định hướng từ đầu đến cuối. 2 vùng cysteines bảo tồn được nhận dạng với
cấu trúc bậc 2.
Từ những nhận định trên tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
và khuếch đại gene TK2017 mã hóa Osmotically Inducible Protein C (
OsmC) từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1”. Để nắm
bắt và tìm hiểu sâu hơn về vấn đề này.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu và khuếch đại được gene TK2017 mã hóa Osmotically
Inducible Protein C ( OsmC) từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus
kodakarensis KOD1.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu đặc điểm protein OsmC do gen Tk2017 mã hóa
- Khuếch đại được gene Tk2017 mã hóa Protein OsmC từ vi khuẩn chịu
nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 bằng phương pháp PCR


3

1.4. Ý nghĩa của đề tài

1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu kế tiếp có liên quan đến
gene TK2017 mã hóa protein ( OsmC) từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus
kodakarensis KOD1
1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng tạo dòng
gene, biểu hiện protein, tinh sạch và kiểm tra hoạt tính của nó.


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
2.1.1.1. Nguồn gốc
Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 là một chủng vi khuẩn kỵ
khí chịu nhiệt có nguồn gốc từ miệng núi lửa gần bờ đảo Kodakara,
Kagoshima, Nhật Bản, ban đầu được đặt tên là pyrococcus kodakarensis
KOD1 sau đó được phân loại vào loài Thermococcus dựa vào trình tự
16sRNA[1]. Hướng nghiên cứu chính chủ yếu là tính chịu nhiệt tự nhiên của
enzyme, tính chất dễ dàng xử lý và tác động trong các quá trình sinh học của
tự nhiên đã thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu trong lĩnh
vực kỹ thuật di truyền[2].

Hình 2.1: Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1


5

2.1.1.2. Phân loại

Hình 2.2: Cây phân loại vi khuẩn chịu nhiệt
Thermococcus kodakarensis KOD1
Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 được phân loại như sau:
Giới: Archaea
Ngành: Euyarchaeota
Lớp: Thermococci
Bộ: Thermococcales
Họ: Thermococcaceae
Chi: Thermococcus
Loài: Thermococus kodakarensis KOD1


6

2.1.2. Đặc điểm chung về hệ gen
- Hệ gen của Thermococcus kodakarensis được ước lượng khoảng 2,09
triệu bp chứa khoảng 2358 gen, toàn bộ trình tự đã được Đại học Kyoto, Nhật
Bản giải trình tự, phát hành trên tạp chí khoa học tháng 03 năm 2005[3].

Hình 2.3: Genome của vi khuẩn chịu nhiệt
Thermococcus kodakarensis KOD1
Chú thích:
- Vòng tròn ngoài cùng: bản đồ vật lý thu nhỏ trong dữ liệu cơ sở.
- Vòng tròn thứ 2: dự đoán các vùng mã hóa protein trong chiều kim
đồng hồ.


7

- Vòng tròn thứ 3: dự đoán các vùng mã hóa ngược chiều kim đồng hồ.
- Các gen biểu thị được phân màu theo nhóm phân loại chức năng, cụ thể:
+ Màu hồng: phiên mã
+ Màu hồng nhạt: sao chép DNA, tái tổ hợp hoặc sửa chữa
+ Xanh lá cây: vùng phân chia tế bào, nhiễm sắc thể
+ Vàng nhạt: lớp bên ngoài tế bào
+ Xanh da trời: thực hiện hóa sinh tổng hợp, dị hóa
+ Xanh nhạt: tế bào nhu động, vận chuyển ion, trao đổi chất
+ Xanh lam: cơ chế truyền tín hiệu, trao đổi các coenzyme
+ Màu tím: sản xuất năng lượng, chuyển đổi
+ Tím nhạt: chuyển hóa lipide
+ Màu xám: chức năng chỉ mới được đề xuất
+ Màu đen: không rõ chức năng
- Vòng tròn thứ 4: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều kim đồng hồ
(màu đỏ trong vòng thứ 4).
- Vòng tròn thứ 5: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều ngược chiều
kim đồng hồ (màu xanh vòng tròn thứ 5).
- Vòng tròn thứ 6: dự báo các yêu tố di động theo chiều kim đồng hồ
(màu đỏ vòng thứ 6).
- Vòng tròn thứ 7: dự báo các yếu tố di động theo chiều ngược kim
đồng hồ (màu xanh vòng thứ 7).
- Đường thẳng đứng thể hiện việc dự đoán gen chuyển và chỉ ra vùng
virus liên quan
- Vòng tròn trong cùng: % (G+ C) trong vòng 10 kb và thay đổi gia
tăng tới các giá trị cao hơn trong khoảng ít nhất là 38 %.


8

2.1.3. Vai trò của vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1
Nhiều protein đã được báo cáo đóng vai trò quan trọng trong việc bảo
vệ tế bào chống lại căng thẳng khác nhau. Ví dụ:
Osmotically cảm ứng protein C (OsmC) từ T. kodakarensis đóng một
vai trò trong việc bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa gây ra thông qua tiếp
xúc với hyperoxides hoặc thẩm thấu cao[4]. T. kodakarensis cũng sở hữu bốn
gen prefoldin, mã hóa hai tiểu đơn vị alpha (pfdA và pfdC) và hai tiểu đơn vị
beta (pfdB và pfdD) của prefoldins trên hệ gen. Các chức năng PfdA / PfdB
phức tạp ở mọi nhiệt độ tăng trưởng, trong khi phức tạp PfdC / PfdD góp
phần vào sự sống còn trong môi trường nhiệt độ cao [1]. Protein liên quan đến
căng thẳng oxy hóa đã được nghiên cứu tốt trong Pyrococcus, mà thuộc về
cùng một thứ tự Thermococcales, cùng với T. kodakarensis KOD1.
Trong Pyrococcus horikoshii, một sự gia tăng đáng kể của một 25 kDa
alkyl hydroperoxide reductase (PH1217) đã được quan sát thấy khi các vi sinh
vật được trồng trong điều kiện hiếu khí . P. furiosus bất ngờ chịu được oxy,
phát triển tốt trong sự hiện diện của 8% (vol / vol) O 2. Superoxide reductase
(SOR) và protein flavodiiron giả định một vai trò quan trọng trong việc chống
O 2 [1]. Hầu hết các phản ứng căng thẳng tế bào được đánh giá cao bảo tồn cơ
chế phòng vệ của tế bào để bảo vệ chống lại những thay đổi môi trường đột
ngột hoặc biến động thường xuyên trong các yếu tố môi trường [1]. Phản ứng
căng thẳng di động đã được gắn liền với các khía cạnh thiết yếu của protein
và chế biến DNA và sự ổn định trong cả ba lĩnh giới: Archaea, vi khuẩn, và
Eukarya . Trong Archaea, T. kodakarensis đã nổi lên như một hệ thống mô
hình hàng đầu cho các nghiên cứu về hóa sinh archaea, di truyền, và
hyperthermophily [2]


9

2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy

Do đặc điểm của Thermococcus kodakarensis KOD1 là vi khuẩn chịu
nhiệt, có khả năng sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ 60- 100 0C, nhiệt độ tối
ưu cho sự sinh trưởng là 95 0C và trong khoảng pH từ 6- 9 (tối ưu là 5,8) nên
nhà khoa học đã nghiên cứu môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Thermococcus kodakarensis KOD1 như sau [2]:
Thermococus vừa(208 bp)[2]
Bảng 2.1: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Thermococcus kodakarensis KOD1
KCl
MgCl2·6H2O
MgSO4·7H2O
NH4Cl
NaCl
K2HPO4
Cao nấm men
(Difco)
Tryptone (Difco)
FeSO4·7H2O
NaBr
Khoáng vi lượng
Vitamin giải pháp
Lưu huỳnh (bột)
Na2S·9H2O
Resazurin
Nước cất

0.33
2.8
3.4
0.25

25.0
0.3

g
g
g
g
g
g

3.0

g

3.0
0.025
10.0
10.0
10.0
10.0
0.5
1.0
1.0

g
g
mg
ml
ml
g

g
mg
L

Trộn các thành phần, trừ lưu huỳnh và Na2S.9H2O, điều chỉnh pH đến
7,0-7,2 và khử trùng (Hình 2.4)


10

Hình 2.4
Trộn Na2S.9H2O dung dịch 5% vào nồi hấp hơi và bột lưu huỳnh trong
3 giờ ở 90oC (Hình 2.5)

Hình 2.5


11

Hình 2.6
Sục khí N2 vào bình, thêm bột lưu huỳnh và Na2S.9H2O 5% vào và hấp
trong khí N2 trong 5 giờ (Hình 2.7, 2.8,2.9)

Hình 2.7

Hình 2.8


12

Phối trộn các chất và lưu huỳnh vào hấp có sục khí N2, và bình có nút
cao su butyl

Hình 2.9
Bảng 2.2. Thành phần của khoáng chất vi lƣợng
Nitrilotriacetic acid
1.5
g
MgSO4·7H2O

3.0

g

MnSO4·xH2O

0.5

g

NaCl

1.0

g

FeSO4·7H2O

0.1

g

CoSO4·7H20

0.1

g

CaCl2·2H2O

0.1

g

ZnSO4·7H2O

0.1

g

CuSO4·5H2O

0.01

g

AlK(SO4)2

0.01

g

H3BO3

0.01

g

Na2MoO4·2H2O

0.01

g

Nước cất

1.0

L

Hòa tan axit nitrilotriacetic và điều chỉnh pH đến 6,5 bằng dung
dịch KOH. Sau đó tiếp tục thêm các khoáng chất. Điều chỉnh pH cuối


13

cùng để pH đạt 7.0.
Bảng 2.3. Thành phần của Trace vitamins
Biotin
2.0

mg
Folic acid

2.0

mg

Pyridoxin·HCl

10.0

mg

Thiamine·HCl

5.0

mg

Riboflavin

5.0

mg

Nicotinic acid

5.0

mg

Calcium pantothenate

5.0

mg

Vitamin B12

0.1

mg

p-Aminobenzoic acid

5.0

mg

Lipoic acid

5.0

mg

Nước cất

1.0

L

2.2. Tổng quan về protein OsmC do gene Tk2017 mã hóa
2.2.1. Protein
2.2.1.1.Khái niệm protein
Là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn
phân là axít amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên
kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc
gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của
protein.
2.2.1.2. Tính chất protein
Axit amin - đơn phân tạo nên protein
Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân
là các axit amin. Axit amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm
amin (-NH2), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử


14

cacbon trung tâm đính với 1 nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định
tính chất của axit amin. Người ta đã phát hiện ra được tất cả 20 axit amin
trong thành phần của tất cả các loại protein khác nhau trong cơ thể sống.
Đơn vị tạo thành cơ bản của protein là các axit amin. Trong cơ thể con
người có hơn 20 loại axit amin, thành phần và số lượng axit amin của mỗi loại
protein không giống nhau do đó hình thành nên hàng nghìn các protein khác
nhau. Mặc dù cơ thể con người cần tất cả các axit amin, nhưng phần lớn các
axit amin là do cơ thể tự tổng hợp được hoặc do các axit amin khác chuyển
hóa thành, do đó trên thực tế các axit amin mà cơ thể người trưởng thành cần
hấp thụ qua thức ăn chỉ có 8 loại, còn trẻ em là 9 loại, là những chất được cho
rằng là axit amin thiết yếu.
Các bậc cấu trúc của protein

Người ta phân biệt ra 4 bậc cấu trúc của protein.
Cấu trúc bậc một: Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình
thành nên chuỗi polypeptide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của axit
amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm carboxyl của axit amin cuối cùng. Cấu
trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của các axit amin trên
chuỗi polypeptide. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì
trình tự các axit amin trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các
phần trong chuỗi polypeptide, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và
do đó quyết định tính chất cũng như vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình
tự sắp xếp của các axit amin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất
của protein.
Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong
không gian. Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo
nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hyđro
giữa những axit amin ở gần nhau. Các protein sợi như keratin, collagen... (có


15

trong lông, tóc, móng, sừng)gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu có
nhiều nếp gấp β hơn.
Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với
nhau thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu
trúc không gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của
protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -R trong
các mạch polypeptide. Chẳng hạn nhóm -R của cysteine có khả năng tạo
cầu đisulfur (-S-S-), nhóm -R của proline cản trở việc hình thành xoắn, từ đó
vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm
phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử...
Các liên kết yếu hơn như liên kết hydro hay điện hóa trị có ở giữa các nhóm R có điện tích trái dấu.

Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp
với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptide liên
kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết hyđro.
2.2.1.3. Chức năng Protein
Loại
protein

Chức năng

Ví dụ
Collagen và Elastin tạo nên cấu trúc sợi rất bền

Protein

Cấu trúc,

của mô liên kết, dây chẳng, gân. Keratin tạo nên cấu

cấu trúc

nâng đỡ

trúc chắc của da, lông, móng. Protein tơ nhện, tơ
tằm tạo nên độ bền vững của tơ nhện, vỏ kén

Xúc tác sinh Các Enzyme thủy phân trong dạ dày phân giải thức
Protein

học: tăng

ăn, Enzyme Amylase trong nước bọt phân giải tinh

Enzyme

nhanh, chọn bột chín, EnzymePepsin phân giải Protein,
lọc các phản Enzyme Lipase phân giải Lipid