lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phỏửn I : Cồ sồớ lyù
thuyóỳt
HPLC laỡ chổợ vióỳt từt cuớa 04 chổợ caùi õỏửu
bũng tióỳng Anh cuớa phổồng phaùp sừc kyù loớng
hióỷu nng cao ( High Performance Liquid
Chromatography) ,trổồùc kia goỹi laỡ phổồng phaùp
sừc kyù loớng cao aùp (High Pressure Liquid
Chromatography)
Phổồng phaùp naỡy ra õồỡi tổỡ nm 1967-1968
trón cồ sồớ phaùt trióứn vaỡ caới tióỳn tổỡ phổồng
phaùp sừc kyù cọỹt cọứ õióứn . Hióỷn nay phổồng
phaùp HPLC ngaỡy caỡng phaùt trióứn vaỡ hióỷn õaỷi
hoaù cao nhồỡ sổỷ phaùt trióứn nhanh choùng cuớa
ngaỡnh chóỳ taỷo maùy phỏn tờch .Hióỷn nay noù
aùp duỷng rỏỳt lồùn trong nhióửu nghaỡnh kióứm
nghióỷm õỷc bióỷt laỡ ổùng duỷng cho nghaỡnh
kióứm nghióỷm Thuọỳc . Vaỡ noù hióỷn laỡ cọng cuỷ
õừc lổỷc trong phỏn tờch caùc thuọỳc õa thaỡnh
phỏửn cho pheùp õởnh tờnh vaỡ õởnh lổồỹng .


Phỏửn I : Cồ sồớ lyù
thuyóỳt
1 - Khaùi nióỷm : Sừc kyù loớng hióỷu nng cao laỡ mọỹt
phổồng phaùp chia taùch trong õoù pha õọỹng laỡ chỏùt
loớng vaỡ pha tộnh chổùa trong cọỹt laỡ chỏỳt rừn õaợ
õổồỹc phỏn chia dổồùi daỷng tióứu phỏn hoỷc mọỹt
chỏỳt loớng phuớ lón mọỹt chỏỳt mang rừn ,hay mọỹt
chỏỳt mang õaợ õổồỹc bióỳn õọứi bũng lión kóỳt hoaù
hoỹc vồùi caùc nhoùm chổùc hổợu cồ .Quaù trỗnh sừc kyù

loớng dổỷa trón cồ chóỳ hỏỳp phuỷ,phỏn bọỳ ,trao õọứi
Ion hay phỏn loaỷi theo kờch cồợ ( Rỏy phỏn tổớ ) .
2- Nguyón từc cuớa quaù trỗnh sừc kyù trong
cọỹt :
Pha tộnh laỡ mọỹt yóỳu tọỳ quan troỹng quyóỳt õởnh baớn
chỏỳt cuớa quaù trỗnh sừc kyù vaỡ loỹai sừc kyù .
Nóỳu pha tộnh laỡ chỏỳt hỏỳp phuỷ thỗ ta coù Sừc kyù
hỏỳp phuỷ pha thuỏỷn hoỷc pha õaớo .
Nóỳu pha tộnh laỡ chỏỳt trao õọứi Ion thỗ ta coù Sừc
kyù trao õọứi ion .
Nóỳu pha tộnh laỡ chỏỳt Loớng thỗ ta coù Sừc kyù phỏn
bọỳ hay sừc kyù chióỳt .


Phỏửn I : Cồ sồớ lyù
thuyóỳt

Nóỳu pha tộnh laỡ Gel thỗ ta coù Sừc kyù Gel hay Rỏy phỏn
tổớ .
Cuỡng vồùi pha tộnh õóứ rổớa raới chỏỳt phỏn tờch ra
khoới cọỹt ,chuùng ta cỏửn coù mọỹt pha õọỹỹng .
Nhổ vỏỷy nóỳu chuùng ta naỷp mỏựu phỏn tờch gọửm
họựn hồỹp chỏỳt phỏn tờch A,B,C .. Vaỡo cọỹt phỏn tờch
,kóỳt quaớ caùc chỏỳt A,B,C.. Seợ õổồỹc taùch ra khoới nhau
sau khi õi qua cọỹt .Quyóỳt õởnh hióỷu quaớ cuớa sổỷ
taùch sừc kyù ồớ õỏy laỡ tọứng hồỹp caùc tổồng taùc .

Chỏỳt phỏn tờch A
+B+C
Pha tộnh

Pha õọỹng
F2
F3
F1

Phỏửn I : Cồ sồớ lyù
thuyóỳt
Tọứng cuớa 03 tổồng taùc naỡy seợ quyóỳt
õởnh chỏỳt naỡo õổồỹc rổớa raới ra khoới cọỹt
trổồùc tión khi lổỷc lổu giổợ trón cọỹt laỡ nhoớ
nhỏỳt ( F1) .vaỡ ngổồỹc laỷi .
ọỳi vồùi mọựi chỏỳt ,sổỷ lổu giổợ õổồỹc qui
õởnh bồới 03 lổỷc F1,F2,F3 .Trong õoù F1 vaỡ F2
giổợ vai troỡ quyóỳt õởnh .coỡn F3 laỡ yóỳu tọỳ
aớnh hổồớng khọng lồùn .
õỏy F1 laỡ lổỷc giổợ chỏỳt phỏn tờch trón
cọỹt .F2 laỡ lổỷc keùo cuớa pha õọỹng õọỳi vồùi
chỏỳt phỏn tờch ra khoới cọỹt .
Nhổ vỏỷy vồùi caùc chỏỳt khaùc nhau thỗ F1
vaỡ F2 laỡ khaùc nhau ,Kóỳt quaớ laỡ caùc chỏỳt
khaùc nhau seợ di chuyóứn trong cọỹt vồùi tọỳc
õọỹ khaùc nhau vaỡ taùch ra khoới nhau khi ra
khoới cọỹt . ( nhổ hỗnh dổồùi õỏy )


Phỏửn I : Cồ sồớ lyù thuyóỳt :
Phỏửn minh hoaỷ quaù trỗnh taùch caùc
chỏỳt A vaỡ B trong cọỹt taùch sừc kyù
Thồỡi gian A
B

Pha
õọỹng

Pháưn I : Cå såí l
thuút
3 - Phán loải sàõc k :
Theo cå chãú tạch sàõc k ngỉåìi ta phán loẵi nhỉ sau :
3.1 Sàõc k háúp phủ :
Quạ trçnh sàõc k dỉûa trãn sỉû háúp phủ mảnh ,úu
khạc nhau ca pha ténh âäúi våïi cạc cháút tan v sỉû
rỉía gii ( phn háúp phủ ) ca pha âäüng âãø kẹo
cháút tan ra khi cäüt .Sỉû tạch mäüt häùn håüp phủ
thüc vo tênh cháút âäüng hc ca cháút háúp phủ .
Trong trỉåìng loải ny cọ 02 loải háúp phủ :
+ Sàõc k háúp phủ pha thûn ( NP - HPLC) : Pha ténh
phán cỉûc ,pha âäüng khäng phán cỉûc .
+ Sàõc k háúp phủ pha âo (RP - HPLC) : Pha ténh
khäng phán cỉûc ,pha âäüng phán cỉûc .
Loải sàõc k ny âỉåüc ạp dủng ráút thnh cäng
âãø tạch cạc häùn håüp cạc cháút cọ tênh cháút gáưn
tỉång tỉû nhau v thüc loải khäng phán cỉûc,phán
cỉûc úu hay trung bçnh nhỉ cạc Vitamin,thúc hả
nhiãût gim âau ....
Hiãûn nay chụng ta âang sỉí dủng chè cọ loải sàõc k
ny m thäi.

Phỏửn I : Cồ sồớ lyù
thuyóỳt
Chuớ yóỳu hióỷn nay chuùng ta sổớ duỷng loỹai
sừc kyù hỏỳp phuỷ pha õaớo ( RP )

Trong dổồỹc õióứn USP khi chuùng ta tra cổùu
cọỹt coù giaù trở tổồng ổùng nhổ sau :
L1 : RP 18 Kờch thổồùc haỷt tổồng ổùng
tổỡ 5 - 10 àm
L7 : RP 8 Kờch thổồùc haỷt tổồng ổùng
tổỡ 5 - 10 àm
L3 : Si 60 Kờch thổồùc haỷt tổồng ổùng
tổỡ 5 - 10 àm
Vaỡ coỡn mọỹt sọỳ loaỷi cọỹt khaùc nhổ cọỹt Diol
, Cọỹt NH
2
,CN . . vv

Phỏửn I : Cồ sồớ lyù
thuyóỳt
4 - Caùc õaỷi lổồỹng õỷc trổng cuớa sừc kyù õọử
Kóỳt quaớ cuớa quaù trinh taùch caùc chỏỳt õổồỹc
Detector phaùt hióỷn ghi thaỡnh sừc kyù õọử
nhổ hỗnh trón

Pháön I : Cå såí lyï
thuyãút
t
o t
’
r2
t
’
r1
t

r1
t
r2
T
o
: Thåìi gian læu chãút
t
’
r1
: Thåìi gian læu thæûc
cháút A
t
’
r2
: Thåìi gian læu thæûc
cháút B
t
r1
: Thåìi gian læu cháút A
t
r2
: Thåìi gian læu cháút B

Phỏửn I : Cồ sồớ lyù
thuyóỳt
Tổỡ caùc thọng sọỳ cuớa caùc peak trón õỏy ,nhióửu
õaỷi lổồỹng õỷc trổng vóử lyù thuyóỳt õổồỹc õổa
ra õóứ aùnh giaù mọỹt quaù trỗnh sừc kyù .Dổồùi õỏy
laỡ mọỹt sọỳ õaỷi lổồỹng thổồỡng duỡng trong thổỷc
tóỳ vaỡ caùch thay õọứi caùc õaỷi lổồỹng naỡy coù lồiỹ

cho quaù trỗnh phỏn tờch sừc kyù.
4.1 Thồỡi gian lổu thổỷc t
r
: Retention time
Thồỡi gian lổu cuớa mọỹt chỏỳt laỡ thồỡi gian tờnh tổỡ
khi bồm mỏựu vaỡo cọỹt cho õóỳn khi chỏỳt õoù ra
khoới cọỹt õaỷt giaù trở cổỷc õaỷi.
Thồỡi gian lổu cuớa mọựi chỏỳt laỡ hũng õởnh vaỡ caùc
chỏỳt khaùc nhau thỗ thồỡi gian lổu seợ khaùc nhau
trón cuỡng mọỹt õióửu kióỷn sừc kyù õaợ choỹn .Vỗ
vỏỷy thồỡi gian lổu laỡ õaỷi lổồỹng õóứ phaùt hióỷn
õởnh tờnh caùc chỏỳt.
Thồỡi gian lổu phuỷ thuọỹc vaỡo caùc yóỳu tọỳ :
+ Baớn chỏỳt sừc kyù cuớa pha tộnh.
+ Baớn chỏỳt ,thaỡnh phỏửn,tọỳc õọỹ cuớa pha õọỹng
+ Cỏỳu taỷo vaỡ baớn chỏỳt phỏn tổớ cuớa chỏỳt tan
+ Trong mọỹt sọỳ trổồỡng hồỹp thồỡi gian lổu coỡn
phuỷ thuc vaỡo pH cuớa pha õọỹng .

Trong mọỹt pheùp phỏn tờch nóỳu t
r
nhoớ quaù thỗ sổỷ
taùch keùm ,coỡn nóỳu t
r
quaù lồùn thỗ peak bở doaợng vaỡ
õọỹ lỷp laỷi cuớa Peak rỏỳt keùm ,thồỡi gian phỏn tờch rỏỳt
daỡi õọửng thồỡi keùo theo nhióửu vỏỳn õóử khaùc nhổ hao
tọỳn dung mọi,hoaù chỏỳt, õọỹ chờnh xaùc cuớa pheùp phỏn
tờch keùm.
óứ thay õọứi thồỡi gian lổu chuùng ta dổỷa vaỡo caùc yóỳu

tọỳ trón õaợ trỗnh baỡy .
4.2 Hóỷ sọỳ dung lổồỹng K :

Capacity Factor
Hóỷ sọỳ dung lổồỹng cuớa mọỹt chỏỳt cho bióỳt khaớ nng
phỏn bọỳ cuớa chỏỳt õoù trong hai pha cọỹng vồùi sổùc
chổùa cọỹt tổùc laỡ tyớ sọỳ giổợa lổồỹng chỏỳt tan trong
pha tộnh vaỡ lổồỹng chỏỳt tan trong pha õọỹng ồớ trong
thồỡi õióứm cỏn bũng .
K

= ( t
R
- t
0
)/ t
0

Nóỳu K

nhoớ thỗ t
R
cuợng nhoớ vaỡ sổỷ taùch
keùm . Nóỳu K

lồùn thỗ Peak bở doaợng . Trong
thổỷc tóỳ K

tổỡ 1- 5 laỡ tọỳi ổu .
Phỏửn I : Cồ sồớ lyù

thuyóỳt

4.3 - ọỹ choỹn loỹc

:
ọỹ choỹn loỹc cho bióỳt hióỷu quaớ taùch cuớa
hóỷ thọỳng sừc kyù ,khi 02 chỏỳt A ,B coù K
A
vaỡ
K
B
khaùc nhau thỗ mồùi coù khaớ nng taùch
.,mổùc õọỹ taùch bióứu thở ồớ ọỹ choỹn loỹc .
= K
B
/ K
A
Vồùi õióửu kióỷn K
B
> K
A
vồùi caỡng khaùc 1 thỗ khaớ nng taùch caỡng roợ
raỡng
= 1.02
= 1.16 = 1.20
Phỏửn I : Cồ sồớ lyù
thuyóỳt

4.2 Sọỳ õộa lyù thuyóỳt N:
Sọỳ õộa lyù thuyóỳt laỡ õaỷi lổồỹng bióứu thở hióỷu nng

cuớa cọỹt trong mọỹt õióửu kióỷn sừc kyù nhỏỳt õởnh .Mọựi
õộa lyù thuyóỳt trong cọỹt sc kyù giọỳng nhổ laỡ mọỹt lồùp
pha tộnh coù chióửu cao laỡ H ,Tỏỳt nhión lồùp naỡy coù tờnh
chỏỳt õọỹng tổùc laỡ mọỹt khu vổỷc cuớa hóỷ phỏn taùch
maỡ trong õoù mọỹt cỏn bũng nhióỷt õọỹng hoỹc õổồỹc
thióỳt lỏỷp giổợa nọửỡng õọỹ trung bỗnh cuớa chỏỳt tan
trong pha tộnh vaỡ pha õọỹng .
Bóử daỡy H phuỷ thuọỹc vaỡo nhióửu yóỳu tọỳ :
+ ổồỡng kờnh vaỡ õọỹ hỏỳp phuỷ cuớa haỷt pha tộnh
+ Tọỳc õọỹ vaỡ õọỹ nhồùt ( õọỹ phỏn cổỷc )cuớa pha õọỹng
+ Hóỷ sọỳ khuyóỳch taùn cuớa caùc chỏỳt trong cọỹt .
Vỗ vỏỷy vồùi mọỹt õióửu kión sừc kyù xaùc õởnh thỗ chióửu
cao H cuợng hũng õởnh õọỳi vồùi mọỹt chỏỳt phỏn tờch vaỡ
sọỳ õộa lyù thuyóỳt cuớa cọỹt cuợng õổồỹc xaùc õởnh.
Phỏửn I : Cồ sồớ lyù
thuyóỳt

4.2 Sọỳ õộa lyù thuyóỳt N:
Sọỳ õộa lyù thuyóỳt N õổồỹc tờnh theo cọng
thổùc sau :
N = 5,54 ( t
R
/ W
0,5
)
2
Trong õoù : t
R
:

Thồỡi gian lổu cuớa chỏỳt
phỏn tờch .
W
0,5
: ọỹ rọỹng taỷi õióứm 1/2 cuớa
Peak .
Trong thổỷc tóỳ N nũm trong khoaớng 2500 õóỳn
5500 laỡ vổỡa õuớ .
Phỏửn I : Cồ sồớ lyù
thuyóỳt

4.3 Âäü phán gii R : ( Resolution )
Âäü phán gii l âải lỉåüng biãøu thë âäü tạch ca
cạc cháút ra khi nhau trãn mäüt âiãưu kiãûn sàõc k
â cho. Âäü phán gii ca 02 Peak cảnh nhau phi
âỉåüc tênh theo cäng thỉïc sau :
R= 2( t
’
RB
- t
’
RA
)/ (w
a
+ w
B
)
Trong thỉûc tãú nãúu cạc Peak cán âäúi ( Gass) thç
âäü phán gii täúi thiãøu âãø 02 Peak tạch l R =1.0
.Trong phẹp âënh lỉåüng R=1,5 l ph håüp

+ Nãúu R nh thç cạc Peak chỉa tạch hàón ,viãûc tênh
toạn diãûn têch Peak s khäng chênh xạc ,lục ny phi
tçm cạch tàng R theo 03 cạch sau:
* Lm thay âäøi K’ bàòng cạch thay âäøi lỉûc rỉía
gii ca pha âäüng ( Thay âäøi âäü phán cỉûc nãúu l
RP - HPLC ,thay âäíi cỉåìng âäü ion nãúu l IE - HPLC ....)

* Lm tàng säú âéa l thuút ca cäüt bàòng cạch
dng cäüt di hån hồûc cäüt cọ kêch thỉåïc nh hån .
Pháưn I : Cå såí l
thuút

4.3 Âäü phán gii R : ( Resolution )
* Lm tàng âäü chn lc α bàòng cạch dng cäüt
khạc ph håüp hån våïi quạ trçnh tạch hồûc thay âäøi
thnh pháưn pha âäüng .
+ Nãúu R låïn quạ thç thåìi gian phán têch s láu,täún
nhiãưu pha âäüng ,âäü nhảy s kẹm. Âãø khàõc phủc
ta cọ thãø thay âäøi hãû pha âäüng hay dng chỉång
trçnh Gradient dung mäi . Tuy nhiãn trong quạ trçnh
chảy sàõc k dng chỉång trçnh dung mäi thç mäüt säú
pha âäüng cọ t lãû thay âäøi s kẹo theo sỉû thay âäøi
âỉåìng nãưn lm nh hỉåíng ráút låïn âãún thåìi gian
lỉu v diãûn têch ca cạc Peak ta phán têch .
Trong thỉûc tãú nãn hản chãú sỉí dủng chỉång
trçnh Gradient dung mäi m ch úu l chụng ta phi
tçm âỉåüc hãû pha âäüng rỉía gii ph håüp, âạp ỉïng
cạc u cáưu trong quạ trçnh phán têch .
Pháưn I : Cå såí l
thuút

4.4 Hóỷ sọỳ khọng õọỳi xổùng T : ( Tailing factor)
Hóỷ sọỳ khọng õọỳi xổùng T cho bióỳt mổùc õọỹ khọng
õọỳi xổùng cuớa Peak trón sừc kyù õọử thu õổồỹc .
T õổồỹc tờnh bũng tyớ sọỳ õọỹ rọỹng cuớa 02 nổớa
Peak taỷi õióứm 1/10 chióửu cao Peak :
Peak daỷng õọùi xổùng hỗnh Gauss trón thổỷc tóỳ khoù õaỷt
õổồỹc vỗ vỏỷy phaới quan tỏm õóỳn hóỷ sọỳ khọng õọỳi
xổùng T,
ba
T = a/b
Phỏửn I : Cồ sồớ lyù
thuyóỳt

4.4Hóỷ sọỳ khọng õọỳi xổùng T : ( Tailing
factor)
* Khi T

2.5 thỗ pheùp õởnh lổồỹng õổồỹc
chỏỳp nhỏỷn
* Khi T > 2.5 thỗ õióứm cuọỳi cuớa Peak rỏỳt
khoù xaùc õởnh ,vỗ vỏỷy pheùp õởnh lổồỹng cỏửn
phaới thay õọứi caùc õióửu kióỷn sừc kyù õóứ laỡm
cho Peack cỏn õọỳi hồn theo caùc caùch sau :
+ Laỡm giaớm thóứ tờch chóỳt tổùc laỡ õoaỹn
nọỳi tổỡ cọỹt õóùn Detector .
+ Thay õọứi thaỡnh phỏửn pha õọỹng sao cho
khaớ nng rổớa giaới tng lón
+ Giaớm bồùt lổồỹng mỏựu õổa vaỡo cọỹt
bũng caùch pha loaợng mỏựu hay giaớm thóứ tờch

tióm mỏựu .
Phỏửn I : Cồ sồớ lyù thuyóỳt

5 Phán loải sàõc k v ỉïng dủng :
+ Theo cå chãú chia tạch ca sàõc k ,ngỉåìi ta phán ra
cạc loải sau âáy :
Sàõc k háúp phủ ( NP - HPLC v RP - HPLC); sàõc k phán
bäú - sàõc k chiãút ( LLC); sàõc k trao âäøi ion ( IE -
HPLC) ; sàõc k ráy phán tỉí - sàõc k gel ( IG - HPLC)
.Nhỉng thỉûc tãú hiãn nay chụng ta hiãûn chè âang ỉïng
dủng sàõc k háúp phủ vo phán têch máùu .
5.1 Sàõc k háúp phủ :
* Quạ trçnh sàõc k dỉûa trãn sỉû háúp phủ mảnh
úu khạc nhau ca pha ténh âäúi våïi cạc cháút tan v
sỉû rỉía gii (phn háúp phủ) cu pha âäüng âãø kẹo
cháút tan ra khi cäüt .Sỉû tạch mäüt häùn håüp phủ
thüc vo tênh cháút âäüng hc ca cháút háúp phủ
.Trong loải ny cọ 02 kiãøu háúp phủ:
Pháưn I : Cå såí l thuút

+ Sừc kyù hỏỳp phuỷ pha thuỏỷn (NP-
HPLC): Pha tộnh phỏn cổỷc ,pha õọỹng
khọng phỏn cổỷc .
+ Sừc kyù hỏỳp phuỷ pha õaớo ( RP -
HPLC): Pha tộnh khọng phỏn cổỷc pha
õọỹng phỏn cổỷc .
Loaỷi sừc kyù naỡy õổồỹc aùp duỷng rỏỳt
rọỹng raợi ,thaỡnh cọng õóứ taùch caùc họựn
hồỹp caùc chỏỳt coù tờnh chỏỳt gỏửn tổồng
tổỷ nhau vaỡ thuọỹc loaỷi khọng phỏn cổỷc

,phỏn cổỷc yóỳu hay trung bỗnh nhổ caùc
Vitamin, caùc thuọỳc haỷ hióỷt giaớm
õau .......
Phỏửn I : Cồ sồớ lyù thuyóỳt