Nghiên cứu biểu hiện gen Paga mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn Bacillus anthracis trong vi khuẩn E. Coli BL21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT



NGUYỄN PHƢỢNG MINH



NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN PAGA MÃ HÓA
KHÁNG NGUYÊN BẢO VỆ PA CỦA VI KHUẨN
BACILLUS ANTHRACIS TRONG VI KHUẨN E. COLI BL21


Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 01 03


LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC



Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH

HÀ NỘI - 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được
nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó.
Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Đình Bính,
người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi
hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng Di truyền Vi
sinh, Viện công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ
Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian dài thực tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn Thủ trưởng và cán bộ Viện Hóa học -
Môi trường Quân sự nơi tôi công tác đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn
thành luận văn của mình.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã
luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua!
Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2013
Học viên



Nguyễn Phượng Minh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP Acid Adenozin Triphosphate
B. anthracis/ Ba Bacillus anthracis

bp base pair
CA Casamino Acid
dH
2
O deion water
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EF Edema Factor
FAO Food Agricultural Organisation
h giờ
kDa Kilo Dalton
LB Lauria Betani
LF Lethal Factor
MPA Meat Pepton Agar
MPB Meat Pepton Broth
ORF Open Reading Frame
PA Protective Antigen
PCR Polymerase Chains Reaction
SDS Sodium Dodecylsulphate
TAE Tris – Acetate EDTA
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Sơ lƣợc về bệnh than 3
1.1.1. Lịch sử xuất hiện và phát triển của bệnh than 3
1.1.2. Các dạng bệnh than 4

1.1.2.1. Bệnh than thể da 5
1.1.2.3. Bệnh than hô hấp 7
1.1.2.4. Bệnh than thể màng não 7
1.1.3. Bệnh than và chiến tranh sinh học 8
1.2. Tác nhân gây bệnh than 9
1.2.1. Đặc điểm vi khuẩn Bacillus anthracis 10
1.2.2. Độc tố của vi khuẩn B. anthracis 11
1.2.2.1. Độc tố vỏ nhày 11
1.2.2.2. Độc tố than 12
1.2.2.2.1. Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen – PA) 12
1.2.2.2.2. Tác nhân gây phù thũng (Edema factor – EF) 13
ện của các gen gây độc trong vi khuẩn B. anthracis 15
1.3. Kháng nguyên bảo vệ PA 17
1.3.1. Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA 17
1.3.2. Cấu trúc kháng nguyên bảo vệ PA 18
1.3.3. Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA 20
1.4. Gen mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA 22
1.5. Biểu hiện gen pagA 23
1.5.1. Vector biểu hiện 23
1.5.2. Lựa chọn chủng biểu hiện 25
1.5.3 Phƣơng pháp biểu hiện 26
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28
2.1. Vật liệu 28
28
2.2. Hoá chất và môi trƣờng 29
2.2.1. Hoá chất, dung dịch 29
2.2.2. Môi trƣờng 34
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 34

2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn [30]. 35
2.3.2. Phƣơng pháp tinh sạch plasmid [30]. 35
2.3.3. Phƣơng pháp PCR 36
2.3.4. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose [30]. 36
2.3.5. Phƣơng pháp cắt bằng enzym giới hạn [30] 37
2.3.7. Phƣơng pháp làm tế bào khả biến E. coli 39
2.3.8. Phƣơng pháp biến nạp vào tế bào khả biến [30] 39
2.3.9. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % [30] 40
2.3.10. Phƣơng pháp biểu hiện gen 41
2.3.11. Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp cho quá trình biểu hiện 41
2.3.12. Xác định khả năng hoà tan của protein 42
2.3.13. Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin 42
2.3.14. Phƣơng pháp Western Blot [3, 25] 44
CHƢƠNG 3-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46
3.1. Tách chiết DNA tổng số 46
3.2. Khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR 46
3.3. Tách dòng gen pagA 47
3.3.1. Biến nạp vector mang gen pagA vào tế bào khả biến E. coli chủng
DH5α 47
3.3.2. Kiểm tra sự tồn tại của gen pagA trong vector tái tổ hợp 47
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3.3.3. Đọc trình tự nucleotide của gen pagA 51
3.4. Biểu hiện gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA 54
3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen pagA 54
3.4.2. Gắn đoạn gen pagA vào vector biểu hiện pET-TRX-FUS 54
3.4.3. Tạo chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA 55
3.4.3.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA vào chủng trung
gian E. coli DH5α 55
3.4.3.2. Kiểm tra sự tồn tại của pagA trong plasmid tái tổ hợp 55

3.4.3.3. Kiểm tra khung đọc của vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA . 57
3.4.3.4. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-TRX-pagA vào E. coli BL21 (DE3) 58
3.4.4. Nghiên cứu biểu hiện gen pagA trong E. coli BL21 59
3.4.4.1. Nghiên cứu điều kiện biểu hiện gen pagA 59
3.4.4.2. Xác định khả năng hoà tan và định khu của protein 62
3.5. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin 63
3.6. Khẳng định sự biểu hiện của protein tái tổ hợp PA bằng phản ứng
Western blot 64
66
66
KIẾN NGHỊ 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC HÌNH

5
ủa bệnh nhân nhiễm than đường tiêu hóa 6
Hình 1.3: Phổi bị nhiễm bệnh than 7
Hình1. 4: Não của người bị nhiễm bệnh 8
Hình 1.5: Hình thái tế bào (A) và bào tử (B) của vi khuẩn B. anthracis 10
Hình 1.6: Nhân tố gây chết EF 13
Hình 1.7: Nhân tố gây chết LF 14
Hình 1.8: Cấu trúc đơn phân kháng nguyên bảo vệ PA 18
Hình 1.9: Cấu trúc vòng heptam của kháng nguyên bảo vệ PA 20
Hình 1.10: Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA 20
Hình 1.11: Vector biểu hiện 23
Hình 1.12: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vectơ pET-28a(+). 25
Hình 2.1: Mô hình phản ứng Western blot 44

Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel 0,8% agarose 46
Hình3.2. Điện di sản phẩm PCR của gen pagA trên gel 0,8% agarose 46
Hình 3.3. Khuẩn lạc E. coli DH5α trên môi trường LBA chứa X - gal và
ampicillin 47
Hình 3.4. Điện di DNA plasmid từ các dòng khuẩn lạc xanh và trắng trên gel
0,8 % agarose 48
Hình 3.5. Điện di sản phẩm cắt bằng EcoRI trên gel 1,5% agarose 49
Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc trắng
dòng 1, 10 bằng enzyme BamHI và XhoI trên gel 1 % agarose 50
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen pagA với cặp mồi BA1 và
BA2 từ các dòng khuẩn lạc 1,2 trên gel 0,8% agarose 51
Hình 3.8. So sánh trình tự gen pagA của chủng B. anthracis VCM1167 với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế 52
Hình 3.9. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS-pagA 54
Hình 3.10. Điện di sau khi thôi gel trên gel 1% agarose 55
Hình 3.11. Khuẩn lạc của E. coli DH5α trên môi trường LBA 55
Hình 3.12. Điện di plasmid từ các khuẩn lạc E. coli DH5a trên gel 1 %
agarose 56
Hình 3.13. Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp trên gel 1 % agarose 56
Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR trên gel 1 % agarose 57
Hình 3.15. Trình tự acid amin của protein kháng nguyên bảo vệ trên lý thuyết 58
Hình 3.16. Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli chủng BL21 trên môi trường LBA 58
Hình 3.17. Điện di sự biểu hiện protein PA trên gel 12,6 % polyacrylamide 59
Hình 3.18. Điện di protein tái tổ hợp PA theo nhiệt độ trên gel 12,6 %
polyacrylamide 60
Hình 3.19. Điện di biểu hiện protein tái tổ hợp PA theo nồng độ IPTG 61
Hình 3.20. Điện di mẫu protein PA theo thời gian trên gel 12,6 %
polyacrylamide 62

Hình 3.21. Điện di protein tan và không tan trên gel 12,6 % polyacrylamide 63
Hình 3.22. Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide 64
Hình 3.22a. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng
thể kháng Thioredoxin trên màng lai PVDF 65
Hình 3.22b. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng
thể kháng PA trên màng lai PVDF 65
Hình 3.22c. Phản ứng western blot giữa protein tái tổ hợp PA với kháng thể
kháng PA tự nhiên 65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh than là một căn bệnh nhiễm khuẩn cấp tính do vi khuẩn Bacillus
anthracis (B. anthracis) gây ra cho gia súc, đặc biệt là cho các động vật ăn cỏ
như trâu, bò, dê cừu ngựa Bệnh than có khả năng lây nhiễm sang người
thành dịch với tỷ lệ tử vong cao. Bệnh có nhiều dạng biểu hiện khác nhau tuỳ
theo cách tiếp xúc với bệnh, nhưng nhìn chung, bệnh than bao gồm 4 dạng:
than thể da, than thể hô hấp, than thể tiêu hoá và than thể màng não.
Bệnh than là một căn bệnh vô cùng nguy hiểm. Nó mang một số đặc
điểm được trung tâm kiểm soát và ngừa bệnh Hoa Kỳ dùng để nhận biết các
trường hợp có thể làm vũ khí sinh học như thời gian lây nhiễm nhanh, tỷ lệ
gây chết cao, tác nhân gây bệnh có thể chống chịu được với điều kiện khắc
nghiệt. Chính vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chẩn đoán bệnh than và tác
nhân gây bệnh than là rất quan trọng
Kháng nguyên tái tổ hợp Protective Antigen (PA) là một trong 3 loại
độc tố than của vi khuẩn Bacillus anthracis. PA là nhân tố quyết định tính độc
của vi khuẩn than. Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố
gây chết Lethal Factor (LF) hay nhân tố gây phù thũng Edema Factor (EF) lại
sinh sản độc tố gây chết hoặc phù thũng cho tế bào vật chủ. Ngoài ra, PA còn
có chứa vùng liên kết thụ thể và có khả năng gây đáp ứng miễn dịch chống

bệnh than. Chính vì vậy, hiện nay có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng nguyên
bảo vệ PA để tạo protein tái tổ hợp làm nguyên liệu để tạo kit chuẩn đoán
bệnh than cũng như tạo vaccine phòng chống bệnh than.
Xuất phát từ tính cấp thiết chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu
biểu hiện gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn
Bacillus anthracis trong vi khuẩn E . coli BL21”.
Mục tiêu của đề tài:
1. Biểu hiện Protein PA của vi khuần Bacillus anthracis trong vi khuẩn
E . coli BL21,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

2. Thu nhận kháng nguyên bảo vệ PA tái tổ hợp phục vụ các nghiên
cứu chuyên sâu.
Nhiệm vụ của đề tài:
1. Tách dòng và giải trình tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA,
2. Thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS mang gen pagA,
3. Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn E . coli BL21 tái tổ hợp mang gen
pagA,
4. Nghiên cứu tìm ra điều kiện thích hợp cho quá trình biểu hiện về
nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng (IPTG), thời gian,
5. Tinh sạch được protein PA trên cột sắc ký ái lực Probond Nikel
Resin,
6. Kiểm tra khả năng phản ứng của protein PA tái tổ hợp với kháng thể
đặc hiệu kháng PA bằng phản ứng Western blot.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về bệnh than
1.1.1. Lịch sử xuất hiện và phát triển của bệnh than
Bệnh than hay còn gọi là bệnh nhiệt thán, đã gây ra những thiệt hại vô
cùng to lớn cho ngành chăn nuôi gia súc cũng như làm ảnh hưởng tới sức
khoẻ con người. Vì thế mà nó được đặt tên là “Black Bane” nghĩa là thảm họa
đen, vì khi bị nhiễm bệnh, vết thương có màu đen [1]. “Bệnh than” bắt nguồn
từ Hy Lạp “Anthrakos” nghĩa là than, do vết thương trên da có màu đen. Bệnh
than được tìm ra bởi John Bell vào cuối thế kỷ 15.
Năm 1876, Robert Kock đã tìm ra nguồn gốc của bệnh than và quá
trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus anthracis (B. anthracis).
Bệnh than thường xuất hiện ở những trang trại vào một thời điểm nhất
định, đặc biệt là những vùng nông nghiệp phía Nam Châu Mỹ và Châu Phi.
Bệnh thường gặp ở những động vật ăn cỏ như: cừu, dê, ngựa, trâu bò. Đặc
biệt bệnh có thể lây nhiễm sang người nên được coi là mối hiểm họa đe doạ
cho sức khoẻ cộng đồng.
Trận dịch than được biết đến đầu tiên trong lịch sử xảy ra năm 1500
trước Công Nguyên làm chết nhiều vật nuôi của người Ai Cập.
Năm 1491 trước Công Nguyên, tiếp tục một cơn lốc bệnh than ở Ai

Cập làm chết nhiều gia súc, và làm nóng lên sự kiện bệnh than.
Năm 1789, một trận dịch bệnh than lan tràn ở vùng Tresnobin (Nga).
Những năm 1960, bệnh than đã làm chết khoảng 60.000 gia súc ở
Châu Âu.
Tháng 4 năm 1979, ở Sverdlovsk, Liên Xô nay là Ekatarinbua, xảy ra
một trận dịch than thể hô hấp làm chết 66 người [18]. Sau đó vài năm, một
trận dịch tương tự xảy ra ở Paraguay.
Năm 1978 – 1980, một trận dịch than ở Zimbabwe làm hơn 6.000
người bị nhiễm bệnh và 100 người chết.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Năm 1989, ở miền Bắc xứ Wales xảy ra một trận dịch than lớn. Người
ta phải giết 4.492 con gia súc bị nhiễm than và áp dụng các biện pháp sát
trùng chất thải, nhà cửa, thiết bị, đường sá, đất đai bằng fomalin.
Sau sự kiện ngày 11/9/2001, bọn khủng bố sinh học đã dùng bào tử của
vi khuẩn B. anthracis tấn công một số bưu điện của Mỹ bằng các phong bì thư
làm 5 người chết và 17 người bị nhiễm bệnh [1].
Trận dịch than gần đây nhất là ngày 14/6/2005 xảy ra ở một quốc gia
nhỏ ở Châu Phi làm chết 4 người và hơn 80 người bị nhiễm bệnh.
Ở Việt Nam, bệnh than cũng đã xuất hiện từ lâu nhưng ít được thông
báo. Theo số liệu thống kê của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, năm 1997
có 30 người mắc bệnh than, năm 1998 có 59 người, năm 1999 có 58 người.
Riêng năm 2000 có 27 người mắc bệnh than, trong đó có 12 ca ở Cao Bằng,
11 ca ở Lai Châu, 4 ca ở Đồng Nai, tuy nhiên không có ca nào bị tử vong.
Tháng 5/2008 ở Điện Biên có 22 người mắc bệnh nhưng không có ai bị tử
vong. Từ tháng 6 đến nay, tại huyện Mèo Vạc, Hà Giang đã xảy ra các vụ trâu
bò, lợn, dê chết. Người dân đã ăn thịt các gia súc này và kết quả xét nghiệm
của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương kết luận có 13 ca nghi nhiễm mắc bệnh
than, một người đã tử vong [32].

Hầu hết các ca mắc phải đều tập trung ở miền núi chăn nuôi gia súc lớn
như Thanh Hoá, Tuyên Quang, Nghệ An, Lai Châu, Đắk Lăk [1, 2]. Đối với
các trường hợp mắc bệnh than ở nước ta hầu hết do tiếp xúc với động vật ăn
cỏ như trâu, bò, những người làm nghề thuộc da chế biến xương.
1.1.2. Các dạng bệnh than
Bệnh than thường xuất hiện ở các loài động vật hoang dã cũng như
động vật nuôi, đặc biệt là các loại gia súc ăn cỏ như trâu, bò, cừu, la, ngựa, dê
do chúng hít phải hoặc nhiễm phải bào tử than trong đất. Ở người, nguy cơ
mắc bệnh than là do tiếp xúc với động vật ăn cỏ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Bệnh than có thể nhiễm vào cơ thể vật chủ theo ba con đường: qua da,
qua đường tiêu hoá và đường hô hấp. Bệnh than có thể biến chứng thành thể
than màng não nếu hít vào bào tử than. Tuỳ theo cách thức lây nhiễm mà
người ta chia bệnh than thành 4 thể than khác nhau: than da, than tiêu hoá,
than hô hấp, than màng não [19].
1.1.2.1. Bệnh than thể da

Đây là hình thức than phổ biến nhất chiếm hơn 95 % và là loại bệnh có
khả năng điều trị. Bệnh thường gặp ở những nhóm đối tượng nguy cơ lây
nhiễm cao, thường xuyên tiếp xúc với động vật và các sản phẩm từ gia súc đã
bị nhiễm than, thường là những người nông dân, bác sĩ thú y, người giết mổ
gia súc hay thịt. Từ các vết thương hở trên da, vi khuẩn hay bào tử B.
anthracis có thể xâm nhập và gây bệnh.
Triệu chứng của bệnh: sau 1 – 2 ngày đầu thấy xuất hiện các vết sẩn
ngứa như côn trùng đốt, dần dần xuất hiện các dấu hiệu hoại tử trong vùng
tâm. Sau 2 – 3 ngày sẽ xuất hiện các mụn nhỏ hay nốt nhú tại vị trí nhiễm,
xung quanh xuất hiện các mụn nước. Vài ngày sau, tại vùng trung tâm vết loét
sẽ xuất hiện các nốt đen, khô bắt đầu bong vẩy. Trong khoảng 1 – 2 tuần kể từ

khi nhiễm bệnh sẽ xuất hiện các mủ và các hiện tượng đau nhức, mệt mỏi, sốt,
bạch cầu tăng, các hạch bạch huyết tăng lên. Sau đó vùng thương tổn sẽ
chuyển sang dạng tự phát. Nếu bệnh nặng thêm vết loét sẽ lan rộng và ăn sâu





Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

làm nhiễm trùng máu dẫn đến không thể chữa khỏi. Than da gây tử vong
khoảng 20 % các trường hợp không được điều trị kịp thời.
1.1.2.2. Bệnh than thể tiêu hoá

Nguyên nhân của bệnh than thể tiêu hoá là do ăn phải thịt gia súc đã bị
nhiễm bào tử than mà không được nấu chín, thậm chí cả khi được nấu chín thì
khả năng gây bệnh vẫn cao [2]. Người ta tìm thấy vi khuẩn than trong dịch ruột
của bệnh nhân mắc bệnh than. Đầu tiên vi khuẩn sẽ tấn công vào những vị trí
thương tổn của màng ngoài ruột và dạ dày. Từ những vị trí này sẽ xuất hiện
những vết loét, lan rộng và lan vào hệ bạch huyết. Bệnh than tiêu hoá thường ít
gặp nhưng lại có tỷ lệ tử vong khá cao. Bệnh thường có hai thể lâm sàng [11]:
– Thể bụng: dấu hiệu đầu tiên và rất dễ nhận biết là có thương tổn xuất
huyết hoại tử ở manh tràng và các vùng lân cận. Triệu chứng ban đầu không
đặc biệt với những cảm giác buồn nôn, biếng ăn, sốt cao. Sau đó là các triệu
chứng đau bụng, tiêu chảy, sốc do nhiễm trùng và tử vong. Bệnh nhân có thể
viêm phúc mạc hoặc viêm lá lách do vi khuẩn tấn công vào khu bạch huyết.
Sau 2– 3 ngày kể từ khi xuất hiện dấu hiệu của bệnh sẽ gây tử vong.
– Thể họng, miệng: tại vùng thương tổn thấy xuất hiện hoại tử ở vùng
vòm họng, cổ họng cứng, sưng amidan. Bệnh nhân sốt cao, khó nuốt, hạch

của bệnh nhân nhiễm than đường tiêu hóa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

vùng cổ sưng to, nhiễm độc máu và đa số dẫn đến tử vong. Dạng than này có
tỷ lệ tử vong cao chiếm 50 % mặc dù có được điều trị.
1.1.2.3. Bệnh than hô hấp

Nguyên nhân gây than hô hấp là do hít phải bào tử than. Sau khi vào cơ
thể, các bào tử than sẽ phát triển thành thể hoạt động và di chuyển tới các phế
nang, hạch lympho phổi và trung thất gây xuất huyết hoại tử và phù thũng làm
trung thất giãn rộng ra cả hai bên làm bệnh nhân có cảm giác đau vùng ức, sốt
cao. Các thương tổn xuất huyết và hoại tử lan đến màng phổi gây tràn máu
màng phổi. Khí quản cũng bị ảnh hưởng với các triệu chứng như ho khan, co
thắt, vùng phổi bị phù. Vi khuẩn sẽ theo đường máu lan đến phần dưới niêm
mạc của ống tiêu hoá và tạo nên các vết loét ở thành ruột làm bệnh nhân nôn ra
máu, tiêu hoá ra máu hoặc cả hai triệu chứng trên. Một số nang lympho của
đường tiêu hoá cũng bị phù và xung huyết, nếu bệnh nặng hơn có thể biến
chứng sang thể màng não gây xuất huyết. Đa số bệnh nhân đều tử vong trong
khoảng 1– 2 ngày kể từ khi phát bệnh. Tỷ lệ tử vong của bệnh than này rất cao.
1.1.2.4. Bệnh than thể màng não
Bệnh thường do biến chứng từ ba thể than trên. Than màng não xuất
hiện khi vi khuẩn B. anthracis tấn công vào hệ thống thần kinh trung ương
theo đường máu và các mạch bạch huyết. Triệu chứng của bệnh là thường sốt
cao, mệt mỏi, đau cơ, đau đầu, buồn nôn, lên cơn mê sảng khi phát bệnh và



Hình 1.3: Phổi bị nhiễm bệnh than

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

dẫn đến hôn mê. Đa số bệnh nhân thường dẫn đến tử vong sau 1– 2 ngày kể
từ khi mắc bệnh. Thể than này có tỷ lệ tử vong rất cao, thường là 100%.

1.1.3. Bệnh than và chiến tranh sinh học
Sức tàn phá của bệnh than là vô cùng to lớn, đồng thời nó dễ chuẩn bị
và phát tán nhanh nên đã được sử dụng như một loại vũ khí sinh học làm tê
liệt cả một thành phố, thậm chí cả một quốc gia.
Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, bệnh than đã được sử dụng như
một thứ vũ khí vô cùng lợi hại. Một vài nước như Đức, Nhật, Hoa Kỳ, Liên
hiệp Anh, Iraq và Liên Xô cũ đã thừa nhận là sử dụng bệnh than làm phương
tiện của chiến tranh.
Năm 1915, Mỹ đã tiêm vi khuẩn bệnh than vào ngựa, la, trâu, bò, để
cung cấp cho các nước trong chiến tranh thế giới thứ nhất.
Năm 1937, Nhật bắt đầu thử nghiệm vũ khí bệnh than ở Mãn Châu Lý
(Trung Quốc).
Năm 1942, Liên hiệp Anh cũng tiến hành thử nghiệm vũ khí bệnh than
ở Gruinard Island, vùng duyên hải Scotland.
Năm 1943, Mỹ bắt đầu phát triển vũ khí bệnh than. Sau chiến tranh thế
giới thứ hai, Mỹ vẫn tiếp tục thực hiện chiến tranh sinh học ở Fort Detrick,
Maryland.



Hình1. 4: Não của người bị nhiễm bệnh
than

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Năm 1972, mặc dù quy ước Quốc tế cấm phát triển và dự trữ vũ khí
sinh học nhưng các cuộc chiến tranh và khủng bố vẫn tiếp diễn.
Năm 1979, bào tử than đã được phóng thích từ Sverlosx, Nga khi quân
đội nghiên cứu bệnh than làm chết 68 người.
Năm 1991, lính Mỹ được tiêm phòng vaccine bệnh than để chuẩn bị
cho chiến tranh vùng Vịnh.
Năm 1990 – 1993, nhóm khủng bố Aum Shinrikyo đã phóng thích bệnh
than ở Tokyo nhưng không gây tổn thương.
Tháng 9/2001, sau vụ khủng bố ngày 11/9, tại Cangene xảy ra một vụ
tương tự làm 22 người mắc bệnh trong đó 11 người mắc bệnh than da và 11
người mắc bệnh than hô hấp, 5 người trong số mắc than hô hấp đã chết [31].
Ngày 22/10/2001, những lá thư có chứa bào tử than được chuyển đến
các bưu điện Mỹ làm 5 người chết, và 17 người bị nhiễm bệnh. Sự kiện này
đã làm đau đầu các nhà cầm quyền Mỹ và buộc họ phải chi trả nhiều triệu đô
la cho việc tiêm phòng vaccine.
Nguyên nhân mà bệnh than được sử dụng như một loại vũ khí sinh học
hiệu quả là do vi khuẩn than phát tán rất nhanh và bào tử của nó có khả năng
chống chịu tốt với điều kiện khắc nghiệt của ngoại cảnh.
Trước tình hình chính trị bất ổn như hiện nay thì nguy cơ xảy ra chiến
tranh sinh học luôn là mối đe doạ lớn. Vì vậy chúng ta cần phải nghiên cứu kỹ
về tác nhân và cơ chế gây bệnh than để ngăn ngừa và chống lại chúng bất cứ
lúc nào.
1.2. Tác nhân gây bệnh than
Năm 1849, lần đầu tiên nguồn gốc bệnh than được nhà nghiên cứu
người Đức Pallender phát hiện ra tác nhân là vi khuẩn B. anthracis.
Năm 1950, ông Daven, nhà nghiên cứu người Pháp cũng tìm ra tác nhân
gây bệnh là B. anthracis. Nhiều năm trước đó, cũng có nhiều nhà khoa học
nghiên cứu kỹ hơn về loại vi khuẩn này như Kock và cộng sự (1876), Pasteur

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

và cộng sự (1877), Xenkovck và cộng sự (1883). Năm 1877, Kock đã nuôi
cấy vi khuẩn B. anthracis trên môi trường tinh khiết và chứng minh nó có khả
năng hình thành bào tử và có thể gây chết cho động vật. Ông đã chứng minh
sự có mặt của vi khuẩn này trong máu của động vật chết bởi bệnh than.
Năm 1822 – 1905, Pasteur và cộng sự đã tìm thấy bào tử B. anthracis ở
nơi chôn xác động vật bị chết bởi bệnh than.
1.2.1. Đặc điểm vi khuẩn Bacillus anthracis
Vi khuẩn B. anthracis thuộc nhóm I, chi Bacillus, tồn tại trong đất,
nước và không khí. B. anthracis là vi khuẩn Gram dương sinh bào tử (trong
điều kiện kị khí hay kị khí không bắt buộc) không có lông roi nên không có
khả năng di động. Kích thước tế bào từ 3 – 5 m, rộng từ 1 – 2 m. Tế bào
hình que, vuông đầu, sắp xếp với nhau thành chuỗi dài hoặc chỉ vài tế bào nối
với nhau [19].

Bào tử B. anthracis có hình elip nằm ở trung tâm tế bào, kích thước
khoảng từ 1 – 1,5 m, nang bào tử không phồng, bào tử được hình thành vào
thời kỳ cuối của pha sinh trưởng logarit [13].
Khuẩn lạc B. anthracis có màu trắng sữa hoặc trắng xám tới xám, bề
mặt sần sùi, dính, ướt, đường kính 3 – 5 mm [5].
Điều kiện thích hợp cho B. Anthracis phát triển là ở điều kiện nhiệt độ
28 – 32
o
C, pH= 7, thời gian nuôi cấy từ 3 – 5 ngày. Khi gặp điều kiện bất lợi

A

B

Hình 1.5: Hình thái tế bào (A) và bào tử (B) của vi khuẩn B. anthracis

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

tế bào sinh dưỡng sẽ hình thành nội bào tử. Các nội bào tử nằm bên trong tế
bào mẹ, khi tế bào mẹ phân giải, thì các nội bào tử sẽ được giải phóng, chúng
có thể tồn tại và phát triển độc lập trong một thời gian dài. Các nội bào tử khá
bền vững, chúng có thể chịu đựng được các điều kiện khắc nghiệt của môi
trường bên ngoài như tia tử ngoại, sự ăn mòn, nhiệt độ môi trường (quá nóng
hay quá lạnh), thiếu hụt chất dinh dưỡng hoặc nước. Khi gặp điều kiện thuận
lợi, các nội bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Các tế
bào sinh dưỡng lại tiếp tục phát triển nếu gặp điều kiện thuận lợi và ngược lại
nếu gặp điều kiện bất lợi nó lại hình thành nên các nội bào tử.
Bào tử B. anthracis được hình thành trong điều kiện nhiệt độ 12 – 42
o
C
và có khả năng chống chịu tốt với các điều kiện khắc nghiệt. Bào tử B.
anthracis đã được tìm thấy ở rất nhiều nơi trên thế giới. Nó vùi sâu trong lòng
đất và có thể tồn tại ở đó hàng chục năm. Sau những cơn mưa rào hoặc hạn
hán, bào tử sẽ nảy mầm trên bề mặt đất, khi động vật ăn phải sẽ bị nhiễm
bệnh và chết. Bào tử B. anthracis có khả năng chống chịu với điều kiện khắc
nghiệt của ngoại cảnh rất tốt, vì vậy nó được sử dụng như một thứ vũ khí lợi
hại trong chiến tranh và khủng bố.
1.2.2. Độc tố của vi khuẩn B. anthracis
Các độc tố của vi khuẩn B. anthracis bao gồm độc tố vỏ nhày và các
độc tố than. Độc tố vỏ nhày bản chất là acid poly – – D – glutamic, đã được
mã hoá bởi các gen capA, capB, capC nằm trên plasmid pXO2 (95kb). Các
độc tố than bao gồm kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen), nhân tố
gây chết LF (Lethal factor), nhân tố gây phù thũng EF (Edema factor). Các
độc tố than lần lượt được mã hoá bởi các gen pagA, lef và cya, các gen này

nằm trên plasmid pX01 (185kb) [7, 13].
1.2.2.1. Độc tố vỏ nhày
Độc tố vỏ nhày hay vỏ capsulee có bản chất là acid poly – – D –
glutamic trong khi vỏ capsulee của hầu hết các loài vi khuẩn khác lại có bản

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

chất polysaccharides. Độc tố vỏ nhày có trọng lượng phân tử là 215 kDa ở
trong tế bào và ở ngoài tế bào là 20 – 55 kDa. Nó được mã hoá bởi các gen
cap nằm trên plasmid pXO2 có trọng lượng phân tử là 95kb [19, 20].
Tất cả các dòng độc của B. anthracis đều tạo ra vỏ nhày. Vỏ nhày giúp
cho vi khuẩn B. anthracis tránh được sự bảo vệ của hệ thống miễn dịch vật
chủ và kích thích gây nhiễm trùng. Vỏ nhày ức chế đại thực bào và gây ra đáp
ứng miễn dịch yếu. Ngoài ra vỏ nhày còn có tác dụng bảo vệ làm tăng tính
độc của vi khuẩn bệnh than. Thông thường các khuẩn lạc xù xì sẽ độc hơn các
khuẩn lạc nhẵn [19].
Vỏ nhày không được hình thành khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường
dinh dưỡng thông thường. Nó chỉ hình thành trong môi trường thạch huyết
ngựa hoặc môi trường có bổ sung 0,7 % Na
2
CO
3
, ủ ở 37
o
C, trong điều kiện kị
khí [11]. Bản thân chuỗi poly – – D – glutamic không gây độc nhưng có
chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại thành phần diệt khuẩn của huyết thanh
và bạch huyết, chống lại hiện tượng thực bào. Vì vậy, vỏ nhày có vai trò trong
suốt quá trình xâm nhiễm và có vai trò nhất định trong giai đoạn cuối của
bệnh [11].

1.2.2.2. Độc tố than
Các độc tố than đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh ở cả
giai đoạn đầu của bệnh cũng như trong suốt quá trình phát triển của bệnh [8].
Độc tố than bao gồm 3 thành phần: kháng nguyên bảo vệ PA, nhân tố gây phù
thũng EF và nhân tố gây chết LF.
1.2.2.2.1. Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen – PA)
Protein độc tố PA hoàn chỉnh có trọng lượng phân tử là 83kDa, bao
gồm 735 acid amin (M
r
82,684), 394 phân tử nước và 2 nguyên tử canxi. Phân
tử PA hoàn chỉnh có 4 vùng chức năng, mỗi vùng có vai trò khác nhau trong
quá trình nhiễm bệnh [19, 20].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hoá bởi gen pagA nằm trên plasmid
pXO1. Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố gây chết
LF hay nhân tố gây phù thũng EF lại sinh sản độc tố gây chết hoặc phù thũng
cho tế bào vật chủ. Do đặc tính này mà kháng nguyên bảo vệ PA được xem là
một kênh dẫn truyền gián tiếp cho các nhân tố EF và LF để chúng phát huy
độc lực.
1.2.2.2.2. Tác nhân gây phù thũng (Edema factor – EF)

EF được coi như một enzyme Adenylate Cyclase (AC), có trọng lượng
phân tử 89 kDa, chứa 767 gốc acid amin. Nó có chức năng chuyển hoá ATP
nội bào thành cAMP, quá trình này được thực hiện khi EF kết hợp với
Calmodulin (CaM – là một thụ quan canxi lớn trong tế bào nhân chuẩn) [16,
19]. EF phụ thuộc Calmodulin có 3 trình tự được duy trì chặt chẽ, gồm 24
acid amin (303 – 339) mang vị trí gắn ATP. Trình tự này có liên quan đến quá
trình xúc tác. EF có thể tương tác với màng kép lipid mà không phụ thuộc vào

pH, không giống như LF, EF còn liên kết với các lỗ màng sau khi được
chuyển vào trong tế bào chất [19]. Khi EF được kháng nguyên bảo vệ PA dẫn
vào trong tế bào vật chủ, độc tố EF sẽ gây nên hiện tượng mất cân bằng
enzym và dẫn đến làm mất tính thấm của tế bào vật chủ. Dịch tế bào bị dồn ứ

Hình 1.6: Nhân tố gây chết EF


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

và gây nên hiện tượng trương bào, màng tế bào căng ra mọng nước, đây chính
là nguyên nhân gây phù thũng ở tế bào vật chủ [16].
Nhân tố gây phù thũng EF được tạo bởi ít nhất 3 vùng chức năng riêng
biệt, trong đó có vùng EF3 (là phức tạp bởi phần enzyme của EF với CaM và
adennosine 5’– α – β – Methylene – triphosphat, đây là vùng quan trọng nhất,
nó kết hợp với CaM để gây phù thũng cho tế bào vật chủ.
1.2.2.2.3. Nhân tố gây chết (Lethal factor – LF)
Nhân tố gây chết LF là một protein gồm 776 acid amin, trọng lượng
phân từ 90kDa, được coi là một nhân tố quan trọng do vi khuẩn B. anthracis
tiết ra [19].

LF chứa một loạt 4 trình tự lặp lại không hoàn toàn trong phần trung
tâm, sự mất đoạn trong vùng này làm protein bị bất hoạt hoặc không hoạt
động. Sự đột biến ở những gốc có tính chất quyết định sẽ tiêu huỷ hoạt tính
độc tố gây chết và gắn Zn
2+
với LF. Vì thế, LF được coi là một
metalloprotease kẽm [9]. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng LF phân giải
các acid amin đầu N của protein kinase hoạt hoá quá trình phân bào (Mitogen
Activated Protein Kinase – MAPKs) [19]. Sự đột biến ở vùng xúc tác của LF

sẽ làm mất độc tính của đại thực bào và ảnh hưởng đến sự phân bào [7].

Hình 1.7: Nhân tố gây chết LF


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Khi LF kết hợp với Zn
2+
sẽ làm tăng quá trình sản xuất cytokine trong
đại thực bào và tế bào bạch huyết [16]. Đây chính là nguyên nhân gây phá
huỷ đại thực bào và là thủ phạm chính dẫn đến hiện tượng sốc và tử vong. Sau
khi được vận chuyển vào trong tế bào, độc tố LF sẽ làm tăng tính thấm của
các ion Na
+
và K
+
, sau đó là quá trình thuỷ phân ATP [10]. Quá trình này ức
chế sự tổng hợp các đại phân tử liên quan đến đáp ứng miễn dịch. LF phong
toả hệ thống báo động của cơ thể bằng cách gắn với một cấu trúc protein đặc
biệt của tế bào, vùng metalloprotease của LF sẽ nhằm tới các kênh dẫn truyền
tín hiệu nội bào làm cho những thông tin mà tế bào cần thông báo cho hệ
miễn dịch về sự xuất hiện của yếu tố lạ bị đình chỉ, từ đó các protease sẽ phá
huỷ cấu trúc nội bào gây chết cho tế bào vật chủ.
1.2.3. Bi u hiện của các gen gây độc trong vi khuẩn B. anthracis
Người ta đã xác định được rằng có hai nhân tố chính điều hoà sự dịch
mã và biểu hiện của gen là atxA và acpA. Gen acpA nằm trên plasmind pXO2
hoạt hoá sự biểu hiện của gen capB (một trong các gen mã hoá vỏ capsulee).
Gen atxA nằm trên plasmind pXO1 hoạt hoá sự biểu hiện của các gen capB và
các gen mã hoá protein độc tố pagA, lef và cya. Gen atxA là nhân tố điều hoà

dương cho sự hoạt hoá quá trình dịch mã của các gen độc tố. Sự hoạt hoá này
phải thực hiện trong môi trường có nồng độ CO
2
/bicarbonate cao. Ngoài ra
atxA còn thực hiện một vai trò khác là điều chỉnh sự biểu hiện của các gen
độc tố khi nó xâm nhiễm vào tế bào vật chủ để gây độc [19].
Để hiểu rõ vai trò của nhân tố điều hoà atxA, người ta tiến hành gây đột
biến để tạo một thể đột biến atxA. Khi nuôi cấy trong môi trường giàu dinh
dưỡng, thể đột biến atxA và chủng gốc có sự phát triển như nhau. Nhưng trên
môi trường nghèo dinh dưỡng như môi trường tổng hợp XO hoặc các môi
trường tương tự khác thì thể đột biến không gây độc chủng Sterne (pXO1
+

pXO2
–
) rất khó phát triển. Thể đột biến này tạo ra những đám khuẩn lạc nhỏ
hơn so với chủng gốc. Như vậy gen atxA có liên quan trực tiếp đến sự tổng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

hợp vỏ capsulee có nghĩa là nó liên quan đến gen mã hoá vỏ capsulee. Đồng
thời sự có mặt của atxA còn có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành bào tử. Thể
đột biến atxA của chủng Sterne tạo nhiều bào tử hơn khi phát triển trong môi
trường giàu dinh dưỡng, còn các chủ Sterne ban đầu mang đột biến atxA
nhưng đã loại bỏ các gen độc tố thì không có đặc tính trên. Điều đó thể hiện
sự liên quan chặt chẽ của atxA và các gen độc tố [14].
Cùng với hai nhân tố điều hoà acpA và atxA, người ta cũng tìm thấy
một gen pag kích thước 300 bp, nó cùng được dịch mã xuôi chiều với gen
pagA. Gen pagR mã hoá cho một protein có trình tự acid amin giống các
tác nhân điều hoà dịch mã trong các sinh vật khác. Gen pagR ức chế sự

biểu hiện của gen acpA và atxA. Ngoài ra, gen pagR còn điều khiển sự biểu
hiện của một vài tổ hợp phiên mã promoter – lacZ được hoạt hoá bởi
CO
2
/atxA. Sự điều hoà những tổ hợp này cùng với gen pagA và pagR có
thể phụ thuộc vào sự thay đổi mức độ atxA hoặc không phụ thuộc vào sự
biểu hiện của atxA [14].
Sự dịch mã các gen độc tố và gen mã hoá vỏ capsulee tăng lên khi tế
bào phát triển trong môi trường có nồng độ CO
2
/bicarbonate cao và ngược lại,
nếu nồng độ này thấp sẽ ức chế quá trình dịch mã [13].
Hai nhân tố là CO
2
/bicarbonate và nhiệt độ cũng đóng vai trò quan
trọng trong sự biểu hiện của 3 gen độc tố. Sự tổng hợp độc tố thu được nhiều
nhất khi ủ canh trường có nồng độ CO
2
>> 5 % hoặc bổ sung bicarbonate vào
môi trường đã được đậy kín. Sự tổng hợp độc tố khi ủ canh trường ở nhiệt độ
37
o
C cũng nhiều hơn khi ủ ở 28
o
C [13, 15].
Như vậy quá trình dịch mã và biểu hiện của gen độc tố và gen mã hoá
vỏ capsulee trong vi khuẩn B. anthracis được điều khiển bởi ba nhân tố điều
hoà là acpA, atxA và pagR. Đồng thời 2 yếu tố CO
2
/bicarbonate và nhiệt độ

cũng chi phối sự biểu hiện của các gen độc tố [7, 19, 20].


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.3. Kháng nguyên bảo vệ PA
1.3.1. Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA
Kháng nguyên bảo vệ PA là thành phần quan trọng trong quá trình gây
độc của vi khuẩn B. anthracis. Phân tử PA hoàn chỉnh có trọng lượng 83 kDa,
gồm 735 acid amin, kích thước không gian 3 chiều là 100 x 50 x 30 Å. Kháng
nguyên bảo vệ PA do gen pagA mã hoá, gen này nằm trên plasmid pXO1
(185 kb) [19, 20].
Mặc dù bản thân PA không gây độc nhưng nó lại có khả năng truyền
dẫn các độc tố vào bên trong tế bào vật chủ. PA83 có khả năng kết hợp với
thụ thể trên bề mặt tế bào. Dưới tác dụng của protease nội bào họ furin, PA83
sẽ bị phân tách thành 2 phần là PA20 và PA63, để lộ ra vị trí liên kết với LF
và EF [19, 20] Đây là bước rất nguy hiểm trong quá trình gây độc của PA.
Các nghiên cứu gần đây cho thấy nếu trên phân tử PA83 không chứa vị trí
phân cắt này thì không có khả năng gây độc. Sau đó, các mảnh PA63 sẽ liên
kết với nhau để tạo thành vòng heptam có 7 nhánh. Khi vòng heptam kết hợp
với nhân tố LF sẽ gây chết và kết hợp với nhân tố EF sẽ gây phù thũng cho tế
bào vật chủ. Vì vậy, kháng nguyên bảo vệ PA được coi là tác nhân gián tiếp
gây độc cho tế bào vật chủ làm tăng hiệu quả gây độc của nhân tố gây chết và
phù thũng [19, 20].
Bên cạnh đó PA còn có vai trò chính trong miễn dịch bệnh than. Người
ta đã nghiên cứu khả năng kích thích gây đáp ứng miễn dịch của nhiều kháng
nguyên vi khuẩn B. anthracis như vỏ capsulee, S – layer hay các protein khác,
kết quả cho thấy chỉ có các protein hình thành độc tố than mới có khả năng
kích thích miễn dịch sinh kháng thể nhờ khả năng trung hoà độc tố than [9].
Kháng thể PA sẽ phá huỷ protein PA ở vị trí liên kết với thụ thể trên tế bào

vật chủ hoặc phá huỷ vị trí phân cắt trên vùng I của PA83. Chính nhờ vai trò
dẫn truyền quan trọng của PA cũng như khả năng kích thích cơ thể sản sinh
kháng thể chống bệnh than nên PA đã trở thành tâm điểm chú ý của nhiều