Nghiên cứu tạo rễ cây tơ bạch hoa xà (plumbago zeylanica l ) và khảo sát khả năng tạo plumbagin trong nuôi cấy in vitro (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

……..….***…………

TÊN NCS: BÙI ĐÌNH THẠCH

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ
(Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO
PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành: Sinh lý học Thực Vật
Mã số: 62.42.01.12

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2016


Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: TS. NGUYỄN HỮU HỔ
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TSKH. NGÔ KẾ SƯƠNG

Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp tại Học
viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201….

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Cây

Bạch

hoa

xà

(Plumbago

zeylanica

L.)

thuộc

họ

Plumbaginaceae, là cây dược liệu được phân bố ở vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới như Australia, Châu Á và Châu Phi (Vijver và Looter, 1971).
Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, Plumbagin chiết từ cây Bạch
hoa xà có khả năng kháng ung thư (Mohana và Purushothoma, 1980),
kháng khuẩn (Duraga và cs, 1990; Didery và cs, 1994), kháng ký sinh
trùng sốt rét (Parimala và Sachdanandam, 1993), ức chế hoạt động phân
chia tế bào (Bhargava, 1994), kháng sâu, kháng đột biến (Kubo và cs,
1983) và có khả năng làm giảm cholesterol (Ram, 1996).
Vai trò của Plumbagin như một chất kháng ung thư đã được ghi
nhận bởi nhiều tác giả (Parimala và Sachdanandam, 1993; Naresh và cs,
1996; Sugie và cs, 1998; Hazra và cs, 2002) cũng như kháng ung thư
tuyến tiền liệt (Powolny và Singh, 2008), ung thư phổi (Hsu và cs, 2006;
Gomathinayagam và cs, 2008), ung thư thanh quản (Nair và cs, 2008),
ung thư buồng trứng (Srinivas và cs, 2004) và ung thư da (Wang và cs,
2008).
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của Plumbagin được biểu hiện qua
khả năng ngăn chặn chu kỳ phân chia tế bào S-G2/M thông qua sự kích
thích p12 –yếu tố kìm hãm enzyme cyclin-dependent kinase (Jaiswal và
cs, 2002; Kuo và Cho, 2006) ở ung thư ruột; kìm hãm enzyme
1


NAD(P)H oxidase (Ding và cs, 2005) ở tế bào khối u não và thận; kìm
hãm các enzyme liên quan đến hoạt động kháng ung thư (Hazra và cs,
2002; Jaiswal và cs, 2002) và ức chế hoạt động của yếu tố phiên mã NFKB

(NF-KB: nuclear factor-kappaB) và các sản phẩm gen được điều hòa

bởi NF-KB, kết quả là làm tăng sự chết theo chương trình và ức chế sự
phát triển của tế bào khối u (Aggarwal, 2004). Ngoài tác động kháng

ung thư¸ Plumbagin cũng kích thích tính nhạy cảm của tế bào ung thư
đối với bức xạ qua các thí nghiệm với tế bào khối u ở chuột cũng như
các tế bào khối u in vitro (Devi và cs, 1998; Ganasoundari và cs, 1997).
Cho đến nay, trong nước đã ghi nhận được một số công trình công
bố về kết quả nghiên cứu về cây BHX, chủ yếu là khảo sát các hoạt chất
thứ cấp và tác dụng dược lý, chưa ghi nhận được công trình công bố về
kết quả nghiên cứu về thu hoạt chất thứ cấp từ nuôi cấy rễ cây BHX in
vitro.
Do có tác dụng dược lý như đã nêu, song việc trồng cây BHX ở
điều kiện tự nhiên để thu hoạt chất đòi hỏi nhiều thời gian, nên việc
nghiên cứu tìm nguồn nguyên liệu chứa Plumbagin cao thông qua kỹ
thuật công nghệ nuôi cấy rễ tơ cây BHX được đề xuất thông qua việc
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà (Plumbago
zeylanica L.) và khảo sát khả năng tạo Plumbagin trong nuôi cấy in
vitro”.
2. Mục đích của luận án:
- Nghiên cứu tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.)
2


- Khảo sát khả năng tạo Plumbagin trong nuôi cấy rễ tơ cây Bạch
hoa xà in vitro.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro câyBạch hoa xà dùng cho
chuyển gen.
- Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt
chất Plumbagin.
- Định tính và định lượng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ.
- Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của

Plumbagin.
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Thông tin về đối tượng nghiên cứu
1.1.1.Đặc điểm hình thái
Bạch hoa xà thuộc họ Plumbaginaceae, có nguồn gốc từ vùng Tây
Bắc Châu Á. Họ Plumbaginaceae có 10 chi và 280 loài, nhiều loài thuộc
chi Plumbago phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Vijver và cs.,
1971; Aditi và cs., 1999; Vishnukanta và cs., 2010; Lubaina và cs.,
2011).
Ở Việt Nam, cây Bạch hoa xà còn có nhiều tên khác (Bạch tuyết hoa,
cây Chiến, cây Đuôi công (Đỗ Tất Lợi, 2003), Đuôi công trắng, Bươm
bướm trắng) là cây hoang dại, phân bố ở các tỉnh miền Trung và đồng
3


bằng trung du Bắc bộ, hoặc được trồng ở vườn các gia đình và các cơ sở
khám chữa bệnh y học cổ truyền. Vị trí phân loại của cây như sau:
Giới

Thực vật

Phân giới

Plantae

Lớp

Magnoliopsida

Phân lớp

Caryophyllidae

Bộ

Plumbaginales

Họ

Plumbaginaceae

Chi

Plumbago

Loài

Plumbago zeylanica L.

1.1.2.Thành phần hóa học
Hoạt chất chính trong thành phần hóa học của cây Bạch hoa xà là
chất Plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1, 4-naphthoquinone), có ở dạng
đơn (hydro plumbagin, dihydro plumbagin, hydroxyl plumbagin
(droseron), dihydroxy hydro

plumbagin

(idoshinanolon), chloro

plumbagin, plumbagin acid), dạng ghép đôi (hai phân tử nối với nhau

tạo thành biplumbagin: chitanon, zeylanon, isozeylanon và maritinon),
có khi hai phân tử plumbagin và zeylanon ghép lại với nhau thành
plumbazeylanon làm thành một triplumbagin.

4


1.1.3.Hoạt tính Plumbagin
- Phản ứng oxy
hóa chuyên
biệt
- Tế bào chết
theo chương
trình
- Gây lỗi chu
kỳ tế bào
- Cảm ứng bức
xạ

kích
thích

kìm
hãm
Plumbagin

- NF-kB
- Bcl-2
- Akt
- Topoisomerase-II

- STAT-3
- NMPs
- uPA
- Phát triển của vi
sinh vật

(Padhye và cs, 2010).
1.2. Các nghiên cứu về nuôi cấy rễ tơ thu nhận Plumbagin ở thực
vật
Loài thực Nguồ
vật

n

Môi

Chất

Nguồn thu

Tài liệu

trường

ĐHSTTV và

nhận

trích dẫn

một số chất

Plumbagin

mẫu

bổ sung
P. indica

Lá

MS

Thân

MS

6,7 μM BA +
1,4 μM IAA
+ 370 μM
Ads

Chồi

Das và Rout
(2002)

Mô sẹo

Satheesh

Kumar và
Bhavananda

1,5 mg/L
kinetin+ 2,5
Chồi

MS
½ B5

mg/L 2,4-D

5

n (1988)
Chồi

Chanprame
và cs (2003)


3 mg/L BA
Rễ tơ

Rễ tơ

Tatreerod
và cs (2003)

Plumbago Thân

non
zeylanica
P. indica

Rễ

MS

0,49mmol/L
IBA

Rễ tơ

Verma và cs
(2001)

MS

0,2 mg/L

Dịch huyền

Petcharut

NAA, 0,2

Phù tế bào

Chuntaratin

mg/L 2,4-D +
Thân

MS

0,5 mg/L

(2006)
Mô sẹo

kinetin

Lá

MS

0,2 mg/L
NAA, 0,2
mg/L 2,4(2,4-D), 0,5
mg/L kinetin

Rễ tơ

30 g/l
sucrose.
Plumbago

Lá

MS

zeylanica

1,0 mg/L

Rễ bất định

Sivanesan

IBA và 0,5

và rễ tơ

và Jeong

mg/L NAA
Plumbago Chồi
indica

(2009)
Rễ tơ

MS

Gangopadh
yay và cs
(2010)

Plumbago Chồi

MS

2,0 mg/L
IAA – 0,02
6

Mô sẹo

Villarrea và


scandens
L
P. rosea

Rễ tơ

MS

mg/L BAP –
0,5 mg/L
GA3
0

cs (2015)
Rễ tơ

L.

Pillai và cs

(2015)

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Phương pháp thực nghiệm
2.1.1.Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro câyBạch hoa xà dùng cho
chuyển gen
2.1.1.1. Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu
Mẫu sử dụng nghiên cứu là đoạn thân chứa chồi bên thu nhận từ
cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên, được xử lý vô trùng và nuôi cấy tuần tự
theo các bước sau: Rửa dưới vòi nước máy 10-15 phút; rửa tiếp 3-4 lần
bằng nước khử ion vô trùng, lắc 10 phút trong cồn 70%, rửa sạch cồn
bằng nước khử ion vô trùng. Mẫu được khử trùng tiếp bằng dung dịch
Javel (2-8%); tiếp đó mẫu được rửa bằng nước khử ion vô trùng 3-4 lần,
loại bỏ những đoạn tế bào chết và cấy mẫu lên môi trường MS. Thí
nghiệm lặp lại 3 lần với 30 mẫu/nghiệm thức. Các chỉ tiêu theo dõi sau 4
tuần nuôi cấy: Tỷ lệ mẫu cấy vô trùng (%) = (số mẫu cấy vô trùng/tổng
số mẫu) x 100; Tỷ lệ mẫu cấy có khả năng phát triển (%) = (số mẫu cấy
có khả năng phát triển/tổng số mẫu vô trùng) x 100; Tỷ lệ mẫu nảy chồi.

7


2.1.1.2. Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi
ngủ
Các đoạn thân (chứa chồi bên) được tạo ra từ nghiệm thức 2.2.1.1.
được nuôi cấy tiếp trên môi trường MS có bổ sung BA 1,0 – 2,5 mg/L và
IBA 0,1 – 0,5 mg/L. Thí nghiệm được bố trí 3 mẫu/bình, 3 bình/nghiệm
thức, lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy: Tỷ lệ mẫu
cấy tạo chồi (%) = (số mẫu cấy tạo chồi/tổng số mẫu cấy) x 100; Số chồi
trung bình/mẫu cấy; Chiều cao chồi (cm).

2.1.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro
Các chồi in vitro tạo ra từ nghiệm thức 2.2.1.2. được nuôi cấy tiếp
trên môi trường MS có bổ sung IBA 0,1 – 0,5 mg/L. Thí nghiệm được
bố trí 3 mẫu/bình, 3 bình/nghiệm thức, lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu theo dõi
sau 2 tuần nuôi cấy: Tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ (%) = (số mẫu cấy tạo rễ/tổng
số mẫu cấy) x 100; Số rễ trung bình/mẫu cấy; Số lá trung bình/mẫu cấy;
Chiều dài rễ (cm).
2.1.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân cây
Bạch hoa xà in vitro
Các mẫu (lá và đoạn thân) in vitro được nuôi cấy trên môi trường
MS có bổ sung NAA, IBA 0,1 – 1,5 mg/L. Thí nghiệm được bố trí 5
mẫu/bình, 3 bình/nghiệm thức, lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu theo dõi sau 4
tuần nuôi cấy: Trọng lượng rễ trung bình (gTLT/nghiệm thức).

8


2.1.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ
2.1.2.1. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ
Lá trưởng thành từ cây in vitro (lá thứ 2 từ ngọn xuống) được dùng
làm nguồn mẫu cho quá trình chuyển gen. Chủng Agrobacterium
rhizogenes ATCC 11325 được chuyển vào mẫu lá. Ở điều kiện môi
trường bổ sung acetosyringone (10 - 150 M), thời gian ủ 1, 3, 7 ngày.
Thí nghiệm được thực nghiệm với 1000 mẫu/nghiệm thức.
Hiệu quả chuyển gen được đánh giá dựa trên % số mẫu tiếp nhận
được gen chuyển (dựa vào thuật toán đáp ứng bề mặt để tìm điểm tối ưu
thông qua phần mềm thống kê SAS).
2.1.2.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen rol trong T-DNA của vi
khuẩn hợp nhất được vào bộ gen tế bào rễ tơ bằng phương pháp PCR
Mẫu rễ tơ được cho là chuyển gen tiến hành tách chiết DNA. Tiến

hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế theo Królicka và
cs., 2001 (Bảng 2.1) và thành phần phản ứng: 2,5 ml 10 x đệm PCR; 0,2
mM dNTP’s; 0,4 mM mồi; 1,0 Unit Taq polymerase; 200 ng DNA
khuôn; Thể tích hỗn hợp cuối cùng 25 µl.
Bảng 2.1. Các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR
Gen

RolB

Tên
mồi

Trình tự (5’-3’)

B1

TCAAGTCGCCGAGGTTTCTT

B2

AAACGCTCCGCGGTGGT

9

Sản phẩm PCR
(bp)
610


RolC

C1

TTGACCTATGTGCTCTTT

C2

CTCCATTCCAAATTTGCATT

530

Chương trình phản ứng PCR: Chương trình nhiệt bắt đầu ở
94oC thời gian 2 phút, tiếp theo sau 30 chu kỳ với nhiệt độ: 94oC trong 1
phút; 55oC trong 1 phút; 72oC trong 1 phút; Kết thúc 30 chu kỳ nhiệt độ
được giữ ở 72oC trong 5 phút.
2.1.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy
hoạt chất Plumbagin
2.1.3.1. Khảo sát điều kiện nuôi cấy
Một số yếu tố như trạng thái môi trường, điều kiện chiếu sáng, loại
môi trường, khối lượng rễ nuôi cấy ban đầu được khảo sát nhằm chọn
lọc điều kiện tối ưu cho sự phát triển sinh khối rễ. các thí nghiệm được
nuôi cấy trên môi trường có bổ sung sucrose 30 g/l, pH 5,8-5,9; Nhiệt độ
25oC ±2oC; độ ẩm = 65% để khảo sát cho từng yếu tố. Chỉ tiêu về trọng
lượng tươi rễ tơ (gTLT/bình), chỉ số sinh trưởng rễ tơ được ghi nhận sau
4 tuần nuôi cấy.
2.1.3.2. Xác định đường cong tăng trưởng
1 g mẫu rễ tơ được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu của nghiệm thức
2.2.3.1.
Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần (3 bình/lần lặp lại). Khả năng phát
triển của rễ tơ được ghi nhận sau 0, 1, 2, 3,4, 5, 6 tuần nuôi cấy, với chỉ

tiêu theo dõi: Trọng lượng tươi (gTLT/bình); Hàm lượng Plumbagin
(µg/g TLT).
10


2.1.3.3. Ảnh hưởng một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự
sinh trưởng của rễ tơ
- Thí nghiệm được thiết lập với 12 nghiệm thức, cho 7 yếu tố:
Nước dừa (10-30%), chitosan (10-100 mg/L), salicylic acid (100-300
mg/L), đường (10-50 g/L), dịch chiết nấm men (100-1000 mg/L), casein
(100-500 mg/L) và peptone (100-500 mg/L) (Bảng 2.2). Mức thấp (-1)
và mức cao (+1) của các yếu tố được thiết lập bởi ma trận PlackettBurman (Plackett, Burman 1946), qua phần mềm Design Experment 7.0
để chọn ra 4 yếu tố ảnh hưởng đến thông số cần khảo sát từ đó tìm điểm
tối ưu dựa trên thuật toán D-Optimal.
Bảng 2.2. Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự sinh
trưởng rễ tơ
Nghiệm
thức

X1-

X2 -

X3-

X4 -

X5 - dịch

X6 -

X7 -

Nước chitosan salicylic đường trích nấm casein peptone
dừa

(10-100

acid

(10-50

men

(100-

(100-

(10-

mg/L)

(100-

g/L)

(100-

500

500

300

1000

mg/L)

mg/L)

mg/L)

mg/L)

30%)

1

-1

-1

+1

-1

+1

+1

-1

2

+1

-1

-1

-1

+1

-1

+1

3

+1

-1

+1

+1

-1

+1

+1

4

+1

-1

+1

+1

+1

-1

-1

5

+1

+1

-1

-1

-1

+1

-1

11


6

-1

-1

-1

+1

-1

+1

+1

7

+1

+1

+1

-1

-1

-1

+1

8

-1

+1

-1

+1

+1

-1

+1

9

-1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

10

+1

+1

-1

+1

+1

+1

-1

11

-1

+1

+1

-1

+1

+1

+1

12

-1

+1

+1

+1

-1

-1

-1

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình erlen (250 ml) chứa
60 ml môi trường lỏng. kết quả được ghi nhận thông qua: xác định trọng
lượng tươi (TLT), trọng lượng khô (TLK) và hàm lượng Plumbagin
trong mỗi nghiệm thức sau 4 tuần nuôi cấy.
2.1.4. Định tính và định lượng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ
Nghiền 1 g mẫu rễ khô và ly trích với chloroform trong máy ly
trích soxhlet ở nhiệt độ phòng 48 giờ. Cho bay hơi dịch ly trích để loại
chloroform và thu được bột ly trích thô (Jeyachandran và cs., 2009). Hòa
tan 5 mg bột ly trích thô với 5 ml acetonitrile trong bình flask thể tích 10
ml, thêm dung dịch acetonitric đến vừa đủ 10 ml. Các nồng độ khác
nhau được chuẩn bị và được dùng để chạy sắc ký lỏng cao áp. Trước khi
phân tích các mẫu Plumbagin đều được lọc qua màng lọc có kích thước
lỗ 0,45 µm.
2.1.4.1. Định tính Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)
Dịch ly trích từ rễ tơ cây Bạch hoa xà được định tính cùng với chất
chuẩn Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng như sau:
12


- Sử dụng bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 20 x 20cm.
- Dung dịch ly giải: Ether dầu hỏa: ethyl acetate = 7:3
- Thuốc thử: NaOH 10% trong cồn.
2.1.4.2. Định lượng Plumbagin bằngHPLC (Gopinath và cs, 2009)
HPLC được tiến hành trên cột pha đảo C-18, (250×4.6), kích thước 5
μm. Dung môi để phân tách là acetonitrile (50 mM potassium
dihydrogen phosphate: actonitrile với tỉ tệ (45:55)) ở pH 3,5, tốc độ
dòng 1,0 ml/phút. Hệ thống hoạt động ở nhiệt độ 26 oC. Thể tích mẫu: 20
μl. Sắc ký được ghi nhận ở 270 nm để xác định Plumbagin cùng với chất
chuẩn.

2.1.5. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của
Plumbagin
Tế bào ung thư gan HepG2 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ
sung 10% FBS, 1% kháng sinh Penicillin và Streptomycin. Tế bào
HepG2 được cảm ứng bằng Plumbagin ở các nồng độ khác nhau: 0 µM,
2,5 µM, 5 µM, 10 µM và 20 µM. Khả năng kháng tế bào HepG2 của
Plumbagin được ghi nhận sau 3 ngày nuôi cấy thông qua xác định mật
độ tế bào trong mỗi ml, sự hiện diện của gen bax, bcl-2 và beta-actin;
đánh giá sự phân mãnh.
2.1.6. Xử lý số liệu :
Thu thập số liệu thực nghiệm và xử lý bằng phần mềm Microsoft
Excel 2003, Design Experment 7.0, SigmaPlot và SAS.

13


Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro
3.1.1.Xác định điều kiện khử trùng mẫu
Kết quả khảo sát khả năng khử trùng mẫu của Javel cho thấy: Ở
nghiệm thức sử dụng Javel 8% và thời gian 20 phút có tỷ lệ mẫu vô
trùng 72,33%, tỷ lệ mẫu sống 53,49% và tỷ lệ nảy chồi 96,50% (Bảng
3.1) là điều kiện tối ưu trong các nghiệm thức khảo sát (38,67% mẫu đạt
yêu cầu).
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước Javel và
thời gian khử trùng tạo mẫu in vitro từ đoạn thân cây Bạch hoa xà.
Nghiệm

% mẫu vô

Tỷ lệ mẫu sống

Tỷ lệ nảy

thức

trùng

(%)

chồi(%)

J1

1,67 h

100a

100 a

J2

2,33 h

100 a

100 a

J3

10,00 gh

100 a

100 a

J4

14,38 fg

75,39 b

100 a

J5

43,78 e

62,57 c

100 a

J6

64,11 cd

46,56 f

100 a

J7

22,50 f

64,89 c

100 a

J8

49,67 e

60,25 cd

100 a

J9

78,83 ab

44,92 f

100 a

J10

61,70 d

56,95 de

100 a

J11

72,33 bc

53,49 e

96,50 b

14


J12

84,83a

20,28 g

85,67 c

Tương tác javen *thời gian, có:
P

<0,01

<0,01

<0,01

CV

9,29

3,54

1,18

Các số trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa thống kê ở
mức xác suất với yếu tố P: p <0,01.
z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g, h trên cùng một cột biểu thị sự khác
biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's
Multiple Range Tests .
3.1.2. Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi
ngủ
Kết quả khảo sát khả năng tạo chồi từ chồi bên trong nuôi cấy mô
cây Bạch hoa xà sau 4 tuần nuôi cấy nhận thấy: Nghiệm thức A1 (1,0
mg/L BA và 0,1 mg/L IBA) cho chiều cao trung bình của chồi là 1,57
cm với số lượng chồi trung bình là 4,49 chồi/mẫu, còn ở nghiệm thức B1
(1,5mg/L BA và 0,1 mg/L IBA) - chiều cao trung bình của chồi thấp
hơn, chỉ đạt 1,40 cm, nhưng lại đạt số lượng chồi trung bình lên đến 4,68
chồi/mẫu (Bảng 3.2).
Với mục tiêu tạo số lượng lớn chồi trực tiếp từ chồi bên cho quá
trình nhân nhanh in vitro, nghiệm thức B1 (1,5 mg/l BA và 0,5 mg/l
IBA) được chọn là nghiệm thức thích hợp cho sự tạo chồi in vitro cây
Bạch hoa xà.

15

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật đến khả năng tạo chồi từ chồi bên in vitro của cây Bạch
hoa xà.
NT

BA

IBA

(mg/L) (mg/L)

Tỷ lệ mẫu

Số chồi

Chiều cao chồi

tạo chồi

trung

trung bình

(%)

bình/mẫu

(cm)

A1

1,0

0,1

88,48 b

4,49 b

1,57 b

A2

1,0

0,2

77,52 d

4,19 c

1,47 c

A3

1,0

0,3

83,22 c

2,66 f

1,59 a

A4

1,0

0,4

77,85 d

3,51 e

1,31 f

A5

1,0

0,5

55,91 f

3,78 d

1,12 h

B1

1,5

0,1

99,00a

4,68a

1,40 e

B2

1,5

0,2

88,89 b

4,34 c

1,44 d

B3

1,5

0,3

88,22 b

1,83 i

0,68 o

B4

1,5

0,4

98,17 a

2,40 g

0,73 m

B5

1,5

0,5

77,11 d

3,73 d

0,87 k

C1

2,0

0,1

98,33 a

2,44 g

1,33 f

C2

2,0

0,2

87,89 b

1,85 i

1,06 j

C3

2,0

0,3

77,78 d

1,36 kj

0,83 l

C4

2,0

0,4

98,33 a

2,78 f

1,10 i

C5

2,0

0,5

77,78 d

3,58 e

1,26 g

D1

2,5

0,1

88,89 b

1,46 j

1,04 j

D2

2,5

0,2

88,57 b

1,21 k

0,68 on

16


D3

2,5

0,3

87,89 b

2,46 g

1,27 g

D4

2,5

0,4

65,00 e

1,72 i

0,51 p

D5

2,5

0,5

67,00 e

2,13h

0,70 n

có:

<0,01

<0,01

<0,01

P

2,1

2,39

0,89

Tương tác BA*IBA,

CV
Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác
nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.
z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt
giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's Multiple
Range Tests.
3.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro
Sự hình thành và phát triển của hệ rễ mới in vitro là điều kiện quan
trọng để cây phát triển.Vì thế, trong thí nghiệm này, IBA được sử dụng
để kích thích ra rễ. Kết quả sau 2 tuần nuôi cấy cho thấy, ở tất cả các

nghiệm thức đều có tạo rễ, nhưng có sự khác nhau về số lượng và chiều
dài rễ ở các nghiệm thức (Bảng 3.3). Ở nghiệm thức có bổ sung IBA lần
lượt là 0,1 mg/L; 0,15 mg/L; 0,3 mg/L đều nhiều rễ. Trong đó, nghiệm
thức có bổ sung 0,1 mg/L IBA cho chiều dài rễ tốt nhất (2,28 cm).

17


Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự phát triển cây
Bạch hoa xà từ chồi in vitro.
NT

IBA(mg/L)

Tỷ lệ

Số rễ

Chiều

Số lá

tạo rễ

trung

dài rễ

trung

(%)

bình/mẫu

(cm)

bình/mẫu

E0

0,00

100

4,31 g

2,92 a

4,03g

E1

0,10

100

11,32 c

2,28 b

6,62a

E2

0,15

100

12,99 a

1,31 c

6,33 b

E3

0,20

100

9,12 e

1,16 d

5,37d

E4

0,25

100

10,32 d

1,16 d

4,99e

E5

0,30

100

12,67 b

0,96 e

5,61c

E6

0,35

100

5,59 f

0,66 f

4,69f

<0,01

<0,01

<0,01

1,32

3,55

1,76

Ảnh hưởng IBA lên sự tạo rễ, có:
P
CV

Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác
nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.
z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt
giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's Multiple
Range Tests.

18


3.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây
Bạch hoa xà in vitro
Cảm ứng tạo rễ bất định ở lá và đoạn thân trên môi trường MS có bổ

sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ở nồng độ khác nhau nhằm
xác định loại mô có khả năng tạo rễ tốt để sử dụng làm nguồn nguyên
liệu chuyển gen, kết quả được ghi nhận ở Bảng 3.4, hình 3.1.
b

a

Hình 3.1. Rễ bất định từ lá (a) và đoạn thân (b)
Bảng 3.4. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ
bất định từ lá và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy.
Hàm

lượng Trọng lượng rễ TB/nghiệm thức

(mg/L)
Nghiệm

(gTLT)
Lá

Đoạn thân

0,0

1,21 m

0,43 o

0,0

0,1

2,63 b

0,68 n

R3

0,0

0,5

2,53 c

0,82 l

R4

0,0

1,0

1,83 h

1,13 k

R5

0,0

1,5

1,70 jk

1,23 gh

IBA

NAA

R1

0,0

R2

thức

19


R6

0,1

0,0

1,63 k

1,23 gh

R7

0,1

0,1

2,05 g

1,75 a

R8

0,1

0,5

2,10 fg

1,54 c

R9

0,1

1,0

2,18 ef

0,85 l

R10

0,1

1,5

2,39 d

1,67 b

R11

0,5

0,0

1,72 j

1,44 e

R12

0,5

0,1

3,06a

1,23 gh

R13

0,5

0,5

1,70 jk

0,77 m

R14

0,5

1,0

1,80 h

1,15 jh

R15

0,5

1,5

1,80 h

1,26 g

R16

1,0

0,0

1,82 h

0,85 l

R17

1,0

0,1

2,14 f

0,75 m

R18

1,0

0,5

2,24 e

1,49 d

R19

1,0

1,0

2,39 d

1,19 ijh

R20

1,0

1,5

2,55 c

0,84 l

R21

1,5

0,0

1,85 h

0,76 m

R22

1,5

0,1

2,35 d

1,31 f

R23

1,5

0,5

1,74 ij

1,22 ghi

R24

1,5

1,0

1,30 l

1,15 jh

R25

1,5

1,5

1,26 lm

1,17 ijk

Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác
nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.

20


z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt
giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's Multiple
Range Tests.
Từ kết quả nhận được, mô lá được sử dụng cho nghiên cứu chuyển
gen tạo rễ tơ ở cây Bạch hoa xà.
3.2. Chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà
3.2.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ
Mô lá được xử lý với vi khuẩn và nuôi chung trong điều kiện môi
trường chứa acetosyringone thay đổi (10, 50, 100, 150 M) và thời gian
ủ chung kéo dài 1, 3, 7 ngày; mỗi nghiệm thức được tiến hành với 1000
mẫu. Sau thời gian nuôi chung, tiến hành chọn lọc và xác định các mẫu
rễ chuyển gen, kết quả nhận được theo Bảng 3.5, Hình 3.2, 3.3, 3.4,
3.5).

Hình 3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi chung với vi khuẩn: a. Nuôi
chung mẫu cấy với vi khuẩn 1 ngày; b. Nuôi chung mẫu cấy với vi
khuẩn 3 ngày; c. Nuôi chung mẫu cấy với vi khuẩn 7 ngày.

21


Hình 3.5. Rễ tơ nuôi

Hình 3.3. Rễ tơ giả Hình 3.4. Đoạn rễ tơ
định hiển vi (vật
hiển vi (vật kính 40).
kính 40).

trên môi trường lỏng
lắc sau 30 ngày

Kết quả kiểm tra PCR (Hình 3.6, 3.7) đã chọn được 4 dòng rễ chuyển
gen, trong đó chỉ có một dòng mang cả 2 gen rolB và rolC.
L N P P1 P2 P3 P4

L N P P1 P2 P3 P4
10.000 bp

10.000 bp
3.000 bp

3.000 bp
1.000 bp

1.000 bp
750 bp
750 bp

500 bp

500 bp

250 bp

250 bp

Hình 3.7. PCR gen rolC.

Hình 3.6. PCR gen rolB

Kết quả nhận được ở điều kiện acetosyringone 50 µm/L và 7 ngày ủ
chung mẫu với vi khuẩn cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao nhất (0,2%)
(Bảng 3.5).

22


Bảng 3.5. Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acetosyringone đến mô nuôi
và tỉ lệ mẫu chuyển gen.
Ngày

Hàm lượng

Tỉ lệ mẫu lá bị

Tỉ lệ mẫu rễ

ủ

acetosyringone

nhũn (%)

chuyển gen thu
nhận được (%)

(µM)
1

10

28

0

1

50

28

0

1

100

28.5

0

1

150

30

0

3

10

54,5

0

3

50

55

0

3

100

56,5

0

3

150

57,67

0,1

7

10

60

0,1

7

50

63

0,2

7

100

65

0

7

150

67,5

0

R2

0,9996

0,4834

CV

0,8518

190,1575

Từ kết quả phân tích cho thấy điểm tối ưu cho khả năng tạo mẫu
chuyển gen cao nhất được dự đoán (dựa trên phần mềm SAS để phân
tích mối tương quan đáp ứng bề mặt, tìm điểm tối ưu) là: thời gian ủ

23