Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 4
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 6
1.1. Cấu trúc của lignocellulose ................................................................................ 6
1.1.1. Cấu trúc thành tế bào thực vật ..................................................................... 6
1.1.2. Cellulose ...................................................................................................... 9
1.1.3. Lignin ......................................................................................................... 11
1.1.4. Hemicellulose ............................................................................................ 15
1.2. Enzyme thủy phân lignocellulose ..................................................................... 17
1.2.1. Enzyme cellulolytic ................................................................................... 18
1.2.2. Enzyme xylanolytic ................................................................................... 20
1.3. Ứng dụng của enzyme lignocellulolytic ........................................................... 22
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................. 24
2.1. Nguyên liệu....................................................................................................... 24
2.1.1. Mẫu đất ...................................................................................................... 24
2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................... 24
2.1.3. Thiết bị ....................................................................................................... 24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 24
2.2.1. Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ƣa nhiệt .... 24
2.2.2. Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ƣa nhiệt.......... 25
2.2.2.1.

Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn ...................................................... 25

2.2.2.2.

Tách chiết ADN tổng số...................................................................... 25

2.2.2.3.

Định lƣợng ADN bằng cách đo độ hấp thụ tử ngoại ở bƣớc sóng 260

nm và 280 nm. ..................................................................................................... 26

1


2.2.2.4.

PCR nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S .................. 27

2.2.2.5.

Gắn sản phẩm PCR vào vector p-GEM T ........................................... 27

2.2.2.6.

Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli DH5α ..................................... 28

2.2.2.7.

Đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S ..................... 29

2.2.3. Thu nhận chế phẩm enzyme ...................................................................... 30
2.2.4. Xác định hoạt độ enzyme........................................................................... 31
2.2.4.1.

Xác định hoạt độ enzyme .................................................................... 31

2.2.4.2.

Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt độ và độ bền của enzyme ................ 33

2.2.4.3.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt độ và độ bền của enzyme ........ 33

2.2.5. Xác định protein......................................................................................... 33
2.2.6. Thủy phân các chất lignocellulose ............................................................. 33
2.2.7. Tách phức hệ multienzyme từ dịch lỏng của môi trƣờng nuôi cấy ........... 33
2.2.8. Điện di gel và kỹ thuật zymogram ............................................................. 34
2.2.9. Sắc ký bản mỏng (TLC)............................................................................. 34
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................................... 35
3.1. Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ƣa nhiệt ........... 35
3.1.1. Sàng lọc các vi khuẩn ƣa nhiệt kỵ khí bằng môi trƣờng làm giàu và nuôi
cấy ở nhiệt độ cao ................................................................................................... 35
3.1.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính xylanolytic-cellulolytic ........... 39
3.2. Kết quả nhận dạng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ƣa nhiệt .............. 40
3.2.1. Xác định hình thái tế bào vi khuẩn ............................................................ 40
3.2.2. Nhận dạng vi khuẩn bằng đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN
ribosome 16S .......................................................................................................... 41
3.2.2.1.

Tách chiết ADN hệ gen của chủng vi khuẩn NKP13 ......................... 41

2


3.2.2.2.

Nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi

khuẩn NKP13 bằng PCR..................................................................................... 42
3.2.2.3.

Nhân dòng gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn

NKP13 vào vector p-GEM T .............................................................................. 44
3.2.2.4.

Giải trình tự gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn

NKP13… ............................................................................................................. 47
3.3. Nghiên cứu phức hệ enzyme xylanolytic-cellulolytic của chủng NKP13 ....... 49
3.3.1. Khả năng sinh tổng hợp xylase và CMCase .............................................. 49
3.3.2. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ xylanase và CMCase ............................... 51
3.3.2.1.

pH phản ứng tối ƣu ............................................................................. 51

3.3.2.2.

Độ bền pH ........................................................................................... 52

3.3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzyme xylanase và CMCase và độ
bền nhiệt của enzyme .............................................................................................. 53
3.3.3.1.

Nhiệt độ phản ứng tối ƣu .................................................................... 53

3.3.3.2.

Độ bền nhiệt ........................................................................................ 53

3.3.4. Khả năng thủy phân nguyên liệu lignocellulose của enzyme .................... 54
3.3.5. Điện di chế phẩm enzyme trên gel polyacrylamide có SDS ..................... 56
KẾT LUẬN .................................................................................................................... 58
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 59

3


MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của nông nghiệp, hàng năm hàng triệu tấn chất
lignocellulose bắt nguồn từ các hoạt động nông nghiệp, đƣợc thải ra môi trƣờng. Điều
này không chỉ làm tăng thêm gánh nặng môi trƣờng mà còn làm lãng phí về các nguồn
sinh khối, do đó cần phải thực hiện nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với việc thải các
chất thải vào môi trƣờng. Các phƣơng pháp xử lý hóa học và sinh học thông thƣờng
ngày càng khó đạt đƣợc mức độ cần thiết để loại bỏ các chất ô nhiễm này. Vì vậy cần
phải triển khai những biện pháp xử lý sao cho vừa nhanh hơn, rẻ hơn, hiệu quả hơn,
đáng tin cậy hơn vừa đem lại lợi ích kinh tế. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa
học kỹ thuật, công nghệ sinh học đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong xử lý chất thải nông
nghiệp.
Thế hệ nhiên liệu sinh học đầu tiên dựa trên đƣờng, tinh bột và dầu thực vật, tuy
nhiên chƣa thực sự có đƣợc những ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp.
Lignocellulose đƣợc xem là thế hệ nhiên liệu sinh học thứ hai. Đối với môi trƣờng và
các ngành kinh tế, các chất thải lignocellulose sẽ đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn nguyên
liệu để sản xuất các chất hóa học, nhiên liệu và các vật chất tƣơng hợp khác. Bên cạnh
đó, các nguồn nguyên liệu này đƣợc đặc biệt quan tâm vì giá thành thấp và nguồn cung
cấp dồi dào. Quá trình biến đổi sinh học các chất thải thành nhiên liệu có thể mang đến

các lợi nhuận về kinh tế cũng nhƣ về môi trƣờng [1].
Lignocellulose (sinh khối thực vật) bao gồm các polysaccharide chủ yếu là
cellulose, hemicellulose (xylan) và lignin, trong đó cellulose và hemicellulose chiếm tỉ
lệ cao nhất. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 35% đến 50% khối lƣợng khô thực
vật, còn hai hợp chất, hemicellulose và lignin lần lƣợt chiếm khoảng 20-30% và 5-20%
khối lƣợng khô của cơ thể thực vật [23]. Với tính sẵn có lignocellulose trở thành một
nguồn năng lƣợng tái tạo dồi dào [36].

4


Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng và triển vọng sử dụng enzyme vào
việc biến đổi sinh học các chất thải lignocellulose để tạo ra các đƣờng đơn hữu ích từ
phế phụ liệu chứa lignocellulose [3].
Nhằm thu đƣợc enzyme có hoạt tính thủy phân lignocellulose hiệu quả thành
các đƣờng đơn và đƣờng đôi từ phế phụ liệu nông nghiệp, để rồi từ đó đƣa vào ứng
dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm có giá trị trong đời sống con ngƣời, chúng
tôi đã thực hiện đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ
một chủng vi khuẩn ưa nhiệt”.

5


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Cấu trúc của lignocellulose

1.1.1. Cấu trúc thành tế bào thực vật
Trong tự nhiên, các lớp của thành tế bào thực vật đƣợc minh họa bằng mô hình

của gỗ (Hình 1.1). Ở giữa các tế bào, có một hợp chất đóng vai trò nhƣ keo dán gắn kết
các tế bào lại với nhau, đó là lớp gian bào (middle lamella). Lớp này cấu tạo từ các
chất keo, có bản chất pectin và không có tác động về quang học. Bên trong là thành tế
bào sơ cấp (primary wall).

Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật [37]
Thành tế bào sơ cấp có thể đƣợc chia thành mặt bên trong và mặt bên ngoài. Sự
sắp xếp của các vi sợi trong thành tế bào sơ cấp phân tán tăng dần từ mặt trong ra mặt
ngoài. Tiếp đến là thành tế bào thứ cấp gồm 3 lớp: lớp ngoài (S1), lớp giữa (S2) và lớp
trong (S3). Sự phân chia thành tế bào thứ cấp thành ba lớp S chủ yếu là do sự định
hƣớng khác nhau của các vi sợi trong ba lớp đó. Điển hình các vi sợi định hƣớng xoắn
trong vách tế bào. Lớp ngoài của thành tế bào thứ cấp, các vi sợi đƣợc định hƣớng
trong cấu trúc xoắn chéo có độ nghiêng tạo thành một góc lớn với trục dọc của tế bào.

6


Lớp giữa là lớp dày nhất và ở lớp giữa có góc nhỏ và độ nghiêng của sợi xoắn ốc trong
khi vi sợi trong lớp 3 đƣợc sắp xếp nhƣ ở lớp ngoài, với một góc rộng với trục dọc của
tế bào. Ngoài ra trong một số trƣờng hợp, trên mặt trong của thành tế bào có lớp sần
sùi (W). Chức năng của thành tế bào là chống đỡ cho các cơ quan của cây đặc biệt là
các vách dày và cứng. Thành tế bào còn giữ các chức năng quan trọng chính nhƣ hấp
thụ, thoát hơi nƣớc hay vận chuyển và bài tiết.
Lignocellulose là thành phần

triển của cây và các điều kiện khác. Thành

cấu trúc chính của thực vật thân gỗ

phần của lignocellulose đƣợc trình bày ở

và các thực vật khác nhƣ cỏ, lúa,

bảng 1.1 [9].

ngô…Trong tự nhiên, chúng ta có
thể tìm thấy lignocellulose ở thực
vật hay các chất thải nông nghiệp,
lâm nghiệp và các chất thải rắn
trong thành phố. Thành phần chủ
yếu của lignocellulose là cellulose,
hemicellulose và lignin (Hình 1.2).
Cellulose và hemicellulose là các
đại phân tử cấu tạo từ các gốc
đƣờng khác nhau, trong khi lignin
là một polymer dạng vòng đƣợc
tổng hợp từ tiền phenylpropanoid.
Thành phần cấu tạo và phần trăm
của các polymer này là khác nhau
giữa các loài. Hơn nữa, thành phần
cấu tạo trong cùng một cây hay các
cây khác nhau là khác nhau dựa vào

Hình 1.2: Thành phần chủ yếu của

độ tuổi, giai đoạn sinh trƣởng, phát

lignocellulose

7

Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông
nghiệp phổ biến [9]
Nguồn lignocellulose

Cellulose (%)

Hemicellulose (%) Lignin (%)

Thân gỗ cứng

40-55

24-40

18-25

Thân gỗ mềm

45-50

25-35

25-35

Vỏ lạc

25-30

25-30

30-40

Lõi ngô

45

35

15

Giấy

85-99

0

0-15

Vỏ trấu

32.1

24

18

Vỏ trấu của lúa mì

30

50

15

Rác đã phân loại

60

20

20

Lá cây

15-20

80-85

0

Hạt bông

80-95

5-20

0

Giấy báo

40-55

25-40

18-30

Giấy thải từ bột giấy hóa học

60-70

10-20

5-10

Chất rắn nƣớc thải ban đầu

8-15

-

24-29

Chất thải của lợn

6

28

-

Phân bón gia súc

1.6-4.7

1.4-3.3

2.7-5.7

Cỏ ở bờ biển Bermuda

25

35.7

6.4

Cỏ mềm

45

31.4

12.0

Các loại cỏ (trị số trung bình
cho các loại)

25-40

25-50

10-30

Bã thô

33.4

30

18.9

8


Lƣợng lớn lignocellulose đƣợc thải ra từ các ngành lâm nghiệp, nông nghiệp,
công nghiệp giấy và gây ra ô nhiễm môi trƣờng. Tuy nhiên, lƣợng lớn các sinh khối
thực vật dƣ thừa đƣợc coi là rác thải có thể đƣợc biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá
trị khác nhau nhƣ nhiên liệu sinh học, hóa chất, các nguồn năng lƣợng rẻ cho quá trình
lên men, bổ sung chất dinh dƣỡng cho con ngƣời và thức ăn cho động vật [15].
1.1.2. Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, và là thành phần
chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O- (β-DGlucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.3). Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều
nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp đƣợc khoảng 1011 tấn cellulose
(trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%).

Hình 1.3: Công thức hóa học của cellulose
Các mạch cellulose đƣợc liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết van
Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng

tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi
enzyme cũng nhƣ hóa chất. Ngƣợc lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết
không chặt với nhau nên dễ bị tấn công [40]. Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã
đƣợc đƣa ra nhằm mô tả vùng tinh thể và vô định hình nhƣ hình 1.4 [29].

9


Hình 1.4: Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập
Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose đƣợc kéo thẳng và định
hƣớng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định
hình.
Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị
lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b nhƣ trên hình vẽ. Các
đơn vị đó đƣợc sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ
bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa,
tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β - glycoside giữa
các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer
sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các
tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng
hóa trị (β - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo
đƣợc liên kết hydro [2].
Cellulose có cấu tạo tƣơng tự carbohydrate phức tạp nhƣ tinh bột và glycogen.
Các polysaccharide này đều đƣợc cấu tạo từ các đơn phân là glucose. Cellulose là
glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β-

10


1 4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate

phức tạp khác. Giống nhƣ tinh bột, cellulose đƣợc cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất
500 phân tử glucose. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi
cellulose có đƣờng kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy
giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hidro đƣợc tạo thành giữa
các nhóm OH của chúng. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn
gọi là bó mixen có đƣờng kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống
lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nƣớc, ở tế bào già thì chứa đầy
lignin và hemicellulose.
Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Ngƣời và động vật không có
enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa đƣợc cellulose, vì vậy
cellulose không có giá trị dinh dƣỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose
có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của
gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất
enzyme phân giải cellulose. Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy chúng có
thể sử dụng cellulose làm thức ăn.
1.1.3. Lignin
Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ biến đƣợc tìm thấy trong hệ mạch thực
vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật. Lignin là một trong các
polymer hữu cơ phổ biến nhất trên trái đất. Lignin có cấu trúc không gian 3 chiều, phức
tạp, vô định hình, chiếm 17% đến 33% thành phần của gỗ. Lignin không phải là
carbohydrate nhƣng có liên kết chặt chẽ với nhóm này để tạo nên màng tế bào giúp
thực vật cứng chắc và giòn, có chức năng vận chuyển nƣớc trong cơ thể thực vật (một
phần là để làm bền thành tế bào và giữ cho cây không bị đổ, một phần là điều chỉnh
dòng chảy của nƣớc), giúp cây phát triển và chống lại sự tấn công của côn trùng và
mầm bệnh. Thực vật càng già, lƣợng lignin tích tụ càng lớn. Hơn nữa, lignin đóng vai

11


trò quan trọng trong chu trình carbon, tích lũy carbon khí quyển trong mô của thực vật

thân gỗ lâu năm, là một trong các thành phần bị phân hủy lâu nhất của thực vật sau khi
chết, để rồi đóng góp một phần lớn chất mùn giúp tăng khả năng quang hợp của thực
vật.
Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng
vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và
hemicellulose. Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn.
Lignin là polymer, đƣợc cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu
trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl
alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol (Hình 1.5).

Hình 1.5: Các đơn vị cơ bản của lignin [14]
Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc
của nó trong gỗ. Ngoài việc đƣợc phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ,
lignin có thể đƣợc phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringyl lignin.
Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl. Các nghiên
cứu đã chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trƣơng nở của xơ sợi và vì vậy loại
nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringyl lignin [29].
Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong
cấu trúc. Lignin dƣờng nhƣ bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình
thuôn hoặc hình cầu. Lignin trong tế bào thực vật bậc cao không có vùng vô định hình.

12


Các vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm đƣợc sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế
bào. Ngoài ra, cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hƣởng
bởi mạng polysaccharide. Việc mô hình hóa động học phân tử cho thấy rằng nhóm
hydroxyl và nhóm methoxyl trong các oligomer tiền lignin sẽ tƣơng tác với vi sợi
cellulose cho dù bản chất của lignin là kỵ nƣớc.

Hình 1.6: Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhóm chức chính

13


Các nhóm chức ảnh hƣởng đến hoạt tính của lignin bao gồm nhóm phenolic
hydroxyl tự do, methoxyl, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rƣợu mạch
thẳng và nhóm carbonyl (Hình 1.6). Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic
hydroxyl hơn syringyl.
Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose và ngay cả với cellulose (nhƣng
không nhiều). Độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết,
cấu trúc hóa học của lignin và các gốc đƣờng tham gia liên kết [2]. Carbon alpha (Cα)
trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất với khối
hemicellulose. Ngƣợc lại, các đƣờng nằm ở mạch nhánh nhƣ arabinose, galactose, và
acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thƣờng liên kết với lignin. Các liên kết có thể
là ether, ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoside
(phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin)
Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH
thấp nhƣ điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nƣớc. Ở nhiệt độ phản ứng cao
hơn 200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose.
Những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy đối với gỗ cứng, nhóm ether β-O-4 aryl bị phá
hủy trong quá trình nổ hơi. Đồng thời, đối với gỗ mềm, quá trình nổ hơi làm bất hoạt
các nhóm hoạt động của lignin ở vị trí α nhƣ nhóm hydroxyl hay ether, các nhóm này
bị oxy hóa thành carbonyl hoặc tạo cation benzylic, cation này sẽ tiếp tục tạo liên kết
C-C [29].
Trong dinh dƣỡng động vật, lignin rất đáng quan tâm vì nó không bị tiêu hóa
bởi enzyme của cơ thể vật chủ. Lignin còn liên kết với nhiều polysaccharide và protein
màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp chất gỗ. Gỗ, cỏ khô và rơm rất giàu
lignin nên tỷ lệ tiêu hóa thấp trừ khi đƣợc xử lý hóa học làm cho các liên kết giữa
lignin với các carbohydrate khác bị bẻ gãy.

14


1.1.4. Hemicellulose
Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp
khoảng 70 đến 200 đơn phân. Hemicellulose chứa cả đƣờng 6 carbon gồm glucose,
mannose và galactose và đƣờng 5 gồm xylose và arabinose. Thành phần cơ bản của
hemicellulose là β – D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β -(14).
Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy
nhiên có một vài điểm chung gồm:
-

Mạch chính của hemicellulose đƣợc cấu tạo từ liên kết β -(14).

-

Xylose là thành phần quan trọng nhất.

-

Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3.

-

Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thƣờng là disaccharide
hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide
khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có
mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân.

Hemicellulose là polysaccharide trong màng tế bào tan trong dung dịch kiềm và
có liên kết chặt chẽ với cellulose, là một trong ba sinh khối tự nhiên chính. Cùng với
cellulose và lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững chắc ở thực vật. Về cấu
trúc, hemicellulose có thành phần chính là D-glucose, D-galactose, D-mannose, Dxylose và L-arabinose liên kết với các thành phần khác và nằm trong liên kết glycoside.
Hemicellulose còn chứa cả axit 4-O-methylglucuronic, axit D-galacturonic và axit
glucuronic. Trong đó, đƣờng D-xylose, L-arabinose, D-glucose và D-galactose là phổ
biến ở thực vật thân cỏ và ngũ cốc. Tuy nhiên, khác với hemicellulose thân gỗ,
hemicellulose ở thực vật thân cỏ lại có lƣợng lớn các dạng liên kết và phân nhánh phụ
thuộc vào các loài và từng loại mô trong cùng một loài cũng nhƣ phụ thuộc vào độ tuổi
của mô đó.
Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà
nó sẽ có những tên tƣơng ứng nhƣ manan, galactan, glucan và xylan. Các

15


polysaccharide nhƣ manan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất phổ biến trong
thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau nhƣ gỗ,
rơm rạ, v.v…
Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào thực
vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-Dxylopyranose, là nguồn năng lƣợng dồi dào thứ hai trên trái đất. Đa số phân tử xylan
chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên [7]. Các gốc thay thế chủ yếu trên khung
chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl. Các nhóm này có đặc
tính liên kết tƣơng tác cộng hóa trị và không hóa trị với lignin, cellulose và các
polymer khác [32].
Cấu tạo, số lƣợng và vị trí của xylan ở các loài thực vật khác nhau là khác nhau.
Xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng (Hình 1.7),
hay arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm (Hình 1.8) [39], hay thành phần
cấu tạo xylan là axit D-glucuronic, có hoặc không có ete 4-O-methyl và arabinose ở
các loài ngũ cốc.

Hình 1.7: O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng

16


Hình 1.8: Arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm
1.2.

Enzyme thủy phân lignocellulose
Hầu hết những quy trình xử lý rác thải đều sử dụng một trong hai phƣơng pháp

hóa lý hoặc sinh học hoặc kết hợp. Phƣơng pháp xử lý bằng enzyme là trung gian giữa
hai phƣơng pháp truyền thống, nó bao gồm các quy trình hóa học trên cơ sở hoạt động
của các chất xúc tác có bản chất sinh học. Enzyme có thể hoạt động trên các chất ô
nhiễm đặc biệt khó xử lý để loại chúng bằng cách kết tủa hoặc chuyển chúng thành
dạng khác. Ngoài ra chúng có thể làm thay đổi các đặc tính của chất thải đƣa chúng về
dạng dễ xử lý hoặc chuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn.
Phƣơng pháp xử lý bằng enzyme so với phƣơng pháp xử lý thông thƣờng có
những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ: áp dụng đƣợc đối với các hợp chất sinh học khó xử lý;
tác dụng ở cả vùng nồng độ chất ô nhiễm cao và thấp; một số enzyme riêng biệt có tác
dụng trên phạm vi của pH, nhiệt độ, độ mặn…; không gây ra những biến động bất
thƣờng; không ảnh hƣởng đến cân bằng sinh thái.

17


Dựa trên phƣơng pháp enzyme học về quá trình phân hủy cellulose,
hemicellulose và lignin ngày nay đã có một vài phƣơng pháp sinh học thực hiện chu
trình xử lý lignocellulose. Trong tƣơng lai gần, các quy trình sử dụng enzyme thủy

phân lignocellulose hoặc dựa vào vi sinh vật có thể mang lại cho chúng ta nhiều lợi ích
lớn và thân thiện với môi trƣờng. Mối quan hệ giữa cellulose và hemicellulose trong
thành tế bào ở thực vật bậc cao chặt chẽ hơn chúng ta tƣởng trƣớc đó. Đó có thể là do
các phân tử tại các liên kết cellulose-hemicellulose hoặc tại các vùng cellulose tinh thể
đòi hỏi phải có các enzyme khác nhau để thủy phân hiệu quả hơn. Mỗi polymer bị thủy
phân bởi một số vi sinh vật sản xuất các enzyme hoạt động hỗ trợ nhau. Nếu đúng nhƣ
vậy, điều này có thể giúp chúng ta giải thích đƣợc tại sao vi sinh vật cellulolytic tổng
hợp đặc trƣng nhiều enzyme cellulase khác nhau có tính đặc hiệu gối nhau và tại sao
một số enzyme xylanase lại mang vùng liên kết cơ chất gần với cellulose. Các vi sinh
vật cellulolytic và xylanolytic không ở trong môi trƣờng riêng biệt mà chúng tồn tại
cùng với các loài khác nhƣ nấm và vi khuẩn. Các chủng này sẽ đóng vai trò nhƣ trung
tâm thủy phân polymer để tạo ra đƣờng và các sản phẩm thủy phân khác.
1.2.1. Enzyme cellulolytic
Enzyme thủy phân cellulose có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose,
chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn
năng lƣợng thông qua các sản phẩm, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng
lƣợng khác. Thí dụ nhƣ từ các chất thải nhà máy giấy nhƣ các sản phẩm từ bột giấy và
giấy có thể thu nguồn năng lƣợng nhƣ ethanol [12].
Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(14) glucoside. Nói chung,
để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với
những tác động đặc trƣng riêng biệt. Dựa theo nghiên cứu về hệ enzyme cellulase của
nấm Trichoderma reesei [36], hệ enzyme thủy phân gồm 3 loại hoạt tính enzyme (Hình
1.9):

18


Endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)
Enzyme nội bào endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là
enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong phân tử cellulose bởi tác

dụng ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự do và các chuỗi
oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh thể hiệu
quả nhƣng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tƣơng đối dễ tiếp cận.
Exoglucanase
Enzyme ngoại bào exoglucanase gồm cả 1,4-beta-D-glucan glucanohydrolase
(EC 3.2.1.74), giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và 1,4-beta-D-glucan
cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) mà giải phóng D-cellobiose. Tỷ lệ thủy phân của
enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu chuỗi cellulose.
β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)
β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase giải phóng phân tử D-glucose
từ đƣờng cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác.

Hình 1.9: Tác dụng của từng enzyme trong cellulose

19


1.2.2. Enzyme xylanolytic
Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân của nó đòi hỏi các ảnh hƣởng
của một hệ thống enzyme phức tạp. Enzyme này thƣờng bao gồm hai loại: enzyme
không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, β-xylosidase) và enzyme phân nhánh (αarabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase axit phenolic)
(Hình 1.10). Tất cả các enzyme này tác động tƣơng hỗ để chuyển đổi xylan thành cấu
tử đƣờng của nó. Hệ thống enzyme xylanolytic đa chức năng nhƣ vậy khá phổ biến ở
những vi khuẩn và nấm. Các xylan khác loại chứa nhóm thể khác nhau trong mạch
chuỗi chính và chuỗi bên. Nhƣ vậy, sự phân giải polysaccharide phức tạp nhƣ vậy có
thể gồm hoạt động hỗ trợ giữa các thành phần khác nhau của hệ thống enzyme
xylanolytic [7].

Hình 1.10: (A) Enzyme xylanolytic liên quan đến quá trình phân giải xylan. Ac: nhóm
acetyl; α-Araf: α-arabinofuranose; α-4-O-Me-GlcA: α-4-O-methylglucuronic acid. (B)

Thủy phân các xylooligosaccharide bởi enzyme β-xylosidase [10]

20


β-Xylosidase
β-D-xylosidase (β-D-xyloside xylohydrolase; EC 3.2.1.37) là enzyme ngoại bào
exoglyosidase thủy phân các oligosaccharide ngắn và xylobiose thành đƣờng xylose. βxylobiose thật có thể phân tách chất nhân tạo nhƣ p-nitrophenyl β-D-xyloside [11].
Trong số các xylooligomer, xylobiose thƣờng là cơ chất tốt nhất. Ái lực của enzyme
đối với xylooligosaccharide giảm theo mức độ tăng của phản ứng polymer hóa [4]. Hầu
hết các β-xylosidase đƣợc nghiên cứu cho đến nay đều bị ức chế bởi xylose sản phẩm
thủy phân của chúng. Nhiều β-xylosidase có hoạt tính transferase, đặc biệt là ở các
nồng độ cơ chất cao, tạo ra sản phẩm phân tử lƣợng cao.
α-L-Arabinofuranosidase
Mặc dù enzyme arabinosidase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân
xylan, chỉ có một vài enxyme đã đƣợc cô lập và mô tả. Có hai loại enzyme arabinase,
các enzyme α-L-arabinofuranosidase ngoại bào (EC 3.2.1.55) hoạt hóa ngƣợc lại với pnitrophenly-α-L-arabinofuranoside và trên các arabinan phân nhánh, và các enzyme
1,5-alpha-L-arabinase nội bào (EC3.2.1.99), chỉ hoạt hóa các arabinan dạng thẳng.
α-L-Arabinofuranosidase có khả năng thủy phân cả hai liên kết 1,3- và 1,5-α-Larabinofuranosyl trong arabinoxylolan đã đƣợc báo cáo trong A. ninger và B. subtilis.
Enzyme này đặc hiệu cao đối với arabinoxylan và có thể giải phóng mỗi arabinose từ
arabinoxylan. Khi giải phóng arabinose, mạch chính xylan không bị thủy phân và
không tạo ra xylooligosaccharide. Enzyme này không tác động đối với α-L-1,3 hoặc α1,5 liên kết arabinose từ arabinan, arabinogalactan, hoặc p-nitrophenyl-alpha-Larabinofuranoside.
α-Glucuronidase
α-D-Glucuronidase phân giải liên kết α-1,2 giữa axit glucuronic và gốc xylose
trong phân tử glucuronoxylan. Tính đặc hiệu của α-glucuronidase là khác nhau phụ
thuộc vào nguồn gốc của enzyme.

21

Esterase acetylxylan
Enzyme esterase acetylxylan là enzyme có thể cắt đứt giữa các nhóm acetyl với
2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự nhiên
[8]. Trong các nghiên cứu trƣớc đó đã chứng minh đƣợc enzyme này đƣợc chứng minh
là sinh ra từ một số loài vi khuẩn và nấm [20,31].
1.3.

Ứng dụng của enzyme lignocellulolytic
Thế hệ nhiên liệu sinh học đầu tiên dựa trên đƣờng, tinh bột và dầu thực vật,

không có đƣợc những ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, vì các nguyên vật liệu này
cũng đƣợc sử dụng làm thức ăn. Lignocellulose đƣợc xem là thế hệ nhiên liệu sinh học
thứ hai. Trong thập kỷ qua, enzyme thủy phân lignocellulose ngày càng đƣợc quan
tâm. Cellulose và xylan rất phổ biến trong tự nhiên. Hàng năm, lƣợng lignocellulose do
thực vật tổng hợp nên là 1011 tấn. Sự phân hủy lignocellulose chủ yếu là do vi sinh vật.
Do đó mà quá trình phân hủy lignocellulose bằng các enzyme từ vi sinh vật có một ý
nghĩa lớn về lý thuyết cũng nhƣ về thực tế. Bởi lẽ do vi sinh vật phân hủy cellulose mà
hàng năm bầu khí quyển của trái đất đƣợc bổ sung đầy đủ lƣợng CO2 cần thiết cho sự
sống. Một số ứng dụng chính của cellulase và xylanase nhƣ:
 Ứng dụng trong quá trình thủy phân gỗ và phế liệu gỗ rẻ tiền thành các đƣờng
đơn giản rồi có thể chế biến thành thức ăn cho gia súc.
 Các nguyên liệu thực phẩm có nguồn gốc thực vật nếu đƣợc gia công bằng chế
phẩm enzyme cellulase và xylanase sẽ đƣợc mềm ra, tăng hệ số đồng hóa và
chất lƣợng. Do đó sẽ rất bổ ích làm thức ăn đặc hiệu cho trẻ em, ngƣời ăn kiêng
cũng nhƣ chế biến thức ăn gia súc.
 Ứng dụng trong quá trình thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các
hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng
lƣợng thông qua các sản phẩm đƣờng, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm

22

giàu năng lƣợng khác. Thí dụ: từ các chất thải nhà máy giấy nhƣ các sản phẩm
từ bột giấy và giấy có thể thu nguồn năng lƣợng nhƣ ethanol.

23


CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1.
2.1.1.

Nguyên liệu
Mẫu đất
Mẫu đất nghiên cứu đƣợc thu thập ở các tỉnh thành khác nhau ở các vùng miền

Phetchaburi, Nakorn Pathorn và Nakorn Ratchasrima tại Thái Lan.
Trong nghiên cứu này, các chủng vi khuẩn kỵ khí đƣợc phân lập từ 34 mẫu đất
ở các vùng nông nghiệp và các mẫu này đƣợc thu thập ở độ sâu ít nhất là 1 mét, sau đó
đƣợc bảo quản ở -4oC trong điều kiện kỵ khí. Trong 34 mẫu đó có 10 mẫu đƣợc lấy ở
tỉnh Phetchaburi, 10 mẫu ở Nakorn Ratchasrima và 14 mẫu ở Nakorn Pathorn.
2.1.2.

Hóa chất
Tris-base, ethanol, chloroform, phenol, SDS, APS, acryamide, NaCl, cao nấm

men, trypton, agarose, kanamycin, SDS – PAGE, CMC, dNTP... đƣợc mua từ hãng
Sigma (Mỹ), vector pGEM-T và các oligonucleotide đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen.
Các hóa chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dành cho phân tích.
2.1.3.

Thiết bị
Các thiết bị chính sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: bể ổn nhiệt, buồng cấy kỵ

khí, buồng cấy vi sinh, hệ thống điện di SDS-PAGE, hệ thống điện di gel agarose, máy
phân tích ảnh điện di gel doc, máy ly tâm lạnh Sigma 3K30, máy ly tâm, máy đọc trình
tự CEQ 8000, máy quang phổ Nano drop, máy PCR 9700, máy lắc nuôi cấy, nồi hấp
khử trùng, tủ ổn nhiệt, máy trộn vortex.
2.2.
2.2.1.

Phương pháp nghiên cứu
Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt
Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng cơ bản gồm K2HPO4 0,15g/l, KH2PO4

0,29g/l, urea 0,21g/l, cao nấm men 0,45g/l, muối khoáng 0,02%, resazurin 0,0025%,

24


cystein 0,004% và giấy lọc 1% làm cơ chất. Môi trƣờng đƣợc xử lý bằng dòng khí nitơ
để loại bỏ khí oxi tạo môi trƣờng kị khí, sau đó khử trùng và ủ ở 60oC, pH 7. Quá trình
sinh trƣởng của vi khuẩn đƣợc quan sát hàng ngày và các bƣớc sàng lọc đƣợc tiến hành
vài lần cho đến khi thu đƣợc kết quả tốt.
Sau đó 1 ml mỗi mẫu đƣợc dàn đều lên đĩa thạch 2,5% với môi trƣờng tƣơng tự
nhƣ trên có chứa bã giấy 1% rồi ủ ở 60oC từ 2-3 ngày trong buồng cấy kị khí.
Các khuẩn lạc đƣợc sàng lọc vài lần đến khi đƣợc tinh sạch.
2.2.2.

Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt.

2.2.2.1.

Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn

Phƣơng pháp nhuộm Gram cải tiến nhƣ sau [1]:
- Chuẩn bị chủng vi khuẩn sạch: các chủng đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch
đã nêu ở trên.
- Tím kết tinh đƣợc nhỏ để làm vết bôi và để trong 1 phút.
- 1-2 giọt dung dịch (lugol) đƣợc bổ sung và giữ 30 giây đến 1 phút. Tiêu bản
đƣợc tẩy màu bằng cồn 95% có chứa iot trong khoảng 30 giây.
- Tiêu bản đƣợc nhuộm bổ sung safranin từ 30 giây đến 1 phút, sau đó đƣợc rửa
bằng nƣớc, thấm, hong khô và đƣợc quan sát dƣới vật kính dầu.
Kết quả: vi khuẩn Gram dƣơng bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram âm có màu
hồng.
2.2.2.2.

Tách chiết ADN tổng số

- Việc tách chiết ADN tổng số đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau [26]:
 Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy lắc ở 50oC trong môi trƣờng BM.
 Dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu tế bào.

25