tìm hiểu về test kit

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

TIỂU LUẬN
MÔN: NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài: Test Kit
Nhóm 8
Chiều thứ 6, tiết 11-12

GVHD: Trần Hoàng Ngâu

Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2016


2

Họ và tên
Phan Thị Băng Trâm

MSSV
2008130142

Trần Hoài Nam

2008130116

Nguyễn Cao Thủy Tiên

2008140314

Vũ Thị Xuân Hiền

2008140083

Nhiệm vụ
-Tìm phần khái
niệm và phương
pháp miễn dịch
-Tổng hợp
-Tìm phần phương
pháp miễn dịch
-Tìm phần phương
pháp phân tử
-Tìm phần phương
pháp phân tử

Ghi chú
Nhóm trưởng
Hoàn thành
Hoàn thành
Hoàn thành
Hoàn thành

DANH SÁCH THÀNH VIÊN
VÀ PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ


3
MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU
Trong cuộc sống hiện đại, việc bảo vệ sức khỏe đang là một vấn đề hết sức được quan
tâm. Vì thế việc sử dụng một công cụ để có thể dễ dàng hơn trong việc dự đoán về những căn
bệnh hay vấn đề thường gặp là rất cần thiết. Test kit là bộ công cụ như thế. Thuật ngữ “test
kit” không được dùng phổ biến, thế nhưng khi nhắc tới những sản phẩm của nó thì lại rất quen
thuộc. Test kit được dùng trong rất nhiều lĩnh vực trong cả công nghiệp hay nông nghiệp.
Ngoài những loại test kit gần gũi mà ta đã biết thì bài viết này sẽ trình bày thêm một số loại
mới. Hơn nữa, bài viết còn đề cập tới cơ chế hoạt động chung của một số loại test kit - những
loại liên quan tới ngành công nghệ sinh học và y dược.
Bài viết sẽ làm rõ những một số vấn đề liên quan tới test kit để ta có thể hiểu rõ hơn về
công dụng và cơ chế của chúng. Qua đó, chúng ta có thể chọn cho mình bộ test phù hợp để sử
dụng. Bài viết bao gồm các phần:
-

Khái niệm và phân loại.
Sự phát triển của test kit.
Cơ chế chẩn đoán miễn dịch và ứng dụng
Cơ chế chẩn đoán phân tử và ứng dung
Bài viết tham khảo nhiều tài liệu khác nhau nên chắc chắn sẽ có thiếu sót. Mong nhận
được sự thông cảm và góp ý.
Xin cảm ơn!

NỘI DUNG
I. Khái niệm và phân loại:
1.Khái niệm:
Test kit được hiểu nôm na là bộ kiểm tra. Nó là một bộ công cụ để kiểm tra một
vấn đề cụ thể nào đó bằng cách lấy một lượng nhỏ mẫu và chờ xem kết quả trong một
thời gian ngắn.

4
Tesst kit không chỉ là những sản phẩm nhỏ gọn được bán ra ngoài thị trường
như ta đã thấy mà những bộ kiểm tra/chẩn đoán trong bệnh viện hay phòng thí
nghiệm cũng gọi là test kit.
Hiện nay chúng được thiết kế nhỏ gọn, dễ sử dụng, độ chính xác khá cao.
Những sản phẩm đưa ra thị trường nước ta chỉ là một phần nhỏ và thông dụng như
que thử thai, đo pH, test nhóm máu, test nước, hóa chất trong thực phẩm…
Nhưng ở các nước phát triển thì còn có các loại test kit phát hiện một số bệnh
như tiểu đường, viêm gan B/C, test vi khuẩn, test DNA, thuốc…thậm chí là test HIV.
2.

2. Phân loại:
Có nhiều phương pháp sử dụng trong test kit, nhưng phương pháp phổ biến sử
dụng trong ngành công nghệ sinh học và y dược cũng như các ngành khác là phương
pháp chẩn đoán phân tử và phương pháp chẩn đoán miễn dịch
Người bị nghi
nhiễm bệnh

Lấy mẫu
máu, phân,
nước tiểu,
sinh
thiết…

Tăng sinh
vi sinh vật

Bổ sung môi
trường phù

hợp

Phân
lập

Nhận dạng thông
qua sự phụ thuộc
tăng trương, miễn
dịch hoăc phân tử

Xét nghiệm kháng thể: tìm kháng nguyên của vi
sinh vật/virus, sử dụng kháng thể huỳnh quang,
EIA…
Phương pháp phân tử hoặc
miễn dịch

Xết nghiệm phân tử: tìm gen gây nguồn bệnh
chính,lai hóa nucleic acid, PCR

• Phương pháp chẩn đoán miễn dịch, điển hình là ELISA:


5
Test kit ELISA giúp cung cấp kết quả chính xác, nhạy cảm và nhất quán. Mỗi
đầu dò protein được nghiên cứu và các bộ dụng cụ được điều chỉnh để cung cấp
đọ nhạy cảm về mặt sinh lý có liên quan. Ngoài ra, bộ dụng cụ được xác nhận sử
dụng các loại mẫu phổ biến, bao gồm huyết thanh, huyết tương và dịch nổi nuôi
cấy tế bào. Lysates (dịch phân giải) di động được sử dụng để xác nhận bộ dụng
cụ phát hiện các protein truyền tín hiệu hoặc phosphoryl hóa.
Ưu điểm của những bộ kit ELISA:

 Dùng trên 800 đối tượng khác nhau.
 Tối ưu hóa cho hiệu suất nhạy, chính xác và nhất quán.
 Kết quả có trong 2,5 - 4h.
 Xác định với nhiều loại mẫu.
• Phương pháp chẩn đoán phân tử, điển hình là PCR và RT-PCR:
Từ một khuôn DNA rất nhỏ như giot máu, sợi tóc hay một tế báo… người ta
có thể khuếch đại chính xác, trật tự lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho
quá trình khảo sát trong phản ứng
PCR được ứng dụng rất rộng rãi trong y học : chẩn đoán bệnh ung thư (tìm
HPV trong ung thư cổ tử cung, gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRC1 –
BRCA2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen NF-1,2
trong u xơ thần kinh…), nghiên cứu kháng nguyên bạch cầu người….
Trong vi sinh vật thì PCR là một phương tiên hưu dụng để phát hiện tác nhân
gây bệnh.
II. Sự phát triển của test kit:
1960s and earlier
1980’s to 1990’s
1983

1991
1997
2000
2002
2003

Phát hiện nhiều dấu ấn sinh học và xét nghiệm chẩn đoán
bệnh hoặc mầm bệnh. Xét nghiệm miễn dịch phát triển
Những công ty dược bán và mua những công ty chẩn đoán,
hơp nhất thành những đối thủ lớn
Công nghệ PCR sử dụng nhiệt và Tag polymerase enzyme

để khuếch đại đoạn DNA, đây là công cụ chính trong
nghiên cứu công nghệ sinh học và phát triển trên toàn thế
giới
Ra những sản phẩm microarray
FDA phê chuẩn việc bán các thuốc thử cần phân tích cho
các phòng thí nghiệm được ủy quyền
Hoàn thành công trình nghiên cứu bộ gen người.
Phòng thí nghiệm tự động, công nghệ microaray tăng, được
thương mại hóa
Khởi động đề án bản đồ haplotype (SNPs)(dự án
HAPMAP)
FDA tổng hợp những hướng dẫn để sử dụng markers sinh
học trong những thử nghiệm lâm sàng.


6

Biểu đồ về sự phát triển của thị trường chẩn đoán trong ống nghiệm (IDV) toàn cầu
năm 2012, tỉ lệ các nhu cầu cầu chẩn đoán (theo Genetic Engineering News)

Top 10 công ty IVD (in vitro diagnostics) có doanh thu lớn năm 2007(theo top 10
Global In-vitro Diagnostics của Business Insights)
III.Cơ chế chẩn đoán miễn dịch:
1. Bản chất của sự kết hợp của kháng nguyên và kháng thể:


7
Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt của
kháng nguyên và kháng thể. Sự kết hợp này xảy ra giữa một phần rất giwois hạn giữa
phần tử kháng nguyên (nhóm quyết định) và một phần rất giới hạn của phần tử kháng

thể (trung tâm hoạt động).
Theo Pauling, phẩn tử kháng thể thường hóa tri hai, nghĩa cùng một lúc có thể
kết hợp với hai phần tử kháng nguyên. Còn kháng nguyên đa hóa trị nên cùng lúc có
thể kết hợp với rất nhiều phần tử kháng thể. Cho nên kháng nguyên và kháng thể có
thể kết hợp với nhau tạo thành một phức hợp hình mạng lưới trong khong gian ba
chiều. Vì kích thước quá lớn nên phức hợp kết tủa hoặc ngưng kết.
Kháng nguyên và kháng thể có thể kết hợp với nhau theo bất cứ tỉ lệ nào nhưng
phản ứng yếu đi nếu thừa hoăc thiếu kháng nguyên hoặc kháng thể. Phản ứng rõ rệt
nhất lúc số phân tử kháng nguyên tương đương với phân tử kháng thể.

Sự kết hợp giữa phần tử kháng nguyên và kháng thể xảy ra nhờ các lực như: lực
liên kết ion giữa các nguyên tử hoặc các nhóm hóa học mang điện tích trái dấu; lực
liên kết của các cầu nối hydro giữa các nguyên tử hydro mang điện tích dương với
các nguyên tử mang điện tích âm, lực Van der Walls giữa hai phân tử phụ thuôc vào
tương tác giữa các đám mây điện tử ở mặt ngoài và lực ố thủy nếu diện tiếp xúc cả
phía kháng nguyên và kháng thể đều có các acid amine ố thủy thì kháng nguyên và
kháng thể kết hợp, nước sẽ bị đẩy ra tạo nên lưc gắn kết giữa các acid amine ố thủy
đó, sự kết hợp này không phải là một phản ứng hóa học.
Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể rất đặc hiệu. Một kháng
nguyên chỉ kết hợp với kháng thể do nó kích thích cơ thể tạo thành. Do đó phản ứng
kết hợp kháng nguyên và kháng thể được sử dụng để xác định kháng nguyên hoặc
kháng thể nếu một trong hai phân tử đã biết. Hiệu giá của kháng thể trong huyết
thành người hoặc động vật có thể xác định nhờ kháng nguyên đã biết và do đó cho
biết sự tiếp xúc trước đó với kháng nguyên. Ngược lại nhờ kháng thể đã biết những
kháng nguyên khác nhau của một vi sinh vật có thể nhận mặt. Mặt khác sự hiểu biết
cấu tạo kháng nguyên cho phép lựa chọn thích đáng vi sinh vật dùng để làm vaccine
phòng ngừa bệnh nhiễm trùng.


8

2. Phương pháp ELISA:
ELISA (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa dùng để
phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫ cần phân tích. Hiện nay ELISA được sử
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là
trong quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm thực phẩm.
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét
nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là
đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể
được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol
phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất
hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và
thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát
hiện.
Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như
peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọi khác
là EIA (Enzyme ImmunoAssay)
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng
thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ
(RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ
chính xác như nhau. ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus,
vi khuẩn, nấm, kí sinh.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể
và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy
nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn
hợp
trong
dung

dịch
thí
nghiệm.


9

(Trích từ Chemicon International)
3. Phân loại ELISA:
3.1. Direct ELISA (ELISA trực tiếp)
Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA. Trong đó, kháng
nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một
kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme).


10

Sơ đồ: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp
- Ưu điểm: Đơn giản nhất
- Nhược điểm:
+ Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng
nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope.
+ Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng.
3.2. ELISA gián tiếp
Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên
không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể
này mới là kháng thể được gắn với enzyme).


11

Sơ đồ : Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp
- Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên
nên
tiện
lợi
và
kinh
tế
hơn,
dễ
dàng
thương
mại
hóa.
- Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến kết
quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh
khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được.

3.3. Sandwich ELISA
Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng
mạnh và nhạy. Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự
kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện
(detection antibodies). Kỹ thuật này cũng được phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA
(DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA –
Triple antibody sandwich).
DAS ELISA gồm sự dính thụ động của kháng thể vào pha rắn (đáy giếng). Những kháng
thể này sau đó kết hợp với các kháng nguyên được thêm vào. Những kháng nguyên được pha
loãng trong blocking buffer nhằm ngăn sự dính không chuyên biệt của chúng vào pha rắn. Ở
đây, những phần của blocking buffer không nên chứa bất kỳ kháng nguyên nào mà có thể kết

hợp với kháng thể bắt. Sau khi ủ và rửa, chỉ còn phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào
pha rắn.
Kháng thể bắt sau đó được thêm vào. Do vậy, đây là sự kết hợp trực tiếp với kháng
nguyên đích và kháng thể bắt. Kháng thể thứ hai này có thể giống kháng thể một hoặc khác về
nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể. Sau khi ủ, rửa, thêm cơ chất vào và đọc
trên máy đo quang phổ. Vì sử dụng một kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới
hạn về tính chuyên biệt và những thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt. Điều này giới


12
hạn sự linh hoạt của phương pháp, ví dụ như mỗi kháng thể được sử dụng phải được đánh dấu
riêng (cho những kháng nguyên khác nhau). Theo cách này, direct ELISA bị giới hạn về sự
chuẩn bị kháng thể. Hệ thống cũng bị giới hạn ở chỗ kháng nguyên phải có ít nhất hai epitope
vì cả hai kháng thể bắt và phát hiện đều kết hợp trực tiếp với kháng nguyên.
Kháng thể bắt trên pha rắn và kháng thể phát hiện có thể chống lại những epitope khác
nhau trên phức hợp kháng nguyên. Do đó, thuận lợi khi khảo sát sự khác biệt nhỏ giữa những
kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể phát hiện và kháng thể bắt khác nhau. Việc sử dụng cùng
một kháng thể bắt và phát hiện có thể dẫn đến vấn đề khi có giới hạn về vị trí gắn kết sẵn có
cho sự phát hiện. Kích thước và mối quan hệ không gian của các epitope trên kháng nguyên
đích là rất quan trọng và có thể ảnh hưởng mạnh đến thử nghiệm.
Sandwich ELISA có thể được chia làm hai hệ thống:
3.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp

Sơ đồ :Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp
- Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể
bắt và kháng thể phát hiện khác nhau.
- Vì phương pháp này có ưu điểm hơn hẳn những phương pháp khác mà chúng tôi chọn
phương pháp này để chẩn đoán bệnh virus đang nghiên cứu.
Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn đề
nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối quan hệ về kích thước và vị trí không

gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm.


13
3.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp

Sơ đồ: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp
Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể được gắn enzyme không
phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên.
3.4. Phản ứng ức chế /cạnh tranh
Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa là hai chất tham gia phản ứng cùng ái lực bắt cặp với
chất thứ ba. Phản ứng cạnh tranh đúng đắn thì hai chất cạnh tranh phải được đưa vào đồng
thời.
Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh. Cả hai phản ứng đều có sự tham gia của hai
kháng thể phản ứng với kháng nguyên. Nếu một kháng thể được ủ trước phản ứng đó được gọi
là ức chế (blocking/ inhibition assays). Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa cả hai kháng thể được
thêm vàođồng thời với nhau (hình 1).


14

Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh
3.4.1. Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên
Trong hệ thống trực tiếp, lượng kháng nguyên trên bề mặt đĩa và lượng kháng thể gắn
enzyme đã được chuẩn độ để tối ưu. Kháng nguyên và kháng thể gắn enzyme được thêm vào
đĩa cùng một lúc để tạo ưu thế cạnh tranh.
Nếu kháng nguyên tương tự hoặc cùng như kháng nguyên đã được gắn trên đĩa thì
kháng thể gắn enzyme sẽ gắn lên kháng nguyên này. Khi nồng độ của kháng nguyên cạnh
tranh cao sẽ ngăn cản bất kỳ sự kết hợp của kháng thể gắn enzyme với kháng nguyên trên bề
mặt đĩa (cạnh tranh 100%). Nếu nồng độ kháng nguyên cạnh tranh giảm (ví dụ : pha loãng) sự

cạnh tranh sẽ giảm. Như vậy nồng độ kháng nguyên cạnh tranh càng cao thì độ hấp thu màu
càng giảm.
Kháng nguyên cạnh tranh có thể được thêm trực tiếp vào đĩa nếu nó được pha loãng
trong blocking buffer trước khi thêm kháng thể gắn enzyme.
Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tương quan của nồng độ phân tử
cần kiểm tra và kháng nguyên trên bề mặt đĩa (và mức độ tương đồng của kháng nguyên).


15
Sau khi ủ và rửa, lượng kháng thể được đánh dấu được định lượng sau khi thêm cơ chất.
khi không có kháng nguyên trong mẫu kiểm tra hay không có sự tương đồng của kháng
nguyên thì không có sự gắn kết với kháng nguyên được đánh dấu và không có sự cạnh tranh
với kháng nguyên này. Kết quả là mẫu có chứa kháng nguyên thì sự cạnh tranh làm giảm
cường độ màu còn đối chứng âm thì không.

Sơ đồ : Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên


16
3.4.2. Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể
Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể tương tự với Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể. Sự
cạnh tranh ở đây là giữa kháng thể trong mẫu và kháng thể được đánh dẫu với các vị trí trên
kháng nguyên trên đĩa. Mẫu và kháng thể đánh dấu được trộn với nhau trước khi thêm vào đĩa.

Sơ đồ : Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể
4. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA
•

Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo màu
hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm.

17
•

Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra
lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản

•

Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm
tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu.

•

Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với đối chứng dương thì có thể kiểm
tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản.

•

Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi một yếu
tố thí nghiệm.

 Kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch: rất nhiều các test kit về bệnh hoặc dấu hiệu trong người
hều hết đều cùng phương pháp này.
Nguyên tắc: Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu được phân bố đều trên
bản giấy sắc ký. Kháng nguyên (KN) đặc thù của vi sinh vật được gắn cố định tại
“vạch phản ứng”. Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể (KT) lên bản sắc ký,
KT đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp với KKT gắn màu, phức hợp miễn
dịch KT-KKT gắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại “vạch phản

ứng” do KT kết hợp với KN vi sinh vật, kết quả “vạch phản ứng” hiện màu. Nếu
trong huyết thanh không có KT đặc hiệu, ở “vạch phản ứng” KN không thể giữ được
KKT gắn màu, vì vậy không hiện màu.
Giới thiệu bộ test kit xét nghiệm chẩn đoán viêm gan B (HbsAg) bằng phương
pháp sắc ký miễn dịch:
+ Nguyên lý: Kit thử chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) là dụng cụ xét nghiệm sắc ký
miễn dịch định tính bằng phương pháp dòng chảy một chiều để phát hiện sự có mặt
của kháng nguyên vi rút Viêm gan B trong huyết thanh hoặc huyết tương. Màng kit
thử được phủ một lớp kháng thể kháng HBsAg ở vùng kết quả. Trong quá trình làm
xét nghiệm, mẫu huyết thanh hoặc huyết tương phản ứng với các phần tử mang theo
kháng thể kháng HBsAg. Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên
nhờ các mao dẫn, gặp và phản ứng kết tủa màu với các kháng thể kháng HBsAg trên
lớp màng và tạo ra vạch màu. Sự có mặt của vạch màu ở vùng kết quả trên kit thử cho
biết kết quả dương tính, ngược lại trong trường hợp không có vạch màu là kết quả âm
tính. Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu luôn luôn
xuất hiện tại vùng chứng (gọi là vạch chứng) để khẳng định rằng lượng mẫu đã đủ và
lớp màng đã thấm tốt.
+ Kết quả:
• Dương tính: xuất hiện hai vạch đỏ rõ rệt: một ở vùng chứng gọi là vạch
chứng (C), vạch kia ở vùng kết quả gọi là vạch kết quả (T).
Lưu ý: độ đậm màu đỏ của vạch kết quả (T) sẽ khác nhau phụ thuộc vào nồng
độ của HBsAg có trong mẫu phẩm. Vì vậy, bất cứ độ mờ nào ở vạch kết quả (T)
cũng đều được coi là dương tính.


18
• Âm tính: xuất hiện chỉ
một vạch chứng (C) .
Không
thấy

xuất
hiện vạch kết quả (T) dù
đậm hay mờ.
• Kết qủa không có giá
trị: không
thấy
xuất
hiện vạch chứng (C).
Nguyên nhân thường gặp
là do lượng mẫu phẩm
không đủ hoặc thao tác xét
nghiệm sai. Đọc lại
hướng dẫn và làm lại xét
nghiệm bằng kit thử
mới khác. Nếu như tình
trạng vẫn như cũ, hãy
liên lạc với đại lý phân
phối để được giải đáp.
 Giới thiệu bộ test kit chẩn đoán HIV :
+ Nguyên lý: dựa trên nguyên tắc thử nghiệm sắc ký miễn dịch in vitro để xác định định
tính kháng thể kháng HIV tuýp 1 và 2 trong huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn
phần người. Khi thêm mẫu thử và mẫu pha loãng vào “sample pad”, mẫu sẽ di chuyển
đến “conjugate pad” và tái hỗn dịch với phức hợp kháng nguyên HIV tuýp 1 và 2 - vàng
cộng hợp đã làm khô trên “conjugate pad”. Hỗn hợp sẽ di chuyển dọc theo màng bằng
hiện tượng mao dẫn và phản ứng với kháng nguyên HIV tuýp 1 và 2 đã giữ cố định trên
vùng phản ứng (ký hiệu T). Nếu kháng thể kháng HIV có mặt đủ trong mẫu thử, vạch
màu trong vùng T sẽ xuất hiện. Nếu không có hoặc kháng thể kháng HIV không đủ
trong mẫu thử thì vùng T sẽ vẫn không màu. Mẫu thử tiếp tục di chuyển đến vùng chứng
(ký hiệu C) và tạo thành vạch có màu đỏ hoặc tím, cho thấy thử nghiệm đã được tiến
hành đúng, thích hợp và kết quả là có giá trị.

+ Kết quả: âm tính: Nếu chỉ có 1 vạch xuất hiện ở vùng C. Dương tính: Nếu xuất hiện
vạch ở cả vùng C và vùng T (1 và hoặc 2) chứng tỏ thử nghiệm dương tính.
Không có giá trị chẩn đoán: Vùng C không xuất hiện vạch nào trong cửa sổ kết quả sau
khi tiến hành thử nghiệm, thử nghiệm được xem như không có giá trị. Nguyên nhân có
thể do các bước tiến hành không đúng hoặc que thử đã bị hư. Khuyến cáo thử nghiệm lại
mẫu trên 1 que thử mới.
IV.Cơ chế chẩn đoán phân tử:
1. Kỹ thuật PCR:


19

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đai nhanh
nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp được thực hiện
trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thê thu được rất nhiều bản sao DNA.
Kỹ thuật này có thể được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực : chẩn đoán, xét nghiệm các
tác nhân vi sinh gây bệnh, giải mã di truyền, tạo giống mới và các đột biến định hướng,
nghiên cứu tiến hóa của sinh vật ở mức độ phân tử….
Nói đến chẩn đoán bệnh, kỹ thuật này chủ yếu dùng trong các phòng xét nghiệm
chứ chưa thông dụng ngoài thị trường.
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR: là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn
dựa trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung.
Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm:
- Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần
nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide.
- Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Là tín hiệu chỉ
hướng đi (5’ → 3’) của enzyme DNA-polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotide và
các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ
sung.

- Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
- Môi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzyme RNase và
DNase.
- Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq)
Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 µl đến 50µl.
Đặc điểm của phản ứng PCR là chọn lọc, nhạy và nhanh


20

2. Quy trình kỹ thuật:
Bước 1 - Thực hiện qúa trình biến tính DNA bằng nhiệt
Đưa DNA vào dung dịch phản ứng (gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép),
tăng nhiệt độ của dung dịch lên tới 90÷98°C, thời gian lưu tương ứng khoảng từ 30s÷1
phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép bị tách ra (do liên kết hydrô bị đứt),
tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới.
Bước 2 - Thực hiện phản ứng lai
Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống từ từ và nhỏ hơn nhiệt độ Tm của
mồi, vào khoảng 37÷68°C và thời gian lưu 30s÷1 phút. Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với
sợi khuôn. Mồi được tổng hợp hóa học, có mồi ngược và xuôi. Người ta còn có thể dựa
vào trình tự nucleotide ở đầu 3’ của khuôn để tổng hợp mồi. Sau đó bổ sung DNApolymerase để kéo dài mồi.
Bước 3 - Tổng hợp mạch mới hay còn gọi là kéo dài (extension)
- Nâng nhiệt phản ứng lên 72°C trong vài chục giây đến 1 phút để DNApolymerase tổng hợp sợi mới. Trong thực tế, thời gian và nhiệt độ phản ứng phụ thuộc
vào sợi DNA cần khuếch đại.
- Kết thúc một chu kỳ từ một DNA kép mẹ tổng hợp 2 sợi DNA kép con. Cứ như
vậy, phản ứng xảy ra trong 25 đến 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở
72°C trong khoảng từ 5 đến 10 phút sao cho tất cả các sợi đơn xoắn lại và tạo nên sản
phẩm của PCR. Sau đó hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm.
- Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose nồng
độ từ 0,8%÷2% để phát hiện sự đa hình của các đoạn DNA đặc thù, hoặc các đoạn DNA

bị thay đổi do các tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp).
3. Phương pháp RT-PCR (PCR ngược)


21
Nguyên tắc cơ bản: Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn
của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn thứ
nhất là sao chép RNA khuôn thành DNA sợi đôi nhờ hoạt động của enzyme sao chép
ngược. Giai đoạn này được thực hiện ở 50÷55°C và thời gian là 30 phút. Giai đoạn 2 là
dùng chính DNA vừa sao chép làm khuôn cho phản ứng PCR, quá trình được thực hiện
theo ba bưóc như đã trình bày ở trên.
Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm của phản ứng PCR ngược được giảm xuống 4°C
để bảo quản cho tới khi sử dụng. Để đánh giá và phát hiện sản phẩm PCR ngược người ta
cũng điện di trên gel agarose 0,8÷1%. Và DNA chuẩn là DNA λ được cắt bởi enzyme
HindIII có độ dài 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb.
 RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan)
Sử dụng đầu dò mang chất huỳnh quang là một phương pháp chính xác và đáng tin
cậy nhất, nhưng cũng đắt nhất. Nguyên lý của phương pháp này là các đầu dò chuyển
năng lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần phát hiện (hiện
tượng FRET). Đầu dò DNA hay RNA gắn đặc hiệu vào khu vực giữa hai đoạn mồi để
định lượng chỉ những DNA chứa trình tự đầu dò, do vậy làm tăng đáng kể độ đặc hiệu,
và thậm chí có thể cho phép định lượng khi có mặt cả một số sản phẩm khuếch đại
không đặc hiệu. Khả năng này còn cho phép làm thử nghiệm đa mồi khi sử dụng các
đầu dò đặc hiệu đánh dấu các mầu khác nhau.

Sơ đồ real-time PCR TaqMan
Thông thường, đầu dò mang huỳnh quang ở một đầu (Reporter – 5’) và một chất
chặn ở đầu kia (Quencher – 3’), vị trí gần nhau giữa chất mang và chất chặn làm

22
thuốc nhuộm huỳnh quang truyền năng lượng tới chất chặn gần đó chứ không phát
quang. Khi taq polymerase hoạt động, do enzyme này có hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease
nên đầu dò bị đánh bật khỏi khuôn mẫu, lúc này, trạng thái gần nhau giữa chất mang và
chất chặn bị phá vỡ nên hiện tượng FRET không xảy ra nữa, chất huỳnh quang không
còn bị chặn, ở trạng thái tự do nên phát quang và tín hiệu phát quang này sẽ được máy
đo lạiỀ Sản phẩm đích tăng lên sau mỗi chu kỳ phản ứng thì lượng chất huỳnh quang tự
do được giải phóng ra cũng tích tụ lại ngày càng nhiều.
PCR được tiến hành bình thường, trừ việc thêm đầu dò có đánh dấu huỳnh quang;
Khi phản ứng bắt đầu, ở giai đoạn gắn mồi của PCR, cả mồi và đầu dò đều gắn đặc
hiệu vào DNA đích; Quá trình tổng hợp chuỗi được thực hiện từ vị trí các mồi, và khi
taq polymerase chạm vào đầu dò thì hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của enzyme này phá
hủy đầu dò, tách chất mang huỳnh quang khỏi chất chặn và do đó làm tăng lượng chất
huỳnh quang ở dạng tự do. Chất huỳnh quang được đo bằng máy real-time PCR, lượng
tăng trung bình nhân chất huỳnh quang tương ứng với lượng tăng cấp số mũ của sản
phẩm và được sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) của mỗi phản ứng.
4. Một số phương pháp chẩn đoán phân tử khác:

Phương pháp lai phân tử (Hydrid)
Phương pháp lai là phương pháp khuếch đại tín hiệu được sử dụng phổ biến để
phát hiện HPV (Human Papillomavirus), HCV (virus viêm gan C),… trong bệnh
phẩm, dựa sự phát quang bằng phản ứng hóa học của phức hợp gồm kháng thể bị bắt
giữ -dung dịch lai và tín hiệu được khuếch đại.


23
Hình phương pháp lai phân tử phát hiện HPV
Ví dụ về các phương pháp lai trong các bộ test kit phát hiện HPV:
•

Hệ xét nghiệm II bắt giữ thể lai (Hybrid Capture II Test System)

Có nhiều phương pháp lai được ứng dụng phát hiện HPV nhưng kỹ thuật lai bắt giữ
(Hybrid Capture technology) là kỹ thuật được ứng dụng phổ biến nhất. Kit ứng dụng
kỹ thuật lai bắt giữ để phát hiện HPV thế hệ 2 (second-generation HPV detection kitHCII) do tập đoàn Diegene công bố và được US FDA công nhận vào năm 1999 là kỹ
thuật được sử dụng nhiều hơn trong lâm sàng.
Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên hiện tượng lai HPV DNA với đầu dò RNA đặc hiệu.
Đầu dò RNA có thể được đánh dấu bằng phóng xạ hoặc không đánh dấu phóng xạ.
Phức hợp lai DNA-RNA được phát hiện bởi kháng thể đặc hiệu đã gắn alkaline
phosphatase trên máy miễn dịch huỳnh quang. Mỗi phức hợp lai sẽ phát một tín hiệu
huỳnh quang (relative light unit - RLU), số lượng tín hiệu huỳnh quang tương ứng
lượng DNA đích trong mẫu bệnh phẩm.
Kit HCII sử dụng mồi DNA đặc hiệu 13 type HPV “nguy cơ cao”: HPV16, 18, 31,
33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 68 và 5 type HPV “nguy cơ thấp”: 6, 11, 42, 43, 44. Lai
bắt giữ là xét nghiệm có độ nhạy cao và có khả năng phát hiện được 1pg/µl của DNA
HPV16, tương ứng với 105 đoạn gen sao chép.
•

Phương pháp lai Southern-blot
Nguyên tắc lai Southern-blot dựa trên khả năng tiếp nhận DNA của màng lai
nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel đã cho phép phân tách các
đoạn DNA được cắt bởi enzym cắt giới hạn dựa trên kích thước của chúng và phương
pháp chuyển DNA từ gel sang màng lai nitrocellulose là cơ sở cho sự ra đời của
phương pháp lai do E.M Southern mô tả năm 1975.
Lai Southern-blot là phương pháp được ứng dụng sớm nhất trong phát hiện HPV.
Đây là phương pháp có độ nhạy rất cao, cho phép phát hiện đoạn DNA đích sử dụng
các mẫu dò được đánh dấu bằng phóng xạ (hệ thống phát hiện bằng enzym). Các điều
kiện cho quá trình lai có thể được kiểm soát tại các thời điểm khác nhau trong hoặc sau
quá trình lai bằng cách thay đổi nhiệt độ và nồng độ muối.

5. Một số ứng dụng trong test kit:

• Bộ kit RT-PCR phát hiện virus gây bệnh đốm trắng ở tôm: người ta đã tách được một
đoạn gen đặc hiệu của virus gây bệnh đốm trắng và thiết kế cặp mồi để nhân đoạn này
lên. Sau đó điện di nếu thấy có băng thích hợp thì chắc chắn tôm đã bị nhiễm bệnh này.


24

• Bộ kit phát hiện virus zika: Kit có độ đặc hiệu cao, các mồi và trình tự bắt cặp có độ
tương đồng 100% so với trình tự bộ gene của Virus Zika dựa trên sự phân tích kỹ lưỡng
bộ gene của virus này.


25
• Bộ kit chẩn đoán virus HPV: có thể phát hiện 23 kiểu gen khác nhau của HPV thông qua
phương pháp PCR kết hợp với phương pháp khác.

KẾT LUẬN
Sức khỏe ngày càng được quan tâm vì vậy sự phát triển của test kit là vô cùng cần thiết và
quan trọng. Trên đây không phải là hầu hết các phương pháp dùng trong test kit, còn nhiều
phương pháp khác, thậm chí là kết hợp nhiều phương pháp với nhau. Bài viết chỉ nêu được một
phần trong số các phương pháp được sử dụng trong các quy trình hay trong các sản phẩm
nhưng các phương pháp này là các phương pháp phổ biến dùng trong công nghệ sinh học và y
dược.
Có thể các phương pháp được nêu trên đây nêu chưa được đầy đủ nhưng cũng nói được
phần quan trọng, giúp người đọc có thể hiểu được thế nào là test kit và chúng được sử dụng
như thế nào, ở đâu. Ngoài ra, bài viết còn có một số sản phẩm cụ thể cho mỗi phương pháp,
còn rất nhiều sản phẩm khác.
Ở Việt Nam các loại test kit còn rất hạn chế về sản phẩm ra thị trường vì giá thành và cả

nhu cầu kiểm tra sức khỏe của mọi người thường xuyên không cao bằng các nước phát triển. Hi
vọng sẽ có những sản phẩm Test kit phù hợp với điều kiện nước ta hơn, cũng như mọi người có
thể quan tâm hơn về những biến đổi trong cơ thể để nhanh chóng phát hiện và chữa trị.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Văn Phùng (2001), Một số ứng dụng của PCR trong vi sinh vật. Tạp chí Y học thực hành
2011
2. Hoàng Văn Sơn (2002), Thành tự mới của sinh học phân tử trong ung thư học. Tạp chí
Thông tin Y dược số 2.