Ly thuyet sac ky (seminar)

SEMINAR

PHÂN TÍCH SẮC KÝ
---------------------------------------------------------------------------------------------

ThS. GVC. NGUYỄN THỊ HUỆ
Khoa Hóa Học - ĐHKHHuế

1


• Trong hóa học phân tích, vấn đề định lượng chất trong đối tượng phức tạp là một công việc khó khăn mà
các phương pháp định lượng trực tiếp không thực hiện được, nguyên nhân là do:
- Ảnh hưởng của yếu tố nền
- Các chất cần phân tích rất giống nhau
- Nồng độ các chất cần phân tích rất thấp

• Phương pháp phân tích sắc ký có thể phân tích được các đối tượng phức tạp này vì nó có thể:
- Tách các chất rất giống nhau ra khỏi nhau
- Định lượng các chất.


VÍ DỤ: PHÂN TÍCH MỘT LOẠI THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT (TBVTV) trong đối tượng rau quả. Phải đi theo các bước

sau đây:

Tách TBVTV ra khỏi môi trường của nó bằng phương
pháp chiết

Tách loại các chất có độ phân cực tương tự TBVTV đó

Chuyển môi trường và làm giàu TBVTV đến nồng độ phù
hợp

Phân tích để xác định hàm lượng TBVTV có trong mẫu.


CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

1.

Lịch sử phát triển
• Phương pháp sắc ký được phát hiện vào năm 1903 do nhà thực vật học người Nga Michael C. Txvet khi
ông tách các chất trong diệp lục tố, thí nghiệm được tiến hành như sau:
Diệp lục tố

Dung môi

Carotine
Xatofil β

CaCO3 + Al2O3

Xatofil α
Clorofil β
Clorofil α

• Năm 1931, Vinterstin và Lederer đã dùng phương pháp của Txvet để tách các Carotine và nhận thấy giá trị
của phương pháp trong kỹ thuật điều chế.

• Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký phân bố trên giấy và đưa ra thuyết đĩa để giải thích các quá
trình sắc ký

•

Năm 1952, những máy sắc ký khí mới ra đời tỏ ra có ưu thế do hiệu quả tách rất
cao. Cột mao quản và các detector được cải tiến, làm tăng độ phân giải và độ nhạy của
phương pháp ⇒ phân tích đươc các chất có hàm lượng nhỏ cỡ ppm và ppb ⇒ phát
triển phương pháp nhanh và ứng dụng nhiều trong thực tế.

•

Năm 1970, Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời, vật liệu nhồi cột được cải
tiến, computer và các thiết bị phụ trợ được đưa vào ⇒ tăng cường khả năng tách của
phương pháp.

• Các kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và các phương pháp khác như:
Sắc ký - Khối phổ ( GC-MS, LC- MS), sắc ký và cộng hưởng từ hạt nhân, sắc ký
đa chiều, sắc ký điện di mao quản (CEC)…
Phương pháp có độ chính xác, độ nhạy cao, phân tích được nhiều đối tượng phức
tạp.


2. BẢN CHẤT CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
Sắc ký là quá trình tách động dựa trên sự phân chia các cấu tử chất phân tích lên 2 pha - pha tĩnh là pha đứng yên có khả năng hấp thu chất phân tích, pha động là pha chuyển dịch dọc theo
pha tĩnh – trong quá trình pha động chuyển dịch dọc theo pha tĩnh. Do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Lực tương tác giữa pha tĩnh và cấu tử chất phân tích thường là: Lực phân bố, hấp phụ, lực ion, lực rây phân tử

Quá trình sắc ký khác cơ bản với các quá trình tách khác ở 2 điểm:

- Sự phân bố chất phân tích lên 02 pha lặp đi lặp lại nhiều lần (hàng ngàn lần, hàng triệu lần)
- Pha động đi qua pha tĩnh.


A(đ) ⇔ A(t)
B(đ) ⇔ B(t)
Dung môi
A
Mẫu phân tích

B

A+B
A

(A >B )
Chất nhồi

B
A

( Chất mang + Pha tĩnh)

B

(a)
t=0

( b)

(c)

( d)

t = t1

Hình 1. Hình vẽ minh họa sự phân tách 2 cấu tử A, B
trong mẫu phân tích trong cột sắc ký.

(e)

A


• Hợp chất có ái lực nhiều với pha động thì có xu hướng ra khỏi cột trước.

• Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh bị giữ lại lâu hơn trong cột và ra sau


A+B+C

(A > B > C )
A

B

C

Pha động
B

A
t=0

t1

t2

t3

t4

t5 t6

t7

t8

t RC

t RB

t RA

B
Pha
tĩnh

C

Hình 2. Mô hình tách chiết 3 cấu tử bằng
phương pháp sắc ký

C


Pha động
Ci

A
A

SẮC PHỔ

B
B
C
C
(A > B >C)

Ci
C
Dung môi rửa giải

L
B

SẮC ĐỒ
A

tRC

tRB

tRA

VR C

VRB

VRA

t(s)
V (ml)


4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG DÙNG TRONG SẮC KÝ
4.1. TỐC ĐỘ CỦA CẤU TỬ A (uA)

● Khi pha động chứa một cấu tử cần phân tích A nào đó đi qua cột chứa pha tĩnh thì chất phân tích tự phân bố giữa 2 pha theo hệ số phân
bố:

A(đ)
KD =

↔

A(t)
(1)

[A]t là nồng độ của A trong pha tĩnh ở thời điểm này trong cột
[A]đ là nồng độ của A trong pha động.

● Cấu tử A có thể di chuyển qua cột chỉ khi nó ở trong pha động.
● Nếu KD rất lớn, A lưu lại lâu trên pha tĩnh và đi ra khỏi cột rất chậm.
● Để xem chất phân tích sẽ ra nhanh như thế nào, chúng ta cần biết chất phân tích trong pha động đang ở phần thời gian nào. Phần thời
gian này có nghĩa là phần chất phân tích A trong pha động ở thời điểm bất kỳ nào đó.

f = Phần thời gian của chất A trong pha động =


f=

(2)
Vđ, Vt là thể tích của pha động và pha tĩnh tương ứng

f= =

(3)

● Mặc dầu [A]t và [A]đ thay đổi suốt dọc cột, nhưng tỉ số [A]t/[A]đ vẫn luôn bằng KD.
● Hệ số dung lượng K’= KD.Vt/Vđ
→ f =

(4)

● Vận tốc của A (uA) đi qua cột bằng tốc độ pha động u trong thời gian A ở trong pha động và bằng 0 khi ở trong
pha tĩnh
uA = u.f = u ( )

(5)

( ) luôn luôn < 1 ( vì k’ ≥ 0) → uA không bao giờ > u


Pha động
Ci

A
A

SẮC PHỔ

B
B
C
C
(A > B >C)

Ci
C
Dung môi rửa giải

L
B

SẮC ĐỒ
A

tRC

tRB

tRA

VR C

VRB

VRA

t(s)
V (ml)


● Chất phân tích A đi ra khỏi cột ở thời điểm bất kỳ tR được gọi là thời gian lưu.
Từ tốc độ A và chiều dài cột, thời gian lưu được tính:
tR = = = =

(6)

● Pha động chảy qua cột với tốc độ u → khoảng thời gian pha động ở trong cột là:
tđ = L/u
→ tR = tđ( 1+ K’)

(7)
(8)

● Thời gian lưu của một chất bất kỳ không ở trong pha tĩnh (K D= 0, k’= 0) cũng bằng tđ.
→ Yếu tố này cho phép ta đo tđ dễ dàng bằng cách theo dõi tốc độ đi ra khỏi cột của một chất nào đó không bị

giữ trên cột


4.3. THỂ TÍCH LƯU VR
● Thời gian lưu phụ thuộc vào tốc độ dòng (F) của pha động, nó là thông số thực nghiệm thường thay đổi từ thí
nghiệm này sang thí nghiệm khác
VR(ml) = tR(s) . F(ml/s)

(9) u(cm/s)

● Ở cùng thời gian đó thể tích pha động(Vđ) có mặt trong cột :
Vđ(ml) = tđ(s) . F(ml/s)

(10)

Vđ là thể tích rỗng của cột sắc ký
● Từ 8, 9, 10 ta có: tR = tđ(1+k’)
= ( 1 + k’)
→ VR = Vđ (1+ k’)

(11)

VR = Vđ + Vđ.k’ = Vđ + Vđ.KD.Vt/Vđ
VR = Vđ + KD.Vt

(12)

4.4. THỂ TÍCH LƯU HIỆU CHỈNH (VR’)
VR’ = VR – Vđ = KD.Vt
VR’= VR – Vđ = tRF – tđ F = (tR – tđ)F = tR’ F

4.5. ĐỘ LƯU TƯƠNG ĐỐI (α)
Thời gian lưu hoặc thể tích lưu của một chất có thể được so sánh với thời gian lưu hoặc thể tích lưu của một
chất chuẩn nào đó. Tỉ số đó được gọi là độ lưu tương đối (α )
α= =

=

= =

→ α là tỉ số các hệ số phân bố đối với chất phân tích và chất chuẩn, có thể tính dễ dàng từ thời gian lưu hoặc thể
tích lưu


4.6. HÀM LƯỢNG CHẤT PHÂN TÍCH
Nồng độ chất phân tích

A

Bơm mẫu
V= 0

50

52

54

56

6

0

V(ml)
Tín hiệu

B

Bơm mẫu
t=0

0

30

250

260

wA=15 s

Hình 3. Sắc đồ hỗn hợp 2 chất 1 và 2.

270

t(s)

WB=17 s

18


● Ở hình H3A biểu diễn nồng độ thực của chất phân tích là hàm số theo thể tích rửa giải.

Diện tích dưới đường cong đối với A là một tích phân
Diện tích =
● Ở hình H3B: tín hiệu của Detector (S) là hàm số của thời gian (t).
Diện tích = = RA mmolA
2
RA : Độ đáp ứng của tín hiệu chất A (cm giấy ghi/mmolA)

19


Ví dụ 1. Dùng sắc đồ ở hình 3 và cho Vt = 10 ml, hãy tính các đại lượng liệt kê dưới đây:
Thời gian lưu tR,
Thời gian lưu pha động tđ,
Thể tích lưu VR,
Thể tích lưu pha độngVđ,
Tốc độ dòng F,
Thể tích lưu hiệu chỉnhVR’,
Thời gian lưu hiệu chỉnh tR’,
Độ lưu tương đối α,
Hệ số dung lượng k’,
Hệ số phân bố KD

20

4.7. SỐ ĐĨA LÝ THUYẾT (n)
● Nếu quá trình tách sắc ký ở H.3 là lý tưởng thì tất cả các phân tử A sẽ đi ra ở t R=250 s và tín hiệu ghi được là 1
hình chữ nhật.
Tuy vậy, trong thực tế một số phân tử A đi ra sớm hơn so với t R và một số lại ra muộn hơn → Sắc đồ có dạng
phân bố Gauss như hình 3.
Sự phân bố đó giống như đối với quá trình chiết lỏng lỏng nhiều giai đoạn với số lần chuyển (hay số đĩa lý thuyết)
lớn.
● Vấn đề đặt ra là có bao nhiêu đĩa lý thuyết liên hợp với cột sắc ký đối với sắc đồ ở H.3 → Để trả lời câu hỏi này
chúng ta phải nhận ra rằng: Phân bố trong qt sắc ký tương tự như đường cong sai số chuẩn (H.4)

21


+ Đỉnh sắc ký là đỉnh của đường cong Gauss.
+ Bề rộng của đường cong (W) đó tỉ lệ thuận với độ lệch chuẩn,
+ Bề rộng pic tăng lên theo ( n: số lần thí nghiệm, trong sắc ký thì n là số lần chuyển cân bằng – số đĩa lý
thuyết)
+ Thời gian lưu tăng trực tiếp theo n.
W∼σ
W∼
→σ∼

mà tR ∼ n → ∼ =
hay n ∼ ()

Signal

2

Lý thuyết đơn giản chỉ ra rằng : Hằng số tỉ lệ là 1

n = ()

Do đó:

2

2
n = () =

h/2

σ σ

σ

σ

t(s)

------w-------Hình 4. Peak sắc ký dạng hình Gauss

22


4.8. CHIỀU CAO ĐĨA LÝ THUYẾT (H)
H=

L: Chiều dài cột

n: Số đĩa lý thuyết

Ví dụ III.2:

a.
b.

Hãy tính số đĩa lý thuyết đối với cột sắc ký, có sắc đồ ở hình 3.
Nếu cột dài 120 cm, hãy tính H cho cột này?

23


Bài giải:
a. Đối với peak A:
3
nA = () = = 4,44 . 10 đĩa lý thuyết
Đối với peak B:
3
nB = () = = 4,04 . 10 đĩa lý thuyết
Số đĩa lý thuyết của cột sắc ký :
3
n = (nA + nB)/2 = 4,2.10 đĩa lý thuyết
3
b. H = L/n = 120/ 4,2.10 = 0,029 cm/ đĩa lý thuyết

24


4.9. ĐỘ PHÂN GIẢI

● Điều quan tâm thú vị là xác định xem 1 cột sắc ký phải chứa bao nhiêu đĩa lý thuyết để tách được 2
chất ra khỏi nhau. Nghĩa là các pic ứng với chất phân tích A và chất phân tích B có độ phân giải tốt đến bao
nhiêu.

● Hình 3 cho thấy A và B được tách tốt khi Pic A về đến đường nền trước khi pic B bắt đầu. Rõ ràng là
độ phân giải của 2 pic phụ thuộc vào điều chúng được tách ra xa như thế nào
( ∆tR) và các pic đó rộng như thế nào ( W)

● Từ đỉnh pic 1 cần WA/2 thời gian để về đến đường nền ( bỏ qua đuôi của đường cong sai số chuẩn),
pic thứ 2 sẽ bắt đầu WB/2 thời gian đến đỉnh pic thứ 2 ( bỏ qua đuôi của đường cong sai số chuẩn).
Như thế sẽ phân giải được 2 pic nếu:
∆tR = tRA- tRB ≥

+

25


Cấu tử A

tRB

Cấu tử B

∆tR

tRA

Bơm mẫu
t=0

0

wA=15 s

W B=17 s
t(s)

Hình 3. Sắc đồ hỗn hợp 2 chất A và B.

26