Bài giảng thực hành Vi sinh công nghệ thực phẩm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.78 MB, 32 trang )
NHỮNG QUI ĐỊNH TRONG PHÒNG THỰC HÀNH
VI SINH VẬT
A. Mục tiêu:
1.
Thực hiện được những yêu cầu đảm bảo an toàn trong phòng thực hành.
2.
Thực hiện đúng những qui định đề phòng nhiễm trùng.
3.
Trình bày được các biện pháp phòng ngừa và xử trí một số rủi ro có thể
xảy ra trong thực hành vi sinh.
B. Nội dung
1. Những yêu cầu cơ bản đảm bảo an toàn
1.1. Những yêu cầu cơ bản về phòng thực hành vi sinh vật – ký sinh trùng
Phải có diện tích làm việc và bố trí phù hợp. Khoảng cách làm việc hợp lý
nhằm hạn chế tối đa sự di chuyển trong phòng, tránh nguy cơ lây nhiễm. Thông
thường phòng thực hành vi sinh vật cần phân chia các khu vực như sau:
-
Lưu trữ mẫu
-
Rửa dụng cụ, khử trùng, làm khô
-
Bảo quản hóa chất
-
Pha chế môi trường
-
Thao tác nuôi cấy vi sinh vật có lợi
-
Thao tác nuôi cấy vi sinh vật gây bệnh
Phòng thực hành phải đảm bảo đủ sáng, thoáng khí nhưng không bụi. Khu thao
tác nuôi cấy cần lắp đặt đèn UV để tiệt trùng không khí và không gian làm việc, hạn
chế tối đa việc sử dụng quạt để tránh lây nhiễm. Hóa chất cần bảo quản nơi khô, mát,
tránh ánh sáng chiếu trực tiếp và an toàn cháy nổ.
1.2. Sổ lưu ký thí nghiệm
* Nhật ký thiết bị
Các dụng cụ, thiết bị phải có sổ ghi chép, người sử dụng cần ghi hoặc đăng ký
thời gian bắt đầu và kết thúc sử dụng dụng cụ, thiết bị, tình trạng trước và sau khi sử
dụng.
1
* Nhật ký thí nghiệm
Mỗi sinh viên làm thực hành cần phải có sổ ghi chép các công việc đã làm, các
kết quả thu được một cách cẩn thận, rõ ràng và làm bài phúc trình kết quả thực hiện
trên giấy A4 (Ví dụ: Họ Tên, Lớp, nhóm, ngày tháng năm, tên bài thực hành, phương
pháp tiến hành, diễn biến và kết quả…).
1.3. Các qui tắc an toàn
Thao tác an toàn trong phòng thực hành vi sinh vật là một yêu cầu cực kỳ quan
trọng, vì chúng ta phải tiếp xúc trực tiếp với một lượng rất lớn vi sinh vật (khoảng 10 9
tế bào/ml ), có nhiều chủng vi sinh vật là tác nhân gây bệnh nguy hiểm, ảnh hưởng đến
sức khỏe và tính mạng của chúng ta. Ngoài ra cũng có một số hóa chất độc hại nên khi
làm việc cần chú ý đến những qui tắc an toàn để bảo vệ bản thân và những người xung
quanh.
-
Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật.
-
Di chuyển nhẹ nhàn, thao tác cận thận và chắc chắn.
-
Trước và sau khi làm việc với vi sinh vật, cần sát trùng vị trí, không gian
làm việc, dụng cụ và hai tay bằng cồn 70o và để khô.
-
Khi lỡ tay làm đổ hay nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, cần dùng khăn giấy
tẩm cồn 70o hay chất diệt khuẩn lau kỹ và khử trùng lại nơi làm việc.
-
Khi đốt que cấy có dính vi sinh vật cần đặt đầu hay vòng cấy vào chân ngọn
lửa, thân que cấy nằm vào ngọn lửa đốt cho cháy đỏ trước sau đó kéo từ từ
lên đến vòng cấy để tránh văng vi sinh vật vào không khí.
-
Cẩn thận thao tác với đèn cồn, dùng nấp đậy một cách dứt khoát, không thỏi
đèn bằng miệng, không dùng đèn để mồi lửa, không để đèn cháy mà khi
không làm việc.
-
Không dùng mũi ngửi hóa chất, môi trường, vi sinh vật.
-
Không dùng miệng hút hóa chất mà phải chọn lựa dụng cụ phù hợp để sử
dụng.
-
Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, phải đeo găng tay để thu gom hết các mảnh
vỡ cho vào túi riêng
-
Các dụng cụ, thiết bị cần phải nắm rõ cách sử dụng, không sử dụng tùy tiện.
-
Tất cả chất thải rắn, môi trường có chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần khử
trùng trước khi bỏ vào bãi rác. Các dụng cụ nhiễm vi sinh vật cần ngâm
2
nước tẩy (nước javel hoặc những dung dịch sát khuẩn khác) trước khi rửa và
tái sử dụng.
-
Sát trùng và rửa tay trước khi rời phòng thí nghiệm
2. Một số nguyên tắc làm việc với vi sinh vật
Khi làm việc với vi sinh vật cần hạn chế đến mức tối đa sự lây nhiễm và nhầm
lẫn các giống với nhau, cần thực hiện các bước cơ bản sau:
+ Khử trùng: Phòng thí nghiệm phải được vệ sinh sạch sẽ, bàn làm việc được lau
bằng chất sát khuẩn thích hợp (dung dịch javen, cồn 70o, cloramin 1%,..), chiếu tia cực
tím (UV) trước khi tiến hành thí nghiệm.
+ Không có luồng gió lưu thông khi làm thí nghiệm, đóng kín cửa và không sử
dụng quạt.
+ Cấy vi sinh vật cần thực hiện trong tủ an toàn sinh học (tủ cấy vô trùng).
+ Dụng cụ dùng để nuôi, cấy vi khuẩn phải được vô trùng.
+ Các thao tác đều được thực hiện bên ngọn lửa đèn cồn.
+ Que cấy phải được hơ nóng trước khi lấy mẫu và sau khi sử dụng.
+ Cầm ống nghiệm luôn ở trạng thái nghiên 1 góc nhỏ hơn 45 0 so với mặt phẳng
ngang để hạn chế bụi rơi vào. Hơn nóng miệng ống nghiệm sau khi mở nắp và trước
khi đóng nắp.
+ Đối với đĩa Petri, để đĩa nằm ngang, nắp nằm phía trên, đáy nằm phía dưới hé mở
tạo một góc khoảng 30o, làm như thế nắp vẫn còn che phía trên của đáy đĩa hạn chế bụi
rơi vào.
+ Khi để trong tủ ấm hay tủ lạnh để đáy phía trên, nắp phía dưới hạn chế bay hơi
nước làm khô môi trường.
3. Những qui định đề phòng nhiễm trùng
Để đề phòng nhiễm trùng, khi làm việc trong phòng thực hành vi sinh vật cần
phải thực hiện nghiêm túc những qui định sau đây:
-
Không ăn uống, hút thuốc trong phòng.
-
Đầu, tóc gọn gàn.
-
Mặt áo blouse, mang khẩu trang, đeo răng tay khi thao tác với vi sinh vật
hay hóa chất.
3
-
Thận trọng không để bắn các giọt nhỏ có vi sinh vật ra ngoài không khí, khi
lắc hay ly tâm dung dịch có vi sinh phải đậy nắp.
-
Khử trùng thường xuyên bàn làm việc, sàn nhà bằng chất sát khuẩn.
-
Các thiết bị nhiễm vi sinh (tủ ấm, máy ly tâm,..) phải được khử trùng bằng
chất sát khuẩn.
4. Xử trí một số tai nạn hay gặp
Loại tổn thương
Xử trí
Hóa chất hay chất sát khuẩn có nồng độ Nhanh chóng rửa kỹ bằng nước sạch và
cao bắn vào mắt
chuyển đến bệnh viện hoặc chuyên khoa
Hít phải chất sát khuẩn, dung dịch kiềm Bôi vaselin oxycyanat
hoặc acid
Tổn thương do các vật nhọn đâm hay Bóp cho máu chảy, rửa nước sạch, bôi
mảnh thủy tinh vỡ
cồn (iod hoặc betadin)
Bỏng
Cho nước lạnh sạch chảy qua khoảng 10
phút, sau đó bôi thuốc chống bỏng
Vi khuẩn vào miệng
Không nuốt, xúc miệng kỹ bằng nước có
chất sát khuẩn
4
BÀI 1: DỤNG CỤ, THIẾT BỊ TRONG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT
VÀ PHƯƠNG PHÁP LÀM MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG (5 tiết)
A. Mục tiêu:
- Biết sử dụng, bảo quản các trang thiết bị, dụng cụ thường dùng trong phòng thí
nghiệm vi sinh vật
- Thực hiện được các bước chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để phân lập vi khuẩn
B. Nội dung
1. Các trang thiết bị thường dùng
1.1. Các dụng cụ thủy tinh.
- Đĩa petri (hộp lồng): gồm một nắp và một đáy nhỏ hơn được lồng vào nhau,
thường dùng chứa môi trường đặc (thạch) để cấy vi khuẩn. Khi đĩa có chứa môi trường
cần úp ngược đĩa tránh bóc hơi nước làm khô môi trường.
- Ống nghiệm: Dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn, pha loãng hay lưu trữ vi khuẩn
- Lọ thủy tinh/ bình tam giác: dùng để chứa hóa chất, môi trường nuôi cấy
- Cốc thủy tinh/cốc nhựa: dùng để pha môi trường, pha hóa chất.
- Đèn cồn: có tác dụng vô trùng khi làm việc với vi khuẩn
- Phiến kính/lam: sử dụng làm tiêu bản khi quan sát hình thái, sinh hóa, di động
của vi khuẩn,…
- Lá kính/lamel: Dùng để đậy lên vết bôi của vi khuẩn trên phiến kính
- Phiến kính có khung đếm/buồng đếm: Dùng để kiểm tra số lượng vi khuẩn
1.2. Dụng cụ thiết bị khác
- Que cấy: Được chế tạo bằng kim loại chóng nóng và chóng nguội, dùng để lấy
và chuyển vi khuẩn, có 4 loại que cấy:
+ Que cấy vòng: được làm bằng kim loại, có đầu uốn cong thành vòng tròn,
được sử dụng lấy vi khuẩn từ môi trường lỏng hoặc đặc chuyển sang môi
trường khác, sử dụng cấy vạch (cấy ria) để tách ròng.
5
+ Que cấy thẳng: được làm bằng kim loại, đầu thẳng dùng để cấy trích sâu
trong môi trường đặc.
+ Que cấy móc: làm bằng kim loại, đầu uốn hơi cong giống như có móc dùng
để cấy nấm và xạ khuẩn.
+ Que cấy gạt: thường làm bằng thủy tinh, đầu có hình tam giác hoặc hình
chữ L dùng để phân bố dịch chứa vi khuẩn trên mặt môi trường đặc.
- Cân: cân môi trường, hóa chất,…
- Máy đo pH: dùng để phá hóa chất và môi trường
- Tủ lạnh/tủ âm: lưu trữ, vi sinh vật, hóa chất, môi trường
- Tủ cấy vô trùng (tủ an toàn sinh học): Có hệ thống quạt, đèn UV, khử trùng tạo
khoảng không gian vô trùng để cấy vi sinh vật
- Tủ ấm: Dùng để ủ vi sinh vật, có chế độ điều chỉnh nhiệt độ phù hợp giúp cho
vi sinh vật phát triển
- Tủ sấy: dùng để sấy khô các dụng cụ
- Nồi hấp khử trùng nhiệt ướt (autoclave): hấp khử trùng môi trường, một số
nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm bằng hơi nước ở áp suất cao.
- Kính hiển vi quang học: dùng để quan sát hình thái, sự di động hay khảo sát trực
tiếp số lượng vi khuẩn
6
Kính hiển vi quang học
1.3. Một số điểm cần lưu ý khi sử dụng thiết bị, dụng cụ
-
Tủ lạnh, tủ ấm: khi bảo quản môi trường nuôi cấy vi khuẩn, hóa chất hay
giống vi sinh vật cần phải ghi thời gian và làm dấu tên người làm thí
nghiệm, sắp xếp gọn gàng, ngăn nắp tránh nhầm lẫn hay đổ vỡ.
-
Đối với tủ cấy vô trùng: trước khi cấy phải bậc đèn UV 30 phút, trước và
sau khi cấy phải dùng cồn 700 lau tủ. Sử dụng chổi và giẻ riêng để quét, lau
tủ, bậc quạt trong khi cấy.
-
Que cấy: trước và sau khi cấy phải hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi đầu
và thân que cấy cháy đỏ.
-
Đèn cồn: Không được dùng miệng thổi đèn, không mồi lửa từ đèn này sang
đèn khác, không rót cồn quá đầy. Khi không sử dụng đèn thì dùng nắp đậy
để tắt đèn.
-
Hấp khử trùng: Cần thận để tránh bị bỏng, phải nắm rõ yêu cầu và mục đích
khử trùng, điều kiện khử trùng, cách sử dụng nổi khử trùng. Các dụng cụ
chứa hóa chất, môi trường khử trùng không được chứa nhiều hơn 1/3 thể
tích.
-
Kính hiển vi quang học: Cần quan sát mẫu ở vật kính có độ phóng đại nhỏ
(10X) thật rõ trước khi chuyển sang vật kính dầu (100X). Ở vật kính 40X
thấy rõ, nhỏ 1 giọt dầu vào giữa tiêu bản tại điểm sáng rồi chuyển vật kính
100X vào. Không sử dụng ốc thứ cấp điều chỉnh khi quan sát mẫu ở vật
kính 40X và 100X. Đối với vật kính dầu, sau khi sử dụng xong phải dùng
giấy hoặc khăn lau dành riêng tẩm cylon hoặc xăng tốt lau thật sạch.
7
2. Thực hành làm môi trường dinh dưỡng
Làm môi trường dinh dưỡng dùng để phân lập, nhân và giữ giống vi sinh vật,
đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu những đặc điểm sinh học của chúng.
+ Nguyên tắc
-
Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hoá các
chất dinh dưỡng của từng loại sinh vật.
-
Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh
vật.
-
Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của
vi sinh vật.
+ Dụng cụ và thiết bị
-
Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cân, máy đo pH, phễu, giấy lọc, tủ cấy
vô trùng, tủ ấm.
-
Môi trường dinh dưỡng, agar, nước cất.
+ Các bước thực hiện
-
Cân, đong chính xác các thành phần môi trường theo hướng dẫn của nhà sản
xuất (đối với môi trường pha sẳn) hoặc các hóa chất theo công thức môi
trường.
-
Hòa tan các chất vào nước.
-
Làm trong môi trường bằng cách lọc môi trường bằng bông hoặc giấy lọc.
-
Kiểm tra thể tích, pH nếu có.
-
Phân phối môi trường vào dụng cụ như ống nghiệm, bình tam giác. Đối với
ống nghiệm, trước khi rót phải đun cho hóa chất hòa tan đều rồi mới rót vào
ống nghiệm. Môi trường được phân phối vào dụng cụ khoản ¼ đến 1/3 thể
tích của dụng cụ.
-
Khử trùng, tùy từng loại môi trường và yêu cầu sử dụng chọn các phương
pháp khử khác nhau, thông thường khử trùng bằng nhiệt ướt ở nhiệt độ
121oC, áp suất 1 atm, thời gian 15 phút.
+ Đổ thạch (môi trường dinh dưỡng thạch)
8
Thao tác đổ hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn. Mặt thạch
phải phẳn, nhẵn, có độ dày khoản 2mm. Môi trường sau khi đổ cho vào tủ ấm 1 – 2
ngày kiểm tra xem có nhiễm khuẩn hay không rồi mới sử dụng.
• Làm thạch đĩa:
-
Việc phân phối môi trường vào đĩa petri phải được thực hiện trong vô trùng.
-
Đĩa petri phải được vô khuẩn (khử trùng cùng lúc với môi trường).
-
Đặt đĩa trong tủ cấy vô trùng, nắp nằm phía trên, đáy phía dưới.
-
Hé nắp một phần đĩa và rót môi trường vào (tùy theo mục đích của thí
nghiệm mà lượng môi trường được phân phối vào đĩa có thể dày hay mỏng).
-
Đậy nắp lại, xoay đĩa theo đường tròn tới, lui vài lần tránh làm môi trường
dính vào thành đĩa.
-
Hé mở nắp một phần đĩa, bậc đèn UV của tủ và để yên khoảng 15 phút.
-
Tắc đèn UV, đậy nắp đĩa lật úp mặt đáy lên và cho vào hộp đựng đĩa hoặc
bọc kiến để vào tủ ấm ở nhiệt độ 37 oC trong 24 – 48 giờ kiểm tra sự nhiễm
khuẩn. Bảo quản lạnh 0 – 5oC, sử dụng không quá 1 tuần.
• Làm thạch nghiên
-
Môi trường sau khi pha rót vào ống nghiệm không quá ¼ thể tích ống.
-
Vặn nút ống nghiệm không quá chặt làm hơi không thoát ra.
-
Khử trùng.
-
Sau khi khử trùng các ống nghiệm chứa môi trường được đặt nghiên một góc
sao cho môi trường trong ống tạo thành một mặt phẳng nghiên, sâu đạt yêu
cầu.
-
Để nguội, vặn nắp ống nghiệm chặt lại và luôn giữ ống đứng, bảo quản điều
kiện lạnh.
• Làm thạch đứng
-
Các bước thực hiện giống như là thạch nghiên, nhưng sau khi khử trùng ta
vẫn giữ ống môi trường đứng cho đến khi môi trường cứng lại
Các đĩa, ống môi trường được dán nhãn (nhãn gồm tên môi trường, thời gian đổ, người
làm thí nghiệm)
9
10
BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI KHUẨN (5 tiết)
A. Mục tiêu:
- Nắm được nguyên tắc phân lập
- Thực hiện được các phương pháp cấy để phân lập vi khuẩn tạo dòng thuần
- Biết cách đọc kết quả sau khi phân lập
B. Nội dung
1. Khái niệm
Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng vi khuẩn từ quần thể hay mẫu vật ban
đầu để thu nhận những giống thuần khiết.
2. Nguyên tắc
Tách rời các tế bào vi khuẩn, nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh
dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
3. Dụng cụ và thiết bị
- Đĩa môi trường thạch dinh dưỡng, ống môi trường thạch nghiên, que cấy
vòng, đèn cồn, quẹt
- Mẫu bệnh phẩm, thực phẩm, hoặc hỗn dịch vi khuẩn
4. Phương pháp cấy
* Cấy ria góc
- Dùng bút long chia bên ngoài đáy đĩa ra 4 phần và đánh số từ 1 – 4.
- Đốt nóng que cấy, để nguội lấy một ít mẫu hoặc vi khuẩn từ hỗ dịch.
- Hé nắp đĩa petri, cho đầu que cấy có dính mẫu chạm nhẹ vào mặt thạch tại ô
số 1, trượt nhẹ que cấy theo đường zizac liên tục. Tránh đè mạnh que cấy làm
bể mặt môi trường.
- Đốt nóng que cấy, để nguội, chạm đầu que cấy vào đường cấy ở ô 1 kéo nhẹ
sang ô số 2, trượt que cấy theo đường zizac liên tục trong ô này, đường cấy
không trùng nhau.
- Đối với các ô còn lại cũng làm tương tự. Sau mỗi lần cấy, que phải được đốt
nóng. Lần cấy cuối cùng sau khi đốt nóng phải nhúng que vào cồn 700.
11
- Cấy xong, đậy nắp lại, hơ xung quanh miệng đĩa trên ngọn lửa đèn cồn, đặc
ngược hộp thạch đáy lên trên, nắp ở dưới, cho vào tủ ủ ấm 37 oC. Hôm sau đọc
kết quả.
* Phương pháp cấy ria liên tục
- Lấy một ít mẫu hay hỗn dịch vi khuẩn, trượt đều đầu que cấy trên ½ mặt thạch
theo đường zizac liên tục.
- Không đốt nóng que cấy và không đưa que ra khỏi đĩa, không quay bề mặt đầu
que cấy mà xoay đĩa thạch một gốc 90o và tiếp tục tạo đường zizac liên tục như trên
trên vùng thạch còn lại.
- Chuẩn bị đĩa cấy ria đối chứng để kiểm tra sự vô khuẩn. Các bước thực hiện như
trên nhưng que cấy không lấy mẫu hay hỗ dịch vi khuẩn mà cấy không.
12
5. Đọc kết quả
Sau thời gian ủ ấm nhất định, tế bào vi khuẩn phát triển thành một bộ lạc
(khúm) vi khuẩn được gọi là khuẩn lạc. Mỗi một loại vi khuẩn khi tăng trưởng sẽ tạo
nên khuẩn lạc khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc, độ trong, đục,…. Tiến
hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về kích
thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ
trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không).
-Hình dạng khuẩn lạc.
+ Đường kính
+ Đường viền .
+ Bề mặt ( lồi hay lõm, khô hay ướt, trơn hay sần sùi…)
+ Hình dạng tổng thể (tròn đều, không đều, …)
-Màu sắc của khuẩn lạc.
-Độ đục trong của khuẩn lạc.
Mỗi một sự khác nhau về chi tiết của hình dạng, màu sắc, độ đục trong của khuẩn
lạc có thể tượng trưng cho một loại vi khuẩn khác nhau.
Sau khi quan sát hộp thạch để tìm sự khác biệt của các loài khuẩn lạc. Có thể kết
luận: có bao nhiêu khuẩn lạc khác nhau là có bấy nhiêu loại vi khuẩn hiện diện trên
hộp thạch.
13
BÀI 3: NHUỘM GRAM VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI KHUẨN (5 Tiết)
A. Mục tiêu:
-
Thực hiện được qui trình nhuộm Gram
-
Đọc kết quả nhuộm, phân biệt nhóm vi khuẩn Gram âm, Gram
dương, hình dạng tế bào và kiểu sắp xếp
B. Nội dung
1. Nguyên tắc
Dựa trên khả năng bắt màu của màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh
(Crystal violet) mà chia thành hai nhóm:
+ Nhóm thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm Crystal violet sau khi
cố định bởi dung dịch lugol không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi khuẩn thuộc
nhóm này gọi là vi khuẩn Gram dương.
+ Nhóm thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm Crystal violet khi
xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm Safranin bổ sung. Vi khuẩn nhóm này
được gọi là vi khuẩn Gram âm.
2. Dụng cụ và hóa chất
- Lam, kính hiển vi quang học, que cấy, đèn cồn
- Hóa chất: Dung dịch tím kết tinh (Crystal violet = tím gentian), Dung dịch lugol,
Etanol 95%, dung dịch Safranin
3. Cách tiến hành
* Chuẩn bị vết bôi
- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ môi trường đặc
(sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính hoặc 1 vòng cấy vi
khuẩn từ huyền phù vi khuẩn, để khô tự nhiên trong không khí.
- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
- Nhỏ dung dịch tím gentian trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhỏ dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhỏ cồn 95o giữ khoảng 30 giây hoặc cho cồn chảy qua vết bôi vi khuẩn liên
tục đến khi nước cồn chảy không còn màu, rửa nước, thấm khô.
14
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 1 phút, rửa nước, để khô trong
không khí.
- Soi kính: dùng vật kính dầu 100X để quan sát
4. Đọc kết quả
- Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.
- Hình dạng tế bào vi khuẩn (que, cầu, phẩy, xoắn,…)
- Cách sắp xếp (đơn, đôi, chùm, chuỗi, đám,…)
Cầu khuẩn Gram (+)
Trực khuẩn Gram (+)
15
BÀI 4: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ Ở 37 OC BẰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC TRÊN ĐĨA THẠCH (5 tiết)
A. Mục tiêu:
- Nắm được phương pháp đếm sống vi khuẩn trên môi trường đặc
- Đánh giá được mức độ nhiễm vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm
B. Nội dung
1. Khái niệm
Là phương pháp xác định số lượng vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu thực phẩm
hay nước. Dựa vào tiêu chuẩn về an toàn thực phẩm mà chúng ta có thể biết được mức
độ nhiễm khuẩn của thực phẩm hay nước được kiểm tra.
2. Nguyên tắc
Lấy một lượng mẫu xác định trãi đều trên môi trường thạch dinh dưỡng, ủ ở nhiệt độ
37oC trong điều iện hiếu khí, sau 24 giờ đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa
3. Dung cụ và hóa chất
- Dụng cụ: Ống nghiệm, đĩa petri, máy đếm khuẩn lạc, micropipet, đầu côn, máy lắc
ống nghiệm, máy đo pH,…
- Hóa chất: nước muối sinh lý, nước cất vô trùng, môi trường PCA (plate count agar)
4. Thực hiện
- Cân 10g mẫu (10ml mẫu) cho vào ống nghiệm có chứa 90ml nước muối sinh lý
(nước cất) vô trùng, trộn đều mẫu sau đó pha loãng đến nồng độ 10-3.
- Lấy 1ml dung dịch mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri, rót môi trường
PCA (45-50oC) từ trống nghiệm vào đĩa, xoay đĩa để trộn đều mẫu với môi trường và
để nguội tự nhiên.
- Các đĩa sau khi đông đặc được ủ ở nhiệt độ 37oC, trong đều kiện hiếu khí.
- Đọc kết quả sau 24 giờ.
5. Đọc kết quả
- Chọn 2 nồng độ liên tiếp để đếm, số khuẩn lạc ở mỗi nồng độ từ 30-300 khuẩn lạc.
16
- Cách tính kết quả:
Gọi N là số khuẩn lạc có trong 1g mẫu. Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong mẫu được
tính theo công thức sau:
C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri được chọn
d: hệ số pha loãng mẫu
n1, n2 số đĩa petri chọn đếm khuẩn
VD: Ở độ pha loãng 10-2 số khuẩn lạc đếm trên 2 đĩa là 151 và 143. Ở độ pha loãng 10 3
, số khuẩn lạc đếm được là 91 và 67. Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1g mẫu là
151+143+91+67
=
N=
(2+0,1*2)10
452
0,022
-2
17
= 2*105
BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E.COLI (10 tiết)
A. Mục tiêu:
- Nắm được nguyên tắc và cách thực hiện để xác định mật độ coliform và E.
coli trong thực phẩm.
- Đánh giá mẫu thực phẩm có đạt tiêu chuẩn về mặt vi sinh trong thực phẩm.
B. Nội dung
1. Khái niệm
Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ
khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37 oC trong 24 – 48 giờ.
Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong
thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện
của các loại vi sinh vật gây bệnh khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: E. coli,
Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được
thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và
Citrate (iC) thường được gọi là IMViC.
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi
trong khoảng 24h khi ủ ở 44oC trong môi trường lỏng EC.
Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh
indole khi ủ khoảng 24h ở 44oC trong môi trường lỏng trypton. E. coli là Coliforms
phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++-- (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer
-, Citrate –
2. Nguyên tắc
Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E. coli chứa trong
mẫu nước, thực phẩm với mật độ thấp có thể xác định bằng phương pháp MPN (Most
Probable Number). Phương pháp MPN là phương pháp định lượng vi khuẩn dựa trên
kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác
nhau, mỗi độ pha loãng cách nhau 10 lần. Thông thường, việc định lượng này được
thực hiện lặp lại 3 hoặc 5 lần ở 3 độ pha loãng liên tiếp. Các ống nghiệm mẫu đều có
đặt ống bẫy khí Durham để theo dõi sự sinh hơi. Các ống nghiệm sau khi ủ thấy có đổi
màu và sinh hơi được ghi nhận là dương tính. Số lượng ống nghiệm dương tính ở từng
nồng độ được ghi nhận và tra bảng Mac Crady để suy ra số lượng vi khuẩn hiện diện
trong 1g (1ml) mẫu ban đầu.
18
3. Dụng cụ, hóa chất và mẫu thực phẩm
* Dụng cụ: ống Durham, ống nghiệm, đầu côn xanh, đầu côn vàng, micropipet, chai
nút xanh, đĩa petri, cần kỹ thuật 2 số lẻ,…
* Môi trường và hóa chất: LSB (Lauryl Sulphate Broth), BGBL (Brilliant Green Bile
Lactose Broth), EC (E.coli medium), EMB (Eosin Methylene Blue Agar), MR-VP
Both (Glucose Phosphate), trypticase, NaCl, Pepton.
* Mẫu thực phẩm: mẫu nước đóng chai, mẫu rau quả, mẫu thịt, mẫu sữa, mẫu trứng,
….
4. Các bước tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị môi trường
+ Buổi 1
- Dung dịch pha loãng mẫu SPW (mỗi nhóm 27ml, phân bố vào 3 ống nghiệm).
- Môi trường LSB (mỗi nhóm 90ml, phân bố vào 9 ống nghiệm).
+ Buổi 2
- Môi trường BGBL (mỗi nhóm 90ml, phân bố vào 9 ống nghiệm).
- Môi trường EC (mỗi nhóm 90ml, phân bố vào 9 ống nghiệm).
+ Buổi 3
- Môi trường thạch EMB (mỗi nhóm 3 đĩa).
+ Buổi 4
- Trypton (mỗi nhóm 20ml, phân bố 2 ống nghiệm).
- MR-VP (mỗi nhóm 30ml, phân bố vào 3 ống nghiệm).
- SCA (mỗi nhóm 50ml, phân bố vào 5 ống nghiệm)
Bước 2: pha loãng mẫu
- Lấy 1g (đối với mẫu rắn) hoặc 1ml (đối với mẫu lòng) cho vào ống nghiệm chứa
SPW đồng nhất mẫu được ống nghiệm mẫu có độ pha loãng 10 -1, lấy 1ml dung dịch
mẫu ống nghiệm trên cho vào ống thứ 2 được ống nghiệm có độ pha loãng 10 -2, thực
hiện tương tự như trên được độ pha loãng 10-3. Quá trình pha loãng mẫu được tóm tắt
qua hình sau:
19
1ml
1ml
10ml
Pha loãng
Độ pha loãng
10-1
101
9ml
1ml
9ml
1ml
1ml
9ml
9ml
9ml
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
102
103
104
105
106
Hình Sơ đồ pha loãng mẫu
Bước 3: Cấy mẫu vào canh LSB
Chuyển 1ml dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng 10 -1, 10-2, 10-3 vào ống nghiêm có
chứa 10ml môi trường LSB lỏng có đặt ống Durham, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại,
ủ ở 37oC.
Hình chuyển mẫu vào môi trường LSB lỏng
Sau 48 giờ kiểm tra sự sinh hơi và chuyển màu của môi trường. Ghi nhận số ống
nghiệm sinh hơi ở mỗi nồng độ.
Bước 4: Cấy chuyển mẫu vào môi trường BGBL và EC
Dùng que cấy vòng lấy một ít mẫu từ ống sinh hơi chuyển vào các ống môi trường
BGBL và EC có đặt ống Durham. Ủ ở 37 oC trong thời gian 48 giờ đối với môi trường
BGBL, và 44oC trong 24 giờ đối với ống môi trường trường EC.
20
Bước 5: Định lượng Coliform và E. Coli
Bước 6: thử nghiệm IMViC
a. Thử nghiệm Indol (I):
+ Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật
có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện
indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa
p-Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có
màu đỏ.
+ Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước tryptone.
Sinh khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ ở nhiệt độ 37oC trong
24-48 giờ. Bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết tách
indol lên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên
vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi hữu cơ.
+ Đọc kết quả:
(+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường.
(-) lớp màu vàng của thuốc thử.
Đôi khi có sự xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa của
indol tạo ra.
21
b. Thửnghiệm Methyl Red (MR):
+ Nguyên tắc: chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H + hiện diện trong môi
trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này thay đổi màu như sau: pH <4.4
đỏ; pH = 5.0-5.8 màu cam; pH >6.0 màu vàng.
+ Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng
Glucose Phosphate (MR-VP Broth). Dùng que vòng cấy một lượng nhỏ khuẩn lạc trên
môi trường MR-VP, ủ ở 37oC trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ
methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản ở 4 oC) vào trong
ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay.
+ Đọc kết quả:
(+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử.
(-) khi có màu vàng.
Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường có giống trong 4 ngày và
thực hiện lại thử nghiệm.
c. Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP)
+ Nguyên tắt: thử nghiệm VP dùng để nhận biết aceton. Trong quá trình biến dưỡng,
một nhóm vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae sản sinh ra 2,3- butanediol, chất này
bị oxy hóa tạo thành aceton. Trong môi trường kiềm, có sự hiện diện của oxy, aceton
tiếp tục bị oxy hóa tạo thành diacetyl. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong
pepton hình thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ.
22
+ Phương pháp: Cấy chủng vi khuẩn thử nghiệm sau khi được ủ 18-24 giờ vào ống
môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP) có pH 6.9. Các ống nghiệm được ủ
ở 37oC trong thời gian từ 24-48 giờ. Sau thời gian ủ, bổ sung các thuốc thử vào ống vi
khuẩn.
Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B
là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung
dịch B.
+ Đọc kết quả: Sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ
trên bề mặt môi trường. Phản ứng âm tính khi không đổi màu trên bề mặt môi trường.
d. Thử nghiệm Citrate (iC)
+ Nguyên tắc: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kềm hóa môi
trường. Mặt khác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất
đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của
muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH 3 làm kiềm hóa
môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH
trong môi trường.
+ Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng
SCA. Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên môi trường SCA rắn trong
ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 35oC trong khoảng 24-48 giờ.
+ Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh
dương.
(-) khi không có khuẩn lạc và môi trường giữ nguyên màu xanh lục
23
5 Cách tính kết quả
Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng
MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật
trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.
Tóm tắt qui trình
24
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Thùy Linh. 2010. Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm. Trường ĐH Công
Nghiệp Thực Phẩm TP HCM
2. Trần Linh Thước. 2006. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo dục.
25
