ngô kháng Bt (baciluss ....)

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………….2
NỘI DUNG…………………………………………………………………………….3
CHƯƠNG 1 :TỔNG QUAN VỀ BACILLUS THURINGIENSIS....................................3
I. Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis :.................................................................3
II. Sinh trưởng và phát triển của Bacillus thuringiensis..................................................8
III. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis...............................................................11
IV. Hoạt lực diệt sâu của Bacillus thuringiensis............................................................14
CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ TẠO NGÔ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU TỪ BT......15
I. Vài nét về công nghệ chuyển gen ở thực vật.............................................................15
I.1. Khái niệm về thực vật chuyển gen……………………………….………………15
1.2. Tóm tắt lịch sử phát triển của công nghệ chuyển gen thực vật..............................15
1.3. Một số nguyên tắc cơ bản của việc chuyển gen......................................................16
1.4. Vector sử dụng trong công nghệ chuyển gen ở thực vật.........................................18
công nghệ tạo ngô chuyển gen kháng sâu từ BT.....................................................26
2.1. Giới thiệu về ngô.....................................................................................................26
2.2. Giới thiệu về ngô chuyển gen.................................................................................27
2.3. các bước tạo ngô chuyển gen kháng sâu trong phòng thí nghiệm..........................29
II.

2.4. Thực trạng sử dụng ngô chuyển gen kháng sâu trên thế giới và trong nước. ……41
2.5. Tính hữu hiệu của cây trồng chuyển gen Bt...........................................................43
KẾT LUẬN …………………………………………………………………….…….44
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………..…………………….…..45

1


MỞ ĐẦU
Trong tất cả các lớp vi sinh vật, côn trùng có số lượng loài nhiều nhất. Côn
trùng ảnh hưởng xấu đến con người theo nhiều cách khác nhau : phá hoại mùa

màng và là vector truyền bệnh cho người và động vật. Vào những năm 1940, nhiều
loại thuốc trừ sâu hóa học được phát triển nhằm kiểm soát sự tăng sinh của quần thể
côn trùng có hại. Nhưng sau đó, các nhà khoa học đã nhận thấy những tác động tiêu
cực của thuốc trừ sâu hóa học như : ảnh hưởng lâu dài đến động vật, hệ sinh thái và
con người. Thuốc trừ sâu hóa học như DDT bền vững trong môi trường hơn 20 năm
và tích tụ với hàm lượng ngày càng tăng qua chuỗi thức ăn gây hậu quả lâu dài và
nặng nề cho con người và động thực vật. Thêm vào đó, quần thể sâu hại ngày càng
kháng nhiều thuốc trừ sâu hóa học. Thuốc trừ sâu hóa học thiếu tính đặc hiệu và
tiêu diệt cả thiên địch của các loài sâu hại dẫn đến kết quả là xử lý sâu bệnh càng
làm số lượng côn trùng tăng lên. Sau khi xem xét mọi ảnh hưởng tiêu cực của thuốc
trừ sâu hóa học, thuốc trừ sâu vi sinh có hoạt tính trừ sâu của vi khuẩn Bacillus
thuringiensis được chọn là phương án thay thế vì nó không tồn tại bền vững trong
môi trường và an toàn đối với vật nuôi và con người. Nhưng nhược điểm của thuốc
trừ sâu vi sinh là công hiệu thấp, giá thành cao làm hạn chế việc sử dụng. Vả lại,
một số sâu gây hại lại ăn các mô ở trong cây do đó tránh được ảnh hưởng của chế
phẩm B. thuringiensis phun bên ngoài cây. Để khắc phục vấn đề này, các gen độc tố
Bacillus thuringiensis có thể được biểu hiện trong cây bằng phương pháp chuyển
gen độc tố từ B. thuringiensis vào thực vật thông qua plasmid Ti của vi khuẩn A.
tumefaciens hoặc dùng súng bắn gen . Với các cây chuyển gen này, không cần phun
độc tố diệt sâu. Điều này hạn chế sự phát tán độc tố vào môi trường, giảm chi phí sử
dụng thuốc trừ sâu…
Ngô hay bắp ( Zea mays.) là một trong những cây trồng quan trọng trên thế giới
và cả Việt Nam, được dùng làm lương thực hay ứng dụng rất nhiều trong công
nghiệp để làm bánh kẹo, syrup đường nghịch đảo, tinh bột biến hình… Chính vì
điều đó cho nên năng suất thu hoạch ngô là điều cần cải thiện. Một trong những
biện pháp đó là tăng khả năng chống chịu sâu bệnh của cây ngô nhằm tăng năng
suất thu hoạch. Điều đó không những giúp tiết kiệm được chi phí sử dụng thuốc trừ
sâu mà còn góp phần hạn chế những tác động xấu đến môi trường xung quanh.

2

NỘI DUNG
Chương 1 :TỔNG QUAN VỀ BACILLUS THURINGIENSIS
I. Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis :
1.1.Tóm tắt về lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis.
Lần đầu tiên vào năm 1870, nhà bác học Pasteur người Pháp đã phát
hiện một loài vi khuẩn gây bệnh cho con tằm và đặt tên là Bacillus bombycis.
Sau đó vào năm 1911, nhà côn trùng học người Đức là Berline đã phát
hiện loài vi khuẩn này trên loài sâu xám ở Thuringia vùng Địa Trung Hải và đặt
tên là Bacillus thuringiensis (viết tắt là Bt.).
Sau đó đến khoảng giữa thế kỷ 20, người ta đã phát hiện nhiều chủng Bt.
ký sinh trên nhiều loài sâu khác nhau như sâu xanh, sâu keo, sâu róm thông.
Từ đó vi khuẩn Bt. đã được chế tạo thành thuốc trừ sâu sử dụng trong nông
nghiệp ở nhiều nước, mở đầu cho công nghệ thuốc trừ sâu sinh học. Chế phẩm Bt
đã được nghiên cứu từ năm 1971 và hiện đang được ứng dụng rộng rãi ở nhiều
nước thay thế một phần thuốc trừ sâu hóa học để diệt côn trùng.
Với những thành tựu của di truyền học và công nghệ sinh học, người ta đã
phát hiện nhiều chủng Bt. có khả năng ký sinh mạnh, sản xuất ra những chế phẩm
có hàm lượng độc tố và tính ổn định cao để tăng hiệu lực diệt sâu và mở rộng phổ
tác dụng trên nhiều loài sâu hại thuộc nhiều bộ côn trùng ở nhiều vùng khí hậu
khác nhau. Đã xác định có tới trên 150 loài sâu hại bị nhiễm các chủng Bt., trong
đó bao gồm hầu như toàn bộ các loài sâu hại có ở Việt Nam.
Hiện nay thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt. đã chiếm phần lớn thị trường thuốc
trừ sâu sinh học trên thế giới cũng như ở nước ta. Ngoài việc dùng làm thuốc trừ
sâu, hiện nay người ta đã tách một số gen từ vi khuẩn Bt. ghép vào hệ thống gen của
cây để tạo ra các giống cây kháng sâu như giống bông kháng sâu xanh, giống lúa
kháng sâu đục thân, sâu cuốn lá, giống ngô kháng sâu…
Gần đây, một nhóm các nhà khoa học tại Viện Pasteur TPHCM vừa nghiên cứu
thành công chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp.

israelensis serotype H14 diệt lăng quăng.

Hình 1.1. Một số chế phẩm trừ sâu có mặt trên thị trường từ Trung Quốc, Mỹ,
Việt Nam.
1.2. Sự phân bố của B.thuringiensis.
Phổ biến trong tự nhiên, cư trú trong đất, trên bề mặt cây và trên xác sâu.Tần
suất B. thuringiensis phân bố cao nhất từ nguồn đất là 35%, trên mùn thóc là 30%
và thấp nhất ở trên lá cây là 16%.
3


1.3. Đặc điểm sinh thái của B.thuringiensis.
Từ Bacillus nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi được
quan sát dưới kính hiển vi. Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que. Do
đó, một số nơi gọi là khuẩn que hoặc trực khuẩn.
1

Hình 1.2. Hình thái của B.thuringiensis

Hình 1.3.Hình dạng và kích thước Bt..

Qua kính hiển vi Bacillus thuringiensis đơn lẻ có hình dạng giống những
chiếc que, kích thước 1-1,2 x 3-5 µm , phủ tiêm mao, di chuyển được. Bào tử
hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì người ta quan sát
thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và phát
triển lan rộng.
1.4. Đặc điểm sinh hoá của B. thuringiensis.
Bacillus là vi khuẩn gam dương. Catalase dương tính. Sử dụng khí oxy làm
chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Hiếu khí tùy
tiện.Sinh bào tử, kích thước 1,6 – 2 µm Tế bào đứng riêng hoặc xếp chuỗi Nhiệt độ

sinh trưởng 15º-45ºC. Tạo ra tinh thể protein trong giai đoạn tạo bào tử, kích thước
0,6 – 2 µm .Tinh thể có kích thước 0,6 x 2 µm. Bản chất là protein.
Bào tử: hình trứng dài, kích thước 1,6 x 2 µm. Bào tử có màng mỏng và khó
nhuộm màu. Có một cách dễ dàng để cô lập một loại trực khuẩn nào đó là cho đất
tốt vào trong ống nghiệm cùng với nước, lắc đều, cho vào môi trường muối manitol
đã tan, và giữ ở nhiệt độ trong phòng ít nhất một ngày.
1.5.Phân loại B. thuringiensis.
Giới: Procaryotae
Ngành:Firmicutes
Họ: Bacillacaeae
Chi: Bacillus
Loài:thuringiensis
Loài phụ…
(Khoá phân loại của Bergey (1984)) .

4


1.5.1. Phân loại theo typ huyết thanh kháng tiêm mao :
Nguyên lí: Kháng nguyên tiêm mao H kết hợp với kháng thể sẽ xảy ra phản
ứng ngưng kết → tạo cặn lắng trắng dưới đáy ống nghiệm.
Quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào không di chuyển được. Các bước phân loại :
Chuẩn bị dịch kháng tiêm mao H
tiêm vào thỏ sau đó thu huyết thanh
miễn dịch
thử phản ứng ngưng kết.


Chuẩn bị dịch kháng tiêm mao H
Nuôi cấy VK B. thuringiensis trên môi trường bán lỏng NA: cao thịt 5g, agar

2g, nước cất 1000ml, điều chỉnh tới pH = 7,2. Thời gian nuôi 16 – 18 giờ.
Chuyển sang môi trường NB: nuôi ở chế độ lắc cho tới khi OD650nm = 0,8 – 1,0.
Bổ sung 0,5 ml formaldehyde.



Thu nhận dịch kháng nguyên tiêm mao H
Thu nhận huyết thanh miễn dịch
Tiêm dịch kháng nguyên tiêm mao H:
- Mũi đầu tiên dưới da.

-

Các mũi tiếp theo tiêm ven, mỗi tuần 2 lần, liều lượng mỗi lần tăng dần (1ml,
2ml, 3ml), thời gian tiêm 3 tuần
Kiểm tra sự hình thành kháng thể:
Sau 8 ngày của lần tiêm cuối: lấy 2ml máu từ ven tai thỏ để xác định hiệu
giá. Nếu HG lớn hơn hoặc bằng 25 000 là đạt yêu cầu.
Nếu HG nhỏ hơn 25 000 thì tiếp tục tiêm thêm 2 – 3 lần nữa để nhận hiệu giá
cao hơn.
- Dùng 02 con thỏ cho một kháng nguyên để tránh rủi ro.
-

-

Huyết thanh được tách trong đièu kiện vô trùng và bảo quản ở 4oC hoặc đông
khô.



Thử phản ứng ngưng kết.
Cho 1,8ml NaCl 1,15M và 200ml dịch huyết thanh miễn dịch tiêm mao vào
ống nghiệm 5ml.
Pha loãng với các nồng độ giảm dần theo hệ số 2: 1:10; 1:20; 1:40;…;
1:2560. Chuyển 100ml dịch ở mỗi nồng độ pha loãng này vào ống nghiệm có
chứa 900ml dịch vi khuẩn B. thuringiensis, như vậy độ pha loãng lúc này là
1:100;
1:200; 1:400; …..; 1:25600. Mẫu đối chứng được thay thế 100ml dịch huyết
thanh bằng 100ml dịch NaCl 1,15M.
Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 2 giờ và quan sát sự ngưng kết.

Hiệu giá thu được là nồng độ pha loãng cao nhất xảy ra hiện
tương ngưng kết



Nhược điểm của phân loại theo type huyết thanh
Mối liên hệ giữa type huyết thanh với phổ diệt côn trùng không nhất quán:
Có các loài cùng type huyết thanh có độc tính với côn trùng như nhau: loài phụ
Kustaki và loài phụ alesti đều biểu hiện độc với côn trùng bộ cánh vẩy.
5


Có các loài có type huyết thanh giống nhau nhưng độc tính với côn trùng
khác nhau: loài phụ morisoni (type huyết thanh H8ab) có độc tính với côn
trùng bộ hai cánh và loài phụ sandiego (type huyết thanh H8ab) có độc tính
với côn trùng bộ cánh cứng.


Không thể thông qua type huyết thanh của một loài phụ để xác định hoạt tính

diệt sâu của chúng

1.5.2.Theo gen mã hóa protein tinh thể độc
Protein cry hay còn gọi δ-endotoxin (tinh thể độc) (Ge, A. Z., N. I.
Shivarova, and D. H. Dean, 1989) [19].
Tinh thể độc tồn tại dưới dạng tiền độc tố, cần được hoạt hoá để có tác dụng.
Tinh thể độc tồn tại dưới nhiều hình dạng: kim tự tháp đôi, thoi phẳng, khối hộp,
hỗn hợp của các loại trên.
- Tinh thể độc có kích thước khoảng 230KDa với phần nhân độc 65KDa.
- Tinh thể độc tan trong điều kiện pH cao (pH >9,5).
Tính độc: gây độc ở nồng độ picomol (10-12M)
 Gen cry
- Các gen mã hoá cho tiền độc tố thường nằm trên các plasmid.
- Mỗi tiền độc tố là sản phẩm của một gen.
- Một số loài phụ có khả năng tổng hợp được nhiều hơn 1 tiền độc tố.
- 250 gen mã hoá tổng hợp protein cry đã được đọc trình tự và được xếp vào 40
họ dựa vào sự tương đồng về trình tự sắp xếp các nucleotit.
Bảng 1.1.Phân loại Bt. theo gen mã hóa protein tinh thể độc (Hoft và Whiteley,
1989).


-

Kích thước
Hình dạng
Gen

protein

Đối tượng diệt sâu

tinh thể
(kDa)
CryI ( Aa,
Ab, Ac,B,
C, D, E,
F, G, H, I,
J, K, L)

Lưỡng tháp

CryII(A,

Hình lập

B, C)

phương

CryIII(A,

Phẳng/không

B, C, D)

đều

CryIV

Lưỡng tháp

130-140

Ấu trùng bộ cánh vẩy

69-71

Bộ cánh vẩy và bộ hai cánh.

73-74

Bộ cánh cứng

73-134

Bộ hai cánh

(A,B,C,D)
6


CryV-

Đa dạng

35-129

Đa dạng

cryIX

Tế bào động vật xương sống
Cyt

25-28
và không xương sống

Bảng 1.2.Phân loại Bt. theo độc tố diệt sâu

1.5.3. Các cách phân loại khác
- Phân loại theo loại hình enzyme lipase
Căn cứ vào số lượng các vạch enzyme lipase.
7


Tương đối thống nhất với loại hình huyết thanh kháng nguyên H, sử dụng để
phân biệt các loài phụ của cùng một type huyết thanh.
-

Phân loại theo type huyết thanh kháng protein tinh thể

Các tinh thể có cấu trúc khác nhau, thành phần kháng nguyên của các
tinh thể khác nhau.
Thông qua phản ứng huyết thanh nhận biết type huyết thanh tinh thể. Quan hệ
mật thiết với phổ diệt sâu
-

Phân loại theo type huyết thanh kháng nguyên O

Kháng nguyên O là một kháng nguyên bền nhiệt của Bt., thu được khi xử lý nhiệt
để loại bỏ tiêm mao.

Được sử dụng để xác định vị trí phân loại Bt. không có tiêm mao.
-

Phân loại theo loại bệnh gây cho côn trùng

Căn cứ vào độ nhạy khác nhau của côn trùng: Dạng A (nhạy cảm với bộ cánh vẩy).
Dạng B (nhạy cảm với bộ hai cánh). Dạng C (nhạy cảm với bộ cánh cứng). Dạng
D (nhạy cảm với bộ hai cánh và bộ cánh vẩy).
•
1.

Sinh trưởng và phát triển của Bacillus thuringiensis.

Chu trình sống của Bacillus thuringiensis

Hình 1.4. Chu trình sống của B. thuringiensis .
Bacillus thuringiesis trải qua 2 chu trình sống : pha phát triển sinh dưỡng và
pha tạo bào tử. Nội bào tử không hình thành trong suốt quá trình sinh trưởng và
phân chia tế bào. Chúng thường được hình thành khi tế bào đã vượt qua pha log
trong sinh trưởng hoặc là khi môi trường đã cạn kiệt nguồn dinh dưỡng.
Thường thì một tế bào sinh dưỡng chỉ hình thành một nội bào tử. Khi bào tử
trưởng thành tế bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào
mẹ. Bào tử trưởng thành không có quá trình trao đổi chất chúng tồn tại ở trang thái
gọi là crytobiotic. Chúng có sức chống chịu cao với những điệu kiện khắc nghiệt

8


của môi trường như nhiệt độ cao, sự bức xạ, axit mạnh, chất tẩy…Khi gặp điều
kiện thuận lợi chúng nảy mầm thành các té bào sinh dưỡng.

Bào tử được hình thành từ tế bào sinh dưỡng để đáp ứng lại các điệu kiện
khắc nghiệt của môi trường và chúng sẽ nảy mầm thành các tế bào sinh dưỡng khi
điều kiện bớt khắc nghiệt. Bào tử của vi khuẩn không phải là một hình thức sinh
sản mà chúng chỉ là một hình thức thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những điều
kiện sống bất lợi.
2.2. Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử

Hình 1.5 : Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử.
Bước 1 : Nhiễm sắc thể của Vi khuẩn phân chia nhân lên làm đôi.
Bước 2 : Hình thành màng tế bào phân cắt NST vi khuẩn làm 2 phần không đều
nhau.
Bước 3 : Phần nhỏ hơn phát triển hình thành nhân bào tử. Sau đó phần lớn hơn
bao lấy phần nhỏ. Kết quả 2 tế bào chất hợp nhất làm một. Chính điều này mà
một số người cho rằng quá trình hình thành bào tử cũng là quá trình sinh sản do
sự hình thành bào tử là một hình thức đổi mới tế bào do sự kết hợp của các phần
nguyên sinh chất trong quá trình hình thành bào tử mà tế bào được đổi mới.
Bước 4: Vỏ bào tử được tổng hợp.
Bước 5 : Áo bào tử được tổng hợp.
Bước 6 : Màng tế bào và NST dần tiêu biến.
Bước 7 : Bào tử được hình thành hoàn chỉnh.
2.3. Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử và tinh thể của Bt.
9


Tinh
thể
độc

Bào tử
Hình 1.6. Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử và tinh thể của Bacillus

thuringiensis.
Trong quá trình hình thành bào tử thì tinh thể độc cũng được tổng hợp đồng
thời và không nằm trong bào tử. Tinh thể độc sẽ được phóng thích ra môi trường
khi màng tế bào bị tiêu biến.
2.4. Động học quá trình phát triển, tạo bào tử và tinh thể độc.
Tế bào sinh dưỡng (vegetative cells) phát triển nhanh chóng từ 2-8h
đầu trong chu kỳ sinh trưởng và giảm dần rồi dừng hẳn sau 10h sinh trường.
Tiếp theo đó là sự hình thành các tinh thể độc tố trong khoảng thời gian
10-14h. Trong khoảng giờ thứ 12 bào tử bắt đầu hình thành và được tổng hợp
hoàn chỉnh tại thời điểm 20h.

Hình 1.7. Động học quá trình phát triển, tạo bào tử và tinh thể độc.
2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và hình thành bào tử của vi
khuẩn
Bacillus thuringiensis.
N

-

hiệt
10


Đ

-

ộ pH
O

-

xy
Á

-

nh sáng và tia xạ
C

-

hất kháng sinh và hóa học.

BI.

Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis.

3.1.Bản chất hóa học của tinh thể :
Trong tinh thể độc có b ản chất là protein, trong đó có hai loại chiếm tỷ lệ
cao nhất là axit glutamic và axit asparaginic. Trong tinh thể có chứa lượng khá lớn
5 nguyên tố như C, N, H, O, S. Ngoài ra còn chứa lượng nhỏ 19 nguyên tố khác
nhưng không có P. Các phân tử có khối lượng lớn (>800.000Da) có độc tính còn lại
loại có khối lượng nhỏ (<10.000) thì không có độc tính.
Tinh thể độc được coi là một tiền độc tố (Protoxin), được hoạt hóa trong ruột
côn trùng hình thành nên các phân tử độc tố với khối lượng 50.000Da.
Tinh thể bền vững với nhiệt độ cao so với độc tố dạng hòa tan.
3.2. Phân loại tinh thể độc:
α-exotoxin: là phospholipase C, 45-50 kDa, không bền nhiệt. Chỉ có ở một
số chủng Bt..Enzyme liên quan tới sự phân huỷ mang tính cảm ứng của

phospholipid trong mô của côn trùng.Đầu tiên enzyme liên kết với tế bào ruột của
côn trùng, sau đó tách ra và được hoạt hoá bởi một chất không bền nhiệt.
β-exotoxin: là nucleotide tạo thành trong giai đoạn phát triển sinh trưởng
trước khi hình thành bào tử. Khối lượng phân tử thấp, tan trong nước. Có tác dụng
ức chế tổng hợp ARN.
Tác dụng cộng hưởng với d-endotoxin: d-endotoxin làm dập vỡ, phá huỷ
vùng biểu mô ruột giữa côn trùng. b-exotoxin xâm nhập vào huyết tương và máu
gây ra biến đổi sinh lý của ấu trùng.Độc với cơ thể sống kể cả người, phổ diệt sâu
rộng. Do đó cần loại bỏ các chủng sinh độc tố này.
δ-endotoxin: ICPs (insecticidal crystal proteins) hay protein Cry hay thể vùi
được tạo thành trong giai đoạn tạo bào tử. Tác dụng độc đặc hiệu với các loài côn
trùng. Lượng tinh thể độc cũng như phổ tác dụng thay đổi theo chủng.
Protein kết tinh gồm 640 – 1200 a/a. Chủ yếu là a. glutamic, a. asparaginic chiếm
20% tổng số a/a. Điểm đẳng điện thấp (pI = 4,4).
11


Tỷ lệ axit amin systein thấp (<2%) gây ra tính không tan của tinh thể.
Ngoài ra chứa: hydratcacbon 5,6%; các nguyên tố C, N, H, O, S và 19 nguyên tố
Ca, Mg, Si, Fe… Hình dạng: đa dạng
Vips (Vegetative insecticidal proteins)
3.3.Cấu trúc của tinh thể protein.
Bao gồm 3 vùng:
Vùng 1: 1 chuỗi xoắn α kỵ nước bao quanh là 6 chuỗi xoắn α lưỡng tính khác.
Chứa 290 axít amin và chứa đầu N. Chịu trách nhiệm tạo lỗ rò trên ruột sâu.
Vùng 2: từ a.a 291 đến a.a 500. Chứa 7 tấm β và một chuỗi xoắn α ngắn. Chịu
trách nhiệm gắn với thụ thể.

Hình 1.8: Cấu trúc không gian của tinh thể Cry3.
Vùng 3: Từ a.a 501 đến a.a 644. Chứa 12 tấm β. chứa đầu C. Chịu trách nhiệm

nhận biết điểm gắn kết.
3.4. Cơ chế tác động của tinh thể độc.

Hình 1.9. Minh họa biểu hiện của sâu bệnh dưới tác dụng của tinh thể độc
Bacillus thuringiensis.

12


Tác động của tinh thể độc lên côn trùng là rất phức tạp. Tác động điển hình
là làm liệt đường ruột và xoang miệng. Sau ăn từ 1-7 giờ sâu bị liệt toàn thân. Các
tế bào thượng bì biến đổi. Sau ăn 1 phút, tinh thể độc đã xuất hiện tại thượng bì
ruột giữa. Một số tế bào ruột bị tách rời, biến dạng, các chất bên trong chảy ra
ngoài màng, K+ thoát ra ngoài. K+ trong máu và bạch huyết tăng là nguyên nhân
gây tê liệt đường ruột và toàn thân sâu bọ, côn trùng.
Sự thay đổi tác động của tinh thể lên côn trùng phụ thuộc nhiều yếu tố.
Chẳng hạn bình thường khi vào ruột trước và ruột giữa, nếu pH không cao (>7) và
cơ thể không có cơ chế giải độc, tinh thể sẽ vỡ làm nhiễm độc máu. Tuy vậy trong
nhiều trường hợp khi tinh thể độc vỡ ra một số loài sâu có cơ chế tự giải độc,
ngừng ăn, pH đường ruột giảm xuống, sau một thời gian nhất định đường tiêu hóa
được hồi phục.
Trong khi đó nhiều loài côn trùng sản sinh ra men chuyển protoxin của tinh
thể độc thành độc tố. Tinh thể độc ( Protoxin) ở dạng tiền hoạt động. Sau khi được
sâu hại nuốt vào dưới tác dụng của môi trường pH thấp và men tiêu hóa trong ruột
sâu phân cắt tinh thể độc tố dạng tiền hoạt động thành dạng hoạt động . Độc tố Bt..
chèn vào biểu mô ruột của sâu làm rối loạn trao đổi chất dẫn tới mất nước.

Hình 1.10. Cơ chế thẩm thấu ion K+ trên màng biểu mô ruột.
Biểu hiện của sâu bị bệnh :ngừng ăn nôn mửa, lờ đờ, mất điều khiển có thể
chết ngay sau khi nhiễm bệnh, hoặc cũng có thể bệnh kéo dài 1giờ đến vài ngày.

Nếu sống sót thì tuổi thọ, khả năng sinh sản, trọng lượng của sâu cũng giảm.
IV. Hoạt lực diệt sâu của Bacillus thuringiensis.
Hoạt lực diệt sâu của Bacillus thuringiensis được quyết định bởi:
13


-

Số lượng gen cry có mặt.
Sự khác nhau về trình tự axít amin của các ICPs.
Sự khác nhau của mức độ biểu hiện các gen.

Thuộc tính của các ICPs, vd: khả năng giữ được độ ổn định và hoạt
độ trong quá trình lên men.
• Các yếu tố quyết định phổ tác dụng của Bt.
- Chủng Bacillus thuringiensis.
- Khả năng hòa tan của độc tố trong ruột sâu .
- Khả năng tiếp cận của sâu với độc tố.
- Khả năng tồn lưu của Bacillus thuringiensis trong môi trường.
•
Ưu điểm của thuốc trừ sâu Bt.
- Không ảnh hưởng xấu đến môi trường, người sản xuất, người tiêu dùng.
- Không ảnh hưởng đến chất lượng nông sản.
- Công nghệ sản xuất và thiết bị đơn giản, nguồn nguyên liệu sản xuất là phụ
phẩm công nghiệp.
-

Tỷ lệ phát triển tìm ra chủng giống mới cao. Có thể cải tạo giống theo
ý muốn bằng phương pháp di truyền và công nghệ gen.
- Đăng ký sản phẩm mới đơn giản, nhanh và rẻ tiền.

• Nhược điểm của thuốc trừ sâu BT.
- Gặp khó khăn khi cây trồng bị tấn công bởi nhiều loài sâu hại khác nhau.
- Thời gian có hiệu lực quá ngắn do các độc tố bị phân hủy nhanh chóng do
tia UV.
- Lắng đọng nhanh trong nước → mất hoạt tính.
- Mất hoạt tính trong đất do bị phân hủy bởi các VSV trong đất.
- Khó tiếp cận được với các loài sâu ở rễ hay trong thân cây.
- Một số độc tố có thể gây bệnh ở người → ít khả năng.
-

Không có khả năng tự nhân lên và kém bền vững dưới các tác động vật
lý và hóa học.
- Hiện tượng kháng Bt.. của sâu bệnh.
Biện pháp chuyển gen sinh tổng hợp độc tố vào thực vật có thể giải quyết
được những nhược điểm kể trên.
-

14


CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ TẠO NGÔ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU TỪ
BACILLUS THURINGIENSIS
I.

Vài nét về công nghệ chuyển gen ở thực vật

1.1. Khái niệm về thực vật chuyển gen
Quá trình đưa một DNA ngoại lai vào genome (hệ gen) của một sinh vật
được gọi là quá trình biến nạp (transformation). Những cây được biến nạp được
gọi là cây biến đổi gen (genetically modified plant-GMP).

I.2.

Tóm tắt lịch sử phát triển của công nghệ chuyển gen thực vật.
Bảng 2.1. Tóm tắt những phát triển quan trọng trong công nghệ
chuyển gen thực vật.
Năm
1980

Những phát triển quan trọng

1984

Lần đầu tiên chuyển DNA vi khuẩn vào thực vật thành công nhờ
Agrobacterium tumefaciens
Phát triển các marker chọn lọc, Ti-plasmid được loại bỏ các gen không cần
thiết
Thực hiện biến nạp gen vào tế bào trần

1985

Nghiên cứu chuyển gen thành công vào thực vật gen kháng thuốc trừ cỏ

1986

Nghiên cứu chuyển gen thành công vào thực vật gen kháng virus
Lần đầu tiên đưa cây biến đổi gen ra đồng ruộng.
Nghiên cứu chuyển gen thành công vào thực vật gen kháng côn trùng
Thành công trong quá trình biến nạp phi sinh học như súng bắn gen.
Điều khiển sự chín ở cà chua bằng cách chuyển gen chín chậm vào cà chua.
Kháng thể ở thực vật bậc cao

Biến nạp phi sinh học ở ngô
Tạo cây trồng chuyển gen mang tính bất dục đực.
Thay đổi thành phần carbohydrate
Tạo alkaloid tốt hơn
Thực vật biến đổi gen để sản xuất các axit béo thiết yếu.
Biến nạp phi sinh học ở lúa mỳ
Lần đầu tiên phân giải plastic nhờ cây biến đổi gen
Cà chua biến đổi gen FlavorSaver xuất hiện trên thị trường
Lần đầu tiên hơn 10 gen được chuyển đồng thời vào thực vật.
Trên thế giới có 48 trong đó Mỹ có 35 loại thực vật biến đổi gen
được thị trường hóa
Lúa biến đổi gen với giá trị dinh dưỡng tốt hơn
Cây biến đổi gen được trồng trên diện tích hơn 40 triệu ha

1983

1987
1988
1989
1990
1991
1992

1994
1998

15


1999

Cho đến nay khoảng 9000 thí nghiệm về cây biến đổi gen được
đưa ra đồng ruộng (ở EU: 1360)

I.3. Một

số nguyên tắc cơ bản của việc chuyển gen
 Một số nguyên tắc sinh học

Thực vật được chuyển gen chứa đoạn DNA lạ trong bộ gen.Gen ngoại lai này
phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào sinh sản.
Nếu dòng tế bào sinh sản bị biến đổi, các tính trạng bị biến đổi này sẽ
được truyền cho các thế hệ kế tiếp thông qua sinh sản .
Nếu chỉ có dòng tế bào sinh dưỡng bị biến đổi, chỉ có cơ thể mang các tế
bào sinh dưỡng đó bị ảnh hưởng và không di truyền lại cho thế hệ sau.
Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật (thực vật) chỉ thành công khi các
gen này di truyền lại cho thế hệ sau.
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề
sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau:
-

Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency).

Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen
ngoại lai.
Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng
thu nhận gen biến nạp vào genome.
-

-

Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau. Cần xem
xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp và tái sinh
cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế bào nếu được
tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác hoàn toàn không
có khả năng biến nạp và tái sinh cây.

-

Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan,
từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.

-

Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai. Vì thế, cho đến nay chỉ có
thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus và
bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng phương pháp xung
điện, siêu âm và vi tiêm.

-

Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm
thời của gen.

-

Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa đảm bảo là
đã liên kết ổn định với genome.

16

- Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi
mà nó được đưa vào.
- Trong khi đó, DNA của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lại không liên
kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh
(meristem).


Phản ứng của tế bào với quá trình chuyển gen

Mục đích chính của chuyển gen là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của
tế bào vật chủ có khả năng tái sinh cây và biểu hiện ổn định tính trạng mới. Nếu
quá trình biến nạp xảy ra mà tế bào không tái sinh được thành cây, hoặc sự tái sinh
diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp chưa thành công.
Ở rất nhiều loài thực vật, điều khó khăn là phải xác định cho được kiểu tế bào
nào trong cây có khả năng tiếp nhận sự biến nạp. Hạt phấn hay tế bào noãn sau khi
được biến nạp có thể được dùng để tạo ra cây biến nạp hoàn toàn, thông qua quá
trình thụ tinh bình thường.
Từ nhiều thập kỷ qua người ta đã biết rằng, tính toàn thể của tế bào thực vật đã
tạo điều kiện cho sự tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan
(hình thành chồi) hay phát sinh phôi. Các chồi bất định hay phôi được hình thành
từ các tế bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và
có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh (không có tính khảm).
Các bước cơ bản của chuyển gen
Từ khi người ta khám phá ra rằng các thí nghiệm chuyển gen có thể thực hiện
nhờ một loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, thì các nhà khoa học tin rằng
Agrobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các cây trồng. Nhưng sau đó kết quả
thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium không thể thực hiện được trên cây
ngũ cốc (một lá mầm) vì thế hàng loạt kỹ thuật chuyển gen khác đã được phát triển

đó là các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp như bắn gen bằng vi đạn
(bombardement/gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation),
silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống
phấn (pollen tube)... Đến nay, nhờ cải tiến các vector chuyển gen nên kỹ thuật
chuyển bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa. Kỹ
thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với cây chuyển gen ở thực vật.
Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau :


-

Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm.
Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc từ thư viện
genomic DNA).

-

Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp.

-

Biến nạp vào E. coli.

-

Tách chiết DNA plasmid.
17


-

Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác
nhau đã kể trên.

-

Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.

-

Tái sinh cây biến nạp.

Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và đánh
giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA hoặc
các thử nghiệm in vivo khác...).
Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng lẽ, các mô
hoặc cây hoàn chỉnh.
Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế bào.
Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzyme và dưới
những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận
DNA nói chung dễ dàng. Chẳng hạn sử dụng phương pháp xung điện, ở đây tế bào
được đặt ở trong một xung điện ngắn, xung điện này có thể làm xuất hiện những lỗ
tạm thời ở trên màng tế bào, những phân tử DNA có thể đi vào bên trong tế bào.
Sau khi biến nạp người ta tách những enzyme phân giải và để cho tế bào phát triển,
thành tế bào mới được tạo nên. Các tế bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi
trường nhân tạo thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng để tạo nên cây
hoàn chỉnh. Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern
blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen.
-

Bên cạnh các phương pháp biến nạp Agrobacterium hoặc xung điện, hiện nay
có hai phương pháp khác cũng thường được sử dụng để đưa DNA vào trong tế bào.
Phương pháp thứ nhất là vi tiêm: với một cái pipet rất nhỏ người ta có thể đưa các
phân tử DNA trực tiếp vào nhân tế bào mà người ta muốn biến nạp. Phương pháp
này đầu tiên chỉ được sử dụng ở tế bào động vật, nhưng sau này người ta đã sử dụng
cho tế bào thực vật. Phương pháp thứ hai là bắn vào tế bào các vi đạn
(microprojectile), thường bằng vàng hoặc wolfram, được bao bọc bởi DNA.
Phương pháp này được gọi là phi sinh học và được sử dụng thành công ở nhiều loại
tế bào khác nhau.
Ở động-thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế bào
biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn.
Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên,
tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác cũng gặp một vài khó
khăn. Từ một tế bào biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gen,
trong đó mỗi tế bào mang DNA ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau sau khi
nở hoa và tạo hạt.
1.4.Vector sử dụng trong công nghệ chuyển gen ở thực vật.
 Vector là gì:

18


Trong sinh học, vector là một phân tử DNA có khả năng mang một đoạn DNA
ngoại lai và khi xâm nhập vào loại tế bào chủ thích hợp thì có khả năng tự tái bản
không phụ thuộc vào sự sao chép của hệ gen tế bào chủ.
Nói cách khác, vector là một phương tiện truyền thông tin di truyền trong cơ
thể hoặc giữa các cơ thể khác nhau.
Tế bào chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E.coli. Phần lớn các vector là
các phân tử DNA dạng vòng nhỏ (plasmid) hoặc là bacteriophage.
Vector có thể được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzyme hạn chế và

được nối với một đoạn DNA tương hợp khác được cắt bởi cùng enzyme.
Trong tạo dòng phân tử, vector là rất cần thiết bởi vì thực tế cho thấy rằng một
đoạn DNA chứa gen không thể làm gì trong tế bào chủ. Vì nó không phải là một bộ
phận của genome bình thường của tế bào, cho nên nó sẽ không được tái bản khi tế
bào phân chia, không được biểu hiện và có khả năng bị phân huỷ khá nhanh.
Trong kỹ thuật di truyền, vector là công cụ có khả năng nghiên cứu genome
người và genome các loài khác và sự sử dụng chúng trong nghiên cứu đang trở nên
ngày càng phổ biến một cách rộng rãi.
Các đặc tính của vector:



Vector phải đủ lớn để mang DNA ngoại lai nhưng không quá lớn để dễ xâm
nhập vào tế bào, đồng thời thuận lợi trong quá trình sao chép.
-

Vector phải chứa các trình tự kiểm soát (control sequences) như khởi điểm tái
bản (origin of replication), promoter nhờ đó DNA trên vector mới có thể sao chép
và được duy trì trong quần thể tế bào.
-

Vector phải mang một hoặc nhiều vị trí nhận biết của enzyme giới hạn sử
dụng làm vị trí ghép DNA trong tạo thể tái tổ hợp.
-

Vector phải mang các gen marker chọn lọc (thường là các gen kháng chất
kháng sinh). Vì vậy các tế bào chứa chúng có thể được phát hiện một cách dễ dàng.
-

Các bước trong tạo dòng phân tử:

Nối vector và đoạn DNA ngoại lai cần được tạo dòng trong ống nghiệm để tạo DNA
tái tổ hợp nhờ sự xúc tác của enzyme ligase.


-

-

Biến nạp DNA tái tổ hợp vào một dòng tế bào chủ. Chọn lọc thể biến nạp trên môi
trường agar trong đĩa petri có chất kháng sinh.
-



Tách dòng DNA tái tổ hợp bằng cách sử dụng mẫu dò (probe).

Các vector sử dụng để chuyển gen vào thực vật.
- Các vector biến nạp vào tế bào thực vật sử dụng Agrobacterium
tumefaciens.

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh khối u trên cây, để tổng hợp
ra một loại dinh dưỡng đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển.
19


Hình 2.1: Bệnh khối u hình chóp ở cây Hình 2.2: Khối u hình chóp ở cành táo.
mâm xôi do A.tumefaciens gây ra.
Vi khuẩn Agrobacterium là sinh sản trong đất, gram âm, cùng họ
với
Rhizobium. Agrobacterium tumefaciens tạo ra khối u trong tế bào chưa được phân

hóa và chưa được tổ chức. Một vài dòng của Agrobacterium tumefaciens không
tạo khối u nhưng kích thích sự tăng trưởng của teratomas (thể dị thường, khác
thường).Tuy nhiên thực vật thuộc đơn tử diệp tỏ ra kháng đối với Agrobacterium,
chỉ trừ một vài loài của Asparagus.

b:

Hình 2.3. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
a: Dưới kính hiển vi điện tử.
Khối u ở cây và từ khối u này xuất hiện chồi một cách tự nhiên.

Đặc điểm quan trọng của tế bào khối u là tăng trưởng không cần chất điều hòa sinh
trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy mô. Điều này ngược lại với tế bào cây
bình thường là cần phải bổ sung auxin, cytokinin để duy trì sự tăng trưởng và sự
sống trong nuôi cấy. Những khối u này là không gian sống của vi khuẩn, một số
chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn được tạo ra, đây cũng chính là đặc tính
20


của tế bào khối u. Trong mô bình thường không có hình thành nhóm hóa học này.
Những opine phổ biến là nopalin và octopin. Nopalin được tạo nên từ arginine và ketoglutaraldehyd, còn octopin được tạo nên từ amino acid là arginine và pyruvate.

Hình 2.4. phản ứng tạo nopalin và octopine.
Khả năng chuyển DNA của Agrobacterium tumefaciens được sử dụng trong
công nghệ gen hiện đại. Để được quá trình này điều cần thiết là phải làm rõ sự
tương tác giữa Agrobacterium với thực vật.
Nhiễm
sắc thể
vi
khuẩn

T- DNA
Gen vir

Ti plasmid

Hình 2.5: Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
21




Ti – plasmid.
• Cấu tạo Ti-plasmid.

Việc sử dụng A. tumefaciens đã bắt đầu từ 1907, khi người ta phát hiện vi
khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị thương, được gọi là
khối u cổ rễ. Trong những năm bảy mươi người ta tìm thấy trong các chủng
A. tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn có kích thước 200 đến 800 kb.
Qua những thí nghiệm chuyển đến những chủng không độc (không có plasmid
này), đã khẳng định plasmid này cần thiết cho việc tạo khối u. Vì vậy, plasmid này
được gọi là Ti-plasmid (tumor inducing-plasmid).
Ti-plasmid là một plasmid lớn với kích thước khoảng 200kb. Trên Tiplasmid có đoạn T-DNA (tumor DNA) được giới hạn bằng bờ phải (right border)
và bờ trái (left border). Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tương tự nhau.
Các bờ này gồm một trình tự lặp lại của 25 bp, là trình tự nhận biết cho việc cắt TDNA. T-DNA là một
đoạn có kích thước 25kb chứa các gen tổng hợp opine và đoạn này sẽ được chuyển
vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể của tế bào cây chủ và gây ra bệnh u.
Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có vùng vir (vir region) chịu trách nhiệm hoạt
động lây nhiễm, chuyển nạp (conjugative transfer) và tiêu hóa opine (opine
catabolism) và các gen gây khối u, tổng hợp và đồng hóa opine.

Hình 2.6: Cấu tạo của Ti-plasmid.
Phân tích di truyền và ứng dụng kỹ thuật lập bản đồ liên kết gen cho phép
chúng ta hiểu được chức năng của vùng mang T-DNA, vùng này được thể hiện theo
22


sự liên hợp nhất. T-DNA được đưa vào DNA thực vật trong nhân tế bào. Vị trí gắn
vào thường là ngẫu nhiên, tuy nhiên thường là những vùng có khả năng sao chép.
Sự tổng hợp opine được điều khiển bởi T-DNA. Những enzyme như: octopine
synthase, nopaline synthase được mã hóa trên T-DNA tại những locus: osc và nos
theo thứ tự. Trong T-ADN có chứa 3 vùng gen quan trọng quy định sự hình thành
khối u. Đó chính là vùng gen iaam và iaah kích thích cho sự hình thành IAA và
vùng gen ipt kích thích cho sự hình thành cytokinin. Tỷ lệ auxin/cytokinin kích
thích sự hình thành callus tạo lên các khối u.
•

Cơ chế chuyển gen của Ti-plasmid.
Quá trình chuyển nạp gen của vi khuẩn như sau: khi cây bị thương tiết ra

chất độc vết thương thường là các chất có bản chất phenol: acetosyringone (AS) và
hydroxyacetosyringone (OH-AS). Chất này có tác dụng làm lành vết thương, vừa là
kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập, chất có vai trò quan trọng trong việc nhận
biết và sự gắn kết giữa vi khuẩn và tế bào thực vật lại có vai trò như một chất kích
hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ
trái và bờ phải) để gắn vào bộ gen thực vật. Cơ chế nhận biết được giải thích là nhờ
tính đặc hiệu của A.tumefaciens với cây hai lá mầm, ở cây một lá mầm thì phản ứng
này chỉ ở một ít loài. Vì vậy, Agrobacterium được sử dụng giới hạn cho biến nạp
cây một lá mầm.
A. tumefaciens nhận biết acetosyringon nhờ một chất nhận, được mã hóa bằng
một gen ở vùng vir. Sự nhận biết bằng chất nhận dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả gen

vir. Vùng vir bao gồm nhiều gen. Một sản phẩm gen vir khác là một endonuclease
nhận biết bờ phải và trái của T-DNA và cắt T- DNA ở những vị trí này. Sau đó, một
protein gắn vào sợi đơn của T-DNA và phức hệ này được chuyển vào thực vật dưới
tác dụng của các sản phẩm gen vir .
Tiplasmid

T-DNA
T-DNA
LB

RB
endonucle
as
RB
Protein
gây
khối u

23


Phức hệ T-DNA-Protein
Hình 2.7: Quá trình tạo phức hợp T-DNA- protein.
1: T- DNA với bờ phải và bờ trái được chèn vào Ti-plasmid. 2: Sợi đơn được cắt ra
nhờ protein được mã hóa bởi gen virD2. 3: Sợi đơn của T-DNA được giải phóng và
kết hợp với protein do virD2 và virE2 mã hóa, chỗ đứt ở sợi đơn thứ hai được tổng
hợp bổ sung. 4: Lấp đầy chỗ trống trong Ti-plasmid (đường gạch nối đậm). Sợi TDNA tự do được vận chuyển vào tế bào thực vật ở dạng phức hệ DNA-protein.
Sau đó T-DNA duỗi mạch và liên kết với các protein gây khối u tạo thành
phức hợp DNA – protein. Phức hợp này thông qua vết thương xâm nhập vào tế bào
thực vật. Khi xâm nhập vào tế bào thực vật, protein kích thích hình thành khối u

tách ra khỏi phức hợp còn T-DNA gắn vào bộ gen thực vật.

Hình 2.8: Minh họa cơ chế hoạt động của Ti-plasmid.
Khối u được tạo nên là do phytohormone (auxin và cytokinin) được tạo ra ở trong tế
bào thực vật bị xâm nhiễm, chúng kích thích sự phân chia tế bào và tạo nên mô
không phân hóa.
Sự phát triển khối u sau khi nhiễm A. tumefaciens dựa trên tác dụng của hai
phytohormone. Các enzyme cần thiết cho tổng hợp phytohormone được mã hóa chủ
yếu từ những gen trên T-DNA. Sự tổng hợp auxin được thực hiện bởi hai gen là
tms1 và tms2. Gen tms1 mã hóa tryptophan-2- monooxygenase xúc tác cho sự biến
đổi tryptophan thành indol-3-aceamid. Sản phẩm của gen tms2 là indol-3-acetamidhydrogenase, xúc tác để tạo ra auxin: indolylacetic acid. Ngoài ra T-DNA còn mang
gen tmr mã hóa cho enzyme isopentenyltransferase. Enzyme này gắn 5’-AMP vào
chuỗi bên isoprenoid để tổng hợp nên tiền cytokinin là isopentenyladenin và
isopentenyladenosin. Hydroxyl hóa tiền cytokinin bằng những enzyme thực vật để

24




tạo nên cytokinin. Auxin được tạo nên cùng với cytokinin làm cho khối u lớn lên,
trong đó sự phân chia tế bào không phân hóa được kích thích.
Quá trình này ứng dụng trong công nghệ gen gặp khó khăn do việc tạo mô
do những gen tổng hợp cytokinin và auxin không thể tái sinh từ tế bào thành những
cây hoàn chỉnh và khỏe mạnh. Sự tổng hợp opine là không mong muốn vì cây tiêu
tốn năng lượng không cần thiết. DNA lạ không thể đưa vào Ti-plasmid cũng như TDNA.
Vector Ti-plasmid cải tiến.
•
Hệ thống vector đồng liên hợp
Người ta đã thành công trong việc làm biến đổi Ti-plasmid và T-DNA để

những phytohormone này không được tạo nên. Trong những bước tiếp theo gen
tổng hợp opine được cắt ra và đưa vào đó những gen chọn lọc , ví dụ gen kháng
kanamycin. Ngày nay, người ta sử dụng những hệ thống được gọi là vector liên hợp
ở đây chức năng của Ti-plasmid được thực hiện ở hai plasmid.

Ti-plasmid
Không có
T-DNA

A.t. ori
LB T2 Gen

P2 T1

Mod. T-DNA
R
L
E.coli

E. coli plasmid
với T- DNA

KanR
Hình 2.9: Sơ đồ biểu diễn hệ thống vector hai nguồn để biến nạp bằng
A. tumefaciens.
Các gen tạo khối u và tổng hợp nopalin được loại ra, T-DNA mang một gen đánh
dấu để chọn lọc trong thực vật (SMG). Các gen khác được chèn vào. A. t. ori: Khởi
đầu sao chép để nhân lên trong A. tumefaciens, E. c. ori: Khởi đầu sao chép để nhân
lên trong E. coli. kanR: gen kháng kanamycin để chọn lọc trong E.coli và A.
tumefaciens. P1, P2: Promoter, T1, T2: Terminator, vir: Vùng vir.

25