Định lượng coliforms bằng pp MPN

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (742.75 KB, 15 trang )

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:
ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG
PHƯƠNG PHÁP MPN

GVHD: NGUYỄN THỊ KIM OANH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 10/2016

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG
PHƯƠNG PHÁP MPN

DANH SÁCH NHÓM 4

HỌ VÀ TÊN

MÃ SỐ SINH VIÊN

Nguyễn Thị Kim Loan
Lê Thị Mỹ Duyên

2006140062

Nguyễn Phạm Thị Mỹ Duyên

2006140059

Nguyễn Thị Kiều Em

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 10/2016

2

MỤC LỤC

3

LỜI MỞ ĐẦU

4

I.

TỔNG QUAN VỀ COLIFORMS
Coliforms là trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí
tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi trong 24 – 48 giờ.
Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi
trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 370C trong môi trường lỏng Lauryl Sunfate và
môi trường Brilliant Green Lactose Bile Salt.
Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dụng để đánh giá mức an toàn

về vi sinh trong thực phẩm, được áp dụng đầu tiên ở Mỹ 1920. Nhóm Coliforms
hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Sự hiện diện một
lượng lớn Coliforms trong thực phẩm là điều không mong muốn, tuy nhiên rõ
rang không thể loại bỏ chúng hoàn toàn trong nhiều thực phẩm động lạnh hoặc
tươi sống. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: E.Coli; Citrobacter; Klebsiella và
Enterrobacter.

Hình 1 : Coliforms

5

1.

II.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG
PHÁP MPN.
Phạm vi áp dụng
Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4882 : 2007 ( ISO 4831 : 2006)
dùng để phát hiện và định lượng Coliforms trong thực phẩm.

2.

Nguyên tắc
Cấy vào bộ 3 hoặc 5 ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng
nồng độ kép một lượng mẫu thử xác định ( nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng)
hoặc với một lượng huyề phù ban đầu xác định ( nếu có sản phẩm ở dạng khác).
Sau đó, trong cùng điều kiện, cấy các ống tiếp theo chứa môi trường với các
dịch pha loãng thập phân của phần mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
Ủ các ống chứa môi trường tăng sinh chon lọc nồng độ kép ở 37 0C trong
24 giờ và các ống chứa môi trường nồng độ đơn 24 hoặc 48 giờ và sau đó kiểm

tra sự sinh khí hoặc sự mờ đục của các ống này.
Từ các ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép và các ống
chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn có sinh khí hoặc mờ đục, cấy
các dịch cấy vào một loạt các ống chứa môi trường khẳng định.
Ủ ẩm các ống ở 370C trong 24h đến 48h và sau đó kiểm tra tất cả các ống
này về sự sinh khí.
Tính xác xuất lớn nhất của Coliforms có trong 1 mililit hoặc trong 1 gram
mẫu ( tức là số MPN) từ số ống có sinh khí hoặc loạt ống thử mới. Dùng bảng
để xác định số có xác xuất lớn nhất.

3.
3.1

Hóa chất, môi trường, dụng cụ và thiết bị
Hóa chất và môi trường
Hóa chất- môi trường
Dung dịch Saline

Qui cách

Số lượng/ đơn vị tính
120ml đến 140ml

Peptone Water (SPW)
Lauryl Suflate Tryptone

90ml

Broth (LSB)
Brilliant Green Lactpse

90ml

Bile Salt ( BGBL)
Cồn

900 và 700
6

0,5 lít

NaCl
NaOH


10%
10%

3-5 giọt
3.5
giọt

Môi trường tăng sinh chọn lọc: ( Lauryl Suflate Tryptone Broth ( LSB)
Môi trường nồng Môi trường nồng
độ kép
Tryptose
40 g
Lactose
10 g

Natri Clorua ( NaCl)
10 g
Dikali hidrophotphat 5,5 g

độ đơn
20 g
5g
5g
2,75 g

(K2HPO4)
Natri lauryl sulfat
0,2 g
Nước cất
1000 ml
Kali
hidrophotphat 5,5 g

0,1 g
1000 ml
2,75 g

(KH2PO4)


Môi trường khẳng định: Brilliant green lactose bile broth ( BGBL) gồm :
+ Pepton : 10 g
+ Lactose : 10 g
+ Mật khô bò: 20 g
+ Briliiant green: 0,0133 g

+ Nước cất: 1000 ml

3.2

Dụng cụ ( sử dụng cho một mẫu phân tích)
Ống nghiệm
Cốc thủy tinh
Cốc thủy tinh
Ống Durham
Bình tam giác hoặc bao PE
vô trùng
Ống đong
Que cấy vòng
Đầu típ Pipetman
Đầu típ Pipetman
Đèn cồn
Ống hút nhỏ giọt
Bút lông đầu

18mm
100ml
250ml
250ml or 1 kg
100ml
1000 microlit
5000 microlit

7

18 ống

1 cái
2 cái
18 ống
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái

Bông thấm ướt
Bông không thấm ướt
3.3

0,3 kg
0,3 kg

Thiết bị ( dung cho một mẫu phân tích)
Tủ cấy vô trùng
Nồi hấp
Tủ ấm
300C-370C
Máy dập mẫu (Stomacher)
Máy trộn mẫu
vortex
mixer)
Cân phân tích

pH kế
Bể ổn nhiệt
Pipetman
1000 microlit
Pipetman
5000 microlit
Lò viba

1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái

4. Chuẩn bị dung dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy
4.1 Chuẩn bị dung dich pha loãng
Dung dịch pha loãng được tham chiếu theo TCVN 6507-1 : 2005 (ISO
6887-1 : 2003)
Dung dịch muối pepton (SPW): Hòa tan các thành phần trong nước, đun
nóng nếu cần. Phân phối 90ml dịch pha loãng vào các bình (hoặc lọ có nắp vặn)
và 9ml vào các ống nghiệm. Đậy nắp bình và ống nghiệm, hấp khử trùng.



4.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Môi trường tăng sinh chọn lọc: Lauryl sulfate tryptose broth (LSB)
Hòa tan các thành phần trong nước cất, đun nóng nếu cần. Phân phối 10ml

môi trường vào từng ống nghiệm có chứa ống Durham úp ngược. Hấp khử
trùng, ống Durham không chứa bọt khí sau khi hấp.


Môi trường khẳng định: Brilliant green lactose bile broth (BGBL)

8

Hòa tan các thành phần trong nước cất, đun nóng nếu cần. Phân phối 10ml
môi trường vào từng ống nghiệm có chứa ống Durham úp ngược. Ống Durham
không chứa bọt khí sau khi hấp.
5. Quy trình định lượng coliforms
5.1 Quy trình định lượng Coliforms

9

10g/25g đối với mẫu rắn hoặc 10ml/25ml đối với mẫu lỏng + 90/225ml Saline
Peptone Water(SPW)

Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60 giây
Pha loãng
Mẫu chất lỏng/ huyền phù ban đầu

Dịch mẫu 10-1/10-2

1ml

1ml

10ml
Ba ống nghiệm LSB
nồng độ kép

Ba ống nghiệm LSB
nồng độ đơn

Ba ống nghiệm
LSB nồng độ
đơn

Ủ ở 30oC hoặc 37oC trong 24 – 48 giờ

Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi độ pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL, ủ ở 30oC hoặc 37oC
trong 24 – 48 giờ

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

Tra bảng MPN

Biểu thị kết quả

10

5.2 Các bước thực hiện quy trình định lượng Coliforms
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc 10ml/25ml đối với mẫu lỏng
cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác).
Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml vô trùng vào bao PE (hoặc
bình tam giác) chứa mẫu.
Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác
trong 2-3 phút.
Bước 2: Pha loãng mẫu
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu cho vào một ống nghiệm
chứa 9ml dịch dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.
Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn
1cm. Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng.
Trộn đều bằng máy vortex trong 5 – 10 giây để thu được dung dịch pha loãng
10-2 (đối với các mẫu nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1).
Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3,10-4,10-5,…
cho đến khi thu được độ pha loãng thích hợp.

Hình 2: Kỹ thuật pha loãng mẫu

Bước 3: Cấy và ủ mẫu

11

Lấy 3 ống nghiệm môi trường tăng sinh LSB có nồng độ kép. Dùng pipet
vô trùng chuyển 10ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 10ml huyền phù ban đầu
nếu các sản phẩm ở dạng khác vào từng ống trên.
Lấy 3 ống nghiệm môi trường tăng sinh LSB có nồng đô đơn. Dùng pipet

vô trùng khác chuyển 1ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 1ml huyền phù ban
đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác vào từng ống nói trên.
Lấy 3 ống môi trừng tăng sinh LSB có nồng độ đơn còn lại. Dùng pipet vô
trùng khác chuyển 1ml dịch mẫu loãng tiếp theo vào từng ống nghiệm nói trên.
Trộn đều dịch cấy vào môi trường.
Đặt các ống môi trường LSB có nồng độ kép và đơn vào tủ ấm 370C trong
24 2h. Nếu ở giai đoạn này các ống môi trường LSB có nồng độ đơn không thấy
sinh khí hoặc mờ đuc thì ủ thêm 24 2h.
Bước 4: Thử nghiệm khẳng định
Dùng que cấy vòng cấy dịch cấy từ các ống môi trường LSB ở nồng độ
kép và đơn có biểu hiện mờ đục và sinh khí sang các ống môi trường thử khẳng
định BGBL. Đặt vào tủ ấm ở 370C trong 24 2h, nếu không sinh khí ở giai đoạn
này thì ủ tiếp 24 2h.

6. Đọc kết quả
Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính đối với mỗi độ pha
loãng. Tra bảng MPN, suy ra số lượng vi khuẩn Coliforms trên gram hoặc ml
sản phẩm.
Ví dụ 1:
Độ pha loãng

N/chất

10-1

10-2

Số ống (+) trên LSB

3

2

1

Số ống (+) trên BGBL

2

2

0

12

Chỉ số dương tính trên môi trường BGBL là 220, dựa vào bàng 4.2 tra
được số vi khuẩn Coliforms trong 1ml (g) mẫu là 2MPN/ml (g).
Ví dụ 2: Trong trường hợp pha loãng nhiều lần thì kết quả tra bảng sẽ nhân
với số nghịch của số pha loãng ban đầu.

Độ pha loãng

10-3

10-4

10-5

Số ống (+) trên LSB

3

2

1

Số ống (+) trên BGBL

2

2

0

Chỉ số dương tính trên môi trường BGBL là 220, dựa vào bảng 4.2 có kết
quả là 2. Vậy ta có số vi khuẩn Coliforms trong 1ml (g) mẫu là 2 103 vi
khuẩn/ml (g).
Bảng 4.2 Tra bảng MPN loạt 3 ống nghiệm

13

Số ống dương

Chỉ số

Nguyên chất

1/10