Nghiên cứu tạo rễ cây tơ bạch hoa xà (plumbago zeylanica l ) và khảo sát khả năng tạo plumbagin trong nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TÊN NCS: BÙI ĐÌNH THẠCH

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH
HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ
NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY
IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TÊN NCS: BÙI ĐÌNH THẠCH

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH

HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ
NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY
IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC.
Chuyên ngành: Sinh lý học Thực vật
Mã số: 62.42.01.12

Người hướng dẫn khoa học:
1. Chức danh, tên GV1: TS. NGUYỄN HỮU HỔ
2. Chức danh, tên GV2: PGS.TSKH. NGÔ KẾ SƯƠNG

Hà Nội – 2016


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng
để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được
cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận án
Nghiên cứu sinh

Bùi Đình Thạch

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành nghiên cứu này, tác giả xin chân thành cảm ơn:
- Các thầy giáo hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Hổ và PGS.TSKH. Ngô Kế
Sương luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu.
- Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới, Bộ phận đào tạo sau Đại học của
Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi và quan tâm sâu sắc trong công
việc và thực hiện nghiên cứu.
- Các Thầy/Cô, Anh/Chị, Đồng nghiệp và Bạn bè đã hỗ trợ trong công tác
chuyên môn, ủng hộ tinh thần và cho những ý kiến xác đáng trong quá trình thực
hiện nghiên cứu.
Đặc biệt, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến Ba, Mẹ và Gia đình
luôn hỗ trợ về vật chất và tinh thần.

Nghiên cứu sinh

Bùi Đình Thạch


iii

TÓM TẮT
Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) là một cây dược liệu quan trọng, rễ
cây chứa thành phần chính là Plumbagin, một naphthoquinone có nhiều đặc tính
dược liệu được quan tâm, như: kháng tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm
và kháng côn trùng. Với mục tiêu tạo nguồn nguyên liệu chứa hàm lượng
Plumbagin cao thông qua nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà, trên cơ sở: chọn cơ

quan thực vật phù hợp dùng chuyển gen; xác định hiệu quả chuyển gen dưới tác
động đồng thời của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone; xác định tác động
đồng thời của một số yếu tố (điều kiện nuôi cấy, môi trường, dinh dưỡng và
elicitor) lên khả năng sinh trưởng, tích lũy Plumbagin trong rễ tơ và đánh giá
biểu hiện tác động kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin.
Kết quả nghiên cứu đã xác định lá là cơ quan được chọn để chuyển gen
tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà, có sự tác động đồng thời giữa thời gian ủ và hàm
lượng acetosyringone lên hiệu quả chuyển gen theo đó Acetosyringone 134,09
µM và 3,47 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC
11325 cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao nhất (0,025%). Khả năng phát triển của rễ tơ
cây Bạch hoa xà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, theo đó: môi trường MS,
rễ được nuôi ở điều kiện tối và môi trường ở dạng lỏng là điều kiện tối ưu cho sự
phát triển sinh khối rễ tơ.
Sử dụng ma trận Plackett-Burman (Plackett, Burman 1946) để đánh giá
tác động đồng thời của nhiều yếu tố (dinh dưỡng và elicitor) lên khả năng sinh
trưởng và tích lũy Plumbagin, qua đó đã chọn lọc và xác định được điều kiện
môi trường nuôi cấy rễ tơ có bổ sung: nước dừa: 14,30%, chitosan 100 mg/L,
salicylic acid 19,40 mg/L và peptone 500 g/L thu được kết quả tối ưu với trọng


iii

lượng tươi 5,268 g, trọng lượng khô: 0,46 g và hàm lượng Plumbagin: 13,135
mg.
Ngoài ra, hoạt tính của Plumbagin cũng được kiểm chứng qua việc cảm
ứng sự biểu hiện các đặc điểm hình thái cũng như thay đổi sự cân bằng trong
biểu hiện một số gene liên quan tới quá trình chết của tế bào HepG2, thông qua
mật độ trung bình của tế bào HepG2 giảm, sự phân mảnh của nhân và sự biểu
hiện của gene (bax và bcl-2) liên quan đến quá trình apoptosis.

iv

ABSTRACT

Plumbago zeylanica L. is an important pharmaceutical plant. Its roots
contain high quantity of Plumbagin, a naphthoquinone that has positive effects
against cancer cells, bacteria, fungi as well as insects. This research aims to
produce Plumbagin sources through culturing Plumbago zeylanica L. hairy roots
on the selection of suitable plant segment for transgene. The study also identifies
the transgene efficiency under effects of incubation time and acetosyringone
concentration; identifies other factors (culturing condition, media, nutrition and
elicitor) on plant growth and plant capacity to accumulate Plumbagin in hairy
roots and evaluates anticancer effect of Plumbagin on liver carcinoma.
This study showed that the highest transgenic efficiency (0.025%) was
achieved when leaf segment was used to generate transgenic hairy roots in 3.47
days of incubation with Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 at 134.09 µM
acetosynringone. P. Zeylanica L. hairy roots showed to be grow best in liquid
MS media and in dark condition.
Using Plackett-Burman (Plackett Burman, 1946) matrix to analyse
efficiency of co-factors, the optimum condition for hairy roots to grow and
accumulate Plumabagin was media supplemented with 14.30 % coconut water,
100 mg/L chitosan, 19.40 mg/L salicyclic acid and 500 g/L peptone. With the
listed condition, the best result achieved were 5.268 g fresh weigh and 0.46 g dry
weight of hairy roots, with plumbagin content was 13.135 mg.
Besides, plumbagin had effects on physiology of liver cancer cells. It also
affects some apoptotic genes of HepG2 cells. The results showed that there were


iv

a reduction in number of HepG2 cells, fragmentation in nucleus and expression
of apoptotic bax and bcl-2 genes.


v

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
TÓM TẮT ............................................................................................................ iii
ABSTRACT ......................................................................................................... iv
MỤC LỤC ............................................................................................................ v
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................... vi
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... viii
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1.......................................................................................................... 4
TỔNG QUAN ...................................................................................................... 4
1.1. Cây Bạch hoa xà ........................................................................................... 4
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................ 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................... 4
1.1.3. Thành phần hóa học ............................................................................ 5
1.1.4. Công dụng của dịch trích ly từ rễ cây BHX ........................................ 6
1.2. Plumbagin ..................................................................................................... 7
1.2.1. Cấu trúc và đặc tính hóa học ............................................................... 7


v

1.2.2. Sinh tổng hợp Plumbagin ở thực vật ................................................... 7
1.2.3. Hoạt tính của Plumbagin ..................................................................... 8
1.2.3.1. Hoạt tính kháng oxy hóa............................................................... 8
1.2.3.2. Hoạt tính kháng viêm.................................................................... 9
1.2.3.3. Hoạt tính kháng ung thư .............................................................. 10
1.2.3.4. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................ 12
1.2.3.5. Hoạt tính kháng nấm ................................................................... 13
1.2.4. Độc tính của plumbagin ...................................................................... 13
1.2.5. Tình hình nghiên cứu thu nhận hoạt chất Plumbagin từ thực vật... 16
1.3. Chuyển hóa thứ cấp từ thực vật ................................................................ 20
1.3.1. Hợp chất thứ cấp từ thực vật ............................................................. 20
1.3.2. Con đường chuyển hóa các hợp chất thứ cấp................................... 21
1.3.3. Dược tính của các hợp chất thứ cấp từ thực vật ............................... 24
1.4. Sự cần thiết nuôi cấy rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp ........................... 25
1.4.1. Sự hình thành rễ tơ ở thực vật ........................................................... 27
1.4.2. Chuyển gen tạo rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes ...................... 28
1.4.2.1. Ri-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes .................. 28
1.4.2.2. Sự chuyển nạp gen từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế
bào thực vật............................................................................................ 29
1.4.2.3. Sự biểu hiện của các gen vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
trong mô thực vật ................................................................................... 32
1.4.2.4. Tạo rễ tơ ở thực vật bằng Agrobacterium rhizogenes .................. 39
1.5. Nuôi cấy rễ tơ ở thực vật ............................................................................ 40
1.5.1. Ảnh hưởng của dòng rễ tơ ................................................................. 41


v

1.5.2. Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy ......................................... 41

1.5.3. Ảnh hưởng của elicitor....................................................................... 43
1.5.4. Nuôi cấy rễ tơ để thu nhận các hoạt chất thứ cấp ............................ 44
CHƯƠNG 2......................................................................................................... 48
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................................... 48
2.1. Vật liệu ......................................................................................................... 48
2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................... 48
2.1.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy .................................................. 49
2.2. Phương pháp thực nghiệm ......................................................................... 49
2.2.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho
chuyển gen ...................................................................................................... 49
2.2.1.1. Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu ............................................. 49
2.2.1.2. Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ ... 50
2.2.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro ................................. 52
2.2.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân cây Bạch
hoa xà in vitro .......................................................................................... 52
2.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ ..................... 54
2.2.2.1. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ ................................................... 54
2.2.2.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen rol trong T-DNA của vi khuẩn
hợp nhất được vào bộ gen tế bào rễ tơ bằng phương pháp PCR............ 56
2.2.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt
chất plumbagin trong nuôi cây rễ tơ cây Bạch hoa xà .......................... 58
2.2.3.1. Ảnh hưởng trạng thái môi trường .............................................. 58


v

2.2.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng sinh trưởng
của rễ tơ .................................................................................................. 59
2.2.3.3. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ .. 59
2.2.3.4. Ảnh hưởng khối lượng ban đầu ................................................. 60

2.2.3.5. Xác định đường cong tăng trưởng ............................................. 60
2.2.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh
trưởng của rễ tơ ............................................................................................. 61
2.2.4. Định tính và định lượng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ ...................... 62
2.2.4.1. Ly trích và chuẩn bị mẫu cho phân tích HPLC ......................... 62
2.2.4.2. Định tính Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) .................. 63
2.2.4.3. Định lượng Plumbagin bằng HPLC .......................................... 63
2.2.5. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của
Plumbagin ................................................................................................ 64
2.2.6. Xử lý số liệu .......................................................................................... 67
CHƯƠNG 3......................................................................................................... 68
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 68
3.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro............................................................ 68
3.1.1. Xác định điều kiện khử trùng mẫu ..................................................... 68
3.1.2. Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ ..... 70
3.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro .......................................... 73
3.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây Bạch hoa
xà in vitro ........................................................................................................ 75
3.2. Chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà ...................................................... 79
3.2.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ ..................... 79


v

3.2.2. Xác định hoạt chất Plumbagin tích lũy trong rễ tơ ............................ 85
3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp Plumbagin ...... 87
3.3.1. Trạng thái môi trường ......................................................................... 87
................................................................................................................................
3.3.2. Điều kiện chiếu sáng............................................................................ 88
3.3.3. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ

tơ...................................................................................................................... 89
3.3.4. Ảnh hưởng của lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi
cấy ................................................................................................................... 91
3.3.5.Xác định đường cong tăng trưởng ....................................................... 92
3.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh dưỡng và elicitor lên sự sinh
trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy ..................................................................... 94
3.4. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin
................................................................................................................. 101
CHƯƠNG 4....................................................................................................... 107
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 107
4.1. Kết luận ...................................................................................................... 107
4.2. Đề nghị........................................................................................................ 108
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................... 109
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ...................................................... 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................
PHỤ LỤC ..............................................................................................................


vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

3MeDAB

Aminoazobenzene 3-methyl-4-dimethyl

BHX

Bạch hoa xà

AQ

Anthraquinone

BRCA

Breast cancer

CADs

Caffeic acid

CĐHSTTV

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Con A

Concanavalin A

ER

Estrogen receptor

GHS

Glutathione

HaCaT

Human keratinocyte line

HEK

Human Embryonic Kidney

IL

Interleukin

MeJA

Methyl jasmonate

MMPs

Matrix metalloproteinases

NPAAs

Non-protein amino acids


vi

NSCLC

Non-small cell lung cancer

OCD

Ornithine cyclodeaminase

ROS

Reactive oxygen species

SM

Secondary metabolism

TLK

Trọng lượng khô

NT

Nghiệm thức

TLT

Trọng lượng tươi

TPA

12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate

NF-kB

Nuclear factor-kappaB

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

PARP

Poly polymerase ADP-ribose

MMP-2

Matrix metalloproteinase-2

ABCG2

ATP-binding cassette sub-family G member 2

SA

Salicylic acid

Trp

Tryptophan

McC

McCown-Lloyd

MS

Murashige and Skoog


vi

B5

Gamborg's B-5

BA

6-benzyladenine

NAA

Naphthalene Acetic Acid

IAA

Indole-3-acetic acid

GA3

Gibberellin A3

2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

GSH

Glutathione

GSL

Glucosinolate

SIR

Sulfur induced resistance


vii

DANH MỤC BẢNG
SỐ

TÊN BẢNG SỐ LIỆU

TRANG

1.1

Một số kết quả ghi nhận trong nghiên cứu in vitro thu nhận

16, 17,

Plumbagin.

18, 19

2.1.

Điều kiện khử trùng đoạn thân cây Bạch hoa xà để tạo mẫu in

49

vitro.
2.2.

Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thử nghiệm

51

tạo chồi từ chồi bên in vitro của cây Bạch hoa xà.
2.3.

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng

53

thực vật đến khả năng hình thành và phát triển rễ bất định
mẫu in vitro.
2.4.

Ảnh hưởng của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone lên

55

tỉ lệ chuyển gen.
2.5.

Các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR.

58

2.6.

Một số loại môi trường nuôi cấy thí nghiệm.

60

2.7.

Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự sinh

62

trưởng rễ tơ.
3.1.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước Javel và thời

69

gian khử trùng tạo mẫu in vitro từ đoạn thân cây Bạch hoa xà
3.2.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật đến khả năng tạo chồi từ chồi bên in vitro của

71


vii

cây Bạch hoa xà.
3.3.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự phát triển cây

75

Bạch hoa xà từ chồi in vitro sau 2 tuần nuôi cấy.
3.4.

Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ

76, 77

bất định từ lá và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy.
3.5.

Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acetosyringone đến mô nuôi

83

và tỉ lệ mẫu chuyển gen.
3.6.

Dữ liệu dự đoán tỉ lệ chuyển gen theo thuật toán.

84

3.7.

Ảnh hưởng trạng thái môi trường nuôi đến khả năng sinh

87

trưởng rễ tơ cây Bạch hoa xà.
3.8.

Ảnh hưởng của chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây

89

Bạch hoa xà.
3.9.

Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ BHX

90

nuôi cấy.

3.10. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả năng sinh trưởng rễ

92

tơ BHX nuôi cấy.
3.11. Sự thay đổi trọng lượng rễ và hàm lượng Plumbagin theo thời

94

gian.
3.12. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự

95

sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy.
3.13. Mức tác động của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự
sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy.

96


vii

3.14. Ảnh hưởng của 4 yếu tố lên sự sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi

97

cấy.
3.15. Phân tích phương sai và phương trình hồi quy theo mô hình

100

D-Optimal.
3.16. Tế bào HepG2 sau 3 ngày cảm ứng Plumbagin ở các nồng độ

102

khác nhau.
3.17. Tỉ lệ đứt gãy DNA trong đuôi và tỉ lệ chiều dài đuôi
comet/chiều dài comet.

104


viii

DANH MỤC HÌNH
TÊN HÌNH ẢNH

SỐ

TRANG

1.1.

Cây Bạch hoa xà

5

1.2.

Cấu trúc phân tử của Plumbagin

7

1.3.

Con đường sinh tổng hợp Plumbagin ở thực vật

8

1.4.

Sơ đồ tóm tắt hoạt động của Plumbagin

16

1.5.

Sinh tổng hợp và trao đổi các chất thứ cấp ở các bào quan

23

1.6.

Cấu trúc Ri-plasmid của A. rhizogenes

29

1.7.

Sự tương tác A.rhizogenes và cơ chế chuyển T-DNA

32

1.8.

Sơ đồ nuôi cấy rễ tơ bằng vi khuẩn Agrobacterium

40

rhizogenes
3.1.

Mẫu Bạch hoa xà sau 4 tuần nuôi cấy in vitro

68

3.2.

Mẫu đối chứng sau 4 tuần nuôi cấy

72

3.3.

MS + 1,5 mg/L BA + 0,1 mg/L IBA sau 4 tuần nuối cấy

72

3.4.

Các nghiệm thức E0, E1, E2, E3, E4, E5, E6 sau 2 tuần nuôi

74

cấy
3.5.

Rễ bất định từ lá (a) và đoạn thân (b)

76

3.6.

Ảnh hưởng của thời gian nuôi chung với vi khuẩn

79


viii

3.7.

Rễ tơ giả định hiển vi (vật kính 40)

80

3.8.

Đoạn rễ tơ hiển vi (vật kính 40)

80

3.9

Rễ tơ nuôi trên môi trường lỏng lắc sau 30 ngày

81

3.10.

PCR gen rolB

81

3.11.

PCR gen rolC

82

3.12.

Ảnh hưởng của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone

83

theo mặt phẳng đồng mức cho tỉ lệ mẫu nhũn.
3.13. Ảnh hưởng của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone theo

84

mặt phẳng đồng mức cho tỉ lệ mẫu chuyển gen
3.14. Sắc ký lớp mỏng định tính Plumbagin

86

3.15. Sắc ký đồ xác định Plumbagin bằng hệ thống HPLC

86

3.16. Đồ thị đường chuẩn hàm lượng Plumbagin

87

3.17

Ảnh hưởng của trạng thái môi trường nuôi đến khả năng sinh

87

trưởng rễ tơ cây Bạch hoa xà
3.18

Ảnh hưởng của chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây

88

Bạch hoa xà

3.19. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ cây

90

BHX nuôi cấy
3.20. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả sinh trưởng triển rễ
tơ BHX nuôi cấy

92


viii

3.21. Đường cong tăng trưởng của rễ tơ cây Bạch hoa xà

93

3.22. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến trọng lượng

98

khô
3.23. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến trọng lượng

99

tươi
3.24. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến hàm lượng

99

Plumbagin
3.25. Hình thái tế bào HepG2

102

3.26. Sự phân mảnh nhân tế bào HepG2

103

3.27. Sự đứt gãy DNA nhân tế bào HepG2 được cảm ứng bởi

105

Plumbagin
3.28. Sự biểu hiện của gene Bcl-2 và Bax ở mức phiên mã của tế
bào HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin ở các nồng độ khác
nhau

106


1

MỞ ĐẦU
Cây Bạch hoa xà (tên khoa học Plumbago zeylanica L.) thuộc họ
Plumbaginaceae, là cây dược liệu có nguồn gốc từ vùng Tây Bắc Châu Á [7],
phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Australia, Châu Á và Châu Phi
[256].
Theo y học cổ truyền, cây Bạch hoa xà (BHX) được dùng để điều trị một

số bệnh về da như bị vết thương, chàm, ghẻ, phong [6]. Nhiều kết quả nghiên
cứu cho thấy, rễ và hạt của cây được sử dụng làm dược liệu vì trong đó chứa một
quinonoid được gọi là Plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1, 4-naphthoquinone)
màu vàng.
Rễ cây BHX được sử dụng làm dược liệu ở Ấn Độ từ khoảng 750 năm
trước công nguyên như: là dược liệu kháng ký sinh, bổ tim, bảo vệ gan và bảo vệ
thần kinh. Có nhiều hoạt chất khác nhau được ghi nhận trong rễ và dịch chiết từ
rễ như phenolic acid, tannin, anthocyanin,… có hoạt tính kháng khuẩn, đặc biệt
là các vi khuẩn gây bệnh [189], [256].
Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, Plumbagin chiết từ cây Bạch hoa xà
có khả năng kháng ung thư [150], kháng khuẩn [54], kháng ký sinh trùng sốt rét
[170], ức chế hoạt động phân chia tế bào [25], kháng sâu, kháng đột biến [127]
và có khả năng làm giảm cholesterol [187].
Vai trò của Plumbagin như một chất kháng ung thư đã được ghi nhận bởi
nhiều tác giả [97], [170], [162], [234], cũng như kháng ung thư tuyến tiền liệt
[182], ung thư phổi [87], [100], ung thư thanh quản [161], ung thư buồng trứng
[228] và ung thư da [259].


2

Hoạt tính kìm hãm tăng trưởng tế bào ung thư của Plumbagin được biểu
hiện qua khả năng ngăn chặn chu kỳ phân chia tế bào S-G2/M bởi sự kích thích
p12 –nhân tố kìm hãm enzyme cyclin-dependent kinase [106], [130] ở ung thư
ruột; kìm hãm enzyme NAD(P)H oxidase [55] ở tế bào khối u não và thận; kìm
hãm các enzyme liên quan đến hoạt động kháng ung thư [97], [106] và ức chế
hoạt động của yếu tố phiên mã NF-KB (NF-KB: nuclear factor-kappaB) và các
sản phẩm gen được điều hòa bởi NF-KB, kết quả là làm tăng sự chết theo chương
trình và ức chế sự phát triển của tế bào khối u [8]. Ngoài tác động kháng ung
thư¸ Plumbagin cũng kích thích tính nhạy cảm của tế bào ung thư đối với bức xạ

qua các thí nghiệm với tế bào khối u ở chuột cũng như các tế bào khối u in vitro
[51], [74].
Cho đến nay, trong nước đã ghi nhận được một số công trình công bố về
kết quả nghiên cứu ở cây BHX, chủ yếu là khảo sát các hoạt chất thứ cấp và tác
dụng dược lý, chưa ghi nhận được công trình công bố về thu hoạt chất thứ cấp từ
nuôi cấy rễ cây BHX in vitro.
Do có tác dụng dược lý như đã nêu, song việc trồng cây BHX ở điều kiện
tự nhiên để thu hoạt chất đòi hỏi nhiều thời gian, nên việc nghiên cứu tìm nguồn
nguyên liệu chứa Plumbagin cao thông qua kỹ thuật công nghệ nuôi cấy rễ tơ
cây BHX được đề xuất thông qua việc thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo rễ tơ
cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) và khảo sát khả năng tạo
Plumbagin trong nuôi cấy in vitro”.
Các nội dung chính của đề tài bao gồm:
- Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho chuyển gen.
- Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ.


3

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt chất
Plumbagin trong nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà.
- Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin.