Đánh giá cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 mang gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

NGÔ ĐÌNH HƢNG
Tên đề tài:
ĐÁNH GIÁ CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN THẾ HỆ T1 MANG
GEN SSIV TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên nghành: Công nghệ sinh học
Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2012-2016

THÁI NGUYÊN, 2016


i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

NGÔ ĐÌNH HƢNG
Tên đề tài:
ĐÁNH GIÁ CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN THẾ HỆ T1 MANG
GEN SSIV TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên nghành: Công nghệ sinh học
Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2012-2016

Giảng viên hƣớng dẫn: 1. TS. Phạm Bích Ngọc
: 2. ThS. Lƣơng Thị Thu Hƣờng

THÁI NGUYÊN, 2016


ii

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực tập tốt nghiệp tại Viện Công nghệ Sinh học–Viện
Hàn Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam, cán bộ kỹ thuật và nhân viên
trong viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện và giúp đỡ rất nhiều để tôi hoàn
thành tốt khoá luận của mình. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và
biết ơn sâu sắc đó‖
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa cùng toàn thể các thầy, cô giáo trong
khoa CNSH – CNTP.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ngƣời hƣớng dẫn đề tài
TS.Phạm Bích Ngọc và Ths. Lƣơng Thị Thu Hƣờng đã tận tình hƣớng dẫn để
tôi hoàn thành tốt bản khoá luận này.
Đồng thời tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới Viện Công nghệ
sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam về sự hợp tác
giúp đỡ bố trí thí nghiệm, theo dõi và thu thập số liệu làm cơ sở cho khóa luận
này.
Một lần nữa tôi xin đƣợc gửi tới các thầy giáo, cô giáo và các bạn bè
lời cảm ơn sâu sắc, lời chúc sức khoẻ cùng những điều tốt đẹp nhất.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016
Sinh viên

Ngô Đình Hƣng


iii

MỤC LỤC
Phần 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2. Mục đích ............................................................................................................... 3

1.3. Yêu cầ u ................................................................................................................. 3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 4
2.1. Cơ sở khoa ho ̣c ..................................................................................................... 4
2.2. Tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới .............................................................. 4
2.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn tại Việt Nam .................................................. 9
2.4. Tinh bột .............................................................................................................. 13
2.4.1. Cấu tạo ............................................................................................................ 13
2.4.2. Cấu trúc tinh thể .............................................................................................. 14
2.4.3 Nghiên cứu quá sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan .......................... 16
2.4.4. Cơ chế phân hủy tinh bột và các gen liên quan............................................... 19
2.4.5. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm
cải biến quá trình trao đổi tinh bột ............................................................................ 20
2.4.6. Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp tinh bột ở sắn ......................................... 21
Phần 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 24
3.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và phạm vi nghiên cứu............................................. 24
3.1.1. Vật liệu ( Đối tƣợng ) ...................................................................................... 24
3.1.2. Hóa chất, thiế t bi ̣nghiên cƣ́u .......................................................................... 24
3.1.3. Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................... 25
3.2. Điạ điể m và thời gian nghiên cƣ́u ...................................................................... 25
3.3. Nô ̣i dung nghiên cƣ́u .......................................................................................... 25
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................... 25
3.4.1. Đánh giá sự phân ly của gen chuyển trên môi trƣờng có
chất kháng sinh chọn lọc ........................................................................................... 25
3.4.2. Phân tích các dòng chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR................................ 26
3.4.2.1 Tách chiết DNA tổng số ................................................................................ 26


iv
3.4.2.2 Kiểm tra bằng sự có mặt của gen SSIV bằng PCR ....................................... 27
3.4.2.3 Phƣơng pháp điện di trên gel agarose ........................................................... 28

3.4.4. Đánh giá khả năng tích lũy tinh bột ở lá bằng phƣơng pháp Iod .................... 29
3.4.5. Phân tích của tinh bột trong lá với thuốc thử Anthrone .................................. 29
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 31
4.1 Kết quả đánh giá sự phân ly của gen chuyển trên môi trƣờng có
chất kháng sinh chọn lọc ........................................................................................... 31
4.2 Kết quả tách DNA tổng số các dòng cây chuyển gen thế hệ T1 ......................... 32
4.3 Kết quả PCR kiểm tra cây chuyển gen thế hệ T1 ............................................... 34
4.4 Kết quả kiểm tra cây T1 mang gen SSIV............................................................ 35
4.5 Kết quả dựng đƣờng chuẩn ................................................................................. 36
4.6 Kết quả định lƣợng hàm lƣợng tinh bột .............................................................. 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 39
Kết luận ..................................................................................................................... 39
Kiến nghị. .................................................................................................................. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 39


v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lƣợng sắn thế giới,
năm 1995 – 2011 ......................................................................................................... 6
Bảng 2.2 Diện tích, năng suất, sản lƣợng sắn Việt Nam
giai đoạn 1995 - 2014 ................................................................................................ 11
Bảng 2.3 Trồng săn theo khu vực, năm 2012 ........................................................... 12
Bảng 3.1 Danh mục thiết bị sử dụng ......................................................................... 24
Bảng 3.2 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy và chọn lọc
cây thuốc lá chuyển gen ............................................................................................ 26
Bảng 3.3 Thành phần tham gia PCR ......................................................................... 27
Bảng 3.4 Cặp mồi sử dụng để PCR........................................................................... 28

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt cho PCR ............................................................................ 28
Bảng 4.1 Kết quả phân tích kháng kanamicine của cây thuốc lá
chuyển gen T1 lần lƣợt mang cấu trúc SSIV ............................................................ 31
Bảng 4.2 Kết quả đo Nanodrop ................................................................................. 33
Bảng 4.3 Định lƣợng tinh bột.................................................................................... 37


vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cây sắn ( Nguồn www.asiacreative.vn ) ...................................................... 4
Hình 2.2 Diễn biến sản lƣợng sắn thế giới giai đoạn 2005-2010 ............................... 8
Hình 2.3 Diễn biến diện tích và sản lƣợng sắn tại Việt Nam
giai đoạn 2001-2011 (Nguồn: TCTK 2012) ............................................................... 9
Hình 2.4 Dạng Amylopectin của tinh bột .................................................................. 16
Hình 2.5 Dạng Amylose của tinh bột......................................................................... 16
Hình 2.6 Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzym liên quan .......................... 17
Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số ..................................................................... 33
Hình 4.2 Kết quả PCR các dòng thuốc lá chuyển gen .............................................. 34
Hình 4.3 Kết quả nhuộm lá cây thuốc lá với dung dịch lugol .................................. 35
Hình 4.4 Đƣờng chuẩn tinh bột ................................................................................. 36

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT


vii

DNA

Deoxyribonucleic acid

SS

Starch synthase

GBSS

Granule-bound starch synthase

SBE

Starch branching enzyme

Npt

Neomycin phosphotransferase

Hpt

Hygromycin phosphotransferase

FAO

Food and agriculture organization

GUS

β-1,4-glucuronidase

M6P

Manose-6-phosphate

PMI

Phosphomanose isomerase

PCR

Polymerase chain reaction

A.tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

E.coli

Escherichia coli

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

A

Adenine

T

Thymine

C

Cytosine

G

Guanin

EtBr

Ethidium Bromid


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây lƣơng thực hàng năm. Củ sắn có
tỷ lệ chất khô 38 – 40%, tinh bột 16 – 32%, giàu vitamin C, calcium, vitamin
B và các chất khoáng, nghèo chất béo, muối khoáng, vitamin và nghèo đạm.
Trong đó, tinh bột là một glucan không tan, đƣợc cấu thành từ hai chuỗi
polymer bao gồm các tiểu phần là glucose, amylopectin và amylose. Ở thực
vật bậc cao, tinh bột đƣợc tổng hợp trong plastid, là cacbohydrate dự trữ chủ
yếu, tinh bột đóng vai trò quan trọng trong suốt chu kỳ sống của thực vật.
Cây sắn hiện đƣợc trồng trên 100 năm có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt
đới thuộc ba châu lục: châu Á, châu Phi và châu Mỹ La tinh. Sắn đƣợc trồng
chủ yếu bởi các hộ nông dân nhỏ.Sắn đƣợc sử dụng vào nhiều mục đích khác

nhau. Củ sắn cung cấp nguyên liệu thô cho chế biến thức ăn cho gia súc và
làm tinh bột ở quy mô lớn và nhỏ. Tinh bột sắn là một thành phần quan trọng
trong chế độ thức ăn của hơn một tỷ ngƣời trên thế giới và cũng là cây hang
hóa xuất khẩu có giá trị để chế biến bột ngọt, bánh kẹo, mì ăn liền, ván ép, bao
bì, màng phủ sinh học, phụ gia dƣợc phẩm. Đặc biệt trong thời gian tới, sắn là
nguyên liệu chính cho nghành công nghiệp chế biến nhiên liệu sinh học.
Sắn là loại cây lƣơng thực quan trọng ở các nƣớc đang phát triển, sản lƣợng
hàng năm trên thế giới khoảng hơn 200 triệu tấn.Năm 2013, sắn tiếp tục đở mở
rộng sản xuất.
Ở châu Phi sản xuất 147 triệu tấn sắn trên một năm, sắn chiếm tỷ trọng
cao trong cơ cấu lƣơng thực của lục địa này với mức tiêu thụ bình quân
khoảng 96kg/ngƣời/năm. Về mức độ tiêu thụ, Cộng Hòa Dân Chủ Congo là
nƣớc sử dụng sắn nhiều nhất với 391kg/ngƣời/năm.
Đối với tinh bột sắn, mỗi năm Nam Phi cần nhập khẩu khoảng 15 nghìn
tấn.Tinh bột sắn đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm, dƣợc phẩm và sản


2

xuất giấy và tùng các tông. Trong năm 2013, kim nghạch nhập khẩu tinh bột
sắn của Nam Phi đặt 7,4 triệu USD. Theo đó, Thái Lan là nƣớc nhập khẩu
chính sang Nam Phi, đạt 5.9 triệu USD. Tiếp theo là Việt Nam đạt 1.6 triệu
USD, chiếm khoảng 21.6% thị phần.
Sắn, hay còn tên gọi khác là củ khoai mì, đƣợc trồng khá phổ biến ở Việt
Nam và đã từ lâu đƣợc xem là cây lƣơng thực và thức ăn gia súc quan trọng
sau lúa và ngô. Sắn chủ yếu dùng để xuất khẩu (48,6%), kế đến dùng làm
thức ăn gia súc (22,4%), chế biến thủ công (16,8%), chỉ có 12,2% dùng tiêu
thụ tƣơi. Bắt đầu từ những năm 2000, cây sắn đã đƣợc chuyển đổi từ một cây
lƣơng thực sang cây công nghiệp. Sắn có những ƣu điểm phù hợp với các hộ
nông dân nghèo và nhỏ nhƣ: dễ trồng, thích hợp với nhiều loại đất, chịu đƣợc

đất đai nghèo dinh dƣỡng và điều kiện khô hạn.
Tại Việt Nam, sắn đƣợc canh tác phổ biến ở hầu hết các tỉnh từ Bắc đến
Nam. Diện tích trồng nhiều sắn nhất vùng Đông Nam Bộ, vùng Tây Nguyên,
vùng núi và trung du phía bắc, vùng ven biển nam Trung Bộ và vùng ven biển
bắc Trung Bộ. Thông thƣờng, sắn đƣợc trồng chính vụ vào khoảng từ tháng 2
đến tháng 4 và thu hoạch sau khoảng 7-10 tháng tùy thuộc điều kiện từng vùng.
Chính vì giá trị kinh tế, tầm quan trọng nên đã có rất nhiều nghiên cứu
về cây sắn chuyển: Giống sắn SVN3 (KM325) là kết quả chọn dòng tự phối
đời ba của tổ hợp lai SC5 x SC5 theo hƣớng tạo dòng đơn bội kép kỹ thuật
CIAT do nhóm nghiên cứu sắn Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hố Chí
Minh và Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam chọn tạo và khảo
nghiệm, khoai mì chuyển gen kháng African cassava mosaic virus, cây sắn có
gen IPT tạo cytokine, xây dựng quy trinhg biến nạp gen bar – gen kháng
thuốc diệt cỏ vào cây khoai mì bằng phƣơng pháp bắn gen - Trƣờng Đại học
Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQG-HCM,…Ngoài ra còn nhiều nghiên cứu chuyển
gen thực vật mang gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp và tích lũy tinh
bột ở cây sắn. Vì vậy, tôi đề xuất và tiến hành nghiên cứu đề tài: “ ĐÁNH
GIÁ CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN THẾ HỆ T1 MANG GEN SSIV
TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT ”


3

1.2. Mục đích
Đánh giá sƣ̣ biể u hiê ̣n của cây thuố c lá chuyể n gen thế hê ̣ T

1 mang

gen SSIV
1.3. Yêu cầ u

- Tìm hiểu đƣợc cách đánh giá cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 mang
gen SSIV tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột
- Nắm bắt đƣợc các phƣơng pháp đánh giá cây thuốc lá chuyển gen


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cơ sở khoa ho ̣c
Gen SSIV là gen mã hóa cho enzyme starch synthase liên quan sinh
tổng hợp tinh bột. Cây thuốc lá chuyển gen SSIV, thế hệ T1 đƣợc kiểm tra,
đánh giá khả năng tăng cƣờng, tích lũy tinh bột. Kết quả của của khóa luận là
cơ sở đánh giá vai trò của gen SSIV phục vụ cho công tác cải tiến giống sắn
nói riêng và cây trồng nói chung.
2.2. Tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới
Sắn là cây lƣơng thực có sản lƣợng 252,20 triệu tấn) đứng hàng thứ
năm sau ngô (883,46 triệu tấn), lúa gạo (722,76 triệu tấn), lúa mì (704,08 triệu
tấn) khoai tây (374,38 triệu tấn). Sắn đƣợc trồng 66 % ở châu Phi, 20 % ở
châu Á, 14 % ở châu Mỹ Latinh[2]. Hội nghị Sắn toàn cầu tổ chức tại Bỉ năm
2008 đã đƣa ra thông điệp: ―Cây sắn là quà tặng của thế giới, cơ hội cho nông
dân nghèo và thách thức đối với các nhà khoa học‖ [24].

Hình 2.1 Cây sắn ( Nguồn www.asiacreative.vn )


5

Sản lƣợng sắn thế giới năm 2006/07 đạt 226,34 triệu tấn củ tƣơi so với
2005/06 là 211,26 triệu tấn và 1961 là 71,26 triệu tấn. Nƣớc có sản lƣợng sắn

nhiều nhất thế giới là Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu
tấn) và Indonesia (19,92 triệu tấn). Việt Nam đứng thứ mƣời trên thế giới về sản
lƣợng sắn (7,71 triệu tấn). Nƣớc có năng suất sắn cao nhất hiện nay là Ấn Độ
(31,43 tấn/ha), kế đến là Thái Lan (21,09 tấn/ha), so với năng suất sắn bình quân
của thế giới là 12,16 tấn/ha (FAO, 2008).
Mức tiêu thụ sắn bình quân toàn thế giới khoảng 18 kg/ngƣời/năm. Sản
lƣợng sắn của thế giới đƣợc tiêu dùng trong nƣớc khoảng 85% (lƣơng thực
58%, thức ăn gia súc 28%, chế biến công nghiệp 3%, hao hụt 11 %), còn lại
15% (gần 30 triệu tấn) đƣợc xuất khẩu dƣới dạng sắn lát khô, sắn viên và tinh
bột (CIAT, 1993). Nhu cầu sắn làm thức ăn gia súc trên toàn cầu đang giữ
mức độ ổn định trong năm 2006 (FAO, 2007).
Sắn chiếm tỷ trọng cao trong cơ cấu lƣơng thực ở châu Phi, bình quân
khoảng 96 kg/ngƣời/năm. Zaire là nƣớc sử dụng sắn nhiếu nhất với 391
kg/ngƣời/năm (hoặc 1123 calori/ngày). Nhu cầu sắn làm lƣơng thực chủ yếu
tại vùng Saharan châu Phi cả hai dạng củ tƣơi và sản phẩm chế biến ƣớc tính
khoảng 115 triệu tấn, tăng hơn năm 2005 khoảng 1 triệu tấn.
Trung Quốc hiện là nƣớc nhập khẩu sắn nhiều nhất thế giới để làm cồn
sinh học (bio ethanol), tinh bột biến tính (modify starch), thức ăn gia súc và
dùng trong công nghiệp thực phẩm dƣợc liệu. Địa điểm chính tại tỉnh Quảng
Tây. Năm 2005, Trung Quốc đã nhập khẩu 1,03 triệu tấn tinh bột, bột sắn và
3,03 triệu tấn sắn lát, sắn viên. Năm 2006, Trung Quốc đã nhập khẩu 1,15
triệu tấn tinh bột, bột sắn và 3,40 triệu tấn sắn lát và sắn viên.
Thái Lan chiếm trên 85% lƣợng xuất khẩu sắn toàn cầu, kế đến là Indonesia
và Việt Nam. Thị trƣờng xuất khẩu sắn chủ yếu của Thái Lan là Trung Quốc, Đài
Loan, Nhật Bản và cộng đồng châu Âu với tỷ trọng xuất khẩu sắn khoảng 40% bột
và tinh bột sắn, 25% là sắn lát và sắn viên (TTTA, 2006; FAO, 2007).


6

Cây sắn tiếp tục giữ vai trò quan trọng trong nhiều nƣớc châu Á, đặc
biệt là các nƣớc vùng Đông Nam Á nơi cây sắn có tổng diện tích đứng thứ ba
sau lúa và ngô và tổng sản lƣợng đứng thứ ba sau lúa và mía. Chiều hƣớng
sản xuất sắn phụ thuộc vào khả năng cạnh tranh cây trồng. Giải pháp chính là
tăng năng suất sắn bằng áp dụng giống mới và các biện pháp kỹ thuật tiến
bộ[3].
Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lƣợng sắn thế giới, năm 1995 – 2011
Năm

Diện tích
(triệu ha)

Năng suất bình quân
(tấn/ha)

Sản lƣợng
(triệu tấn)

1995

16,43

9,84

161,79

1996

16,25

9,75

158,51

1997

16,05

10,06

161,60

1998

16,56

9,90

164,10

1999

16,56

10,31

170,92

2000

16,86

10,70

177,89

2001

17.71

10,73

184,36

2002

17,31

10,61

183,82

2003

17,59

10,79

189,99

2004

18,51

10,94

202,64

2005

18,69

10,87

203,34

2006

20,50

10,90

224,00

2007

18,49

12,25

226,42

2008

19,11

12,14

232,01

2009

19,05

12,36

235,45

2010

18,92

12,51

236,71

Nguồn: Trần Công Khanh, tổng hợp từ FAOSTAT


7

Năm 2006 đƣợc coi là năm có giá sắn cao đối với cả bột, tinh bột và
sắn lát. Việc xuất khẩu sắn làm thức ăn gia súc sang các nƣớc cộng đồng châu
Âu hiện đã giảm sút nhƣng giá sắn năm 2006 vẫn đƣợc duy trì ở mức cao do
có thị trƣờng lớn tại Trung Quốc và Nhật Bản (FAO, 2007).
Viện Nghiên cứu Chính sách lƣơng thực thế giới (IFPRI), đã tính toán
nhiều mặt và dự báo tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn toàn cầu với tầm nhìn
đến năm 2020. Năm 2020 sản lƣợng sắn toàn cầu ƣớc đạt 275,10 triệu tấn,
trong đó sản xuất sắn chủ yếu ở các nƣớc đang phát triển là 274,7 triệu tấn,
các nƣớc đã phát triển khoảng 0,40 triệu tấn. Mức tiêu thụ sắn ở các nƣớc
đang phát triển dự báo đạt 254,60 triệu tấn so với các nƣớc đã phát triển là
20,5 triệu tấn. Khối lƣợng sản phẩm sắn toàn cầu sử dụng làm lƣơng thực
thực phẩm dự báo nhu cầu là 176,3 triệu tấn và thức ăn gia súc 53,4 triệu tấn.
Tốc độ tăng hàng năm của nhu cầu sử dụng sản phẩm sắn làm lƣơng thực,
thực phẩm và thức ăn gia súc đạt tƣơng ứng là 1,98% và 0,95%. Châu Phi vẫn
là khu vực dẫn đầu sản lƣợng sắn toàn cầu với dự báo sản lƣợng năm 2020 sẽ
đạt 168,6 triệu tấn. Trong đó, khối lƣợng sản phẩm sử dụng làm lƣơng thực
thực phẩm là 77,2%, làm thức ăn gia súc là 4,4%. Châu Mỹ La tinh giai đoạn
1993-2020, ƣớc tốc độ tiêu thụ sản phẩm sắn tăng hàng năm là 1,3%, so với
châu Phi là 2,44% và châu Á là 0,84 - 0,96%. Cây sắn tiếp tục giữ vai trò
quan trọng trong nhiều nƣớc châu Á, đặc biệt là các nƣớc vùng Đông Nam Á
nơi cây sắn có tổng diện tích đứng thứ ba sau lúa và ngô và tổng sản lƣợng
đứng thứ ba sau lúa và mía. Chiều tăng năng suất sắn bằng cách áp dụng
giống mới và các biện pháp kỹ hƣớng sản xuất sắn phụ thuộc vào khả năng
cạnh tranh cây trồng.
Hiện nay, sắn đƣợc trồng tại trên dƣới 100 quốc gia trên toàn thế giới với
các quy mô canh tác rất khác nhau. Sản lƣợng sắn toàn thế giới trong nhiều
năm trở lại đây duy trì tƣơng đối ổn định ở mức sản lƣợng 230 triệu tấn sắn.

8

Hình 2.2 Diễn biến sản lượng sắn thế giới
giai đoạn 2005-2010 (Nguồn FAO 2011)
Năm 2011, tổng sản lƣợng sắn thế giới đạt 250,2 triệu tấn củ tƣơi, tăng
6% so với năm trƣớc. Sự gia tăng sản lƣợng mạnh mẽ này bởi ngành chế biến
công nghiệp nhiên liệu sinh học ethanol sử dụng sắn làm nguyên liệu đầu vào
tại các quốc gia Đông Nam Á cùng với nhu cầu lƣơng thực tăng tại châu Phi.
Trong đó, Nigeria là quốc gia sản xuất sắn hàng đầu thế giới với sản lƣợng hai
năm gần đây (2009-2010) có xu hƣớng giảm xuống đạt khoảng 37 triệu tấn so
với giai đoạn 2006-2008 liên tục đạt trên dƣới 45 triệu tấn. Năm 2011 sản
lƣợng sắn của Nigeria cũng đã hồi phục lên xấp xỉ 40 triệu tấn, tăng 4% so
với năm trƣớc.
Quốc gia có sản lƣợng sắn lớn thứ hai thế giới là Brazil với sản lƣợng
thƣờng niên trong giai đoạn 2009-2010 vào khoảng 24 triệu tấn sắn củ tƣơi,
giảm khoảng 8% so với giai đoạn 2 năm trƣớc đó. Năm 2011, sản lƣợng sắn
của quốc gia này cũng đã hồi phục trở lại lên mức trên 26 triệu tấn, tăng 8%
so với năm trƣớc đó. Indonesia, Cộng hòa Công gô và Thái Lan là ba quốc gia
có sản lƣợng sắn lớn tiếp theo trên thế giới, với sản lƣợng hàng năm trong


9

giai đoạn 2009-2011 vào khoảng 22 triệu tấn củ. Các nƣớc còn lại trong nhóm
10 quốc gia có sản lƣợng sắn hàng đầu thế giới bao gồm Angola, Ghana, Việt
Nam, Ấn Độ, Mozambic. 10 quốc gia sản xuất sắn hàng đầu chiếm 75% tổng
sảnlƣợng sắn toàn thế giới. Tại Thái Lan, Việt Nam và Indonesia, sắn trở
thành một loại cây công nghiệp hàng năm quan trọng và đƣợc thu mua để chế
biến thành các sản phẩm xuất khẩu.

Hình 2.3 Diễn biến diện tích và sản lượng sắn tại Việt Nam
giai đoạn 2001-2011 (Nguồn: TCTK 2012)
2.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn tại Việt Nam
Trƣớc năm 1986, những giống sắn địa phƣơng Gòn, Xanh Vĩnh Phú ...
đƣợc trồng chủ yếu trong sản xuất ở Việt Nam. Các giống này có đặc điểm ăn
tƣơi ngon nhƣng năng suất củ tƣơi thấp (chỉ đạt trên dƣới 10 tấn/ha), tỷ lệ tinh
bột thấp (20 - 25 %). Từ năm 1986 đến năm 1990, Trung tâm Nghiên cứu
Thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc (HARC) đã thu thập, tuyển chọn và
giới thiệu cho sản xuất ba giống sắn HL23, HL20 và HL24 sử dụng chính làm
lƣơng thực và thức ăn gia súc, đạt năng suất củ tƣơi 20 - 23 tấn/ ha, đƣợc canh
tác mỗi năm khoảng 70.000 - 80.000 ha ở các tỉnh phía Nam[1]. Giống sắn


10

Xanh Vĩnh Phú và mô hình canh tác sắn trên đất dốc sớm đã sớm đƣợc
nghiên cứu tại các tỉnh phía Bắc[4]. Cây sắn đã góp phần quan trọng vào an
ninh lƣơng thực, đặc biệt vào các giai đoạn khó khăn của đất nƣớc[5].
Ba nƣớc xuất khẩu sắn hàng đầu của thế giới là Thái Lan,Việt Nam và
Indonesia. Thái Lan chiếm 60- 85% lƣợng xuất khẩu sắn toàn cầu ở những
năm gần đây, kế đến là Indonesia và Việt Nam. Gần đây sắn Campuchia cũng
trở thành một mặt hàng nông sản xuất khẩu triển vọng. Trung Quốc hiện là
nƣớc nhập khẩu sắn nhiều nhất thế giới để làm cồn sinh học, tinh bột biến
tính, thức ăn gia súc và dùng trong công nghiệp thực phẩm dƣợc liệu. Thị
trƣờng xuất khẩu sắn chủ yếu của Thái Lan là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật
Bản và cộng đồng châu Âu với tỷ trọng xuất khẩu sắn khoảng 40% bột và tinh
bột sắn, 25% là sắn lát và sắn viên[7]. Sắn lát và tinh bột sắn Việt Nam hiện là
một trong mƣời mặt hàng xuất khẩu chính. Việt Nam hiện có 13 nhà máy
nhiên liệu sinh học công suất 1067,7 triệu lít cồn sinh học mỗi năm, 66 nhà
máy chế biến tinh bột sắn qui mô công nghiệp, hơn 2000 cơ sở chế biến thủ

công[25].
Sản lƣợng và năng suất sắn Việt Nam đã tăng vƣợt bực trong những
năm gần đây. Sản lƣợng sắn Việt Nam năm 2011 là 9,87 triệu tấn trên diện
tích thu hoạch 559,80 nghìn ha với năng suất bình quân 17,81 tấn/ ha[2].
Tây Ninh là tỉnh điển hình về chuyển đổi năng suất và sản lƣợng sắn
mang lại nguồn lợi lớn cho nông dân và doanh nghiệp chế biến tiêu thu sắn,
có tổng diện tích đất tự nhiên 404.929 ha, trong đó đất nông nghiệp 349.064
ha, với 12 loại đất, trong đó nhóm đất xám bạc màu chiếm tỷ trọng cao nhất
83,04% diện tích tự nhiên, kế đến là nhóm đất phù sa 5,41% và đất đỏ vàng
3,58%. Năm 2011, diện tích lúa cả năm có 155,5 nghìn ha (trong đó lúa đông
xuân 45,8 nghìn ha, hè thu 52,9 nghìn ha, lúa mùa 56,8 nghìn ha) với năng
suất lúa bình quân 48,9 tạ/ ha, sản lƣợng 760,7 nghìn tấn. Sắn, đậu phộng, rau
đậu, mía là những cây trồng chính của tỉnh chiếm tỷ trọng cơ cấu giá trị theo


11

thứ tự là 35,0%, 24,2%, 21,3% và 13%. Cây sắn đã đóng góp lớn trong nguồn
thu nhập của nông hộ. Giống sắn tốt là một trong những nhân tố cơ bản làm
nên bƣớc chuyển biến này. Giống sắn chủ lực trong sản xuất là KM94 chiếm
khoảng 60% diện tích sắn trồng, kế đến là KM98-5 khoảng 40%, giống
KM419 và giống khác khoảng 10% [23].
Bảng 2.2 Diện tích, năng suất, sản lƣợng sắn Việt Nam
giai đoạn 1995 - 2014
Năm

Diện tích
(Nghìn/ha)

Năng suât

(Tấn/ha)

Sản lƣợng
(Triệu tấn)

1995

164,30

9,84

1,62

1996

275,60

7,50

2,06

1997

254,40

9,45

2,40

1998

235,50

7,55

1,77

1999

226,80

7,96

1,80

2000

234,90

8,66

2,03

2001

250,00

8,30

2,07

2002

329,90

12,6

4,15

2003

371,70

14,06

5,23

2004

370,00

14,49

5,36

2005

425,50

15,78

6,72

2006

474,80

16,25

7,77

2007

496,80

16,07

7,98

2008

557,40

16,85

9,30

2009

508.80

16,81

8,56

2010

496,20

17,17

8,52

2011

558,40

17,73

9,89

2012

550.60

17,70

9,74

2013

544,100

18,37

10,00

Nguồn: Tổng hợp từ niên giám thông kê


12

Cây sắn là nguồn thu nhập quan trọng của các hộ nông dân nghèo do
sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tƣ, phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế
nông hộ. Sắn đƣợc trồng rộng rãi từ Bắc vào Nam ở Việt Nam.
Bảng 2.3 Trồng sắn theo khu vực, năm 2012
Diện tích

Năng suất

Sản lƣợng

(Nghàn ha)

(Tấn/ha)

(Nghìn tấn)

550,6

17,7

9.745,5

6,7

15,7

105,1

Trung du và miền núi phía Bắc

117,0

12,7

1.486,5

Bắc trung bộ và duyên hải miền Trung

174,9

17,6

3.027,5

Tây Nguyên

149,5

17,0

2.542,0

Đông Nam Bộ

96,0

25,9

2.485,1

Đồng bằng sông Cửu Long

6,5

15,3

99,3

Khu vực
Cả nƣớc
Đồng bắng sông Hồng

Nguồn: asiacreative.vn
Việt Nam đã trở thành điển hình sắn của châu Á và thế giới trong việc
ứng dụng công nghệ chọn tạo, nhân giống sắn lai và xây dựng mô hình canh
tắc sắn bền vững Nhiều hộ nông dân giỏi nhƣ ông Hồ Sáu (Tây Hòa, Trảng
Bom, Đồng Nai), Tống Quốc Thanh (Sa Nghe, Hảo Đƣớc, Châu Thành,Tây
Ninh), Trần Thị Quyền (Hà Tây), Nguyễn Thị Sáu (Hà Tây), Ngô Trung Kiên

(Phổ Yên),…đã trồng sắn đạt năng suất, lợi nhuận cao liên tục nhiều năm liền
và đã thực sự giàu lên từ cây sắn [21,22].
Các giống sắn mới có năng suất tinh bột cao gấp đôi so với các giống
sắn địa phƣơng đã thực sự mang lại năng suất và lợi nhuận cao cho ngƣời
trồng sắn. Toàn quốc hiện có 8 nhà máy chế biến tinh bột sắn và sản xuất cồn
với tổng công suất ƣớc khoảng 7 triệu tấn củ tƣơi/năm, và 6 nhà máy chế biến


13

nhiên liệu sinh học (ethanol) đang đƣợc triển khai, tạo thuận lợi cho sản xuất
sắn. Các nhà máy này có địa điểm xây dựng trải rộng trên toàn quốc, thuận lợi
cho việc thu mua nguyên liệu và giảm chi phí vận chuyển. Ngòai ra, còn có
trên 4000 cơ sở chế biến sắn lát, tinh bột sắn thủ công có công suất dƣới 10
tấn củ tƣơi/ngày nằm rải rác ở hầu hết các tỉnh trồng sắn, chủ yếu ở các tỉnh
phía Nam nhƣ Tây Ninh, Đồng Nai.
Sản phẩm sắn Việt Nam có nhu cầu cao đối với thị trƣờng xuất khẩu
và tiêu thụ nội địa. Việt Nam hiện sản xuất mỗi năm gần 10 triệu sắn củ tƣơi,
trong đó khoảng 70% dành cho xuất khẩu và 30% cho tiêu thụ trong nƣớc.
Việt Nam hiện đã trở thành nƣớc xuất khẩu tinh bột sắn đứng thứ hai trên thế
giới sau Thái Lan.
Ở cấp quốc gia, sắn đã trở thành một sản phẩm xuất khẩu chủ yếu.
Trong cuộc sống của hàng trăm ngàn, nếu không nói là hàng triệu gia đình sản
xuất nhỏ trong cả nƣớc thông qua các thay đổi về năng suất và lợi nhuận.
Nguồn vật liệu giống sắn từ CIAT thông qua chƣơng trình chọn tạo và nhân
giống đã bao gồm hơn 90% của tất cả diện tích sắn đƣợc trồng hiện nay ở
Việt Nam[8].
2.4. Tinh bột
2.4.1. Cấu tạo
Tinh bột tiếng Hy Lạp là amidon (CTHH: (C6H10O5)n) là một

polysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amyloza và amylopectin, tỷ lệ phần
trăm amilose và amilopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ
này thƣờng từ 20:80 đến 30:70. Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác
nhau có tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau.
Theo những nghiên cứu đã có thì amylosechứa khoảng 0,1% các liên
kết phân nhánh a-l,6~glucoside, amylopectin chứa chủ yếu liên kết a-1,4
nhƣng tỷ lệ liên kết phân nhánh chiếm tới 4%. Amylopectin có phân tử
lƣợngtrong khoảng 107 đến 108, trong khi phân tử lƣợng của amylose chỉ
khoảng từ 5xl05 đến 106.


14

Phân biệt đƣợc amylose và amylopectin nhờ sự khác nhau về khối
lƣợng phân tử cũng nhƣ về khả năng gắn kết đặc hiệu với dung dịch iodíne.
Mạch amylose dài tạo thành một vòng linh động trong nƣớc và có ái lực mạnh
với iodine. Mạch amylose 200 phân tử glucose có khả năng gắn kết với iodine
lớn nhất (khoảng 20% khối lƣợng) ở nhiệt độ 20°c. Phức hợp này hấp thụ
sóng mạnh nhất tại bƣớc sóng 620nm cho màu xanh thẫm. Ai lực của amylose
với iodine phụ thuộc tuyến tính với chiều dài của mạch polymer. Khi chiều
dài mạch của amylose giảm, khả năng gắn của polymei với iodine và bƣớc
sóng hấp thụ mạnh nhất cũng giảm, ở nhiệt độ 20oc, khả năng gắn của
amylopectin vứi iodine chỉ khoảng 0,2% khối lƣợng và phức hợp với iodine
thể hiện hấp thụ mạnh nhất ở bƣớc song 550nm.
Một điểm khác nhau quan trọng giữa amylose và amylopectin là các
chất có thể liên kết với chúng. Bản chất hóa học của amylose cho thấy nó có
thể kết hợp với phân tử các chất kỵ nƣớc nhỏ. Nhiều nghiên cứu cho thấy,
amylose (đặc biệt từ ngũ cốc) có thể kết hợp với một lƣợng tƣơng đối lớn.
Khác với amylose, amylopectin có thể chứa các liên kết cộng hóa trị với
phosphate, đặc biệt là amylopectin từ các loại củ. Trong số những loại tinh

bột có giá trị thƣơng mại cao, tinh bột khoai tây có hàm lƣợng phosphate cao
nhất, khoảng 10-30nmol phosphate trên 1 mg tinh bột. Tinh bột từ củ nghệ có
hàm lƣợng phosphor hóa cao gấp hai đến bốn lần, trong khi ở các loại tinh bột
ngũ cốc, mức độ phosphor hóa thấp hơn 100 lần so với tinh bột khoai tây.
2.4.2. Cấu trúc tinh thể
Tinh bột có bản chất bán tinh thể với nhiều mức độ tinh thể hóa khác
nhau, thƣờng từ 15-45% khi ở dạng hạt. Khả năng tạo tinh thể của tinh bột
gắn liền với thành phần amylopectin, tinh bột không chứa amylose có một
mức độ tinh thể hóa không thay đổi.
Lớp tinh thể của hạt tinh bột đƣợc tạo thành từ mạch xoắn kép
amylopectin, sắp xếp theo phƣơng tiếp tuyến với bề mặt hạt. Các lớp tinh thể và


15

vô định hình đƣợc sắp xếp với chiều dày theo chu kỳ 9-10nm. Trong lớp
tinh thể, các doạn mạch thẳng liên kết với nhau thành các sợi xoắn kép, xếp
thành dây và tạo thành chùm trong khi phần mạch nhánh nằm trong các lớp
vô định hình.
Nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử quét SEM, kính hiển vi điện tử
truyền qua TEM, kính hiển vi nguyên tử và những nghiên cứu enzyme khác
cho thấy các lớp tinh thể và vô định hình cua phân tử amylopectin tập hợp
thành một câu trúc hình cầu lớn. Dựa trên nguồn gốc thực vật của tinh bột và
vị trí của các hạt tinh bột, các hạt hình cầu có thể có kích thƣớc từ 20-500/zm.
Tinh bột bền với các tác dụng của enzyme (tinh bột khoai tây và các loại tinh
bột hàm lƣợng amylose cao) thƣờng chứa các hạt hình cầu có kích thƣớc lớn
hơn so với loại tỉnh bột kém bền đòi với tác dụng của enzyme. Tuy nhiên khả
năng bền với tác dụng của enzyme một phần cũng do hàm lƣợng amylose cao
trong các loại tinh bột này.
Hạt tinh bột đƣợc tạo thành từ các lớp tinh thể cứng (câu trúc tinh thể)

và mềm (cấu trúc bán tinh thể) với độ dày khoảng vài trăm nm. Các lớp tinh
thể cứng đƣợc tạo thành từ các hạt hình cầu có kích thƣớc lớn (50-500/nm),
các lớp bán tinh thế mềm đƣợc tạo thành từ các hạt hình cầu có kích thƣớc
nhỏ hơn (20-50nm). Sự lặp lại hết lớp cứng đến lớp mềm đƣợc xem nhƣ
những lớp sinh trƣởng và có thể quan sát đƣợc nhờ kính hiển vi thông thƣờng.
Độ dày cua các lớp tinh thể này càng ở phía ngoài bề mặt của hạt thì càng trở
nên mỏng hơn. Kích thƣớc của các lớp này phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện
phát triển của cây.
Các enzyme liên quan đến quá trình đồng hóa tinh bột có thế ảnh
hƣởng tới việc tổ chức cấu trúc tinh bột đều dƣợc xem xét nhằm giải thích
việc tạo thành cấu trúc phức tạp đó. Tuy nhiên cho đến nay, những vấn đề
đƣợc phác thảo ở trên cũngchỉ mới đƣợc giải đáp một cách hết sức sơ sài.


16

Hình 2.4 Dạng Amylopectin của tinh bột

Hình 2.5 Dạng Amylose của tinh bột
2.4.3 Nghiên cứu quá sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan
Quá trình tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan bao gồm ba bƣớc quan trọng
xảy ra trong lục lạp và thể vô sắc: i) cung cấp glucose-6-phosphate (Glc-6-P)
vào trong các thể lạp, ii) tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P, và iii)
tổng hợp tinh bột từ ADPG. Nói một cách ngắn gọn, bƣớc đầu tiên không thể
thiếu đƣợc là sự tổng hợp ADPG từ Glc-1-P và ATP đƣợc xúc tác bởi ADPglucose pyrophosphorylase (AGPase). Một khi đƣợc hoạt hóa, starch synthase
(SS) chuyển ADPG tới đầu không khử của α-1,4 glucan để tạo thành các sợi
α-1,4 glucan. Tiếp theo, các sợi α-1,4 glucan đƣợc dùng nhƣ là các cơ chất
cho các enzyme phân nhánh của tinh bột (BE hoặc Q-enzyme) tạo ra các liên
kết sợi α-1,6 là amylopectin. Cuối cùng amylopectin đƣợc tinh thể hóa tạo
thành tinh bột dƣới tác động của các enzyme phân rã (DPE), phosphorylase

(P-enzyme) và glucanotransferase (D-enzyme). Ngoài ra, UDP-glucose:


17

protein glucosyltransferase hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa) cũng đƣợc dự
đoán tham gia vào bƣớc đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột [9].

Hình2.6 Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzym liên quan
( />Việc phân nhánh của amylopectin xảy ra đồng thời với quá trình kéo
dài chuỗi. Quá trình phân nhánh đƣợc xúc tác bởi enzyme phân nhánh (BE).
Enzyme này cắt chuỗi α-l,4-glucan sẵn có và chuyển đoạn cắt mang 6 đơn vị
glucose hoặcnhiều hơn tới vi trí C6 của gốc glucosyl ở chuỗi glucan khác. BE
của thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I và II. Nhóm I vận chuyển các chuỗi
dài hơn. Phân tích di truyền chỉ ra rằng hai nhóm BE có vai trò đặc biệt trong
tổng hợp amylopectin.
Bên ca ̣nh SS và BE còn có các

enzyme khác nhau tham gia vào quá

trình sinh tổng hợp tinh bột. Các enzyme khử phân nhánh - (debranching
enzymes, DBE) làm mất các điểm phân nhánh và quan trọng trong việc quyết
định cấu trúc của amylopectin. Thực vật có hai loại DBE— isoamylase (ISA)
và limitdextrinase (LDA, hay còn gọi là pullulanase). Hai loại này khác nhau
bởi trình tự amino acid và cơ chất. ISA có 3 nhóm - ISA1, ISA2, và ISA3.
ISA1 và ISA2 liên quan chặt với tổng hợp amylopectin. Vai trò cơ bản của
LDA và ISA3 là phân hủy tinh bột. ISA1 hoạt động mạnh nhất khi cơ chất là
các chuỗi glucan tƣơng đối dài nhƣ là các amylopectin bị hòa tan, trong khi
đấy LDA và ISA3 có hoạt tính cao với các chuỗi glucan ngắn nhƣ β-limit