khả năng chống oxi hoá của tảo navicula incerta

MỤC LỤC

TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ THÀNH PHẦN
PROTEIN CỦA VI TẢO NAVICULA INCERTA CÙNG VỚI
KHẢO SÁT VỀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HOÁ TỪ CÁC SẢN
PHẨM THUỶ PHÂN BẰNG ENZYME.
Tóm tắt
Vi tảo là nguồn sản xuất chủ yếu các chất hữu cơ trong môi trường nước thông
qua các hoạt động quang hợp của nó. Khuê tảo Navicula incerta là thành phần chính
của thực vật phù du và cũng tương đối dễ trồng, sử dụng làm nguồn thức ăn tươi sống
trong nuôi trồng thủy sản. Các đặc điểm sinh trưởng của N. incerta được đánh giá dựa
theo khả năng thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ mặn, và ánh sáng. Ngoài ra,
các thành phần và hoạt tính chống oxy hóa của N.incerta cũng được xác định. Mật độ
tế bào đạt tối đa 87 × 105 tế bào/ml trong điều kiện ở 20oC, cường độ chiếu sáng 250
µmol/m2.s, độ mặn 33 ‰, pH=8.3, 12 chu kỳ sáng tối, và môi trường F/2 trong 2 tuần
nuôi cấy. Các sản phẩm thủy phân từ enzyme có tác dụng chống oxy hóa hiệu quả với
các gốc tự do khác nhau: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (pepsin IC 50 = 196,0
µg/mL), hydroxyl (α-chymotrypsin IC50 = 102,0 µg/mL) và superoxide (Neutrase IC50
= 169,0 µg/mL). Những kết quả này cho thấy rằng các sản phẩm thủy phân từ enzyme
của N. incerta được xem như chất chống oxy hóa và có thể được sử dụng như một
thành phần thực phẩm chức năng.
1


1. Giới thiệu
Vi tảo biển chủ yếu được sản xuất và bán như thực phẩm bổ dưỡng, do có hàm
lượng cao protein, lipid, vitamin và các chất bổ sung dinh dưỡng khác. Hơn nữa, vi tảo
còn được sử dụng trong sản xuất dầu diesel sinh học và khí hydro sinh học. Đặc biệt
được chú ý là khả năng loại bỏ khí CO2 từ khí nhiên liệu. Gần đây đã có nhiều bài báo
cáo nói về vi tảo là nguồn nguyên liệu mới giàu hoạt tính sinh học. Một số loài tảo như
Botryococcus braunii, Chlorella sp., Dunaliella primolectal, Nannochloris sp.,

Neochloris oleoabundans, và Parietochloris có hàm lượng protein trong tế bào cao. Do
đó, vi tảo được cho là rất hữu ích như là vật liệu chức năng. Trong số vi tảo, tảo cát là
thành phần chính của nhiều chuỗi thức ăn và nó có thể biến động theo mùa, sự biến
động và tốc độ tăng trưởng nhanh của nó sẽ là một phần quan trọng trong việc nghiên
cứu khoa học biển. Tảo cát nhận dạng giữa các vi sinh vật ưa nhiệt khác và tác động
chính của sự phát triển tảo cát là làm giàu chiết xuất bùn và tạo ra sulfoglycolipid có
tác dụng chống viêm. Nhiều nỗ lực để tìm kiếm các hợp chất mới có tiềm năng điều trị
bệnh và vi tảo được báo cáo có thành phần kháng khuẩn, kháng nấm, và đặc tính
chống ung thư. Khuê tảo Navicula incerta là thành phần chính của thực vật phù du và
cũng tương đối dễ trồng. Nó được sử dụng làm thức ăn trực tiếp và là nguồn thức ăn
phổ biến trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, các thành phần sinh hóa của vi tảo có
thể thay đổi cùng với tốc độ sinh trưởng của nó, điều kiện môi trường (bao gồm: nhiệt
độ, tình trạng dinh dưỡng, nồng độ muối, pH, chu kỳ sáng tối và cường độ ánh sáng)
cũng như với các giai đoạn phát triển của nó. Trong thực tế, một số loài đang sống
trong môi trường sống phức tạp với điều kiện khắc nghiệt (Ví dụ như những thay đổi
của nồng độ muối, nhiệt độ, và các chất dinh dưỡng), do đó, nó đã được thích nghi với
các điều kiện môi trường để tồn tại, sản xuất một loạt các chất chuyển hóa (hoạt tính
sinh học), mà không thể được tìm thấy trong các sinh vật khác. Nhiệt độ và cường độ
ánh sáng là một yếu tố quan trọng kiểm soát sự phát triển của tảo trong môi trường tự
nhiên. Theo đó, đặc điểm sinh trưởng rất quan trọng trong việc nuôi trồng N.incerta để
sử dụng cho mục đích nuôi trồng thủy sản. Tốc độ tăng trưởng, xét về số lượng tế bào
hoặc sinh khối; và thành phần sinh hóa, phải được tối ưu hóa về mặt chất dinh dưỡng
cần thiết.

2


Các gốc tự do và các chất hoạt động chứa oxy (ROS) là các dạng oxy đã được
hoạt hoá, quá trình oxy hóa và thường được tạo ra bởi quá trình oxy hóa của các phản
ứng sinh học hoặc các yếu tố ngoại sinh. Chất chống oxy hóa trong các hệ thống sinh

học có nhiều chức năng, bao gồm cả việc bảo vệ chống lại quá trình oxy hóa và tham
gia vào các đường dẫn tín hiệu chủ yếu của tế bào. Hoạt động chính của chất chống
oxy hóa trong tế bào là để ngăn chặn tác hại gây ra bởi các hoạt động của ROS. Chất
chống oxy hóa tự nhiên đã được tách ra từ nhiều loài thực vật khác nhau. Tuy nhiên, vi
tảo lại ít được chú ý như là một nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên.
Sản phẩm thủy phân của protein xúc tác bởi enzyme đã được báo cáo như là
nguồn chất đạm phù hợp cho con người vì nó dễ dàng tiêu hóa, trong đó nó còn hiệu
quả hơn cả các protein hoàn chỉnh và các axit amin tự do. Do đó, sản phẩm thủy phân
của protein đã được sử dụng rộng rãi để cải thiện tính chất dinh dưỡng và chức năng.
Các nguồn protein phổ biến nhất được sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng là
casein và whey protein và các protein từ đậu nành. Sinh khối của vi tảo màu xanh lá sẽ
đại diện cho một nguồn tài nguyên sinh học để phát triển các sản phẩm thủy phân
protein. Thế giới hiện nay đang quan tâm đến việc tìm kiếm chất chống oxy hóa mới
và an toàn từ các nguồn tự nhiên như nguyên liệu thực vật để ngăn chặn các hư hỏng
do oxy hóa trong thực phẩm và giảm thiểu thiệt hại do oxy hóa gây ra trong tế bào
sống. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào đặc tính sinh lý và sự hiện diện của
các chất có giá trị cao như các hợp chất kháng virus hoặc chất chống oxy hóa có trong
tảo. Việc hiểu biết về chất lượng protein và tính chất chức năng trong sản phẩm thủy
phân từ vi tảo sẽ hữu ích trong việc tìm hiểu để sử dụng chúng như là một chất phụ gia
dùng cho thực phẩm và các mặt hàng ăn uống. Tuy nhiên, một loạt các chức năng sinh
học của vi tảo, hiệu quả ứng dụng của các vi tảo vẫn còn hạn chế vì canh tác kém hiệu
quả và chi phí sản xuất cao.
Theo đó, nghiên cứu này thảo luận về việc trồng N. incerta trong một hệ thống
canh tác, với sự nhấn mạnh vào việc sử dụng các kỹ thuật nuôi. Và các hoạt tính chống
oxy hóa của các sản phẩm thuỷ phân trong N.incerta bởi enzyme (Alcalase, neutrase,
pepsin, papain, trypsin, pronase-E, và α-chymotrypsin).

3

2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Vật liệu:
Khuê tảo, Navicala incerta (loài KMMCC B-001) được sử dụng trong nghiên
cứu này đã được cung cấp bởi Trung tâm Văn hóa Hàn Quốc về vi tảo biển. Môi
trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường tiêu chuẩn F/2 (của Guillard). Enzyme
cellulase làm mỏng đi vách tế bào. Tất cả các vật liệu khác cần thiết cho nuôi cấy được
lấy từ Gibco (Grand Island, NY, USA) và tất cả các thuốc thử khác được sử dụng là
loại tốt nhất có sẵn trên thị trường. Alcalase Và neutrase được mua từ Công ty Novo
(bagsvaerd,Copenhagen, Đan Mạch). Cellulose, pronase-E, α-chymotrypsin, papain,
pepsin, trypsin, acid linoleic, ammonium thiocyanate, và hóa chất thử nghiệm gốc
trong đó có 1,1-diphenyl-2-pycryl-hydrazyl (DPPH), 5,5-dimethyl-1-pyrroline-Noxide (DMPO), FeSO4, H2O2, và riboflabin được mua ở Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO, Mĩ).
Đặc điểm sinh trưởng với các thí nghiệm nuôi cấy trong phòng thí nghiệm
Xác định điều kiện sinh trưởng tối ưu: Các khảo sát về điều kiện tối ưu cho sự
phát triển của N.incerta được thực hiện trong bình tam giác dung tích 250ml với 100ml
môi trường nuôi cấy. Đối với nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, nuôi cấy N.incerta
được thực hiện trong môi trường F/2 (Bảng 1).
Bảng : Thành phần môi trường tiêu chuẩn F/2( Guillard’s)
Dinh dưỡng

Số lượng(g)

Dung dịch A: Nitrate và dung dịch phosphat (1 L)
NaNO3

84.15

Na2MoO4.2H2O

6.0

FeCl3.6H2O

2.90

Na2EDTA.2H2O

10.0

Dung dịch B: dung dịch Silicat (1L)
Na2SiO3.9H2O

33.0

Dung dịch C: dung dịch có chứa nguyên tố vi lượng (1L)
4


CuSO4.5H2O

1.96

ZnSO4.7H2O

4.40

Ma2MoO4.2H2O

1.26

MnCl2.4H2O

36.0

CoCl2.6H2O

2.0

Dung dịch D: dung dịch có chứa vitamin (1L)
Vitamine B1

0.4

Vitamine B12

0.002mmg

Biotin

0.1mmg

(1) Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho N. incerta, chỉ cần thêm 2 ml dung dịch A và
B và 1 ml dung dịch C và D trong 1 L nước biển sạch.
Các thí nghiệm thiết lập mối quan hệ giữa sự sinh trưởng và ánh sáng, sự phụ
thuộc về nhiệt độ, độ mặn, cường độ ánh sáng, và pH đến sự sinh trưởng. N.incerta
được xác định bằng cách quan sát dưới kính hiển vi phản pha Zeiss Axioplan (Carl
Zeiss,Oberkochen, Đức) tại độ phóng đại x 400.
2.2. Phương pháp xác định
2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn tới sự sinh trưởng:
Thí nghiệm nuôi cấy được thực hiện tại 4 nhiệt độ (15, 20, 25 và 30 0C) kết hợp

với 4 độ mặn (23, 27, 33, và 40 ‰) sử dụng phòng tăng trưởng Gradient nhiệt độ. Cả
hai thí nghiệm được nuôi cấy dưới ánh đèn huỳnh quang (250 μmol/m 2.s) trong 12:12
5


chu kì sáng:tối, pH 8,3 ± 0,5 trong 2 tuần. Độ mặn <34 được tiến hành bằng cách pha
loãng nước biển với nước đã khử ion (Milli-Q; Millipore, Billerica, MA, USA), và độ
mặn > 34 đã được chuẩn bị bằng cách làm bay hơi nước biển ở nhiệt độ 500C trong lò
sấy.1 mL mẫu được lấy từ mỗi bình nuôi cấy mỗi ngày và cố định bằng dung dịch
Lugol.
2.2.2. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và độ pH tới sự sinh trưởng:
Thực hiện thí nghiệm với các cường độ ánh sáng (50, 100, 150, 200, và 250
μmol photon/m2.s) và các mức pH (7.5, 8.3, và 9.2). Những ảnh hưởng của cường độ
ánh sáng và pH tới sự sinh trưởng được xác định tại điều kiện tối ưu cho tốc độ sinh
trưởng là 200C, 33 ‰, 12: 12 chu kỳ sáng tối. pH được thay đổi bằng cách thêm HCl
hoặc NaOH nồng độ 0.2M. Các tế bào được thêm vào mỗi bình và được đo độ pH. 1
mL mẫu được lấy từ mỗi bình nuôi cấy mỗi ngày và cố định bằng dung dịch Lugol.
Đánh giá sự sinh trưởng: Tất cả các thí nghiệm được thực hiện trong 3 nhóm và kết
thúc sau thời gian tăng trưởng là 2 tuần. Các mẫu được thực hiện 3 lần, cứ mỗi 24h các
tế bào được đếm trong buồng đếm (buồng Sedgewick Rafter). Các tế bào được quan
sát bởi một kính hiển vi Leica CTR 6000 (Wetzlar, Đức). Tất cả các nuôi cấy thực
nghiệm đã được thu vào cuối pha logarit của quá trình sinh trưởng tại những thời điểm
giống nhau trong chu kỳ sáng tối đã được xác định bởi các thí nghiệm sơ bộ, để tránh
tổn hao chất dinh dưỡng. mẫu sau khi thu được sấy thăng hoa, khối lượng chất khô
được ghi nhận lại, các tế bào tảo được lưu trữ ở -70 0C trước khi phân tích hóa học. Tốc
độ tăng trưởng cụ thể (μ) được định nghĩa là sự gia tăng mật độ tế bào/đơn vị thời
gian, công thức như sau:
μ(1/ngày)= (ln (X1/X0)/(t1-t0))
Tại đó: X0 và X1lần lượt là mật độ tế bào tại thời điểm ban đầu (t0) và kết thúc
(t1). Đối với các đường cong tăng trưởng của từng mẫu, ta đếm những lần lặp lại và sử

dụng các giá trị trung bình.
2.2.3. Nuôi cấy sinh khối và sấy thăng hoa:
Sự nuôi cấy sinh khối của sinh vật tảo sống dưới đáy biển tảo N. incerta đã được
thực hiện trong 10 tuần trong chai polycarbonate 5-L và trong thùng polycarbonate 206


L (10 chu kỳ) với môi trường nước biển nhân tạo đã được thanh trùng và môi trường
chất dinh dưỡng F/2 (Na2SiO3) và dung dịch có chứa nguyên tố vi lượng.

Hình : Sơ đồ chảy của hệ thống môi trường nuôi cấy liên tục.
Điều kiện nuôi cấy sinh khối được duy trì trong điều kiện sinh trưởng tối ưu đã
được xác định từ thí nghiệm trên (điều kiện nuôi ở 200C, độ mặn 33‰, pH 8,3 ± 0,5;
12:12 chu kỳ sáng tối và cường độ chiếu sáng 250 μmol photon/m2.s). Nước cất đã
được thêm vào trong chai và thùng nuôi cấy thường xuyên để duy trì độ mặn và sục
khí liên tục trong suốt quá trình ủ. Sinh khối N.incerta được thu thập bằng cách xử lý
trên bọ lọc GF/A Whatman, sử dụng một máy bơm nhu động Millipore. Sinh khối
được lưu trữ trong tủ đông ở -700C trong 24 giờ. Các mẫu sau đó được sấy thăng hoa ở
-500C tại 5 phút Torr. Các mẫu đã sấy thăng hoa được bảo quản ở -20 0C cho đến khi
thực hiện các phân tích hóa học. Thành phần N.incerta được xác định như tổng hàm
lượng protein, lipid,carbohydrate, độ ẩm, tro và hàm lượng chất khô.
2.2.4. Phân tích thành phần của N.Incerta
Sau khi sấy thăng hoa N.Incerta được phân tích để xác định các thành phần Lipid
thô, tro, carbohydrate, hàm lượng protein trong N.incerta theo phương pháp AOAC.
2.2.5. Phân tích amino acid của N.Incerta
Lấy 50mg N.incerta đã sấy thăng hoa đi thủy phân trong 24 giờ bằng dung dịch
HCl 6N chứa 0,1% axit thioglycolic ở 1100C trong điều kiện chân không. Dẫn xuất
acid amin với phenylisothiocyanate đã được xác định và định lượng bằng máy phân
tích tự động acid amin (BIOCHROM 20; Pharmacia Biotech, Cambridge, Vương quốc
Anh).
7

2.2.6. Sản xuất sản phẩm thủy phân từ enzyme
N. incerta sau khi sấy thăng hoa được nghiền thành bột mịn, lấy 100g trộn với 5
lít nước cất. Cellulase là enzyme phá hủy thành tế bào, được thêm vào với hàm lượng
2% khối lượng bột. Nó bị thủy phân ở 500C trong 2 giờ. Để trích xuất peptide chống
oxy hóa từ N. incerta đã sấy thăng hoa, sự thủy phân được thực hiện bởi các enzym
khác nhau (Alcalase, α-chymotrypsin, neutrase, papain, pepsin, pronase-E, và trypsin)
với điều kiện tối ưu của chúng. pH tối ưu của mỗi hỗn hợp phản ứng được điều chỉnh
với HCl/NaOH 1M. Tỷ lệ enzyme cho vào là 1/100. Sau đó, độ pH của sản phẩm thủy
phân đã được điều chỉnh pH=7 với HCl/NaOH 1M. Hỗn hợp được ủ trong 8 giờ ở mỗi
nhiệt độ tối ưu với sự khuấy trộn và sau đó làm nóng trong bể nước sôi khoảng 10 phút
để làm bất hoạt các enzym. Sản phẩm thủy phân được làm khô lạnh và lưu trữ dưới
-800C cho đến khi sử dụng.
2.3. Phân tích khả năng chống oxy hóa bằng máy quang phổ cộng hưởng spin
electron (ESR)
2.3.1. Hiệu quả loại bỏ các gốc tự do DPPH
Hoạt tính loại bỏ các gốc tự do DPPH được xác định bằng phương pháp của
Nanjo và cộng sự. 30 μL dung dịch thủy phân được thêm vào 30 μl DPPH (60 μM)
trong dung dịch ethanol. Sau khi khuấy trộn mạnh trong 10 giây, các dung dịch sau đó
đã được chuyển vào một ống mao mạch thạch anh 100 μL, và hoạt tính loại bỏ gốc
DPPH của pepide được đo bằng máy quang phổ JESFA ESR (JEOL Ltd., Tokyo, Nhật
Bản). Các sản phẩm spin được đo trên máy quang phổ ESR chính xác sau 2 phút. Điều
kiện thí nghiệm như sau: từ trường 336,5 ± 5 mT; điện 5 mW; tần số điều chế 9.41
GHz; biên độ 1×1000; thời gian xử lí 30 giây. Khả năng loại bỏ các gốc tự do DPPH
đã được tính toán theo công thức sau:

Hoạt tính loại bỏ các gốc tự do: (

1- H

H0

) x 100

Trong đó H và H0 lần lượt là chiều cao đỉnh của tín hiệu gốc tự do có và không có
mẫu.

8


2.3.2. Hoạt tính loại bỏ các gốc Hydroxyl
Các gốc hydroxyl được tạo ra bằng phản ứng Fenton Haber-Weiss xúc tác là sắt
và các gốc hydroxyl tạo thành nhanh chóng phản ứng với bẫy spin nitrone DMPO. Kết
quả tạo thành DMPO-OH và được phát hiện bằng máy quang phổ ESR. Dung dịch
thủy phân (20 μL) được trộn với DMPO (0,3 M, 20 μl), FeSO4 (10 mM, 20 μL), và
H2O2 (10 mM, 20 μL) vào dung dịch đệm phosphat (pH 7.4), và sau đó được chuyển
vào một ống mao mạch thạch anh 100 μL. Sau 2.5 phút, máy quang phổ ESR sẽ phát
ra phổ và được ghi lại. Điều kiện thí nghiệm như sau: từ trường 336,5 ± 5 mT; công
suất 1 mW;tần số điều chế 9.41 GHz; biên độ 1 × 200; thời gian quét 4 phút. Khả năng
loại bỏ các gốc tự do Hydroxyl được tính toán theo công thức sau:

Hoạt tính loại bỏ các gốc tự do(%) = (

1- H
H0

) x 100

Trong đó H và H0 lần lượt là chiều cao đỉnh của tín hiệu gốc tự có và không có mẫu.
2.3.3. Khả năng loại bỏ các gốc Superoxide

Các gốc anion superoxide được tạo ra bằng cách chiếu tia cực tím (UV) vào hỗn
hợp riboflavin/ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). Hỗn hợp phản ứng có chứa
0,3 mM riboflavin, 1.6mM EDTA, 800mM DMPO và một phần dung dịch thủy phân,
hỗn hợp được đem đi chiếu xạ trong 1 phút dưới tia UV ở bước sóng 365 nm. Hỗn hợp
phản ứng được chuyển sang ống mao mạch thạch anh 100μL của máy quang phổ ESR
để đo lường. Các điều kiện thí nghiệm như sau: từ trường 36,5 ± 5 mT; điện 10 mW;
tần số điều chế 9.41 GHz; biên độ, 1 × 1000; thời gian quét 1 phút. Khả năng loại bỏ
các gốc tự do Superoxide được tính toán theo công thức sau: .

Hoạt tính loại bỏ các gốc tự do (%) = (

1- H
H0

) x 100

Trong đó H và H0 lần lượt là chiều cao đỉnh của tín hiệu gốc tự có và không có mẫu.
Phân tích thông kê: Điều kiện tối ưu dữ liệu nuôi cấy hàng loạt trong phòng thí
nghiệm được thể hiện dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) của 3 xác định thực
nghiệm của sinhviên đã được sử dụng để xác định mức độ ý nghĩa (p <0,05).
9


3. Kết quả và thảo luận
3.1. Điều kiện nuôi cấy tối ưu của N. incerta
3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn đến sự tăng trưởng của N. incerta
Các khảo sát về đặc tính tăng trưởng đã được thực hiện để tìm ra những điều kiện
để phát triển tốt nhất cho nuôi cấy sinh khối của chúng. Thí nghiệm đầu tiên, được
thực hiện ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. N.incerta tăng trưởng trong mọi điều
kiện, nhưng mật độ tế bào cực đại khác nhau. Từ nuôi cấy, mật độ tế bào ban đầu là

3,4 × 105. Nói chung, mật độ tế bào tối đa và tốc độ tăng trưởng cụ thể bị ảnh hưởng
bởi nhiệt độ. Ở 20oC, các N.incerta biểu diễn đường cong tăng trưởng theo kiểu chữ S
(Hình 2A). Như được biểu diễn ở hình 2A, mật độ tế bào là lớn nhất tại điều kiện nhiệt
độ 20oC theo sau đó là 25, 30 và 15 oC. Mật độ tế bào tối đa (8,9 × 10 6 tế bào/mL) xảy
ra trong 11 hoặc 12 ngày sau khi nuôi cấy. Tốc độ tăng trưởng cao nhất ở 20 oC
(µ=0,57/ngày), trong khi thấp nhất ở 15oC (µ=0,42/ngày). Mật độ tế bào tối đa và tốc
độ tăng trưởng ở 25oC là 8,5 × 106 tế bào/mL, 0,50/ngày (Hình 2B). Tốc độ tăng
trưởng ở mức 20 và 25oC trong nuôi cấy sinh khối gần như tương tự.
Trong thí nghiệm thứ hai, nghiên cứu về các tác động của các độ mặn khác nhau
(23, 27, 33 và 40‰) đối với tốc độ tăng trưởng đã cho thấy sự khác biệt đáng kể
(p<0,05) giữa các nhóm độ mặn. Mật độ tế bào ban đầu của N.incerta là 3,1 × 10 5 tế
bào/ml. Trong 4 độ mặn được khảo sát, mật độ tế bào tối đa (8,1 × 10 6 tế bào/ml) và
tốc độ tăng cụ thể (µ=0,60/ngày) N.incerta đã thu được ở độ mặn 33‰ . Mặt khác, tốc
độ tăng trưởng thấp nhất được biểu diễn ở độ mặn 23‰ (4,3 × 106 tế bào/ml,
0,44/ngày) (Hình 2C,2D). Ở độ mặn 27‰, tỉ lệ tăng trưởng đã được quan sát là 7,7 ×
106 tế bào/ml, 0,58/ngày. Trong thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào được tăng lên trong
vòng 10 ngày và sau đó giảm. Tại độ mặn 40‰, tốc độ tăng trưởng là 6,7 × 10 6 tế
bào/ml, 0,53/ngày. Điều kiện tối ưu của nhiệt độ và độ mặn cho sự phát triển của
N.incerta được thực hiện ở nhiệt độ là 20oC và độ mặn 33‰.

10


Hình : Ảnh hưởng của nhiệt độ khác nhau và độ mặn của N. Incerta. (A) tốc độ
tăng trưởng của N.incerta khi thay đổi nhiệt độ. (B) nồng độ tế bào tối đa và tốc
độ tăng trưởng cụ thể của N. incerta, (C) Tốc độ tăng trưởng của N. Incerta trong
CERTA khi thay đổi độ mặn, (D) nồng độ tế bào tối đa và tốc độ tăng trưởng cụ
thể của N. Incerta
3.1.2. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và độ pH đối với tốc độ tăng trưởng của
N.incerta

Trong thí nghiệm thứ ba, ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến tốc độ tăng
trưởng của N.incerta đã được khảo sát trong một loạt các thí nghiệm, nơi nuôi cấy sinh
khối có mật độ tế bào khác nhau được tiếp xúc với ánh sáng ở những cường độ khác
nhau (50, 100, 150, 200 và 250 µmol/m2.s), và kết quả được hiển thị trong (Hình 3A).
Nhìn chung, tốc độ tăng trưởng thu được dưới mọi điều kiện cường độ ánh sáng.
Trong nuôi cấy sinh khối, mật độ tế bào ban đầu của N.incerta là 3,5 × 10 5 tế bào/ml.
Mật độ tế bào là lớn nhất ở cường độ ánh sáng 250 µmol/m 2.s, tiếp theo là 100, 50,
150 và 200 µmol/m2.s (Hình 3A). Mật độ tế bào cực đại xảy ra trong hai ngày 11 và 12
sau khi nuôi cấy. Các điều kiện tối ưu của các cường độ ánh sáng được thực hiện tại
250 µmol photon/m2.s. Mật độ tế bào tối đa và tốc độ tăng trưởng cụ thể là 8,8 × 10 6 tế
bào/ml, 0,50/ngày (Hình 3B). Sự tăng trưởng của các tế bào đã được tăng lên theo

11


cường độ ánh sáng, nồng độ tế bào cuối cùng tăng theo sự tăng của cường độ ánh sáng
và các hằng số tăng trưởng đạt tối đa ở cường độ ánh sáng là 250 µmol/m2.s.
Trong loạt các thí nghiệm thứ tư, sự tăng trưởng của N.incerta ở các mức pH
khác nhau (7,5 ± 0,5; 8,3 ± 0,5 và 9,2 ± 0,5) đã được nghiên cứu ở nhiệt độ, cường độ
ánh sáng và độ mặn là 20oC, 250 µmol photon/m2.s, 33‰. Mật độ tế bào ban đầu của
N. incerta là 2,3 × 105 tế bào/ml. Hình 3C và 3D hiển thị mật độ tế bào tối đa và tốc độ
tăng trưởng cụ thể (μ) trong môi trường của N.incerta tăng trưởng với các độ pH khác
nhau. Tốc độ tăng trưởng cao nhất được tìm thấy ở pH 8,3 ± 0,5 (Hình 3C), mật độ tế
bào tối đa, 7,9 × 106 tế bào/ml, đạt được ở 0,78/ngày, vào ngày thứ 10 của thời kỳ nuôi
cấy. Nhưng, tốc độ tăng trưởng có một chút khác nhau từ pH 7,5 ± 0,5 (7,3 × 10 6 tế
bào/ml, 0,50/ngày) và pH 9,2 ± 0,5 (7,3 × 10 6 tế bào/ml, 0,73/ngày) (Hình 3D). Như
vậy, trong số các điều kiện khác nhau, mật độ tế bào lớn nhất là ở 20 oC, 33 ‰, 250
µmol photon/m2.s, pH 8,3, môi trường nước F2 từ 10-12 ngày. Hằng số tăng trưởng và
nồng độ tế bào cuối cùng là ổn định ở các phạm vi này.

Hình : Ảnh hưởng của mức cường độ ánh sáng và độ pH khác nhau của N.
Incerta. (A).Tốc độ tăng trưởng của N.incerta ở cường độ ánh sáng nhất định, (B)
nồng độ tế bào tối đa và tốc độ tăng trưởng cụ thể của N. incerta, (C) Tốc độ tăng

12


trưởng của N.incerta ở mức pH nhất định, (D) nồng độ tế bào tối đa và tốc độ
tăng trưởng cụ thể của N. incerta
3.2. Nuôi cấy sinh khối và sấy thăng hoa
Nuôi cấy sinh khối được thực hiện theo các điều kiện tối ưu nghiên cứu từ thí
nghiệm của các nhà khoa học. Trong nuôi cấy sinh khối của N.incerta, mật độ tế bào
trung bình trong chai là 8,7 × 106 tế bào/ml sau hai tuần nuôi cấy. Và sau đó, cấy
chuyền vào chai polycarbonate 5-L và tập trung vào bể polycarbonate 20-L trong 10
tuần nuôi cấy. Mật độ tế bào gần đáy lớn hơn bề mặt. Sau đó các mẫu đã thu được
bằng phương pháp lọc và sấy thăng hoa. Các mẫu đã sấy thăng hoa được xác định tổng
lượng protein, chất béo, carbohydrate, độ ẩm, và tro.
3.3. Các thành phần trong N.incerta
Hợp chất N. incerta vi tảo khác nhau ở tỷ lệ các thành phần hóa học của chúng
như protein (6-52%), carbohydrate (5-23%), và lipid (7-23%). Các thành phần xấp xỉ
của N.incerta sau khi sấy thăng hoa trong môi trường như sau: 50,38 ± 0,03 (protein),
8,76 ± 0,04 (lipid), 10,84 ± 0,03 (carbohydrate), 19,67 ± 0,05 (tro), và 9,81 ± 0,09%
(độ ẩm) trên trọng lượng chất khô. Protein được cấu tạo bởi các axit amin khác nhau
và do đó chất lượng dinh dưỡng của protein đã được xác định căn bản dựa vào sự thỏa
mãn, tỉ lệ và khả năng ứng dụng của chính các acid amin đó. Các thành phần acid amin
của N.incerta được thể hiện trong Bảng 2, và thể hiện như amino acid / tổng số 1.000
dư lượng axit amin. Các thành phần acid amin của N.incerta chủ yếu là các acid amin
có tính acid (acid glutamic và acid aspartic), lysine, arginine. Chúng chiếm 51,3% tổng
đơn vị axit amin. Điều đó cho thấy bản chất mang điện âm của các hợp chất chống oxy
hóa sinh ra trong quá trình thủy phân.

3.4. Điều chế sản phẩm thuỷ phân protein từ N. Incerta và tính chất chống oxy
hoá của chúng
Các nghiên cứu hiện nay thấy rằng N. Incerta bị thuỷ phân một cách độc lập bởi
các enzyme alcalase, pronase-E, α-chymotrypsin, neutrase, papain, pepsin và trypsin.
Bằng kỹ thuật ESR spin- trapping, các sản phẩm thuỷ phân bởi các enzyme này được
phân tích về khả năng loại bỏ các gốc tự do. Chúng tác động lên DPPH, hydroxyl và
superoxide. Bảng 3 cho thấy hoạt tính chống oxy hoá của các sản phẩm thuỷ phân bởi
13


các enzyme trong N. Incerta. Hoạt tính chống oxy hoá được thể hiện thông qua việc
loại bỏ các gốc DPPH, hydroxyl và superoxide. Giá trị IC 50 cao nhất được chú ý đến
như là 196.0µg/mL đối với pepsin, 102µg/mL đối với α-chymosin và 169µg/mL đối
với neutrase.
Ngoài ra, hoạt tính chống oxy hoá của một chất có thể được xác định chính xác
hơn thông qua việc đánh giá khả năng loại bỏ gốc tự do. Loại bỏ gốc hydroxyl có hiệu
quả hơn so với các gốc DPPH và superoxide. Sản phẩm thuỷ phân bởi α-chymosin
được đánh giá là có khả năng loại bỏ gốc hydroxyl tốt hơn các các sản phẩm thuỷ phân
khác. Tuy nhiên, hiệu quả loại bỏ các gốc tự do của các sản phẩm thuỷ phân từ pepsin
và neutrase lên gốc superoxide mạnh hơn là sản phẩm thuỷ phân bởi α-chymotrypsin.
Trong đa số các trường hợp, sản phẩm thuỷ phân từ pronase-E và α- chymotrypsin cho
thấy hoạt tính chống oxy hoá lên 3 gốc tự do này cao hơn là những sản phẩm thuỷ
phân khác. Vì vậy, những sản phẩm thuỷ phân protein bởi enzyme pronase-E và αchymotrypsin được chọn để đẩy mạnh nghiên cứu.
Vi tảo là thành phần chính trong việc sản xuất và cung cấp mạng lưới thức ăn
(chiếm 46% toàn bộ sản lượng) trong môi trường nước từ ao hồ đến đại dương. Trong
nền công nghiệp dược phẩm và thực phẩm, nhiều loài vi tảo được sản xuất thương mại
cho một số protein đơn bào, polysaccharides, nguyên liệu thực phẩm tốt cho sức khoẻ
như acid không bão hoà đa và vitamin. Tảo cát là thành phần chính của thực vật phù
du. Là một trong những nhóm sản xuất chính trong hệ sinh thái dưới nước và là nguồn
thức ăn thiết yếu cho nuôi trồng thuỷ sản. Khả năng thích nghi sinh lý là chìa khoá

then chốt cho phép các thực vật phù du có thể sinh tồn và phát triển ở nhiều môi
trường khác nhau. Giống như tất cả vi sinh vật dưới biển khác, môi trường sống và đặc
tính sinh lý của tảo cát bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ của nước, độ mặn, cường độ ánh
sáng và hàm lượng chất dinh dưỡng.
Đánh giá về sự biến động phong phú theo mùa và tốc độ tăng trưởng của tảo cát
đã và sẽ là phần quan trọng của những nghiên cứu về khoa học biển. Các thực vật phù
du xuất hiện thường xuyên quanh năm ở đại dương do có thể chịu được độ mặn và
nhiệt độ đa dạng. Thật vậy, độ mặn là nhân tố vô sinh quan trọng ảnh hưởng đến sự
sinh trưởng của thực vật phù du. Nhiệt độ và độ mặn được xem là nhân tố vật lý quan
14


trọng nhất ảnh hưởng đến vi sinh vật biển và ảnh hưởng về mặt sinh học của những
nhân tố này thì rất phức tạp và trên diện rộng.
John và cộng sự thấy rằng nhiệt độ là bộ điều chỉnh quan trọng nhất của dòng
năng lượng và sự sinh trưởng sau này ở vi sinh vật dưới nước. Và độ mặn gây ra sức
ép lớn đối với yêu cầu chuyển hoá của động vật. Tài liệu về phản ứng sinh lý của thực
vật phù du biển khi có sự thay đổi pH thì rất hiếm. Một vài nghiên cứu chỉ ra rằng một
vài loài không thể duy trì hằng số pH nội bào khi pH của môi trường thay đổi. Sự thay
đổi pH ngoại bào sẽ không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng mà còn ảnh hưởng
đến thành phần hoá sinh của các tế bào bao gồm việc sản sinh ở ngoại bào. Việc đo
lường tốc độ tăng trưởng là cách để thấy được hoạt động của quần thể vi sinh vật, với
tốc độ tăng trưởng tăng theo hàm số mũ.
Nghiên cứu này đã xác định những giới hạn về đặc tính sinh trưởng của N.
Incerta ở các nhiệt độ, độ mặn và nồng độ pH khác nhau. Môi trường F/2 được sử
dụng như là nguồn dinh dưỡng, nguồn thương mại có sẵn, dễ sử dụng và phù hợp với
mục đích sản xuất tảo thương mại dùng trong công nghiệp và nuôi trồng thuỷ sản.
Khi nhiệt độ môi trường nước cao (25-30oC) hoặc trung bình (20oC), mật độ tế
bào của N. Incerta sẽ cao hơn là khi nhiệt độ thấp (15 oC). Mật độ tế bào cao nhất là ở
20oC. Sơ đồ sinh trưởng của loài này cho thấy nó là loài rộng nhiệt và ở nhiệt độ vừa

phải là điều kiện tốt nhất cho sự sinh trưởng. N. incerta cũng là loài rộng muối vì nó có
thể sinh trưởng tốt, đạt mật độ tế bào tối đa khi độ muối đạt 25-35‰
Affan và Lee đã kiểm tra các biến động theo mùa của thực vật phù du và các
nhân tố môi trường của nước biển ven bờ ở Hàn Quốc. Họ nhận thấy rằng loài
Navicula rất phong phú trong điều kiện nhiệt độ và độ mặn trung bình. Như vậy, trong
ngành nuôi trồng thuỷ sản thương mại, để thu được nhiên liệu sinh khối tối đa từ N.
Incerta ta phải nuôi chúng trong điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng của chúng: nhiệt
độ nước trung bình (200C), độ mặn vừa phải (33‰) và hàm lượng chất dinh dưỡng
(môi trường F/2)
Tuy nhiên, ngoài ngành nuôi trồng thuỷ sản thì việc nuôi trồng tảo cát vẫn là
bước đầu của sự phát triển cho các ứng dụng công nghệ sinh học. Sự phát triển hơn
15


nữa sẽ phụ thuộc vào nhu cầu trong tương lai cùng với tiến bộ trong nuôi trồng, chi phí
thấp hơn và những kỹ thuật tiên tiến.
Nhiều loài vi tảo giàu acid amin thiết yếu. Nghiên cứu của chúng tôi thấy rằng
trong N. Incerta thì hàm lượng protein cao hơn lipid và carbohydrates. Tỷ lệ
carbohydrates trong N. Incerta tương đương với Skeletonema coastatum (4.9%), thành
phần lipit (6.54%) rất thấp so với Nitzschia closterium, Cylindrotheca fusiformis và S.
Coastatum (18-20%) , còn hàm lượng protein (50.10%) rất cao so với Ni. Closterium,
C. Fusiformis (16-38%). N. Incerta là tảo cát sinh trưởng nhanh dưới đáy đại dương,
chúng gắn bó và dính lấy chất nền trong suốt thời kì sinh trưởng.
Chất chống oxy hoá là phụ gia quan trọng trong công nghiệp. Phần lớn sử dụng
chất chống oxy hoá để tránh hư hỏng cho các sản phẩm dễ bị oxy hoá như thực phẩm,
dược phẩm và mỹ phẩm. Rất nhiều nghiên cứu đã được thực hiện với các hợp chất
được trích ly và tinh chế từ thực vật trên cạn, bên cạnh đó các nhà nghiên cứu cũng rất
chú trọng đến việc nghiên cứu tính chống oxy hoá của các phân tử mang hoạt tính sinh
học từ vi sinh vật biển. Các gốc tự do liên tục được sản xuất trong suốt hoạt động sinh
lý bình thường, và bị loại bỏ bởi các chất chống oxy hoá với những cơ chế khác nhau.

Đó là sự cân bằng giữa việc sản sinh ra ROS và hệ thống chống oxy hoá ở vi sinh vật.
Vi sinh vật hiếu khí dựa vào chất chống oxy hoá để chống lại những áp lực từ môi
trường. Nhiều chất chống oxy hoá bảo vệ N. Incerta khỏi các nguyên nhân gây hư hại
từ ROS và RNS. Các chất chống oxy hoá từ thực vật như polyphenolics, những hợp
chất chứa nitơ, phytosterols và carotenoids có thể làm giảm ROS. Tảo là nguồn chống
oxy hoá tự nhiên rất tốt và giàu hoạt tính sinh học. Spirulina platenis, Dunaliella
salina và Botryococcus braunii là các nguồn chống oxy hoá quan trọng từ tảo. Nhiều
protein từ động thực vật có hoạt tính chống oxy hoá, chống lại quá trình peroxide do
thuỷ phân lipid hoặc acid béo. Vì vậy, để hiểu rõ hơn về cơ chế chống oxy hoá của các
sản phẩm thuỷ phân protein, các nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hoá của các acid
amin hay peptide được tiến hành.
Nghiên cứu này sử dụng các enzyme khác nhau để thuỷ phân protein và sau đó
so sánh hoạt tính chống oxy hoá của chúng. Các sản phẩm thuỷ phân của N. Incerta
thể hiện hoạt tính chống oxy hoá lên các gốc DPPH, superoxide, hydroxyl. Dựa vào
16


giá trị IC50 ta thấy được khả năng loại gốc tự do tốt nhất của từng sản phẩm thuỷ phân
bởi các enzyme như sau:
Bảng : Hoạt tính chống oxy hoá của sản phẩm thuỷ phân từ các enzyme khác
nhau

•

Sản phẩm thuỷ phân từ enyme pepsin đối với gốc DPPH

•

Sản phẩm thuỷ phân từ enzyme pronase-E và chymotrypsin đối với gốc
superoxide và hydroxyl.

•

Sản phẩm thuỷ phân từ enzyme nutrase đối với gốc anion superoxide.
Những kết quả này cho thấy tảo là nguồn chống oxy hoá rất tốt và có thể ứng

dụng trong lĩnh vực thực phẩm chức năng. Cần có nhiều nghiên cứu hơn về việc tách,
tinh chế các hợp chất hoá sinh chống oxy hoá và hoạt tính chống oxy hoá trong cơ thể
sống cũng như cơ chế chống oxy hoá.

17