Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------

NGUYỄN KHẮC KHÁNH
Tên đề tài:

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ
cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas
aeruginosa)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành/ngành:

Công nghệ Sinh học

Khoa

:

CNSH & CNTP

Khóa học

:

2012-2016

Thái Nguyên - 2016


i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------

NGUYỄN KHẮC KHÁNH
Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN
NHANH VÀ ĐỒNG THỜI TỤ CẦU VÀNG (Staphylococcus aureus
VÀ TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Psedomonas aeruginosa)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành/Ngành: Công nghệ Sinh học
Lớp

: K44-CNSH

Khoa

: CNSH & CNTP

Khóa học

: 2012-2016

Giảng viên hƣớng dẫn:

BS. NGUYỄN THỊ HUYỀN
TS. NGUYỄN VĂN DUY

Thái Nguyên, năm 2016


ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc tới TS. Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến BS. Nguyễn Thị Huyền,
Trưởng khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên,
KTV. Nguyễn Thị Thủy, CN. Trần Trung Anh, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện
Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên đã hỗ trợ,giúp đỡ tôi và đã cung cấp các
chủng sinh vật để thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm thuộc khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm

Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn những người bạn đã luôn ở bên cạnh động
viên và giúp đỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành khóa luận.
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Khắc Khánh


iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 23
Bảng 3.2. Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu................................ 23
Bảng 3.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 24
Bảng 4.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng multilplex PCR trên các mẫu thu
thập tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên ................................... 40


iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Hình ảnh hiển tế bào Staphylococcus aureus .................................... 5
Hình 2.2. Hình ảnh khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa .................................. 9
Hình 4.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số của các chủng S.
aureus (A) và các chủng P. aeruginosa (B) ..................................................... 29
Hình 4.2. Kết quả điện di kiểm tra khả năng khuếch đại gen mục tiêu của các
cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .................................................................. 31

Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở các điều kiện phản ứng
khác nhau......................................................................................................... 33
Hình 4.4 . Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR sử
dụng khuôn của chủng S. aureus và P. aeruginosa ......................................... 35
Hình 4.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR ở
các nồng độ DNA pha loãng khác nhau.......................................................... 37
Hình 4.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khi sử dụng các khuôn khác
nhau ................................................................................................................. 38


v

MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài.......................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 2
1.2.2. Yêu cầu của đề tài: .................................................................................. 2
1.3. Ý nghĩa đề tài ............................................................................................. 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
2.1.Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa4
2.1.1. Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus ........................................... 4
2.1.2. Giới thiệu chung về Pseumonase aeruginosa .......................................... 9
2.2. Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus và Pseudomonas
aeruginosa trong nước và trên thế giới............................................................ 12
2.2.1. Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus .................................. 12
2.2.2. Tình hình nghiên cứu về Pseudomonas aeruginosa .............................. 14
2.3. Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Pseudomonas

aeruginosa........................................................................................................ 17
2.3.1. Phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus .................................... 17
2.3.1.3. Phương pháp PCR (polymerase chain reaction). ............................... 18
2.3.2. Các phương pháp xác định Pseudomonas aeruginosa .......................... 19
2.4.Tổng quan về kỹ thuật multiplex PCR ...................................................... 20
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 22
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 22


vi

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 22
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu. .............................................................................. 22
3.2. Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu ................................................. 22
3.2.1.Địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 22
3.2.2.Thời gian nghiên cứu ............................................................................. 22
3.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 22
3.3.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài. ......................................................... 22
3.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài ............................................................... 23
3.3.3. Dụng cụ thiết bị sử dụng trong qua trình thực hiện đề tài. ................... 24
3.4. Nội dung nghiên cứu. ............................................................................... 24
3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 25
3.5.1. Phương pháp tách chiết DNA ............................................................... 25
3.5.2. Phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus
aureus và Pseudomonas aeruginosa ................................................................ 26
3.5.3. Phương pháp xác định nồng độ tế bào .................................................. 27
3.5.3. Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR
......................................................................................................................... 27
3.5.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR. ............................ 28

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 29
4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn nghiên cứu..... 29
4.2. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời S. aureus và P.
aeruginosa bằng kỹ thuật multiplex PCR........................................................ 30
4.2.1. Kết quả thử nghiệm khả năng khuếch đại gen mục tiêu của các cặp mồi
sử dụng trong nghiên cứu ................................................................................ 30
4.2.2. Kết quả xác định điều kiện chung của phản ứng PCR sử dụng các cặp
mồi riêng rẽ ..................................................................................................... 32


vii

4.2.3. Kết quả thử nghiệm khả năng khuếch đại của phản ứng multiplex PCR
......................................................................................................................... 35
4.2.4. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR ....... 36
4.2.5. Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR ................ 38
4.3. Kết quả thử nghiệm phát hiện nhanh và đồng thời S. aureus và P.
aeruginosa từ mẫu thu thập tại bệnh viện ....................................................... 39
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 41
5.1. Kết luận .................................................................................................... 41
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 42


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) là một trong những thách thức và mối

tuân tâm hàng đầu tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới. Những nghiên
cứu gần đây cho thấy NKBV làm tăng tỷ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm
viện, tăng việc sử dụng kháng sinh, tăng đề kháng kháng sinh và tăng chi phí
điều trị. Thống kê cho thấy tỷ lNKBV khoảng 5-10% các nước phát triển và ở
một số nước đang phát triển tỷ lệ này lên đến 25% [30] và tỷ lệ này còn cao
hơn ở các khoa Hồi Sức Tích Cực. NKBV cũng làm gia tăng tỷ lệ tử vong
bệnh viện. Tại Cộng đồng Châu Âu, tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng bệnh viện
là 37.000 ca/năm [14] , còn tại Mỹ tỷ lệ này lên tới 99.000 ca/năm. Các bệnh
nguyên gây NKBV có mức độ đề kháng kháng sinh cao hơn với các bệnh
nguyên gây nhiễm khuẩn cộng đồng, đồng thời các NKBV có thời gian nằm
viện trung bình dài hơn, từ 7-14 ngày. Do đó, chi phí cho NKBV thường tăng
gấp 2-4 lần so với các trường hợp không NKBV. Chi phí phát sinh do NKBV
tại Anh quốc là khoảng 1 tỷ USD còn tại Mỹ là 28-45 tỷ USD[11].
Staphylococcsu aureus và Pseudomonas aeruginosa đang là hai trong 6 tác
nhân gây nhiễm trùng bệnh viện phổ biến hiện nay. Ngoài ra việc thực hiện
các quy trình phát hiện S. aureus và P. aeruginosa chủ yếu hiện nay bằng
phương pháp vi sinh. Phương pháp này thực hiện phức tạp qua nhiều công
đoạn nuôi cấy và kiểm tra sản phẩm thu được gặp khó khăn và có khả năng
nhầm lẫn các loại vi sinh vật với nhau. Trong khi đó việc xác định nhanh và
chính xác loại vi sinh vật góp phần giảm nguyên nhân lây lan trong cộng
đồng.
Với trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng hiện đại kéo theo đó con người
ngày càng am hiểu hơn và giải thích rõ ràng các quan điểm và kỹ thuật về


2

sinh học phân tử. Qua đây việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào
các lĩnh vực của đời sống ngày càng rộng rãi, đặc biệt sinh học phân tử đã và
đang được ứng dụng mạnh mẽ vào lĩnh vực y khoa mang lại chẩn đoán chính

xác và nhanh chóng xác định đúng vi sinh vật gây bệnh. Một số kỹ thuật sinh
học phân tử được ứng dụng rộng rãi như : kỹ thuật PCR, kỹ thuật multiplex
PCR, ELISA...trong đó kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu cao và thời gian cho kết
quả nhanh chóng đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn và dựa trên điều kiện cơ sở vật chất của
khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại Học Nông
Lâm Thái Nguyên tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu
ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu
vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas
aeruginosa).”
1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục tiêu của đề tài
Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng
(Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)
bằng kỹ thuật multiplex PCR.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài:
- Tách chiết được DNA tổng số của các chủng vi khuẩn S. aureus và P.
aeruginnosa.
- Tối ưu được phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S.
aureus và P. aeruginosa
- Thử nghiệm thành công phản ứng multiplex PCR trên các mẫu vi
khuẩn phân lập tại Bệnh viện.


3

1.3. Ý nghĩa đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho việc xây dựng bộ kít phát hiện nhanh
và đồng thời tụ cầu vàng (S. aureus) và trực trùng mủ xanh (P. aeruginosa).

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng vào công việc chẩn đoán
nhanh sự nhiễm trùng S. aureus và P. aeruginosa trong lĩnh vực y tế.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa
2.1.1. Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus lần đầu tiên được Scotland Alexander Ogston đề
cập đến tại Hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức năm 1881.
Staphylococcus aureus lần đầu tiên được phân lập và phát hiện bởi Robert
Koch năm 1878 từ mủ ung nhọt. Đến năm 1926, Julius von Daranyi đã hiện
ra sự tương quan giữa khả năng gây bệnh của S. aureus với sự có mặt của
enzyme coagulase huyết tương của vi khuẩn [1].
2.1.1.1. Danh pháp, phân loại
Staphylococcus aureus thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp
Bacilli, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, chi Staphylococcus, loài
Staphylococcus aureus tên khoa học là Staphylococcus aureus [36]
ưStaphylococcus aureus được phân loại chủ yếu theo hai cách sau:
- Dựa vào kháng nguyên: dựa vào hiện tượng ngưng kết với huyết thanh,
các nhà khoa học đã chia S. aureus thành 18 kiểu huyết thanh. Ngoài ra, có
thể dựa vào phương pháp miễn dịch học để chia S. aureus thành kháng
nguyên polysaccharide A ở vách và kháng nguyên protein ở ngoài vách.
- Dựa vào sự xâm nhiễm đặc hiệu của phage, S. aureus được chia thành
các nhóm sau: Nhóm I gồm các kiểu huyết thanh 29, 52, 52A, 79 và 80; nhóm
II gồm các kiểu huyết thanh 3A, 3B, 3C, 55và 71; Nhóm III: gồm các kiểu

huyết thanh 6, 7, 42E, 47, 53, 54, 75, 77, 83A, 84 và 85; và nhóm IV chỉ có 1
kiểu huyết thanh 42D [37].


5

2.1.1.2. Hình thái và cấu tạo của Staphylococcus aureus
Staphylococcus là những vi khuẩn Gram dương hình cầu và không di
động với đường kính khoảng 0,5-1,5μm. Tế bào Staphylococcus xếp hình
chùm nho không di động , vi khuẩn này có thành tế bào kháng với lysozyme
và khá nhạy với lysotaphin, ngoài ra vi khuẩn này không sinh bào tử và cư trú
trên da và màng nhày của con người cũng như động vật máu nóng [37].

Hình 2.1. Hình ảnh hiển tế bào Staphylococcus aureus
(Nguồn: Wikipedia ( />Ngày nay các nhà khoa học đã thành công trong việc giải trình tự gen
của các chủng tụ cầu vàng được ký hiệu như sau: Newman, COL,
UMRSA252, MW2, MSSA476, N315, Mu50, RF122 ... Steven cùng cộng sự
đã giải trình tự thành công bộ gen của chủng S.aureus COL với kích thước
2809422 bp, kết quả này đã được đăng ký trên Genbank với mã số :
CP000046.1 cho hệ gen và CP000045 cho hệ gen plasmid. Theo kết quả này
thì bộ gen của S. aureus có chứa ít các cặp G-C điều này đã làm nảy sinh mối
lo ngại về sự chuyển gen giữa tụ cầu vàng và các tác nhân gây bệnh gram
dương khác [41] Trong số các chủng S.aureus phân lập từ các mẫu thực
phẩm, tỷ lệ chủng có khả năng sản sinh nội độc tố enterotoxin do nhóm gen


6

SE mã hóa được ước tính chiếm khoảng 25% số chủng, tại Pháp trong số 332
chủng S.aureus được phân lập từ thức ăn có 57% chủng có chứa các gen mã hóa

nội độc tố SEG, SEB, SEI, SEJ suất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen
nội độc tố SEA và SEE mà trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế [32].
2.1.1.3. Đặc điểm sinh học của Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có
enzyme catalase phân giải hydro peroxid (H2O2), giải phóng oxy và nước theo
phản ứng sau:

Catalase
H2O2

H2O + O2

Ngoài ra, S. aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do
chúng tiết ra enzyme coagulase. Có thể xem việc S. aureus có phản ứng đông
huyết tương là tính chất đặc trưng của S. aureus, cũng là tiêu chuẩn để phân
biệt S.aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase: coagulase “cố định”
(“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase “tự do” (“free”
coagulase) được phóng thích ra ngoài thành tế bào. Có hai phương pháp để
thực hiện kiểm tra coagulase là thử nghiệm trên lam kính và trong ống nghiệm.
Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase “cố định” do phản ứng
trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiện những coagulase
“tự do” do phản ứng dán tiếp với fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố
khác trong huyết tương [27]. S.aureus còn phản ứng với DNase, phosphatase
dương tính, có thể lên men và sinh axit từ manitol, trehalose, sucrose. Tất cả
các dòng S.aureus đều nhạy với Novobicine(kháng sinh có thành phần là
spiramycin), có thể tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% muối NaCl
[27].Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc của S.aureus có mầu đen
nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng
25mm ( do khả năng khử potassium tellurite (K2TeO3) và khả năng thủy phân
lòng đỏ trứng của enzyme lethinase) [27]. Trên môi trường MSA (Manitol salt

7

agar), khuẩn lạc của S.aureus tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng
đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường
manitol) [27].
2.1.1.4.Đặc tính và các yếu tố độc lực
Trên lâm sàng việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh và
không gây bệnh thường dựa vào sự hiện diện của enzyme Coagulase, enzyme
này gắn với prothrompin trong huyết tương và hoạt tính hóa quá trình sinh
fibrin từ tiền chất fibinogen. Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm( clumping)
một enzyme vách vi khuẩn giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của
nó. Tính chất này là yếu tố bệnh sinh cực kỳ quan trongjvaf yếu tố cũng đóng
vai trò quan trọng trong chẩn đoán. Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố
độc tố độc lực khác có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn như :
Vỏ polysaccharide: một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ
polysaccharide vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ tế bào vi
khuẩn chống lại hiện tượng thực bào.
Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng tổng hợp một loại
protein bề mặt có khả năng gắn với mảnh thụ thể (Fc) của các glubuline miễn
dịch, chính nhờ hiện tượng này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh
Fc của các globuline miễn dịch có vai trò trong hiện tượng opsonin hóa chúng
là các receptor cho các đại thực bào. Qúa trình gắn trên giúp tụ cầu vàng tránh
tránh không bị thực bào
Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng sản xuất một
chất kết dính gian bào , nhờ chất này vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học
bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc.
Các yếu tố độc lực ngoại bào, tụ cầu vàng còn sản sinh một số enzyme
quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này như:

8

Hyaluronidase: enzyme này có khả năng phá hủy chất cơ bản của tổ
chức giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức
Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu và gây chết các tế bào hạt
cũng như tế bào bạch cầu.
Exfoliatine: là các enzyme phá hủy lớp thượng bì enzyme này gây tổn
thương da tạo các bọng nước
Năm độc tố ruột(Enterotoxine A, B, C, D, E) bền với nhiệt các độc tố
này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm
Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc: là nguyên nhân gây nên hội chứng
sốc nhiễm độc đay là một hội chứng sốc trầm trọng
2.1.1.5. Cơ chế gây bệnh
Đầu tiên, trong quá trình tiếp xúc giữa tác nhân gây bệnh và vật
chủ là sự bám dính của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ các bề
mặt này bao gồm: da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) và
các tổ chức sâu hơn (tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang
và tổ chức nội mô). Staphylococcus aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ
các adhensin có bản chất polypeptide. Hơn nữa, S.aureus mới có khả năng
khởi động các quá trình sinh hóa đặc hiệu như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm
nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu tế bào vật chủ. Staphylococcus aureus
xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một vài enzyme như hyaluronidase,
hemolysin, leukocidin… phá hủy thành phần tế bào vật chủ. Hầu hết các
chủng S.aureus đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A)
có khả năng gắn với mảnh Fc (thụ thể) của các globuline miễn dịch. Dựa vào
hịên tượng gắn độc này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của
các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin
hóa, chúng là các receptor cho các đại thực bào. Dựa vào quá trình gắn trên

giúp S. aureus tránh không bị đại thực bào.


9

2.1.2. Giới thiệu chung về Pseumonase aeruginosa
2.1.2.1. Danh pháp, phân loại
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn thuộc giới Vi khuẩn (Bacteria),
ngành Proteobacteria, lớp Gamma Proteobacteria, bộ Pseudomonadales, họ
Pseudomonadaceae, chi Pseudomonas, loài Pseudomonas aeruginosa [38].
2.1.2.2. Hình thái và cấu tạo
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn gram âm hiếu khí với khả năng di
chuyển một cực và có hình que . Ngoài khả năng gây bệnh cho người và động
vật thì P.aeruginosa còn có khả năng gây bệnh trên các loài thực vật .
Pseudomonas aeruginosa có vẻ ngoài được mô tả óng ánh và có mùi giông
như nho khi được nuôi cấy in vitro.Ngoài ra, P.aeruginosa có khả năng sinh
trưởng trong môi trường thiếu một phần hay hoàn toàn khí oxy [39].

Hình 2.2. Hình ảnh khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa
(Nguồn:wikipedia( />2.1.2.3. Đặc điểm sinh học
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram âm hiếu khí, là trực khuẩn
với hai đầu tròn không có vỏ và nha bào, có lông roi ở một đầu nên di động
nhanh . Pseudomonas aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi trường thông
thường với nhiệt độ thích hợp là 37 °C , pH = 7,2 - 7,5. Ở môi trường lỏng P.
aeruginosa phát triển làm đục đều và trên bề mặt có váng, ở môi trường rắn
tạo nên khuẩn lạc dạng S tròn đều, to nhẵn, có loại khuẩn lạc nhỏ sù xì, dạng


10

R . Một đặc điểm quan trọng là P. aeruginosa khi nuôi cấy sinh sắc tố. Có 2
loại sắc tố gồm loại xanh lam pyocianin ở môi trường có thể tan trong nước
và clorofooc và sắc tố huỳnh quang pyoverdin khi ta chiếu tia cực tím. Vi
khuẩn tiết ra chất kimetylamin có mùi thơm đặc biệt [33].
Pseudomonas aeruginosa là một trong những vi khuẩn gây bệnh ở
động vật và con người, nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên
da và các môi trường nhân tạo. Vi khuẩn này không những sống trong môi
trường không khí mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí oxy, vì vậy
nó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo, vi khuẩn này
phát triển bằng rất nhiều các chất hữu cơ. Vì cơ chế thích ứng dễ dàng nó có
thể sống và gây bệnh cho các mô, tế bào của người suy giảm miễn dịch, triệu
chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm tại vị trí
xâm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào cơ quan thiết
yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu, thận sẽ gây ra những tử vong cao
bởi vi khuẩn này phát triển tốt trên bề mặt niêm mạc bên trong cơ thể. Bên
cạnh đó vi khuẩn này phát triển tốt trên các dụng cụ y khoa gây ra viêm
nhiễm và lây lan vi khuẩn trong bệnh viện.
2.1.2.4. Cơ chế gây bệnh
Trực khuẩn mủ xanh từ môi trường bên ngoài xâm nhập vào cơ thể qua
các vết thương hở (nhất là vết thương do bỏng). Tại chỗ xâm nhập, chúng gây
viêm có mủ( mủ thường có màu xanh) nếu như cơ thể vật chủ suy giảm sức
đề kháng P.aeruginosa xâm nhập và gây viêm các phủ tạng (xương, đường
tiết niệu, tai giữa, phế quản...) hoặc có thể gây bệnh toàn thân. Về sinh bênh
học ,có giả thuyết cho rằng các sản phẩm ngoại tiết như sắc tế, độc tố tan
máu, độc tố ruột, ngoại độc tố A (độc tố gây chết) có vai trò chính. Vi khuẩn
có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại tiết, các enzyme này đóng vai trò quan
trọng trong quá trình xâm nhập, gây bệnh tại chỗ


11

- Protease: gần 90% các chủng P.aeruginosacó khả năng phân giải
protein. P. aeruginosatiết ra 2 loại protease quan trọng là alcaline và elastase.
Nhiều chủng tiết ra collagenase. Các protease này thường có tác dụng hiệp
đồng. Elastase có thể phá hủy lớp chun keo thành mạch máu gây tổn thương
xuất huyết, tạo nên những ổ hoại tử trong thành mạch máu. Enzyme này còn
gây ức chế hiện tượng opsonin hoá, làm giảm khả năng thực bào của bạch cầu
đa nhân trung tính. Ngoài tác động trực tiếp, các protease còn có khả năng
làm thay đổi sức đề kháng của vật chủ thông qua việc bất hoạt bổ thể, phá hủy
cấu trúc của các globulin miễn dịch.
- Hemolysine có 2 loại gồm: Glycolipide (hemolysine chịu nhiệt): không
có tính enzyme, không có tính kháng nguyên và ít độc. Glycolipide đóng vai
trò như một chất tẩy hoà tan các lipid là những chất cần cho hoạt động của
phospholipase C và Phospholipase C (hemolysine không chịu nhiệt): là một
enzyme tan máu nằm trong một polypeptid đơn. Phospholipase C thường tác
động hiệp đồng với glycolipide và protease alcaline gây xuất huyết, hoại tử tại
chỗ tổn thương.
- Cytotoxine (leucocidin): là một protein rất độc với bạch cầu đa nhân
trung tính và các tế bào lympho.
- Exoenzyme S: là một protein, có thể có 2 dạng: dạng không hoạt động
và không có tính enzyme và dạng hoạt động, có tính enzyme.
- Enterotoxin và yếu tố thấm qua thành mạch: các độc tố này còn ít được
biết đến. Một số nghiên cứu đã chứng minh, trong thực nghiệm
enterotoxin gây nên tình trạng ứ dịch trong đường ruột; độc tố này có thể
là một trong những nguyên nhân gây viêm ruột non. Khi gây nhiễm qua
da, yếu tố này có thể thấm vào trong lòng mạch, gây ban đỏ kèm theo xuất
huyết ra ngoài lòng mạch.


12

2.2. Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus và Pseudomonas
aeruginosa trong nƣớc và trên thế giới
2.2.1. Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus
2.2.1.1. Trong nước
Ở Việt Nam tình hình nhiễm S.aureus là rất đáng lo ngại. Tỷ lệ dương
tính với tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và tụ cầu vàng kháng
Methicillin (MRSA) cũng giảm rõ rệt ở năm 2014 so với năm 2013: 4,14% vs
14,88% và 2,76% vs 6,61%. Chủ yếu gặp ở các bệnh phẩm mủ được gởi từ
Phòng mổ tại bệnh viện Đa khoa Tỉnh Bình Định tỷ lệ gặp của tụ cầu vàng
năm 2012 là 6,2% .Một điểm nổi bật chúng tôi nhận thấy trong năm 2013 có
13 ca cấy mủ của các bệnh phẩm ở các cơ quan khác nhau của những bệnh
nhân khác nhau từ Phòng mổ đều cho kết quả dương tính với tụ cầu vàng
và kết quả kháng sinh đồ cũng giống hệt nhau về độ nhạy cảm. Theo một
báo cáo của TS.BS Bùi Nghĩa Thịnh và cộng sự khi khảo sát tình hình đề
kháng kháng sinh của vi khuẩn tại khoa hồi sức tích cực và chống độc Bệnh
Viện Trưng Vương cho thấy khi khảo sát các mẫu bệnh phẩm dương tính,
chúng tôi nhận thấy 5 vi khuẩn hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viên là
Acinetobacter baumannii (32,3%), S.aureu 15,4%, Klebsiellaspp. (13,8%),
E.coli (9,7%), P. aeruginosa (7,7%). Trong đó Acinetobacter baumannii
được phân lập chủyếu tại bệnh phẩm đàm (39,3%), và cũng là nguyên
nhân gây bệnh tại phổi nhiều nhất. Staphylococcus aureus chủ yếu được
phân lập trong máu (40%) và Enterococcus spp. được phân lập chủ y ếu
trong nước tiểu (35%).
Ngoài ra, S. aureus còn nhiễm vào trong thực phẩm với tính chất khá
nghiêm trọng, vào năm 1974 tỷ lệ nhiễm S. aureus là 12% trong tổng số các
vụ ngộ độc thực phẩm thì đến năm 1995 con số này đã tăng lên 22%, năm
2004 lên đến 63%.Theo báo cáo của bộ y tế năm 2006 đã sảy ra tổng cộng 35

13

vụ ngộ độc thức ăn trong cả nước. Trong tổng số 25 vụ ngộ độc tập thể thì có
11 vụ xảy ra trong các trường học, trong dó có đến 9 thủ phạm do nhiễm
S.aureus. Đặc biệt cũng trong năm 2006 đã xảy ra 1 vụ nhiễm S. aureus ở trẻ
em, điều tra cho thấy 2/6 trẻ bị sốc vacxin có nhiễm S. Aureus [4]. Trong năm
2007 nước ta có 2 vụ ngộ độc thực phẩm tập thể và thủ phạm là S. aureus.
Vào tháng 9 năm 2007 ở tỉnh Phú Thọ xảy ra 1 vụ ngộ độc tập thể với gần
100 học sinh tại trường mầm non Vĩnh Lại bị ngộ độc thực phẩm do nhiễm t.
aureus. Vào tháng 12 năm 2007 tại thành phố Hồ Chí Minh xảy ra 2 vụ ngộ
độc thực phẩm tập thể, điều chú ý là 2 vụ ngộ độc này đều xảy ra trong trường
học do nhiễm S. aureus.Trong đó, có 31 em tại trường tiểu học Âu Cơ và 44
em tại trường mầm non Vường Hồng[4]. Trong năm 2009 trên cả nước có
tổng cộng 116 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có 6 vụ do nhiễm S. aureus.
Đáng chú ý vào tháng 7 năm 2009 tại Hải Dương đã xảy ra 1 vụ ngộ độc do
nhiễm S. aureus và số người bị ngộ độc trong vụ này lên tới 258 người. Từ
năm 2010 đến nay cả nước có 67 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó có 5 vụ là
do S.aureus gây nên[4].
2.2.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về Staphylococcus aureus
Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng
70% tổng số ca ngộ độc thực phẩm. Ở các nước châu Á S. aureus là nguyên
nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc. Tại châu Mỹ tiêu biểu là Hoa Kỳ những
vụ ngộ độc thực phẩm chủ yếu đều do S.aureus gây ra, theo thống kê cho thấy
từ 1972-1976 ngộ độc S. aureus chiếm 21,4% trong tổng số các vụ ngộ độc.
Từ năm 1983-1987 con số này thấp hơn với chỉ 5,2%. Theo một thống kê
mới nhất thì đến tháng 9 năm 2009 Hoa Kỳ có 32 vụ ngộ độc thực phẩm có
thủ phạm chính là . aureus chiếm 10,3% trong tổng số các vụ ngộ độc[4].Các
đánh giá gần đây cho thấy tại Hoa Kỳ hàng năm có khoảng 48000 người tử
vong vì S. aureus. Ước tính có khoảng 19000 người mĩ tử vong vì S. aureus

14

trong năm 2005, Ở châu Á các vụ nhiễm S. aureus chủ yếu ở các nước Nhật
Bản, Trung Quốc và trong và trong khu vực Đông Nam Á...[4]. Tại Trung
Quốc trong năm 2008 đã sảy ra một vụ ngộ độc ở trẻ em vì uống sữa có chứa
S.aureus. Còn ở Nhật Bản cũng đã có 2 vụ ngộ độc S.aureus lớn vào tháng 8
năm 1955 làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5 trường tiểu học ở Tokyo
vào tháng 6 năm 2006 làm 14780 người bị ngộ độc ở vùng Kansai. Nguyên
nhân của hai vụ ngộ độc này đều do họ đã uống sữa có chứa S.aureus của tập
đoàn Snow[4]. Tại khu vực Đông Nam Á 2 quốc gia có tỉ lệ ngộ độc S.
aureus cao là Indonesia và philippines. Việt Nam cũng là một trong những
nước có tỉ lệ nhiễm S.aureus cao ở trong khu vực Châu Á. Còn ở châu Âu
S.aureus chủ yếu lây nhiễm cho người từ các bệnh viện, tỷ lệ nhiễm S.aureus
chiếm 7% trong các vụ nhiễm khuẩn huyết tại bệnh viện. Ở các vụ nhiễm
khuẩn huyết ở Anh thì nhiễm khuẩn do S.aureus chiếm đến 96%.
2.2.2. Tình hình nghiên cứu về Pseudomonas aeruginosa
2.2.2.1. Trong nước
Hầu hết khả năng gây bệnh và tính đề kháng kháng sinh của loại vi
khuẩn này chủ yếu được phân lập trên bệnh phẩm do nhiễm trùng vết thương.
Quá trình theo dõi mức độ đề kháng trong năm 1997 của Võ Thị Chi Mai và
cộng sự trên các tác nhân trong nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hô
hấp và nhiễm khuẩn đường tiết niệu thì P.aeruginosa là tác nhân chính gây
nhiễm khuẩn. Ngoài ra, hầu hết trong số 374 chủng trực trùng mủ xanh phân
lập được có 16 chủng phân lập từ mẫu máu (16 mẫu), 47chủng từ mẫu nước
tiểu và 331 mẫu phân lập từ đờm kháng lại nhiều loại kháng sinh. Báo cáo về
tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện đa khoa (BVĐK) tỉnh Quảng
Ngãi và bệnh viện đa khoa khu vực Bồng Sơn từ năm 2003-2004 cho thấy P.
aeruginosa sếp thứ 3 với tỷ lệ 18,8%, chủ yếu ở bệnh phẩm mủ, chỉ nhạy với
amikacin, axepim, ceftazidin, ceftriaxon. Kết quả mẫu nước y tế tại 2 bệnh

15

viện cho kết quả: năm 2003 mẫu nước tại BVĐK khu vực Bồng Sơn không có
vi khuẩn gây bệnh, năm 2004 mẫu nước ngâm dây máy hút, rửa tay, nước tắm
trẻ em sơ sinh lấy từ sô đựng nước của cả 2 bệnh viện đều bị nhiễm P.
aeruginosa và P.aeruginosa kháng thuốc. Hai loại vi khuẩn gây bệnh trong
mẫu nước chủ yếu là P. aeruginosa (71,4%) và trực khuẩn đường ruột gram
âm (28,6%) [8]. Trong một báo cáo của Lê Bảo Huy và cộng sự, tác nhân gây
bệnh viêm phổi bệnh viện đa phần là vi khuẩn Gram âm chiếm 86,15%, trong
đó P. aeruginosa chiếm 41,15%. Vi khuẩn này có sức đề kháng khá cao đối
với những kháng sinh chuyên dùng để trị và hay dùng ở Việt Nam (nhất là các
khoa ICU: khoa điều trị tích cực): imipenem (66,7%), ticarcillin/a.clavulanic
(45%), ceftazidime (74,1%), cefepime (77,8%), ciprofloxacin (96,3%) [5].
Ngoài ra theo một báo cáo Nguyễn Thị Thu Ba và cộng sự (2014) thì riêng
với vi khuẩn Pseudomonas spp. và P. aeruginosa tỷ lệ gặp ở năm 2014 cao
hơn so với năm 2013, tính chung cho cả hai loại là 7,59% vs 4,96%. Chủ yếu
gặp ở bệnh phẩm đàm từ Khoa Hồi Sức Cấp Cứu và Phòng mổ. Tại BV Đa
khoa Tỉnh Bình Định tỷ lệ gặp chung cho Pseudomonas năm 2012 là 9,6%(
theo báo cáo của Nguyễn Thị Thu Ba và cộng sự).
Riêng đối với VK Pseudomonas, nếu công tác vệ sinh bệnh phòng
không tuân thủ, đặc biệt tải lau nhà không được giặt sạch và phơi khô thì cũng
góp phần vào việc làm lây lan VK Pseudomonas trong bệnh viện . Nội dung
này cần được Khoa KSNK giám sát và nhắc nhở thường xuyên cho đơn vị vệ
sinh bệnh viện.
2.2.2.2. Trên thế giới
Lateef A. (2005), đã khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các
mẫu bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P. aeruginosa đã có mặt
trong các mẫu bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông,

nước giếng và nước máy). Kết quả: 3,46% P.aeruginosa phân lập từ đất đề


16

kháng với 5 loại kháng sinh. Trong bệnh phẩm, 7,69% đề kháng 6 loại kháng
sinh, 30,77% đề kháng 7 loại kháng sinh, 23,1% đề kháng với 8 loại kháng
sinh (ampicillin, chloramphenicol, cloxacillin, erythromycin, penicillin,
tetracycline, streptomycin, gentamicin). Trong dược phẩm, loại vi khuẩn này
cũng có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh từ 2, 4 đến 8 loại kháng sinh khác
nhau (augmentin, amoxycillin, tetracycline, cotrimoxazole, nalidixic acid,
ofloxacin, nitrofurantoin). Trong nước, 6,7% P.aeruginosa kháng lại 4 loại
kháng sinh, 8,5% kháng với 5 loại kháng sinh (augmentin, amoxycillin,
tetracycline, cloxacillin, cotrimoxazole)[21]. Ngoài ra, một số nghiên cứu
khác trên bệnh phẩm cũng cho thấy khả năng đề kháng kháng sinh của
P.aeruginosa khá cao. Gales A. C. (1997-1999), 6631 chủng P.aeruginosa
được phân lập chủ yếu trên bệnh nhân viêm đường hô hấp tại 3 vùng khác
nhau (Châu Âu, Cannada, Châu Mỹ Latin). Trong đó 218 mẫu P. aeruginosa
đã kháng thuốc – đề kháng với nhiều loại kháng sinh thông dụng (piperacillin,
ceftazidime, imipenem, and gentamicin), với tỉ lệ là 8,2% ở Châu Mỹ Latin,
0,9% ở Cannada[17].
Oguntibeju OO1 & Nwobu RAU2 (2004), nghiên cứu P.aeruginosa trên
các bệnh nhân bị nhiễm trùng vết thương thấy rằng: tỉ lệ P.aeruginosa xâm
nhiễm vào phụ nữ cao hơn đàn ông (tỉ lệ 3 : 2) và tìm thấy P.aeruginosa xuất
hiện nhiều hơn trên các bệnh nhân là trẻ em và người già. Khảo sát tính nhạy
cảm kháng sinh của 20 chủng P. aeruginosa phân lập được cho thấy tính
nhạy cảm của vi khuẩn này với một số kháng sinh, tỉ lệ là colistin (100%),
gentamicin (75%), streptomycin (30%), và tetracycline (10%)[25]. Theo
nhiều nhà khoa học, fosfomycin là một kháng sinh rất hữu hiệu trong điều trị
các nhiễm trùng do P.aeruginosa gây ra. Đặc biệt, fosfomycin có hiệu quả

khá tốt khi kết hợp với các kháng sinh như oxfloxacin[24]. Theo báo cáo
N.B. Hirulkar và Bhavna Soni (2011) trong

nghiên cứu phân lập


17

P.aeruginosa trong nước uống thì có tổng số 22 mẫu được phát hiện nhiễm
P.aeruginosa khi được phân lập cho thấy kháng 55% là Ciprofloxacin, tiếp
theo là Gentamicin (51%), Nitrofurantoin (51%), Erythromycin (50%),
Cotrimoxazole (50%), Ofloxacin ( 50%), tetracycline (46%), Norfloxacin
(46%), Cephalexin (46%),

Metronidazole (46%), Ampicillin (41%),

Penicillin (41%) và Amoxycillin (41%)[20].
2.3. Các phƣơng pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Pseudomonas
aeruginosa
2.3.1. Phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus
2.3.1.1. Phương pháp vi sinh
Staphylococcus aureus có thể được phát hiện thông qua cá mẫu bệnh
phẩm của bệnh nhân, thông qua phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn,
cấy chuyển, kỹ thuật xác định tính chất hóa sinh quy trình này phải trải qua
nhiều bước: đồng nhất mẫu, tăng sinh chọn lọc, xác định tính chất hóa
sinh[12].
- Ưu điểm của phương pháp: thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu
tư dụng cụ và thiết bị đắt tiền
- Nhược điểm của phương pháp: độ nhạy không cao, thời gian để phát
hiện là vi khuẩn gây bệnh do S.aureus khá dài, tốn nhiều nhân công, cần có

nhân viên có kỹ thuật có kinh nghiệm về vi sinh vật, yêu cầu kỹ năng thao tác
của người thực hiện. Ngoài ra khả năng nhầm giữa vi khuẩn gây bệnh khác
với S.aureus là khá cao.
2.3.1.2.Phương pháp miễn dịch.
Phương pháp dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng
nguyên bề mặt để phát hiện nhanh sự nhiễm S.aureus.