(TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC) NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC XÁC ĐỊNH MỘT SỐ PHỤ GIA THỰC PHẨM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------------------

NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN
SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ PHỤ GIA THỰC PHẨM
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 62440118

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2016


Công trình được hoàn thành tại
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Mai
TS. Nguyễn Thị Ánh Hường

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ.............................................................................
Họp tại...................................................................................................
vào hồi.......giờ, ngày.......tháng.......năm 2016.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm thông tin - thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Vấn đề an toàn thực phẩm ở nước ta đã trở nên đáng báo động hơn bao
giờ hết khi một loạt các vụ việc về thực phẩm bẩn bị phanh phui trong thời
gian vừa qua. Các vụ vi phạm liên quan đến an toàn thực phẩm diễn ra khắp
mọi nơi, ở các công ty chế biến thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, từ chợ cóc đến
siêu thị uy tín, từ nhà hàng sang trọng đến bếp ăn tập thể trong khu công
nghiệp, trường học, quán cơm bình dân,… Ngộ độc thực phẩm và các bệnh
do thực phẩm gây ra không chỉ gây ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ, cuộc
sống của mỗi người, mà còn gây thiệt hại lớn về kinh tế, là gánh nặng chi phí
cho chăm sóc sức khoẻ.
Một trong số các vấn đề liên quan đến an toàn thực phẩm đang được
quan tâm hiện nay là sử dụng trái phép và tồn dư các chất cấm (như chất tạo
nạc), kháng sinh trong chăn nuôi, sử dụng không đúng liều lượng và quy cách
các chất phụ gia thực phẩm (chất tạo ngọt, chất điều chỉnh độ acid, bảo quản
thực phẩm…), sử dụng các chất cấm trong chế biến, bảo quản thực phẩm và
trong chăn nuôi. Do đó, việc nghiên cứu phát triển các quy trình và phương
pháp phân tích cho các nhóm chất này là rất cần thiết.
Việc phân tích các chỉ tiêu thực phẩm ở VN hiện nay vẫn là vấn đề mới,
chưa có đầy đủ các qui trình phân tích tiêu chuẩn theo TCVN. Thông thường,
việc kiểm nghiệm thực phẩm được thực hiện chủ yếu bằng các phương pháp

sắc ký (như: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí khối phổ (GC MS), sắc ký ion (IC),..). Tuy nhiên, các thiết bị phân tích này có chi phí đầu
tư lớn và thường chỉ được trang bị tại Viện kiểm nghiệm tuyến Trung ương
(Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia) và một số trung
tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh. Trong khi đó, nhu cầu phân tích, kiểm nghiệm
các chỉ tiêu liên quan đến an toàn thực phẩm là rất lớn và nhiều khi cần thực
hiện ngay tại các địa phương để đáp ứng nhiệm vụ kiểm tra ngăn ngừa và xử
lý kịp thời các vụ việc. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ
dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE - C4D) gần đây được biết đến là
một công cụ hữu hiệu trong phân tích thực phẩm với các ưu điểm nổi trội như
thiết bị nhỏ gọn, hoạt động đơn giản, lượng mẫu và các dung môi hóa chất ít,
chi phí đầu tư và vận hành thấp, có thể chế tạo và linh kiện thay thế sẵn có tại
Việt Nam, từ đó cho chi phí phân tích mẫu thấp hơn so với các phương pháp
phân tích hiện đại khác như HPLC, GC - MS. Phương pháp CE - C4D cho
thấy triển vọng trở thành một công cụ đắc lực trong sàng lọc, kiểm nghiệm an
toàn thực phẩm, nhất là tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ ở tuyến địa
phương, các chợ và siêu thị, các địa điểm kinh doanh, bếp ăn tập thể hay
nhóm hộ tiêu dùng.
1


Với đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng
detector độ dẫn không tiếp xúc xác định một số phụ gia thực phẩm”, bản
luận án tập trung vào các mục tiêu nghiên cứu phát triển ứng dụng của
phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo
kiểu kết nối tụ điện (CE - C4D) nhằm xác định một số chất phụ gia và kích
thích sinh học trong thực phẩm bao gồm phân tích đồng thời bốn chất điều
chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm (acid formic, acid acetic, acid propionic,
acid butyric), phân tách đồng thời bốn chất tạo ngọt (acesulfam kali,
aspartam, cyclamat natri, saccharin) và xác định đồng thời ba chất thuộc
nhóm β - agonist (sabutamol, ractopamin, metoprolol), trong đó có abutamol

thường được thêm trái phép vào thức ăn chăn nuôi để tăng tỷ lệ thịt nạc của
vật nuôi (còn hay được gọi là chất tạo nạc).
2. Nội dung nghiên cứu
1. Tổng quan tài liệu về phương pháp điện di mao quản, về một số phụ
gia thực phẩm, các phương pháp xác định phụ gia thực phẩm và ứng dụng của
phương pháp điện di mao quản trong việc phân tích một số phụ gia thực phẩm
2. Nghiên cứu khảo sát phương pháp CE - C4D nhằm xác định một số
phụ gia thực phẩm: điều kiện tối ưu để xác định đồng thời bốn acid hữu cơ
(acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric), bốn chất tạo ngọt
(acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin) và ba chất tạo nạc lựa
chọn thuộc nhóm các β - agonist (sabutamol, ractopamin, metoprolol).
3. Nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn làm sạch và làm giàu
salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn nhằm xác định bằng phương
pháp CE - C4D.
4. Nghiên cứu áp dụng các điều kiện tối ưu đã khảo sát được để phân
tích một số phụ gia thực phẩm trong các mẫu thực tế, đặc biệt là chất tạo nạc
salbutamol trong qui trình khép kín từ thức ăn chăn nuôi, nước tiểu lợn và
thịt lợn.
5. Đánh giá độ tin cậy và triển vọng của phương pháp CE - C4D trong
việc phân tích một số chỉ tiêu liên quan đến an toàn thực phẩm, so sánh, đối
chứng kết quả phân tích mẫu thực tế với kết quả phân tích bằng các phương
pháp phân tích tiêu chuẩn như: HPLC, GC-MS.
3. Điểm mới, những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn của luận án
 Về mặt khoa học
Phương pháp điện di mao quản với detector UV đã được ứng dụng
nhiều trong phân tích thực phẩm nhưng lần đầu tiên ở Việt Nam, luận án đã
nghiên cứu ứng dụng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn
không tiếp xúc (CE- C4D) xây dựng quy trình xác định đồng thời một số chất
phụ gia (chất điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm và chất tạo ngọt) và
kích thích sinh học (nhóm β - agonist - chất tạo nạc) trong thực phẩm. Tổng

quan nghiên cứu cho thấy, trên thế giới mới chỉ có ba nghiên cứu sử dụng
2


phương pháp CE- C4D phân tích các nhóm chất này (trong đó có hai nghiên
cứu xác định nhóm chất tạo ngọt và một nghiên cứu xác định salbutamol
trong dược phẩm). Vì vậy có thể nói luận án đã tiên phong trong việc sử dụng
phương pháp CE- C4D trong lĩnh vực phân tích thực phẩm, đóng góp thê một
phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm, từ đó hi vọng sẽ góp phần vào việc
quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt Nam.
 Về mặt thực tiễn
Phương pháp CE - C4D với các ưu điểm về hệ thiết bị mở ra khả năng
áp dụng phân tích nhiều đối tượng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là
với lĩnh vực an toàn thực phẩm, có ý nghĩa thực tế lớn, thích ứng với hoàn
cảnh, điều kiện kinh tế, xã hội ở nước ta.
Các quy trình phân tích xây dựng trong luận án đơn giản, dễ thực hiện,
chi phí thấp, có độ chính xác cao, rất phù hợp để áp dụng phân tích các chất
điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm và chất tạo ngọt trong các mẫu thực
phẩm, giúp kiểm soát sử dụng đúng hàm lượng và quy cách các phụ gia này
trong thực phẩm.
Đặc biệt là với salbutamol, một chất tạo nạc được sử dụng trái phép
nhiều trong chăn nuôi ở nước ta, quy trình phân tích trong luận án đã được áp
dụng để phân tích salbutamol trong mẫu thức ăn chăn nuôi, mẫu nước tiểu lợn
và mẫu thịt lợn, có thể giúp các nhà quản lý kiểm tra, giám sát và kịp thời
ngăn chặn xử lý việc sử dụng chất cấm này trong chăn nuôi.
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm năm phần chính là: mở đầu, chương 1: tổng quan, chương
2: nội dung và phương pháp nghiên cứu, chương 3: kết quả và thảo luận, kết
luận. Trong mỗi phần có các hình ảnh và bảng biểu minh họa tương ứng, phù
hợp. Ngoài ra luận án còn gồm đầy đủ các phần: mục lục, danh mục các ký

hiệu và chữ cái viết tắt, danh mục bảng, danh mục hình, danh mục các công
trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án, tài liệu tham khảo tiếng Việt,
tiếng Anh và các phụ lục liên quan.

3


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Một số chất phụ gia và kích thích sinh học trong sản xuất thực phẩm
1.1.1. Khái quát chung về một số nhóm phụ gia thực phẩm
Các chất phụ gia được thêm vào thực phẩm để bảo quản hay cải thiện
hương vị và hình thức của thực phẩm. Trong số các phụ gia thực phẩm thì
acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric với vai trò điều chỉnh độ
acid, bảo quản thực phẩm và acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri,
saccharin với vai trò chất tạo ngọt được sử dụng rất phổ biến. Thực phẩm có
hàm lượng phụ gia vượt quá giới hạn cho phép sẽ gây ảnh hưởng đến sức
khỏe con người. Do đó, Bộ Y Tế đã ban hành QCVN 4 - 8.2010, QCVN 4 11.2010, QCVN 4 - 12.2010 quy định các yêu cầu kỹ thuật và quản lý về chất
lượng, vệ sinh an toàn đối với các chất ngọt tổng hợp, các chất điều chỉnh độ
acid và chất bảo quản được sử dụng với mục đích làm phụ gia thực phẩm.
1.1.2. Các chất kích thích sinh học β-agonist
Salbutamol, metoprolol, ractopamin (Sal, Met và Rac) là ba trong số các
chất β-agonist vừa được ứng dụng trong dược phẩm vừa được thêm trái phép
vào thức ăn chăn nuôi, dẫn đến tồn dư ở thịt động vật, gây ảnh hưởng đến sức
khỏe người tiêu dùng. Đặc biệt là Sal được dùng phổ biến trong y học để điều
trị các bệnh về đường hô hấp nhưng cũng được sử dụng lén lút nhiều trong
chăn nuôi làm giảm tỷ lệ mỡ, tăng tỷ lệ nạc ở gia súc, gia cầm. Tại Việt Nam,
bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã cấm sử dụng Sal trong chăn nuôi.
1.2. Các phƣơng pháp xác định chất phụ gia và kích thích sinh học trong
thực phẩm và mẫu sinh học
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay các phương pháp được sử dụng để xác định các chất phụ gia và
kích thích sinh học trong thực phẩm bao gồm phương pháp sắc ký (HPLC, GC,
IC), phương pháp điện hóa, phương pháp UV- Vis, phương pháp sinh học và
phương pháp điện di mao quản. Trong đó các phương pháp sắc ký được dùng
phổ biến nhất, đối với chất phụ gia có hàm lượng tương đối cao trong thực
phẩm hay sử dụng cùng các detector có độ nhạy trung bình như UV, PDA,
ELSD… (LOD cỡ ppm), còn đối với cácchất kích thích sinh học có hàm lượng
thấp thì sử dụng các detector có độ nhạy cao như MS, ESI/MS, MS/MS…
(LOD cỡ ppb). Trong khoảng 10 năm trở lại đây, phương pháp điện di (CE,
CZE, ITP, MECC) với các detector UV, DAD, điện hóa và đặc biệt gần đây là
detector độ dẫn C4D đang nhanh chóng phát triển thành một phương pháp có
độ nhạy (cỡ ppm) phù hợp để xác định các phụ gia thực phẩm.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Giới hạn cho phép của các phụ gia thực phẩm (chất điều chỉnh độ acid,
bảo quản thực phẩm và chất tạo ngọt) khá cao vì vậy các Quy chuẩn kỹ thuật
quốc gia về phụ gia thực phẩm (QCVN 4.2010 - BYT) và TCVN quy định
phương pháp chuẩn độ để định lượng các chất này trong thực phẩm. Đến nay
4


mới chỉ có TCVN 8471:2010 dùng phương pháp HPLC để xác định đồng thời
aspartam, saccharin, acesulfam - kali trong thực phẩm. Đặc biệt với các chất
tạo nạc, hiện nay vẫn chưa có tiêu chuẩn và quy chuẩn để xác định. Vì vậy
mục tiêu đặt ra của luận án là nghiên cứu xây dựng phương pháp CE-C4D có
độ nhạy phù hợp với giới hạn cho phép của các phụ gia thực phẩm và có thể
áp dụng được để phân tích các chất tạo nạc trong mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn
một cách đơn giản, tiện lợi, áp dụng được ở các phòng thí nghiệm nhỏ tuyến
địa phương.
1.3. Phƣơng pháp điện di mao quản
1.3.1. Giới thiệu chung về phương pháp điện di mao quản

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di
chuyển khác nhau của các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích)
trong dung dịch chất điện ly có chất đệm pH dưới tác dụng một điện trường (E)
nhất định được sinh ra do thế V. Hiện nay, CE được phân loại theo các cơ chế
tách như sau: Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis - CZE),
điện di mao quản điểm đẳng điện (Isoelectric focusing - IFF), điện di mao quản
đẳng tốc độ (Isotachophoresis - ITP), điện di mao quản Gel (Capillary Gel
Electrophoresis - CGE) và sắc ký điện di mao quản điện động học kiểu micelle
(Micellar electrophoresis capillary chromatography - MECC).
1.3.2. Nguyên tắc và cấu tạo của một hệ điện di mao quản cơ bản
Phương pháp điện di mao quản hiện đại sử dụng điện trường sinh ra
bởi một nguồn thế cao (hàng chục kV) áp vào mao quản (có đường kính
trong 10 - 150 µm) tại đầu bơm mẫu, làm cho các chất tích điện (trong nền
dung dịch điện ly, có đệm pH thích hợp) di chuyển với tốc độ khác nhau và
tách ra khỏi nhau

Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị CE
1.3.3. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản
Độ điện di (µ) là hằng số đặc trưng cho hạt tích điện trong một điều
kiện điện di xác định:
µ = q/(6...r.)
(1.4)
5


Từ công thức (1.4) có thể thấy, độ điện di tỷ lệ thuận với điện tích của
hạt mang điện (q) và tỷ lệ nghịch với độ nhớt của dung dịch đệm điện di (),
bán kính hyddrat của hạt mang điện (r). Nghĩa là, trong một điện trường E
nhất định, chất nào có điện tích lớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh; với
các chất mang điện có cùng điện tích, chất nào có kích thước nhỏ sẽ di chuyển

nhanh hơn; với các chất mang điện có cùng bán kính, chất nào có điện tích
lớn sẽ di chuyển nhanh hơn
1.3.4. Dòng điện di thẩm thấu và phương pháp thay đổi dòng điện di thẩm
thấu phân cực ngược anion chất phân tích
Dòng chảy của khối chất lỏng trong mao quản được gọi là dòng điện di
thẩm thấu (EOF). Trong mao quản Silica và khoảng pH điện di 4 ÷ 9, dòng
EOF thường hướng theo phương từ Anot (cực dương) về Catot (cực âm). Ở
điều kiện đó, các anion có tốc độ điện di riêng nhỏ hơn tốc độ của dòng EOF
sẽ được dòng EOF mang theo về phía cực âm. Nếu tăng tốc độ dòng EOF sẽ
làm các anion đó bị cuốn theo, di chuyển cùng dòng EOF về phía cực âm nên
cần phân cực ngược (áp thế ở đầu bơm mẫu) để phân tách các anion này.
1.3.5. Các detector thông dụng trong phương pháp điện di mao quản
Tùy thuộc vào mục đích phát hiện hay định lượng, cũng như tùy thuộc
vào tính chất hóa học, hóa lý, vật lý của các chất phân tích có thể sử dụng các
detector tương ứng như: Detector quang học, detector khối phổ, detector điện
hóa, detector độ dẫn… Trong đó detector độ dẫn không tiếp xúc (C4D) có ưu
điểm là đáp ứng với tất cả các hợp phần mang điện, có thể chế tạo thu nhỏ và
đặc biệt có thể tự chế tạo ở Việt Nam. C4D đã được ứng dụng trong khoảng
10 năm trở lại đây, trở thành detector phổ biến trong điện di mao quản.
1.3.6. Ứng dụng của phương pháp điện di mao quản CE -C4D
Trong những năm gần đây, phương pháp điện di mao quản CE -C4D đã
được phát triển rất nhanh và ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực, đặc biệt là
trong môi trường, sinh học, dược phẩm, thực phẩm… để định lượng các
anion, cation cơ bản, phụ gia thực phẩm, kháng sinh, thuốc kích dục, thuốc
gây mê, ma túy tổng hợp…
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu của luận án là nghiên cứu phát triển ứng dụng của phương
pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết
nối tụ điện (CE - C4D) nhằm xác định một số chất phụ gia và kích thích sinh

học trong mẫu thực phẩm và mẫu sinh học.
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu đề ra, các nội dung chính được thực
hiện gồm: Khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định đồng thời bốn acid hữu
cơ (acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric), bốn chất tạo ngọt
(acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin)và ba chất tạo nạc lựa
6


chọn thuộc nhóm các β - agonist (sabutamol, ractopamin, metoprolol). Nghiên
cứu phương pháp chiết pha rắn làm sạch và làm giàu salbutamol trong mẫu
nước tiểu và mẫu thịt lợn nhằm xác định bằng phương pháp CE - C4D. Áp
dụng các điều kiện tối ưu thu được để phân tích các mẫu thực tế, đánh giá độ
tin cậy của phương pháp phân tích.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp CE - C4D
Nghiên cứu được thực hiện trên hệ thiết bị điện di mao quản sử dụng
detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE -C4D). Một hệ thiết bị
CE cơ bản bao gồm các bộ phận: Mao quản tách, dung dịch đệm điện di,
nguồn điện thế cao, detector (cảm biến) độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ
điện (C4D) và bộ phận điều khiển.
2.2.2. Phương pháp khảo sát các điều kiện tối ưu
Việc khảo sát các điều kiện tách đồng thời các chất phân tích được thực
hiện trên thiết bị điện di CE-C4D với cột mao quản có chiều dài 60 cm, đường
kính trong 50 µm. Bơm mẫu bằng phương pháp thuỷ động lực học kiểu xi
phông. Các điều kiện này được giữ nguyên trong tất cả các thí nghiệm. Ngoài
ra cũng khảo sát một số điều kiệnkhác bao gồm: Dung dịch đệm điện di, thế
điện di, chiều cao và thời gian bơm mẫu theo phương pháp đơn biến.
2.2.3. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu thực phẩm
Các mẫu thực phẩm được lấy ngẫu nhiên trên địa bàn Hà Nội. Các mẫu
ở dạng lỏng chỉ cần lọc qua màng lọc 0,45 µm, pha loãng với tỷ lệ phù hợp.

Các mẫu ở dạng rắn được đồng nhất mẫu, thêm nước cất đề ion, rung siêu âm
trong khoảng thời gian hợp lý sau đó lọc qua màng lọc.
2.2.4. Phương pháp lấy mẫu và xử lý, làm giàu mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn
Mẫu nước tiểu lợn, mẫu thịt lợn được lấy từ con lợn nuôi thí nghiệm,
được xử lý sơ bộ rồi cho qua cột chiết pha rắn (SPE). Các cột chiết pha rắn
khảo sát gồm cột C18, cột SCX 3 ml, cột SCX 6 ml và cột MCX 6 ml. Các
bước chiết pha rắn gồm: Hoạt hóa cột chiết, nạp mẫu vào cột chiết, rửa loại
tạp chất và rửa giải chọn lọc chất phân tích.
2.2.5. Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
Độ tin cậy của phương pháp CE - C4D trong phân tích một số phụ gia
thực phẩm được đánh giá qua các thông số: giới hạn phát hiện, giới hạn định
lượng, độ lặp lại, hiệu suất thu hồi.
2.3. Thiết bị và hóa chất
Thiết bị CE là hệ thiết bị tự chế, bán tự động được thiết kế và chế tạo tại
Việt Nam bởi Công ty 3Sanalysis ( trên cơ sở hợp
tác với Bộ môn Hóa Phân tích (Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, ĐHQGHN) và nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (khoa Hóa,
trường đại học Basel, Thụy Sỹ). Thiết bị có nguồn thế cao lên đến 25 kV, sử
dụng cảm biến độ dẫn không tiếp xúc (C4D).
7


Hình 2.2. Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D triển khai tại Việt Nam
(1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến độ dẫn không tiếp
xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh , 6: Bộ phận điều khiển,
7: Bình khí nén)
Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích và được
pha chế bằng nước deion.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định đồng thời acidformic, acid acetic, acid propionic, acid butyric

bằng phƣơng pháp CE-C4D
Quá trình điện di của của các ion chất phân tích trong mao quản là tổng
hợp của dòng chuyển động của các ion này dưới tác động của điện trường và
dòng EOF. Thông thường, các cation sẽ di chuyển cùng chiều với dòng EOF
và các anion di chuyển ngược chiều. Tùy thuộc vào các đặc tính của chất phân
tích như điện tích, cấu trúc không gian, kích thước phân tử, độ linh động điện
di, … chúng ta sẽ sử dụng kĩ thuật phân cực phù hợp để vừa có thể tách được
chất phân tích vừa lợi dụng (hoặc hạn chế) được ảnh hưởng của dòng EOF.
Nhóm các acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric có pKa
lần lượt là 3,75, 4,75, 4,88, 4,82. Trong khoảng pH điện di từ 5÷ 9, các acid
trên tồn tại dưới dạng anion, có độ linh động điện di cao, tốc độ điện di lớn...
Tuy chuyển động của các anion là ngược chiều với dòng EOF, nhưng tại các
giá trị pH thấp, tốc độ dòng EOF là nhỏ không đáng kể so với tốc độ điện di
của anion nên ít gây cản trở. Vì vậy để xác định các acid này, ta có thể sử
dụng kĩ thuật phân cực thường tức là áp thế âm vào mao quản tại đầu bơm
mẫu. Anion có độ linh động điện di lớn sẽ di chuyển nhanh hơn và ngược lại,
do đó các anion sẽ được tách ra khỏi nhau theo thứ tự lần lượt là HCOO-,
CH3COO-, C2H5COO-, C3H7COO-.
3.1.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu
Để tối ưu hóa quá trình tách điện di, các yếu tố ảnh hưởng quan trọng
đến hiệu quả tách như dung dịch đệm điện di, pH, thế tách,.. sẽ được khảo sát
và biện luận.
8


a) Khảo sát dung dịch đệm điện di
Trong phương pháp CE-C4D, dung dịch đệm điện di có vai trò rất quan
trọng, ảnh hưởng đến tốc độ điện di của chất phân tích. Trong dung dịch đệm
điện di, ba yếu tố gồm: pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm điện di
đóng vai trò quan trọng nhất. Với mao quản silica, vùng giá trị pH điện di

thường dùng và có thể thay đổi trong khoảng từ 2 - 10, tùy thuộc vào mỗi loại
mẫu phân tích. Thành phần của dung dịch đệm gồm các ion có độ điện di nhỏ,
tức là phải có điện tích nhỏ nhưng kích thước tương đối lớn, ngoài ra các chất
đệm phải tan tốt trong nước, bền vững trong mao quản và trong quá trình điện
di. Sau thành phần, pH của hệ đệm điện di, nồng độ đệm được lựa chọn thích
hợp để có dung lượng đệm đủ lớn và khống chế hệ đệm không đổi trong suốt
quá trình điện di.
Các hệ đệm điện di phân tích đồng thời acid formic, acid acetic, acid
propionic, acid butyric cần có pH xung quanh khoảng 5 đến 6 để đảm bảo các
chất phân tích ở dạng anion và dòng EOF không quá lớn. Tỉ lệ nồng độ đệm
tương ứng với pH được khảo sát là: His 30 mM/Mes 50 mM (pH = 5,6), His
30 mM/Mes 40 mM (pH = 5,8), và His 50 mM/Mes 40 mM (pH = 6,3). Kết
quả cho thấy, hệ đệm His 30 mM/Mes 40 mM (pH = 5,8) cho diện tích pic
của các chất phân tích lớn nhất và đường nền tốt nhất. Do đó, dung dịch đệm
điện di His 30 mM/Mes 40 mM (pH =5,8) được lựa chọn cho các khảo sát
tiếp theo.
b) Khảo sát ảnh hưởng của thế tách
Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có một nguồn thế tách
cao V, tạo ra lực điện trường E và dòng điện I trong mao quản, là một yếu tố
quan trọng quyết định kết quả điện di các chất phân tích. Việc khảo sát thế
được thực hiện ở các giá trị thế -15 kV, -18 kV và -20 kV cho thấy khi tăng
thế thời gian di chuyển của các chất phân tích giảm. Để đảm bảo độ phân giải
khi phân tích mẫu thực và thời gian phân tích phù hợp, thế -18 kV là thế phù
hợp cho phép phân tích.
c) Khảo sát ảnh hưởng của chiều cao và thời gian bơm mẫu
Trong phương pháp bơm mẫu thủy động lực học kiểu xi phông, lượng
mẫu bơm vào tỷ lệ thuận với chiều cao bơm mẫu và thời gian bơm mẫu.
Trong quá trình nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu bơm vào phải đủ lớn để
đảm bảo độ nhạy và khả năng tách tốt. Chiều cao bơm mẫu càng lớn thì sự
chênh lệch về chiều cao của hai đầu ống mao quản càng lớn dẫn tới lượng

mẫu bơm vào mao quản càng nhiều. Tương tự chiều cao bơm mẫu, nếu thời
gian bơm mẫu càng lớn thì lượng mẫu bơm vào mao quản càng nhiều. Tuy
nhiên nếu lượng mẫu được bơm vào mao quản quá lớn sẽ dẫn đến sự phân tán
mẫu lớn làm giảm khả năng tách chất. Các chiều cao bơm mẫu được lựa chọn
khảo sát gồm: 10 cm, 15 cm và 20 cm; các thời gian bơm mẫu được khảo sát
là 10 s, 20 s, 25 s. Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.3, 3.4:
9


formic

acetic

formic

propionic butyric

acetic

propionic butyric

20 mV

20 mV
25s

20cm

20s

15cm

10cm

10s

0

100

200
300
Thêi gian di chuyÓn (s)

400

0

Hình 3.3. Ảnh hưởng của chiều cao
bơm mẫu đến sự phân tách acid
formic, acid acetic, acid propionic,
acid butyric

100

200
300
Thêi gian di chuyÓn (s)

400

Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian
bơm mẫu tới sự phân tách acid
formic, acid acetic, acid propionic,
acid butyric

Kết quả cho thấy, tại thời điểm bơm mẫu 20 s và chiều cao bơm mẫu 15
cm, thời gian di chuyển của các chất là nhỏ nhất, tín hiệu đo ổn định, nhiễu
nền ít đồng thời đảm bảo được độ nhạy cao mà vẫn có sự tách tốt giữa các
chất phân tích và thậm chí là giữa các chất phân tích và các chất có thể có
trong mẫu thực. Vì vậy, chiều cao bơm mẫu 15 cm và thời gian 20 s được lựa
chọn cho các khảo sát tiếp theo.
Từ các kết quả khảo sát thu được, các điều kiện tối ưu nhằm xác định
đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric bằng phương
pháp CE-C4D được tóm tắt ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Điều kiện tối ưu xác định đồng thời acid formic, acid acetic,
acid propionic, acid butyric
Các yếu tố
Điều kiện
Detector
Mao quản

CE-C4D
Mao quản silica, tổng chiều dài 60cm, chiều dài
hiệu dụng là 50 cm, đường kính trong là 50 µm

Phương pháp bơm mẫu

Thủy động lực học kiểu xi phông:15 cm

Thời gian bơm mẫu

20 s

Dung dịch đệm điện di

His-Mes (30 mM/40 mM), pH = 5,8

Thế tách

- 18 kV

3.1.2. Xây dựng đường chuẩn cho các chất phân tích và đánh giá phương pháp
Các phương trình đường chuẩn xác định acid formic, acid acetic, acid
propionic, acid butyric được nêu trong bảng 3.6.

10


Bảng 3.6. Phương trình đường chuẩn của acid Formic, acid Acetic,
acid Propionic và acid Butyric
Phƣơng trình đƣờng chuẩn
y = (10,16538±6,5321)+(61,7982±1,16188)x
y = (-0,52484±2,98169)+(31,4926±0,67235)x
y = (-5,07988±6,11372)+(61,63352±1,09553)x
y = (6,70525±5,2828)+(57,9034±0,99063)x

Tên chất
Acid formic
Acid acetic

Acid propionic
Acid butyric

R2
0,99912
0,99909
0,99921
0,99927

P
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001

LOD của acid formic, acid acetic, acid propionic và acid butyric lần
lượt là 0,05; 0,12; 0,17 và 0,18 ppm. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) từ 1,5 %
đến 2,7 %, hiệu suất thu hồi từ 89,6 ÷ 104,0 %. Như vậy phương pháp có độ
chụm và độ đúng tương đối tốt, đáp ứng yêu cầu của hiệp hội các nhà Hóa
học Phân tích (AOAC).
3.1.3. Phân tích đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid
butyric trong mẫu thực phẩm
Tiến hành phân tích bảy mẫu thực tế được mua ngẫu nhiên tại các cửa
hàng/siêu thị ở Hà Nội. Kết quả phân tích không phát hiện acid butyric trong
tất cả các mẫu phân tích, nhưng phát hiện đồng thời 2 hoặc 3 acid còn lại
trong hầu hết các mẫu. Sáu trong tổng số bảy mẫu phân tích đã được phân tích
đối chứng bằng phương pháp tiêu chuẩn (HPLC).
Bảng 3.9. Kết quả phân tích đối chứng acid formic, acid acetic, acid propionic,
acid butyric trong thực phẩm bằng phương pháp tiêu chuẩn HPLC
acid Formic

Mẫu
Cam ép
(mg/l)
Nước C2
(mg/l)
Rượu nho
Pháp (mg/l)
Rượu
Soliera
Tempranillo
(mg/l)
Cà phê Viet
(mg/kg)
Cà phê G7
(mg/kg)
Rượu vang
Thăng Long
(mg/l)

acid Acetic

acid Propionic

CE-C D

HPLC

ER %

CE-C D

HPLC

ER %

CE-C D

HPLC

ER
%

ND

ND

-

6130±53

6570±45

-6,7

249±8

261±9

-4,6

ND

ND

-

1990±17

2390±17

-16,7

448±11

473±12

-5,3

ND

ND

-

83,9±3,9

90.8±4.5

-7,6

471±12

450±11

+4,7

ND

ND

-

1080±9

1100±8

1,8

851±8

875±9

-2,7

7550±66

7710 ± 57

-2,1

1260±10

1320±10

-4,5

4050±36

4120±31

-1,7

7440±65

8590 ± 61

-13,4

2320±20

2110±15

+10,0

9490±84

9920±74

-4,3

270±9

-

-

935±8

-

-

41,5±2,8

-

-

4

4

4

ND: Không phát hiện được với LOD của acid formic, acid acetic,
acid propionic và acid butyric lần lượt là 0,05; 0,12; 0,17 và 0,18 ppm.
-: Không phân tích
Kết quả phân tích đối chứng được thể hiện trong bảng 3.9 cho sự sai
khác giữa hai phương pháp đa số đều dưới 15 %. Từ đó, có thể kết luận kết
quả phân tích đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic và acid

butyric bằng phương pháp CE-C4D là đáng tin cậy.
11


3.2. Xác định đồng thời chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat
natri, saccharin trong thực phẩm bằng phƣơng pháp CE-C4D
Các chất tạo ngọt:acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin
(Ace - K, Asp, Cyc, Sac) có pKa lần lượt là 2,0; 3,2; 1,7; 1,6. Trong dung dịch
có pH = 8 ÷ 10 các chất này tồn tại chủ yếu dưới dạng anion, có kích thước
cồng kềnh, điện tích nhỏ, có độ linh động điện di thấp dẫn đến tốc độ điện di
riêng nhỏ. Ở khoảng pH cao, dòng EOF lại có tốc độ lớn, có khả năng cuốn
theo các anion chất tạo ngọt trong khối liên kết tương tác bền vững với các
phần tử mang điện dương về phía cực âm. Để lợi dụng ảnh hưởng này của
dòng EOF, các chất tạo ngọt thường được phân tích theo kiểu phân cực ngược.
3.2.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu
a) Khảo sát dung dịch đệm điện di
Bốn hệ đệm điện di khảo sát bao gồm: Arg/Mes, Arg/CAPS, Tris/His
và Tris/Ches. Các giá trị pH được thay đổi từ 8,5 đến 9,7 bằng cách thay đổi
tỷ lệ giữa các thành phần đệm.
Trên điện di đồ, pic của các chất xuất hiện theo thứ tự: pic của dòng
EOF, Asp, Cyc, Sac, Ace - K. Khi pH tăng, thời gian phân tích và độ phân
giải của bốn chất tạo ngọt cũng đồng thời giảm. Cả bốn hệ đệm khảo sát đều
cho tín hiệu chất phân tích đẹp, hiệu quả tách tốt, đường nền ổn định và thời
gian phân tích hợp lý nhất tại pH = 9,2. Để có thể lựa chọn được hệ đệm tốt
nhất, các điện di đồ ở pH = 9,2 của bốn hệ đệm được so sánh trong hình 3.12.

Hình 3.12. So sánh khả năng phân tách Ace - K, Asp, Cyc, Sac của các
đệm điện di Tris/Ches, Tris/His, Arg/Mes, Arg/CAPS ở pH = 9,2
Hình 3.12 cho thấy, tại pH = 9,2, hai hệ đệm điện di Tris/His và
Tris/Ches đều cho độ phân giải tốt, đường nền ổn định và thời gian phân tích

hợp lý. Hệ đệm Tris/Ches cho pic sắc nét hơn tuy nhiên hệ đệm Tris/His lại
cho khả năng phân tách tốt hơn nhiều. Hệ đệm Tris/His (100 mM/10 mM),
12


pH = 9,2 được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo để đảm bảo độ phân giải
của các chất phân tích.
b) Khảo sát ảnh hưởng của thế tách
Các chất tạo ngọt được phân tích theo kiểu phân cực ngược (áp điện thế
dương). Bốn giá trị thế + 10 kV, + 15 kV, + 17 kV, + 20 kV được lựa chọn
khảo sát. Kết quả cho thấy khi áp thế càng cao, thời gian phân tích và độ phân
giải càng giảm. Thế + 15 kV cho thời gian phân tích ngắn (gần 8 phút), đường
nền ổn định và độ phân giải tương đối tốt được lựa chọn cho các thí nghiệm
tiếp theo.
c) Khảo sát thời gian bơm mẫu
Thời gian bơm mẫu được khảo sát với các giá trị 10 s, 15 s, 20 s, 30
s.Thời gian bơm mẫu 10 s và 15 s đều cho độ phân giải tốt nhưng với thời
gian 15 s, tín hiệu chất phân tích cao hơn và thời gian phân tích ngắn hơn. Để
đảm bảo độ phân giải và độ nhạy của phương pháp, thời gian bơm mẫu tối ưu
được lựa chọn là 15 s.
Từ các kết quả thu được, điều kiện tối ưu để phân tích đồng thời bốn
chất tạo ngọt Ace - K, Asp, Cyc, Sac bằng phương pháp CE - C4D được trình
bày tóm tắt trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Điều kiện tối ưu để phân tích hỗn hợp chất tạo ngọt Ace-K, Asp,
Cyc, Sac bằng phương pháp CE-C4D
Điều kiện

Các yếu tố
Detector

CE-C4D

Mao quản

Mao quản silica, tổng chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng
50 cm, đường kính trong 75 µm

Phương pháp bơm mẫu

Thủy động lực học kiểu xiphông (chiều cao 10 cm)

Thời gian bơm mẫu

15 s

Dung dịch đệm điện di

Tris/His (100 mM/10 mM), pH = 9,2

Thế tách

+15 kV

3.2.2. Đường chuẩn phân tích và đánh giá phương pháp nghiên cứu
Đường chuẩn của bốn chất tạo ngọt Asp, Cyc, Sac, Ace - K được thiết
lập trong khoảng nồng độ 2,5-180 ppm. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.13.
Bảng 3.13. Phương trình đường chuẩn của Ace-K, Asp, Cyc, Sac
Tên chất

Phƣơng trình đƣờng chuẩn (y = a + bx)

R2

P

Ace - K

y = (1,94236 ± 5,21557) + (6,6173 ± 0,08186)x

0,99946

< 0,0001

Asp

y = (-1,81667 ± 0,67261) + (0,43397 ± 0,00598)x

0,99934

< 0,0001

Cyc
Sac

y = (5,0723 ± 3,59551) + (3,33964 ± 0,05321)x
y = (7,6561 ± 4,50568) + (4,62568 ± 0,06668)x

0,99924
0,99938

< 0,0001
< 0,0001

13


LOD của Ace-K, Asp, Cyc, Sac lần lượt là: 0,7 ppm; 5,0 ppm; 1,0 ppm;
1,0 ppm. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của Asp, Cyc, Sac và Ace-K nhỏ,
dao động từ 0,9 % đến 2,0 %, hiệu suất thu hồi của Asp, Cyc, Sac và Ace-K
khá cao, từ 95,7 ÷ 99,3 %. Như vậy phương pháp là phù hợp để phân tích các
chất tạo ngọt trong mẫu thực phẩm.
3.2.3. Phân tích chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri,
saccharin trong thực phẩm
Áp dụng quy trình tối ưu đã khảo sát ở trên để phân tích bốn chất tạo
ngọt: Ace - K, Asp, Cyc, Sac trong 16 mẫu gồm mẫu nước giải khát và 2 mẫu
thạch. Kết quả ở hình 3.19 cho thấy đã phát hiện một hoặc đồng thời 2 chất
tạo ngọt (Asp và Ace - K) trong số bốn chất tạo ngọt phân tích. Riêng mẫu
chè đỗ đen phát hiện Sac với hàm lượng là 111 ppm.

Hình 3.19: Kết quả phân tích chất tạo ngọt trong mẫu nước giải khát bằng
phương pháp CE - C4D
Kết quả phân tích bằng phương pháp CE-C4D được so sánh đối chứng
với phương pháp tiêu chuẩn (HPLC) hình 3.19 cho thấy kết quả giữa hai
phương pháp khá phù hợp (sai số dưới 15%) chứng tỏ phương pháp phân tích
là chính xác và đáng tin cậy.
3.3. Khảo sát các điều kiện tối ƣu phân tích β-agonist salbutamol,
metoprolol và ractopamintrong mẫu thức ăn chăn nuôi, nƣớc tiểu lợn và
mẫu thịt lợn bằng phƣơng pháp CE-C4D
Salbutamol, metoprolol và ractopamin là ba chất thuộc nhóm β agonist, có cấu trúc tương tự với các dẫn xuất amin, đều có pKa> 9. Tại pH
nhỏ hơn pKa, các β - agonist này tồn tại dưới dạng cation, di chuyển cùng

chiều với dòng EOF, thuận lợi để tách được bằng CE-C4D theo phương pháp
phân cực bình thường (tức là áp thế dương vào mao quản đầu bơm mẫu)
3.3.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu
3.3.1.1. Khảo sát dung dịch đệm điện di
a. Khảo sát dung dịch đệm điện di
Ở pH thấp điện tích của các cationβ-agonist lớn, tuy nhiên dòng EOF lại
nhỏ, còn ở pH cao dòng EOF lớn nhưng điện tích của các cation này lại nhỏ,
chính vì vậy khoảng pH trung gian (khoảng pH từ 4,9 đến 5,5) đảm bảo được
14


điện tích của cation và dòng EOF phù hợp sẽ cho khả năng phân tách bằng
phương pháp điện di mao quản của các β-agonist (salbutamol, metoprolol,
ractopamin) là tốt nhất. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH với bốn giá trị pH
4,5; 4,9; 5,5 và 6,0 cho thấy ở giá trị pH = 4,9 các chất được tách tốt nhất, pic
gọn nhất đồng thời cho tín hiệu đường nền ổn định và thời gian phân tích hợp
lý. Do đó, pH = 4,9 được lựa chọn cho các bước khảo sát tiếp theo.
Thành phần dung dịch đệm khảo sát là Arg (pK = 2,18; 9,09; 12,50) và
His (pK = 1,78; 5,97; 9,97) kết hợp với các acid phosphoric (Phos), ascorbic
(Asc) hoặc acetic (Ace). Kết quả khảo sát thành phần dung dịch đệm được thể
hiện trong hình 3.24 cho thấy hệ đệm Arg/Ace cho kết quả độ phân giải giữa
các pic tốt nhất và tín hiệu của các pic cao nhất nên sẽ được lựa chọn cho các
khảo sát tiếp theo.
50mV

Arg/Phos
His/Ace
Arg/Asc
Arg/Ace

Sal
0

100

200

300

400

500

Met Rac
600

Hình 3.24. Ảnh hưởng của thành phần hệ đệm đến sự phân tách của Sal,
Met, Rac
Các nồng độ 10 mM, 15 mM, 20 mM của hệ đệm Arg/Ace được khảo
sát để tìm ra nồng độ đệm tối ưu. Kết quả khảo sát ở nồng độ đệm 10 mM cho
thấy tại giá trị nồng độ này hình dáng các pic khá cân đối và sắc nét, các chất
được tách tương đối tốt và thời gian phân tích hợp lý. Do đó, đệm Arg/Ace có
nồng độ 10 mM được lựa chọn là dung dịch đệm tối ưu.
b) Khảo sát ảnh hưởng của thế tách
Tại pH = 4,9, Sal, Met và Rac đều mang điện dương. Các điện thế được
lựa chọn khảo sát là: 10 kV, 15 kV, 18 kV và 20 kV.

15

20mV
20kV
18kV
15kV
10kV
Sal Met Rac

200

400

600

800

1000

Thêi gian di chuyÓn (s)

Hình 3.27. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thế tách đến thời gian
di chuyển và sự phân tách các pic
Kết quả ở hình 3.27 cho thấy, thế tách 18 kV cho hiệu quả tách tốt, thời
gian phân tích phù hợp nên được chọn cho các khảo sát tiếp theo.
c) Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu
Thời gian bơm mẫu được khảo sát ở 10 s, 20 s, 30 s và 50 s. Kết quả
cho thấy, khi tăng thời gian bơm mẫu, thời gian di chuyển của các chất hầu
như không thay đổi hoặc thay đổi rất ít nhưng diện tích pic tăng tương ứng
khi tăng thời gian bơm mẫu từ 10 s đến 50 s. Thời gian bơm mẫu 20 s được
lựa chọn để đảm bảo độ nhạy và khả năng tách là tốt nhất đối với cả mẫu
chuẩn và mẫu thực là mẫu thức ăn chăn nuôi.

Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met và Rac bằng phương
pháp CE-C4D được tổng hợp trong bảng 3.21.
Bảng 3.21. Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met, Rac
bằng phương pháp CE-C4D
Các yếu tố
Detector
Mao quản
Phương pháp bơm mẫu
Thời gian bơm mẫu
Dung dịch đệm điện di
Thế tách

Điều kiện
CE-C4D
Mao quản silica, tổng chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng
53 cm, đường kính trong 50 µm
Thủy động lực học kiểu xiphông: 10cm
20 s
Arg/Ace (10 mM) pH=4,9
18 kV

3.3.2. Đường chuẩn phân tích và đánh giá phương pháp phân tích
3.3.2.1. Đƣờng chuẩn phân tích
Các dung dịch để dựng đường chuẩn có nồng độ biến thiên trong
khoảng 2,5- 250,0 ppm. Kết quả khảo sát và tính toán được trình bày trong
bảng 3.22
16


Bảng 3.22. Phương trình đường chuẩn của Sal, Met và Rac

Tên chất

Phƣơng trình đƣờng chuẩn (y=a+bx)

R2

P

Sal

y = (-0,28196±0,68338)+(0,97536±0,01028)x

0,99967

<0,0001

Met

y = (0,38201 ±0,63116)+(0,78866±0,00947)x

0,99957

<0,0001

Rac

y= (-0,6955±0,38796)+(0,93506±0,00582)x

0,99988

<0,0001

LOD của Sal là 0,5 ppm, của Met và Rac là 0,7 ppm. Độ lệch chuẩn
tương đối (RSD) < 3 %, hiệu suất thu hồi của Sal, Met và Rac khá cao, từ
99,0 ÷ 99,5%, cho thấy phương pháp lặp lại, độ đúng cao. Quy trình phân tích
này sẽ được áp dụng để phân tích các mẫu thực tế là mẫu thức ăn chăn nuôi.
3.3.3. Xác định đồng thời salbutamol, metoprolol và ractopamin trong mẫu
thức ăn chăn nuôi
Trước khi xác định Sal và Rac trong mẫu thức ăn chăn nuôi, các cation
có thể gây ảnh hưởng đến phép phân tích đã được khảo sát sơ bộ và khẳng
định được các cation nếu có trong mẫu thức ăn chăn nuôi cũng không ảnh
hưởng đến việc xác định các chất phân tích.
Mẫu thức ăn chăn nuôi được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm An toàn
Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia. Đây là mẫu lưu, đã phân tích cho kết quả có
hàm lượng chất tạo nạc. Điện di đồ thể hiện trong hình 3.33.
cations

20mV
1

Rac
2
Rac
3
Sal
0

100

200

300

400

500

600

Thêi gian di chuyÓn (s)

Hình 3.33. Điện di đồ xác định Sal, Met, Rac trong một số mẫu thức ăn
chăn nuôi. Các đường số 1, 2, 3 tương ứng với các mẫu TACN 1, 2, 3
Từ kết quả ở hình 3.33 cho thấy không có Met trong cả ba mẫu thức ăn
chăn nuôi nhưng có Rac và Sal trong hai mẫu. Các mẫu này được gửi phân
tích đối chứng bằng phương pháp HPLC cho sai số giữa hai phương pháp dao
động dưới 15 % chứng tỏ hàm lượng Sal và Rac thu được theo hai phương
pháp khá phù hợp ở hàm lượng cỡ ppm.
17


Bảng 3.26. Kết quả phân tích Sal và Rac trong mẫu thức ăn chăn nuôi
(TACN)
Tên mẫu

Hàm lƣợng chất phân
tích (bằng CE - C4D)

TACN 1 - có Rac
TACN 2 - có Rac

TACN 3 - có Sal

ND
36,21 ± 0,15 (ppm)
297,13 ±0,92 (ppm)

Hàm lƣợng chất
phân tích (bằng
HPLC-MS)
31,53 (ppm)
281,03 (ppm)

Sai số giữa
phƣơng pháp
(%)
12,92
5,42

ND: Không định lượng được với LOQ của Rac là 2,3 ppm
-: Không phân tích
Đối tượng nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi là các mẫu nước tiểu và
mẫu thịt lợn của lợn đã được nuôi bằng thức ăn chăn nuôi có chứa chất tạo nạc,
cụ thể là salbutamol. Tuy nhiên các đối tượng mẫu này có đặc điểm là thành
phần nền phức tạp và có hàm lượng Sal thấp hơn LOD, LOQ của phương pháp
CE-C4D, do vậy trước khi phân tích bằng phương pháp điện di cần tiến hành
tách và làm giàu Sal từ nền mẫu bằng phương pháp chiết tách phù hợp.
3.3.4. Nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn (SPE) salbutamol trong mẫu
nước tiểu lợn
Kĩ thuật chiết pha rắn (SPE) được chọn làm kĩ thuật làm sạch, làm giàu
salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn. Các yếu tố ảnh hưởng quyết

định đến hiệu suất chiết và hiệu quả làm sạch như cột chiết, dung dịch chiết,
dung môi rửa giải, dung môi rửa tạp,.. sẽ được khảo sát để lựa chọn điều kiện
tối ưu.
a) Khảo sát lựa chọn cột chiết
Salbutamol có cấu trúc tương tự như các catecholamin, ở khoảng pH chiết
nhỏ hơn pKa Sal tồn tại ở dạng cation phân cực mạnh nên theo lý thuyết các cột
SPE theo cơ chế trao đổi cation sẽ có hiệu lực tốt để chiết Sal. Kết quả khảo sát
ảnh hưởng của các cột chiết khảo sát bao gồm cột C18 3 ml, cột SCX 3 ml và cột
CX 6 ml tới hiệu suất thu hồi của quá trình chiết được thể hiện ở hình 3.35.

Hình 3.35. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của từng loại cột chiết
18


Từ hình 3.35 có thể thấy, đúng theo lí thuyết, các cột trao đổi cation
mạnh SCX 3 ml và SCX 6 ml có pha tĩnh là silica liên kết với nhóm acid
sunfonic mạnh (pKa< 1) với ion đối là ion Na+ linh động (- SO3Na), có khả
năng trao đổi với dạng cation của salbutamol (R1NH2+R2) nên cho tín hiệu thu
được của Sal cao hơn nhiều so với cột C18. Tuy nhiên khi so sánh 2 cột 3 ml
và 6ml, cột 3 ml có hiệu suất thu hồi thấp hơn (64,2%) do có thể với lượng
nước tiểu lấy là 10 ml, dung lượng nạp mẫu của cột 3 ml đã bị quá tải. Vì thế,
cột SCX 6 ml với hiệu suất thu hồi cao (97,5 %) được lựa chọn cho những
khảo sát tiếp theo.
b ) Khảo sát dung dịch đệm chiết
Kết quả khảo sát chiết Sal từ mẫu nước tiểu trên hai nền đệm acetat pH
= 5,2, nồng độ 50 mM và đệm phosphat pH = 6,0, nồng độ 100 mM, thể tích
đệm là 10 ml cho thấy khi sử dụng đệm acetat trên điện di đồ không thấy xuất
hiện pic của Sal do đã bị bao phủ toàn bộ bởi pic tạp chất rất lớn. Khi sử dụng
đệm phosphat pH = 6 pic tạp chất thu được nhỏ hơn và nằm cách xa vị trí pic
của Sal, đồng thời pic Sal thu được rõ ràng và sắc nét. Do đó, đệm phosphat

pH = 6,0, nồng độ 100 mM được lựa chọn là đệm tối ưu cho quá trình chiết.
c) Khảo sát quá trình rửa tạp
Dung dịch rửa tạp được lựa chọn phải tương tác đủ mạnh với các tạp
chất để loại bỏ chúng nhưng lại tương tác đủ yếu với chất phân tích để không
làm mất chất trong quá trình rửa. Bốn dung dịch rửa tạp chất đã được lựa
chọn để khảo sát gồm:
Dung dịch 1: 3ml H2O →1,5ml CH3OH.
Dung dịch 2: 3ml hỗn hợp aceton /H2O (1/1 v/v).
Dung dịch 3: 3ml H2O.
Dung dịch 4: 3ml CH3OONH4.

Hình 3.38. Hiệu suất thu hồi của các dung dịch rửa tạp
Kết quả thu được từ hình 3.38 cho thấy hiệu suất thu hồi ứng với bốn
dung dịch 1, 2, 3, 4 đều tương đối cao, trong đó hiệu suất thu hồi của dung
dịch 2 và 4 gần bằng nhau và cao hơn hai dung dịch còn lại. Với hai dung
dịch 2 và 4, dung dịch 2 cho đường nền đẹp, pic cation nhỏ, tín hiệu phân tích
tốt. Vì vậy chúng tôi lựa chọn dung dịch 2, tức là tiến hành rửa tạp bằng 3 ml
hỗn hợp aceton /H2O (1/1 v/v) cho các nghiên cứu tiếp theo.
19


c) Khảo sát dung môi rửa giải
Để rửa Sal chọn lọc ra khỏi cột chiết, ngược lại với dung dịch rửa tạp,
cần chọn dung môi rửa giải có thể hòa tan tốt Sal nhưng lại hòa tan ít các
dạng cation tạp. Tiến hành khảo sát ba hệ dung môi rửa giải sau:
Hỗn hợp 1: 6ml CH2Cl2/2 propanol/NH3 (78/20/2 v/v/v)
Hỗn hợp 2: 6ml CH3OH/NH3 (95/5 v/v)
Hỗn hợp 3: 6ml CH3OH/CH3COOH (9/1/v/v)
10mV
(3)

(2)
Sal

(1)
0

100

200

300

400

500

600

Thêi gian di chuyÓn (s)

Hình 3.39. Khảo sát hệ dung môi rửa giải chiết pha rắn mẫu nước tiểu lợn
(1; 2; 3 tương ứng với quy trình 1; 2; 3)
Kết quả thể hiện trong hình 3.39 cho thấy, hỗn hợp rửa giải 2 là 6 ml
CH3OH/NH3 (95/5 v/v) có khả năng rửa giải Sal tốt nhất, cho tín hiệu của Sal
rõ nét, pic cation nhỏ, đường nền đẹp và hiệu suất thu hồi cao là 97,4%. Từ đó
lựa chọn dung dịch rửa giải tối ưu là 6 ml CH3OH/NH3 (95/5 v/v) cho các
nghiên cứu tiếp theo.
Dựa trên các kết quả nghiên cứu thu được, điều kiện tối ưu cho quá
trình chiết pha rắn Sal trong mẫu nước tiểu lợn sử dụng cột SCX 6 ml được

tổng hợp dưới sơ đồ sau:
SCX 6 ml
Hoạt hoá 10 ml CH3OH+ 10 ml H2O +10 ml đệm phosphat pH 6
Nạp mẫu 10 ml nuớc tiểu + 10 µl Sal 100 ppm
Rửa tạp 3 ml hỗn hợp axeton/H2O (1/1 v/v)
Thổi khô cột, rửa giải 6 ml hh CH3OH/NH3(95/5)
Thổi khô bằng dòng khí nitơ ở 450
Hòa tan cặn bằng 100 µl CH3OH
20


c) Đánh giá phương pháp phân tích Sal trong mẫu nước tiểu lợn bằng
phương pháp CE - C4D kết hợp chiết pha rắn xử lý mẫu phân tích
Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) và giới hạn định lượng của
phương pháp (MQL) xác định được là 30 ppb và 100 ppb. Độ lệch chuẩn RSD
% nhỏ hơn 5 %, hiệu suất thu hồi 96,9 % chứng tỏ độ lặp của phương pháp là
tương đối tốt và độ chính xác cao theo AOAC phù hợp để phân tích mẫu thực
tế. Đặc biệt đây là lần đầu tiên có sự kết hợp giữa kỹ thuật chiết pha rắn (SPE)
với phương pháp CE-C4D nhằm xác định Sal, giúp làm tăng độ nhạy của
phương pháp CE-C4D, phù hợp để áp dụng phân tích các mẫu thực tế.
d) Phân tích mẫu nước tiểu thực tế
Qui trình phân tích CE-C4D kết hợp với chiết pha rắn được áp dụng để
phân tích một số mẫu nước tiểu lấy từ con lợn nuôi thí nghiệm cho ăn Sal. Kết
quả phân tích được cho trong bảng 3.29.
Bảng 3.29. Kết quả phân tích hàm lượng Sal trong 08 mẫu nước tiểu được lấy
theo ngày nuôi với thức ăn bổ sung Sal.
Ngày lấy mẫu
Nồng độ (ppm)

18/8/14 19/8/14 20/8/14 22/8/14 24/8/14 26/8/14 1/9/14 6/9/14

0,44
0,32
0,53
0,34
0,37
0,73
1,22
2,23

Kết quả phân tích cho thấy các mẫu đều chứa Sal với nồng độ từ 0,322,23 ppm. Như vậy, dựa trên việc xác định Sal trong mẫu nước tiểu có thể
nhận biết được con lợn có ăn thức ăn chứa Sal hay không. Điều này sẽ giúp
các nhà quản lý kiểm soát được việc sử dụng Sal trong thức ăn chăn nuôi và
lợn nuôi thức ăn có chứa Sal.
3.3.5. Nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn (SPE) làm giàu salbutamol
trong mẫu thịt lợn
a) Khảo sát lựa chọn cột chiết
Các cột chiết pha rắn được khảo sát gồm cột C18 3 ml, cột SCX 3 ml,
cột SCX 6 ml, cột MCX 6 ml. Kết quả thu được minh họa ở hình 3.41.

Hình 3.41. Khảo sát lựa chọn cột chiết pha rắn mẫu thịt lợn
(1) cột C18 , (2) cột SCX 3 ml, (3) cột SCX 6 ml, (4) cột MCX 6 ml
21


Kết quả khảo sát ảnh hưởng của từng loại cột chiết tới hiệu suất thu hồi
của quá trình chiết cho thấy khi sử dụng cột trao đổi cation mạnh SCX 6 ml,
tuy tín hiệu các tạp chất lớn nhưng hiệu suất thu hồi chất phân tích là tốt nhất
(97,3 %). Do đó, cột SCX 6 ml được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
b) Khảo sát lựa chọn quy trình rửa tạp
Nghiên cứu quá trình rửa tạp để loại bớt tạp chất trong quá trình chiết

Sal từ mẫu thịt lợn là đặc biệt quan trọng. Từ kết quả khảo sát dung dịch rửa
tạp chất trong quá trình chiết Sal từ mẫu nước tiểu, tiến hành khảo sát 6 dung
dịch rửa tạp chất bao gồm:
Dung dịch 1: 6 ml H2O+ 3 ml CH3OH+ 1 ml H3PO4 10 mM
Dung dịch 2: 6 ml H2O+ 3 ml CH3OH
Dung dịch 3: 6 ml H2O+ 3 ml CH3OH+ 1 ml H3PO4 5 mM
Dung dịch 4: 3 ml H2O+ 3 ml CH3OH+1 ml H3PO4 10 mM
Dung dịch 5: 3 ml hỗn hợp axeton /H2O +1 ml H3PO4 10 mM
Dung dịch 6: 3 ml HCOOH 2 %+ 3 ml H2O
Hiệu suất thu hồi tính được của các dung dịch rửa tạp được trình bày
trong hình 3.45.

Hình 3.45. Kết quả hiệu suất thu hồi của từng dung dịch rửa tạp
(1, 2, 3, 4, 5, 6 ứng với các dung dịch rửa tạp 1, 2, 3, 4, 5, 6)
Kết quả cho thấy dung dịch rửa tạp 2 (sử dụng 6 ml H2O+ 3 ml CH3OH)
có hiệu suất thu hồi Sal lớn nhất là 98,5% nên được lựa chọn là dung dịch rửa
tạp tối ưu.
Kết quả chiết mẫu nước tiểu cộng với kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy
dung dịch rửa giải trong chiết Sal trong mẫu nước tiểu lợn cũng là dung dịch
rửa giải tối ưu để chiết Sal trong mẫu thịt lợn. Các điều kiện tối ưu cho quá
trình chiết pha rắn Sal trong mẫu thịt lợn sử dụng cột SCX 6 ml được tổng
hợp dưới sơ đồ sau:
22


SCX 6 ml
Hoạt hoá 10 ml CH3OH+ 10 ml H2O +10 ml đệm phosphat pH 6
Nạp mẫu 2 g thịt lợn đã được xử lý
Rửa tạp 6 ml H2O + 3 ml CH3OH
Thổi khô cột, rửa giải 6 ml hh CH3OH/NH3(95/5)

Thổi khô bằng dòng khí nitơ ở 450
Hòa tan cặn bằng 100 µl CH3OH
c) Đánh giá phương pháp phân tích salbutamol trong mẫu thịt bằng kĩ thuật
CE-C4D sử dụng chiết pha rắn xử lý mẫu phân tích
MDL và MQL phân tích Sal trong mẫu thịt lợn bằng phương pháp CEC4D thu được là 40 ppb và 133 ppb. Độ lệch chuẩn RSD đạt 7,1 % và hiệu suất
thu hồi trung bình 87,0 %. Như vậy, các kết quả thu được từ việc khảo sát, đánh
giá phương pháp phân tích Sal trong mẫu thịt lợn bằng phương pháp CE-C4D
kết hợp với chiết pha rắn để xử lí mẫu đáp ứng được yêu cầu của một phép phân
tích theo AOAC, có thể áp dụng phân tích Sal trong mẫu thịt lợn thực tế.
d) Kết quả phân tích mẫu thịt lợn
Mẫu thịt lợn được lấy từ con lợn nuôi thí nghiệm. Kết quả phân tích cho
thấy trên điện di đồ của mẫu thịt xuất hiện pic Sal tương đối rõ nét nhưng diện
tích pic để định lượng nhỏ, nồng độ Sal ở đây ước tính nhỏ hơn giới hạn định
lượng của phương pháp (133 ppb) nhưng vẫn có thể tính tương đối nồng độ
Sal thu được là 116,0 ppb. Như vậy trước mắt có thể khẳng định có thể phát
hiện được sự có mặt của Sal trong mẫu thịt bằng cách sử dụng phương pháp
chiết pha rắn kết hợp với CE-C4D. Đồng thời dựa trên việc xác định có Sal
trong mẫu thịt hay không, có thể nhận biết được con lợn có ăn thức ăn chứa
Sal không. Điều này sẽ giúp các nhà quản lý kiểm soát được việc sử dụng Sal
trong thức ăn chăn nuôi và lợn nuôi ăn Sal.
3.3.6. Kết quả phân tích đối chứng với phương pháp LC/MS/MS
Để đánh giá độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp phân tích Sal
trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn bằng phương pháp CE - C4D, một số mẫu
nước tiểu và mẫu thịt lợn được gửi phân tích đối chứng bằng phương pháp
LC/MS/MS. Các kết quả phân tích được trình bày trong bảng 3.32.
Bảng 3.32. Kết quả phân tích Salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn
bằng phương pháp CE - C4D, đối chứng với phương pháp LC/MS/MS
Ngày lấy mẫu
CE-C4D (ppb)
LC/MS/MS (ppb)

Độ lệch (%)

Nƣớc tiểu 22/8
340,00
403,10
15,60

Nƣớc tiểu 6/9
2230,0
2212,1
0,80

Thịt 8/9/14 Thịt 10/12/15
116,00
KPH
104,20
0.28
11,30

Bảng 3.32 cho thấy độ lệch khi phân tích mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn
bằng phương pháp CE-C4D so với phương pháp tiêu chuẩn LC/MS/MS dao động
từ 0,8 ÷ 15,6 %. Từ đó có thể kết luận phương pháp CE-C4D có độ đúng cao, có
thể áp dụng để phân tích Sal trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn cho độ tin cậy
cao, góp phần giúp các nhà quản lý kiểm soát việc sử dụng Sal trong chăn nuôi.
23