nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

Bùi Minh Thái

NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH VÀ
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CHẤT KHÁNG
SINH METRONIDAZOLE VÀ CÁC
SULFAMIT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

1


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH VẼ
MỞ ĐẦU …………………………………………………………………..

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ……………………………………………….
1.1. Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)………
1.1.1. Cấu trúc phân tử …………………………………………………..
1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của các Sulfamit, Metronidazole ………….
1.1.3. Tính chất dược lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole ...........
1.1.4. Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole ..........
1.1.5. Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu ………..………………...
1.2. Phƣơng pháp xác định……………………………………………….
1.2.1. Một số công trình nghiên cứu xác định Sas bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ……………………………………………..
1.2.2. Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) …………………………………….
1.2.3. Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và
metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ……….
Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……..
2.1.

Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu…………………

2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu …………………………………

2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu ……………………………………………..
2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………

2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC …….

2

Luận văn Thạc sĩ
2.2.2.

Bùi Minh Thái

Phân tích định lượng bằng HPLC …………………………

2.3.

Giới thiệu chung về phƣơng pháp chiết pha rắn ….………….

2.4.

Hóa chất và dụng cụ……………………………………………..

2.4.1.

Hoá chất …………………………………………………

2.4.2.

Dụng cụ ………………………………………………………

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………….
3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký ……………………………………….
3.1.1. Chọn bước sóng của detector ……………………………………..
3.1.2. Thăm dò khả năng tách của các Sulfamit trên cột RP-C18 ……….
3.2. Chọn pha tĩnh ……………………………………………………......
3.3. Tối ƣu hóa pha động …………………………………………………

3.3.1. Nồng độ đệm axetat của pha động ………………………………...
3.3.2. Độ pH cho dung dịch đệm axetat ………………………………….
3.3.3. Tỉ lệ thành phần pha động ………………………………………...
3.3.4. Tốc độ pha động ..............................................................................
3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích …………………………………..
3.4.1. Khảo sát lập đường chuẩn trong khoảng nồng độ 0,05 – 1,000ppm
3.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD); Giới hạn định lượng (LOQ) ................
3.4.3. Độ đúng, độ lặp lại của phép đo ………………………………….
3.5. Mẫu thực, quy trình xử lý và kết quả phân tích …………………...
3.5.1. Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi …………………..
3.5.2. Phân tích mẫu thực ………………………………………………………

KẾT LUẬN ……………………………………………………………….
TÀI LIỆU THAM KHẢO

3


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

MỞ ĐẦU
Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ngại của hầu hết
các cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Một số loại kháng sinh thông thường
(chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) bản thân nó có thể gây ra tác
động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, một số loại khác như các kháng sinh
nhóm nitrofurans qua quá trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ra
những hợp chất có độc tính cao đối với cơ thể sống. Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit
(SAs) là nhóm kháng khuẩn có hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều trong trong nuôi

trồng, chế biến nông thủy sản, v.v..
Việc sử dụng chất này một cách tùy tiện có thể dẫn đến tồn dư một lượng lớn
quá giới hạn cho phép trong cơ thể động vật. Khi người tiêu dùng sử dụng thực
phẩm có dư lượng lớn sulfamit hay các chất kháng sinh trong thời gian dài gây ra
một loạt các phản ứng như rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu, rối loạn
chuyển hóa porphyrin. Cho nên việc xác định chính xác lượng các sulfamit, các chất
kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và lượng tồn dư trong sản phẩm từ động vật là rất
quan trọng.
Dựa trên thực tế đó, trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các
điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit
như sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis,
phương pháp này có độ chọn lọc, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểm
nghiệm của nước ta, có tính khả thi và ứng dụng vào thực tế cao.

4


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN

1.2. Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole(MTD)
1.1.1. Cấu trúc phân tử [3,6]
Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát:

R2 N

SO 2 NH R1

Khi thay thế các nhóm R1, R2 bằng các gốc khác nhau, chúng ta có các SAs
khác nhau.Vì thế có cả một họ SAs.
Khi R2 = H thì sulfamit mới có hoạt tính kháng khuẩn. Khi R2 # H, thì chất đó
là tiền thuốc. R1 có thể là mạch thẳng, dị vòng. Tuy nhiên nếu R1 là dị vòng thì hiệu
lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông thường các dị vòng 2-3 dị tố.
Cấu trúc Metronidazole(MTD):

Là một thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt đối với vi
khuẩn kỵ khí và động vật nguyên sinh. MTD là một trong những thành phần có mặt
trong thức ăn chăn nuôi, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản (với tên thương
mại là Enro DC).
1.1.3. Tính chất vật lý và hoá học của các Sulfamit, Metronidazole [3]
1.1.2.1. Tính chất vật lý
SAs ở dạng tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, thường ít tan trong
nước, tan trong dung dịch axít, tan trong dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin).

5


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

MTD là tinh thể hoặc bột kết tinh, hơi vàng, không mùi, bền ngoài không khí,
sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng. Nóng chảy ở khoảng 159oC – 163oC.
Metronidazol khó tan trong nước, aceton.
1.1.2.2. Tính chất hoá học
- SAs có tính chất lưỡng tính:
 Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung dịch axít.

Ví dụ: cho kết tủa muối picrat trong dung dịch HCl loãng.
 Có tính axít do có nguyên tử H ở N-amit linh động, nên dễ tan trong dung
dịch kiềm tạo muối natri tan để pha thuốc tiêm (trừ Sulfaguanidin):
R
H2N

SO2

R

N

H2N

SO2

N

H

H

H2N

SO2

N

R

Na

- SAs tạo muối phức kết tủa với ion Ag+, và tạo phức màu kết tủa với ion Cu2+,
Co2+, …
- Ở nhóm amin bậc một của SAs có đôi điện tử tự do, giúp SAs thực hiện phản
ứng tạo phức chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho phức màu tím có bước
sóng hấp thụ cực đại ở 270-273 nm.
- Nhóm amin thơm tự do cho phản ứng diazo hoá, rồi ngưng tụ với
ản phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ ở bước sóng 460nm.
Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl = [Ar-N+ ≡N]Cl- + NaCl + 2H2O
Muối diazoni
Ở đây, Ar – là thành phần -C6H5-SO2NH-R1 của phân tử SAs.
Nhờ thế mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp này diễn ra dễ dàng.

6


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

1.1.6. Tính chất dƣợc lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole [3,6,9]
Với liều điều trị, SAs không diệt vi khuẩn, chỉ làm vi khuẩn yếu đi, không phát
triển và sinh sản được, dễ bị bạch cầu tiêu diệt.
SAs có phổ tác dụng và hoạt phổ rộng: tác dụng lên nhiều vi khuẩn than, vi
khuẩn tả, Shigella, E.coli, trực khuẩn Hansen... Ít hoặc không tác dụng trên một số
vi khuẩn: liên cầu khuẩn yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia... Không có tác dụng
đối với virut (trừ virut gây đau mắt nhạy cảm với sulfacylum). Nhưng lại có tác
dụng lên một số ký sinh trùng, đặc biệt ký sinh trùng sốt rét.
Tính hấp thu và đào thải: trừ nhóm SAs điều trị đường ruột, các SAs nói chung

đều được hấp thu nhanh ở ruột non, đào thải chủ yếu qua đường thận với tốc độ
khác nhau nên thời gian có tác dụng khác nhau.
Metronidazole cũng có hoạt phổ rộng bao gồm động vật nguyên sinh và các vi
khuẩn yếm khí bao gồm: nhóm Bacteroides(gồm cả B. fragilis), Fusobacterium
Veillonella, nhóm Clostridium (bao gồm cả C. difficile và C. perfringens),
Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus. Nó là hiệu quả đối với B. fragilis
phân lập kháng với clindamycin..
Metronidazole cũng có những hoạt động ức chế miễn dịch và kháng viêm, và
nó đã được sử dụng trong các bệnh nhân bị bệnh rosacea. Các hoạt động kháng
khuẩn của metronidazole làm thay đổi trao đổi chất của vi khuẩn acid mật trong
đường ruột, giảm ngứa ở những bệnh nhân bị ứ mật thứ cấp đến xơ gan mật tiền phát.
1.1.7. Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole [3]
1.1.4.1. Cơ chế kháng khuẩn của SAs
- Ức chế enzym chuyển hóa acid folic
Các sulfamit có hiệu lực điều trị tốt đều có gốc R mang dị vòng, dị vòng 2 dị
tố tốt hơn dị vòng 1 dị tố. Ví dụ: sulfamethoxazol: ức chế enzym dihydrofolat
synthetase nên ngăn chặn giai đoạn chuyển acid folic thành axit hydrofolic.
- Ngăn cản tổng hợp axít folic của vi khuẩn

7


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Vi khuẩn tổng hợp và chuyển hoá axít folic thành nucleo protein (cần thiết cho
mọi tế bào sống) theo sơ đồ sau:
OH
N

CH2

NH

CO

NH

CH CH2 CH2 COOH

N
COOH
H2N

N

acid glutamic

A.PAB

N

+

(vitamin H )

pterin
pteoryl

Acid folic (acid pteoryl glutamic)

Acid Dihydrofolic

Dihydrofolat syntetase
(enzy m)
Dihydrofolat sreductase
(enzy m)

Acid Tetrahydrofolic
Nucleoprp tein

Acid folinic

Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein
Theo sơ đồ trên sự đối kháng giữa A.PAB và SAs là sự cạnh tranh vào vị trí
của A.PAB trong thành phần phân tử axít folic trong quá trình vi khuẩn tổng hợp
axít này. Khi nồng độ đủ cao thì SAs sẽ chen vào vị trí của A.PAB làm cho việc
tổng hợp axít folic bị gián đoạn, ngưng trệ. Sự tranh chấp giữa A.PAB và SAs rõ
ràng tuân theo quy luật khối lượng, nên cần duy trì nồng độ có tác dụng ở máu trong
suốt thời gian dùng SAs.
SAs thay được A.PAB vì chúng giống nhau về hình dạng, kích thước và nhóm
chức hoá học:
o

6.9 Ao

6.7 A

O

O
H2N

o

C

2.3 A

H2N

o

S

2.4 A
O

OH

NH - R

Ở ngoài mặt phẳng
A.PAB

Sulfamit

8

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Như vậy những vi khuẩn không cần đến axít folic hoặc lấy được axít foclic có
sẵn trong môi trường thì không bị SAs tác dụng. Tế bào của người và động vật lấy
axít folic từ bên ngoài vào như một vitamin (axít folic là vitamin B9), nên không bị
ảnh hưởng bởi SAs. Khi dùng SAs để chữa bệnh thì nó chỉ có tác dụng chọn lọc
trên vi khuẩn.
H

H

HH H H
N N

N

(-)
N

S
O

(-)
(-)
OS S N O R

R

O

O

H

H
N

O

S

(-)
O

O

anion sulfamit

anion PAB

1.1.4.2. Cơ chế kháng khuẩn của Metronidazole
Metronidazole tác dụng lên vi khuẩn kỵ khí như Helicobacter pylori và
Gardnerella vaginalis, nhưng cơ chế của hành động này là chưa được hiểu rõ. Tuy
nhiên, hoạt động của nó chống lại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc xảy ra thông qua một
quy trình bốn bước:
- Tấn công vào vi sinh vật: Metronidazole là một hợp chất có khối lượng phân
tử thấp nên dễ dàng khuếch tán qua màng tế bào của vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí.

- Làm suy giảm hoạt hóa bởi sự vận chuyển protein trong tế bào:
Metronidazole làm giảm bởi pyruvat : ferredoxin(protein chứa sắt chuyển các điện
tử) oxidoreductaza (enzyme xúc tác phản ứng oxy hóa- khử) trong ty thể của vi
khuẩn kỵ khí, làm thay đổi cấu trúc hóa học của nó.
Pyruvate: ferredoxin oxidoreductase thường tạo ra ATP qua decarboxylation
oxy hóa của pyruvate. Với metronidazole trong tế bào, nhóm nitro của nó hoạt động
như một chỗ cất giữ điện tử, thu giữ điện tử thường được chuyển giao cho các ion
hydro trong chu kỳ này. Tác dụng làm suy giảm của metronidazole thúc đẩy hình
thành các hợp chất trung gian và các gốc tự do độc hại đối với tế bào.

9


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

- Giảm tương tác tiểu phân trung gian với tế bào - các tiểu phân trung gian độc
tương tác với DNA chủ, dẫn đến vỡ sợi DNA và phá hủy chuỗi AND.
- Sự phá vỡ của các sản phẩm trung gian gây độc tế bào - các tiểu phân trung
gian độc hại phân hủy thành sản phẩm cuối cùng không hoạt động.
1.1.8. Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu [3;6; 9]
Như ta đã biết, các SAs có cả một họ gồm hàng nghìn chất, với những tính
chất và công dụng khác nhau. Vì vậy, chúng tôi chỉ đi sâu vào bốn SAs sẽ được
nghiên cứu trong luận văn này.
1.1.8.1. Sulfaguanidin (SGU)
Công thức:
O

O

S
NH

H2N

NH2

HN

Tính chất: Dạng bột tinh thể màu trắng, tan rất ít trong nước, axeton, etanol
96o; không tan trong metylen clorit (CHCl3); không tan trong dung dịch có tính
kiềm; tan tốt trong dung dịch các axít vô cơ loãng... Nhiệt độ nóng chảy 189 –
193oC.
SGU cũng như nhiều SAs khác có cấu trúc rất giống A.PAB - một chất không
thể thiếu cho sự phát triển của vi khuẩn. Nên dễ dàng thay thế A.PAB để kìm hãm
quá trình trao đổi chất của vi khuẩn. Vì vậy SGU là một tác nhân kháng khuẩn
mạnh, được dùng như một loại thuốc chống các bệnh dịch tả, đái tháo đường, chứng
phù, tăng huyết áp...
1.1.5.2.Sulfamethoxypyridazin (SMP)
Công thức:
N
O

O
S
NH

H2N

10

N

OCH 3


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Tính chất: SMP ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà, dưới tác dụng
của ánh sáng sẽ bị sẫm màu, nâu dần; có vị đắng; rất ít tan trong nước, tan trong
kiềm và axít vô cơ loãng. Nhiệt độ nóng chảy của dẫn chất axetyl hoá là 228 –
229oC.
SMP tác dụng lên vi khuẩn tương tự như sulfadiazin nhưng hấp thụ ở ruột
nhanh hơn, nhiều hơn và đào thải rất chậm nên đạt được nồng độ cao trong máu,
đồng thời duy trì được nồng độ có tác dụng lâu, nên có tác dụng kéo dài. Vì vậy
dùng liều thấp hơn, ít nguy cơ kết tinh ở đường tiết niệu song cần đề phòng nguy cơ
tích luỹ gây ngộ độc vì sự đào thải chậm. SMP dùng để điều trị các bệnh nhiễm
khuẩn đường hô hấp, sinh mủ, viêm (hoặc giãn) phế quản, viêm đường niệu đạo (bể
thận, ruột thận), viêm họng, màng não tuỷ, v.v...
1.1.5.3.Sulfadoxin (SDO)
Công thức:
O

N

O

N

S
OCH3

NH
OCH3

H2N

Tính chất: SDO dạng bột kết tinh màu trắng, rất ít tan trong nước, ít tan trong
etanol 96o, không tan trong ete, tan trong các dung dịch axít vô cơ loãng và
hydroxyt kiềm. Nhiệt độ nóng chảy 198oC.
SDO chỉ định các nhiễm khuẩn do tụ cầu, lậu cầu, màng não cầu, E.coli, phế
cầu. Dung dịch muối natri tiêm tĩnh mạch cho các trường hợp nhiễm khuẩn nặng, trị
sốt rét. Muối Ag của SDO có tác dụng tốt lên trực khuẩn mủ xanh, chữa bỏng. SDO
cũng có tác dụng kéo dài.
1.1.5.4. Sulfamethoxazol (SMX)
Công thức:
O
O

O

CH3

S
NH
H2 N

11

N


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Tính chất: SMX dạng bột tinh thể trắng hoặc trắng ngà. Thực tế không tan
trong nước, khó tan trong ete, hơi tan trong ethanol 96o, dễ tan trong axeton, tan
trong các dung dịch hydroxyt kim loại kiềm loãng. Nhiệt độ nóng chảy là 169 172oC.
SMX có tính kháng khuẩn mạnh, đã được làm thuốc điều trị sốt rét phối hợp
với pyrimethamin, do ức chế men dihydropholat nên ngăn cản sự chuyển hóa axít
dihydrofolic. SMX còn được dùng rộng rãi cho các bệnh nhiễm khuẩn đường hô
hấp, tai - mũi - họng, đường tiết niệu, thận, máu, bộ phận sinh dục, đường tiêu hoá,
v.v...
1.2. Phƣơng pháp xác định
1.2.1. Một số công trình nghiên cứu xác định Sas bằng phƣơng pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất
là các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học
hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích môi trường... đặc
biệt là tách và phân tích lượng vết các chất.
Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định các kháng khuẩn SAs
trong các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác khi xác định
dư lượng các kháng khuẩn trong mẫu thực phẩm vì có độ chính xác, độ nhạy và độ
lặp lại cao...
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau
khi rửa giải. Ngày nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã

mở rộng khả năng phát hiện được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối
với phân tích dư lượng thì người ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD) nhất là
tách và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp. Còn thông dụng người ta dùng
detector UV-Vis hay detector huỳnh quang. Dùng detector UV-Vis thì xác định
được nhiều loại chất hơn, nhưng detector huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc
hơn và ít hơn các tương tác do các hợp chất có trong nền mẫu.

12


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004 [8], qui định phương pháp xác định
hàm lượng nhóm chất SAs (gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfamethazin,sulfamethoxypiridazine,sulfacloropyridazin,sulfadoxin, sulfamethoxazone
sulfadimethoxin và sulfa-chinoxalin) trong sản phẩm thủy sản bằng HPLC- detector
huỳnh quang. Điều kiện chạy sắc ký như sau: Cột sắc ký: cột Nucleosil 250×3mm
100-5 C18 AB. Chương trình pha động (gồm: dung dịch H3PO4 0,02M và hỗn hợp
metanol- axcetonitril tỷ lệ 1:1), bắt đầu với 60 % H3PO4 và đến 45 phút 45 %
H3PO4, tốc độ dòng 0,6 ml/phút. Thể tích mẫu tiêm 10 l. Bước sóng kích thích
405nm, bước sóng phát xạ 495nm. Phương pháp xử lý mẫu này cho hiệu suất thu
hồi nằm trong khoảng 60-70 %, với giới hạn phát hiện nhỏ hơn 5

g/kg.

Năm 2010 Cheong và cộng sự[12] đã xác định dư lượng 4 SAs (Sulfadiazine
(SDZ),Sulfamethazine(SMZ),Sulfamethoxazole(SMX) và Sulfaquinoxaline(SQX))
trong gan gà sử dụng phương pháp HPLC pha đảo, detector UV tại bước sóng
266nm. Điều kiện chạy sắc ký như sau: cột C18 (5 μm, 4.6 mm x 25.0 cm). Kênh

A: amoni axetat nồng độ 0,01M(pH =4,6). Kênh B: ACN. Sử dụng gariend pha
động như sau: ban đầu 95% A- 5%B, sau 18phút: 67%A -37%B, sau 23 phút95%
A- 5%B. Tốc độ pha động 1ml/phút. Nồng độ của SAs được phát hiện trong mẫu từ
11 tiểu bang trên bán đảo Malaysia là 0,006-0,062 μg/g trong nhu mô và 0,08-0.193
μg/g trong gan .
Rodrigo H.M.M. Granja, Alfredo M. Montes Niño, Fernanda Rabone and
Alessandro Gonzalez Salerno[25] đã sử dụng phương pháp HPLC –detector UV để
xác định sunfamit trong mật ong. Sulfonamid được trích xuất từ mật ong với
dichloromethane sau khi giải thể với clorua natri 30%, và làm sạch với chiết pha rắn
trên các cột Florisil. Dung dịch chiết được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
với phát hiện tia cực tím. Các giới hạn phát hiện được xác định tại 3 μg/kg, 4 mg/kg
và 5 mg/kg cho sulfamethazine, sulfathiazole và sulfadimethoxine, tương ứng với
hiệu suất thu hồi 61,0% cho sulfathiazole; 94,5% cho sulfamethazine và 86,0% cho
sulfadimethoxine ở mức 100μg/kg.

13


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Ngoài detector UV, huỳnh quang, là những detector thường dùng, nhiều công
trình nghiên cứu còn sử dụng detector khác như detector diode array (DAD),
detector điện hóa cho độ nhạy và độ chọn lọc cao.
Tác giả Ivan Pecorelli và các đồng sự [18], sử dụng phương pháp HPLC DAD để phân tích đồng thời dư lượng 10 SAs trong mẫu bắp thịt (sulfadiazin,
sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamono-methoxin, sulfachlorpyridazin, sulfamethoxazone, sulfaquinoxalin, và sulfadimethoxin). Điều kiện
chạy sắc ký: Cột C8 (250mm × 3mm, 5 m). Pha động là axetonitril (A) và dung
dịch đệm axetat pH = 4,5(B), chạy gradient: bắt đầu với 15% B, đến 22 phút 41%
B, tốc độ pha động 0,4 ml/phút. Detector DAD đặt 270nm. Chuẩn bị mẫu: Cân 10g

mẫu bắp thịt đã được nghiền đồng thể vào ống ly tâm 50ml. Thêm vào đó 10g
Na2SO4 khan và 20ml etyl axetat lắc đều trong 15 phút. Đem ly tâm với tốc độ 3000
vòng/phút trong 10 phút. Pha hữu cơ được chuyển sang bình nón 250ml. Quá trình
chiết như vậy được lặp lại lần hai. Kết hợp hai phần chiết lại đem cô cạn bằng hút
chân không. Sau đó đem pha trong 40ml etyl axetat. Chiết pha rắn: Cột Speedisk
được hoạt hoá bằng 2×3ml n-hexan và 2×4ml etyl axetat. Sau khi bơm mẫu vào cột
được rửa bằng 5ml nước và 5ml metanol, rửa giải bằng 20ml hỗn hợp
metanol/amoniac (tỷ lệ 97,5/2,5 về thể tích). Dung dịch thu được làm khô trong
điều kiện chân không, rồi hoà tan trong 1ml dung dịch đệm axetat pH = 4,5 với
0,1% metanol. Lọc qua catridge 0,45 và 0,2 l trước khi bơm vào máy HPLC.
Phương pháp này có hiệu suất thu hồi các SAs khá cao 55-92%, với giới hạn phát
hiện 0,05

g/kg.

W.Hela và các cộng sự [29] cũng sử dụng phương pháp HPLC - DAD để xác
định đồng thời mười hai SAs (sulfadiazin, sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin,
sulfamethizol,sulfadimidin,sulfisoxazol,sulfamethoxazone,sulfatroxazol,sulfachlorp
yrazin, sulfaphenazol và dapsone) trong mẫu bắp thịt, gan và thận của lợn, gà...
Điều kiện chạy sắc ký: pha tĩnh được dùng là cột Phenonmenex Luna C8 (250 ×
2mm, kích thước hạt nhồi 5 m). Pha động là đệm amoniaxetat pH=4,6 (A) và
axetonitril (B), chạy gradient bắt đầu với 5% B đến 60 phút 40% B, tốc độ pha động

14


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

0,35 ml/phút. Detetor DAD đặt 260nm (đối với các SAs), và đặt 294nm (đối với
chất nội chuẩn). Phương pháp này có giới hạn phát hiện các SAs là 1ppb.
Sắc ký lỏng (HPLC) là một phương pháp được lựa chọn cho việc xác định
các chất vô cơ và hữu cơ trong hỗn hợp khác nhau. Tuy nhiên, nhiều chất có thể
không được phát hiện trong HPLC vì không chứa các màu, huỳnh quang hoặc
nhóm khử oxy hóa. Điều này vấn đề có thể khắc phục bằng các phản ứng dẫn xuất
hóa. Một phản ứng dẫn xuất hóa là cần thiết để tăng độ nhạy cảm hay chọn lọc và
có thể đạt được bởi một phát hiện cụ thể, chẳng hạn như huỳnh quang hoặc hấp thụ
trong ánh sáng nhìn thấy, tại một bước sóng cao. Ngày nay, có rất nhiều công trình
nghiên cứu ứng dụng lý thuyết này để phát hiện và tách các sulfamit trong các mẫu
sinh học phức tạp.
PVinas, C.Lopez Erroz, N.Campillo, M.Hernandez [22] xác định dư lượng
sulfamit( sulfadiazine, sulfathiazole, sulfapyridine, sulfamerazine, sulfamethazine,
sulfamethizole,sulfamethoxypyridazine,sulfachloropyridazine,sulfamonomethoxine,
, sulfamethoxazole, sulfadimethoxine) trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC
với dẫn xuất hóa huỳnh quang sau cột. Chất dẫn xuất hóa được sử dụng ở đây là
OPA (o-phthldialdehyde) kết hợp với β-mercaptoethanol (ME). Phát hiện huỳnh
quang: Eex =302nm; Eem = 412nm. Xây dựng đường chuẩn: Pha động ban đầu:
acetonitrile-nước (3:97) trong 5 phút sau đó gradient tuyến tính từ(3:97) đến (40:60)
trong 15 phút. Cuối cùng, lặp lại điều kiện ban đầu trong 1phút, giữ trong 15phút,
tốc độ 0,5ml/phút. Chất dẫn xuất hóa (0,01M OPA + 0,02M ME, hòa tan trong
ethanol 2% 0,7M H3PO4) được thêm bởi bơm nhu động tại tốc độ 0,25ml/phút.
Chúng được trộn lẫn và phản ứng trong cuộn PTFE (2,5

0,8 I.D) ở 40oC. Đường

chuẩn của sulphamethoxazole từ 0,01 -2 µg/ml, các sulfamit còn lại 0,02 -2 µg/ml.
Craig D.C. Salisbury, Jason C.Sweet, Roger Munro[13]sử dụng phương pháp
HPLC với dẫn xuất huỳnh quang trước cột để xác định dư lượng sulfamit
(sulfachloropyridazine,sulfadiazine,sulfadimethoxine,sulfadoxine, sulfaquinoxaline,

sulfaethoxypyridazine, sulfamethazine, sulfathiazole) trong mô lợn, gan bò, cừu
,ngựa , thịt gà, gan cá, thức ăn chăn nuôi. Mẫu trích được bảo quản trong đệm pH

15


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

3,0-ACN (60:40), mẫu được dẫn xuất hóa trước cột với fluorescamine. Các chất dẫn
xuất sulfonamide được tách bằng sắc ký lỏng sử dụng cột C18 với pha động: acid
phosphoric 0,02M-ACN(60,5: 39,5) và phát hiện bằng huỳnh quang (Eex = 405 nm;
Eem = 495nm). Giới hạn phát hiện (LOD) cho tất cả các sulfamit được 0,01 μg/g,
ngoại lệ sulfaquinoxaline LOD là 0,015 μg/g.
Qiong-Hui Zou, Xiang-Feng Wang,Yuan Liu, Jin Wang, Jia Song, Hui Gao,
Jie Han[23] cũng xác định dư lượng đồng thời là 12 sulfamit (sulphadiazine,
sulphamethazine,sulphathiazole,sulphadimethoxine,sulphamerazine,sulphapyridine,
sulphamethoxazole,suphamethizole,sulphaquinoxaline,sulphameter,sulphamonomet
hoxine, và sulphachloropyridazine) trong các mô động vật (gan lợn, thịt gà, bắp thịt
bò) bởi HPLC với detecto UV. Chất dẫn xuất hóa trước cột của các hợp chất
sulfamit với 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl) đã được đề xuất và các
điều kiện phản ứng đã được tối ưu hóa. Các giới hạn phát hiện cho các hợp chất
sulfamit đã được cải thiện rất nhiều sau khi bước dẫn xuất hoá. Dư lượng sulfamit
trong mô động vật được chiết bằng acetonitrile và tinh chế bằng cách chiết pha rắn
với C18. Phương pháp này có độ nhạy cao và lặp lại tốt và hiệu suất thu hồi trung
bình trên 70%. Các giới hạn phát hiện cho hầu hết các sulfamit có thể đạt 3-5 μg/kg.
1.2.2. Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phƣơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là phương pháp mới được ứng dụng để xác định Metronidazole trong

những năm gần đây.
Năm 2005, Ticiano Gomes Nascimento và cộng sự [26] sử dụng HPLC – UV
xác định đồng thời ranitidine và metronidazole trong huyết tương. 250ml huyết
tương sau khi được kết tủa với percloric 60%, ly tâm, sau đó tiêm trực tiếp vào
HPLC. Điều kiện tách: cột C18 Shimpak, pha động KH2PO4 10mM(pH=3,5) –
ACN(90:10,v/v), phát hiện UV tại bước sóng 315nm. Phương pháp này cho độ
chính xác cao (RSD <15%). Hiệu suất thu hồi: ranitidine (96,22 ± 3,52);
metronidazole (95,00 ± 4,50%). Định lượng ranitidine trong huyết tương là
20ng/ml, metronidazole là 40ng/ml.

16


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Năm 2007 Naser Tavakoli[20]và cộng sự cũng đã sử dụng HPLC để xác
định đồng thời metronidazole và amoxicillin. Điều kiện sắc ký: cột C18, pha động
pH =4, phát hiện bởi detector UV tại bước sóng 254nm. Khoảng tuyến tính của
amoxicillin 0,15- 600(mg/ml); metronidazole 0,13 -300mg/ml. Giới hạn phát hiện
của amoxicillin (LOD:0,05mg/ml,LOQ:0,15mg/ml);metronidazole(LOD: 0,1mg/ml,
LOQ:0,13mg/ml).
Cũng vào năm đó Han-Wen Sun[17] đã xác định đồng thời dư lượng 7
nitroimidazole:metronidazolenext,ronidazole, dimetridazole, tinidazole, Ornidazole,
secnidazole và các chất chuyển hóa chung của ronidazole và hydroxydimetridazole
trong thịt bằng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện tách: cột silica C18, pha động
H2O- ACN, detector UV phát hiện tại bước sóng 300nm. Hiệu suất thu hồi cho các
mẫu thịt gà, thịt lợn, thịt xông khói 71,4-99,5%. Khoảng tuyến tính từ 0,7 60mg/kg. Độ lệch chuẩn tương đối của 10 phép đo cho các mẫu thịt gà, thịt lợn và
thịt xông khói tăng, ở nồng độ 1mg/kg : 6,2-13,9% và 20 mg/kg : 4,0-8,7%.

Năm 2008 Hadir M. Maher và cộng sự [16] đã xác định dư lượng đồng thời
metronidazole và spiamycin trong cá sử dụng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện
sắc ký: cột tách C18 Sep-Pak, pha động: rửa giải gradient 0,05M đệm phosphate
(pH =2,4)-ACN, tốc độ dòng 1ml/phút. Khoảng tuyến tính của metronidazole:
0,005-1,000mg/g, LOD:0,002mg/g, LOQ:0,005mg/g. Khoảng tuyến tính của
piamycin: 0,025 -1,000mg/g, LOD: 0,005mg/g, LOQ: 0,025mg/g.
1.2.3. Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và
metronidazole bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Từ những tương đồng trong việc xác định SAs và MTD, rất nhiều công trình
đã xác định được đồng thời MTD và các SAs trong các đối tượng khác nhau
Năm 2002, Richard Lindberg và cộng sự[24] đã xác định đồng thời các chất
kháng sinh thuộc các họ sau: fluoroquinolones, sulfamit, trimethoprim,-β lactam
(penicillin và cephalosporines), nitroimidazoles và tetracycline trong nước thải bệnh
viện. Phương pháp phân tích là HPLC – MS. Các chất phân tích có nồng độ thay

17


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

đổi theo thời gian vì vậy 7 mẫu phân tích được lấy lúc 13h. Nồng độ chất phân tích
thay đổi trong phạm vi sau đây(mg/l):ciprofloxacin:3,6-101,0 (mg/l); metronidazole
0,1-90,2(mg/l);sulfamethoxazole:0,4-12,8(mg/l);ofloxacin:0,2-7,6(mg/l);
trimethoprim 0,6-7,6(mg/l); doxycycline 0,6-6,7(mg/l).
Năm 2007, Wang P, Li J, Zheng H [31] đã xác định đồng thời 7 sulfamit
(sulfacetamide,sulfapyridine,sulfamerazine,sulfamethazine,sulfamater,sulfamonome
thoxine, sulfamethoxazole) và metronidazole, chloramphenicol trong mỹ phẩm
bằng sắc ký HPLC-PDA. Điều kiện sắc ký: cột sắc ký Atlantis dC18 (150 mm x 4,6

mm, 5µm). Pha động : axit formic0,1% - acetonitrile(20: 80, v/v) tốc độ dòng chảy
1,0 ml/phút. Phát hiện bởi detector PDA tại 268 nm. Giới hạn định lượng 3 - 80
mg/g. Khoảng tuyến tính của các sulfamit 20-200 mg/ml. Khoảng tuyến tính của
metronidazol, chloramphenicol 40-400 mg / ml. Hiệu suất thu hồi trung bình là
83,8% - 105,3% . Độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 5%. Phương pháp này thường
được sử dụng cho việc xác định bảy sulfamit và metronidazole, chloramphenicol
trong mỹ phẩm.

18


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
2.5.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Ở Việt Nam nuôi tôm đã trở thành hoạt động quan trọng nhất và được xem là
mục tiêu chủ yếu của kế hoạch phát triển nuôi trồng thủy sản. Sự phát triển nhanh
chóng của nghề nuôi tôm dẫn đến tình hình sử dụng thuốc và hóa chất cũng gia
tăng. Họ thuốc kháng khuẩn SAs, MTD là nhóm có hoạt phổ rộng, được sử dụng
nhiều trong chăn nuôi tôm để phòng ngừa và chữa nhiều loại bệnh nhiễm khuẩn cho
vật nuôi. Sau khi vật nuôi đã sử dụng các chất đó, nếu không đảm bảo thời gian
cách ly để vật nuôi tự làm sạch thì sẽ có tồn dư chất kháng khuẩn có thể gây tổn hại
cho sức khoẻ người tiêu dùng.
Dư lượng kháng sinh trong tôm tác động xấu cho người tiêu dùng đã được
cảnh báo từ nhiều năm trước nhưng đến nay vẫn còn tồn tại vì thế các nghiên cứu
liên quan đến lĩnh vực này hiện rất quan trọng và có ý nghĩa lớn nhằm cải thiện sự
bền vững trong nuôi tôm theo định hướng bảo vệ môi trường và sản xuất sản phẩm

có chất lượng và an toàn.
Vì vậy đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là Metronidazole
sulfaguanidin(SGU),sulfamethoxypyridazon(SMP),sulfadoxim(SDO),sulfamethoxa
zon (SMX) được sử dụng nhiều trong chăn nuôi.
Mục tiêu của đề tài chính là cần tìm ra phương pháp có thể tách và xác định
đồng thời các chất trên trong tôm cho độ nhạy, độ chính xác cao mà đơn giản, phù
hợp với trang thiết bị sẵn có. Xuất phát từ yêu cầu này, chúng tôi lựa chọn phương
pháp nghiên cứu là phương pháp HPLC hấp phụ pha ngược, detector ghép nối là
detector UV-Vis.

2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
Với mục tiêu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu tách và xác định

19


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

đồng thời các Sas, MTD bằng HPLC sử dụng cột chiết pha ngược dùng detector
UV-Vis.
Vì vậy để xây dựng được một quy trình phân tích tốt, chúng tôi đã nghiên cứu
một cách có hệ thống các vấn đề sau:
Tối ưu hoá các điều kiện tách và định lượng đồng thời năm chất bằng HPLC:
 Chọn bước sóng của detector
 Chọn pha tĩnh
 Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ…
 Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
 Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo.

Tối ưu hoá các điều kiện xử lý mẫu phân tích:
 Chọn phương pháp xử lý mẫu và xác định hiệu suất thu hồi
Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để phân tích
một số mẫu tôm.
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong luận văn này đối tượng phân tích là các mẫu tôm, có thành phần nền rất
phức tạp. Vì vậy chúng tôi chọn phương pháp HPLC (High Performance Liquid
Chromatograghy - Sắc ký lỏng hiệu nâng cao) để khảo sát các điều kiện tách và
định lượng các chất.
2.6.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp HPLC [4 ; 8]
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất
trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất
nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ
số phân bố của nó. Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiệu quả tách
sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được lực rửa giải phù hợp
nhất. Chất tan sau khi chuyển tới cuối cột tách được chuyển đến detector để phát

20


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

hiện. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại detector khác nhau.
Trong một hệ pha HPLC, dung lượng hấp phụ của pha tĩnh được đặc trưng
bằng hệ số dung tích k’. Nếu k’ càng lớn thì chất phân tích sẽ bị lưu giữ càng nhiều
trên cột tách. Hệ số dung tích được tính theo biểu thức : k' 

tR  to

(tR: thời gian lưu
to

tổng cộng, to: thời gian không lưu giữ).
Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:
 Tương tác hấp phụ
 Tương tác trao đổi ion
 Tương tác theo cơ chế rây phân tử
 Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau:
 Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP - HPLC và hấp phụ pha ngược RP
- HPLC)
 Sắc ký trao đổi ion (EX - HPLC)
 Sắc ký rây phân tử (Gel - HPLC)
Đối với hệ NP - HPLC, pha tĩnh là các chất phân cực, pha động là dung môi
không và kém phân cực. Ngược lại trong hệ RP - HPLC, pha tĩnh kém phân cực,
thông thường pha tĩnh là các chất phân cực đã được silan hoá bề mặt tạo thành các
vật liệu nhồi kém phân cực. Pha động trong hệ này là các dung môi phân cực. Khác
với hệ pha thường dùng cho các chất không phân cực hay ít phân cực, hệ này có thể
phân tích nhiều loại chất với độ phân cực khác nhau. Do các ưu điểm như xác định
được nhiều loại chất, hiệu quả tách tốt, dung môi ít tốn kém hơn NP – HPLC nên
ngày nay sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế hấp phụ pha ngược được sử dụng
nhiều hơn.
Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau:

21


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Hình 2.1: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đủ
2.6.2. Phân tích định lƣợng bằng HPLC
Trong điều kiện phân tích đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là thời
gian lưu tRi của chất đó trên cột tách. Chúng ta có thể dựa vào thời gian lưu này để
định tính được chất đó thông qua mẫu chuẩn. Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích
thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất. Thông thường
trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào
chiều cao pic hoặc diện tích.
H = k.Cb
S = k.Cb
Trong đó:
H - chiều cao pic sắc ký của chất
S - diện tích pic sắc ký của chất
k - hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký
b - hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b ≤ 1
Ở vùng nồng độ nhỏ thì b = 1, mối quan hệ giữa H(S) với C là tuyến tính:
H = k1.C = f(C)
S = k2.C = f(C)

22


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Sử dụng các quan hệ đó có thể xác định nồng độ chất phân tích theo phương
pháp đường chuẩn hay phương pháp thêm chuẩn. Dùng phương pháp đường chuẩn
thì nhanh, đơn giản. Còn khi thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cần xác định nhỏ

thì người ta dùng phương pháp thêm chuẩn.
Đối với các pic tách rời nhau hoàn toàn thì biểu diễn mối tương quan của diện
tích pic vào nồng độ chất phân tích cho kết quả vùng tuyến tính lớn hơn. Tuy nhiên,
trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic là dễ dàng hơn đo diện tích. Nên trong
phân tích lượng nhỏ (nồng độ nhỏ) người ta thường đo chiều cao pic. Tuy nhiên đối
với các pic sắc ký có hiện tượng kéo đuôi (peak tailling) thì việc đo diện tích píc lại
chính xác hơn.
Trong luận văn này chúng tôi thiết lập quan hệ diện tích pic phụ thuộc vào
nồng độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau đó tiến hành xác định nồng
độ chất theo phương pháp thêm chuẩn.
2.7. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chiết pha rắn [9]
Khi lượng chất phân tích có trong mẫu quá nhỏ, bước làm giàu chất phân tích
qua cột chiết pha rắn là rất cần thiết. Hơn nữa, mẫu thực phẩm là loại mẫu có nền
rất phức tạp, ngoài chất phân tích còn có rất nhiều các chất béo khác nên cần phải
chiết pha rắn để lấy các chất phân tích một cách định lượng từ dung dịch, loại tạp
chất và thu hồi toàn bộ nó. Sau khi làm sạch chất phân tích được rửa giải vào một
thể tích nhỏ dung dịch và lấy một cách định lượng khỏi dung dịch nên có hệ số làm
giàu cao. Cơ sở chính của phưong pháp này về căn bản rất giống với sắc ký lỏng (đã
được giới thiệu ở trên), chỉ khác ở chỗ: HPLC tách các hợp chất trong một hệ có
pha động chảy liên tục, trong khi chiết pha rắn giữ chất phân tích ở chất hấp phụ,
các tạp chất bị loại vào pha động và chất phân tích được rửa giải vào dung môi thích
hợp sau đó. Chiết pha rắn là một dạng HPLC đặc biệt, chỉ giữ chất này và không
giữ chất kia. HPLC đòi hỏi một cột (pha tĩnh) có số đĩa lý thuyết lớn (hàmg trăm
ngàn đến hàng triệu đĩa) trong khi chiết pha rắn chỉ yêu cầu một cột có số đĩa lý
thuyết nhỏ (khoảng vài chục đĩa).
Nguyên tắc chung của phương pháp chiết pha rắn.

23

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Chiết pha rắn là quá trình chuyển chất tan (chất phân tích) từ pha lỏng sang
pha rắn. Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu, làm giàu và làm sạch mẫu phân tích.
Quá trình chiết pha rắn được tiến hành qua 4 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Hoạt hoá chất hấp thu (pha rắn): Người ta cho dung môi chảy qua
cột chiết để thấm ướt các hạt pha rắn, hoạt hoá các nhóm chức, đuổi bọt khí, lấp đầy
dung môi vào các khoảng trống. Sau khi hoạt hoá, pha rắn cần được ngâm trong
dung môi.
Giai đoạn 2: Cho mẫu phân tích chảy qua cột chiết. Các chất phân tích bị hấp
thu thành dải ở phần đầu của cột chiết nhờ lực tương tác Van-de-van
(Vanderwaals), cũng có thể lực liên kết hidro; lực lưỡng cực - lưỡng cực hoặc theo
cơ chế trao đổi ion.
Giai đoạn 3: Giai đoạn làm sạch mẫu phân tích.
Người ta tiến hành rửa cột chiết bằng dung môi để loại bỏ các chất lạ bị hấp
thu cùng với chất phân tích.
Giai đoạn 4: Rửa giải toàn bộ chất phân tích bằng một lượng nhỏ dung môi.
Hệ số làm giàu càng cao khi lượng dung môi rửa càng ít.
2.8. Hoá chất và dụng cụ
2.8.1. Hoá chất
Sulfadoxin (SDO), sulfaguanidin (SGU), sulfamethoxypyridazine (SMP),
sulfamethoxazon(SMX), metronozazol(MTD) tinh khiết 99.9% của Viện Kiểm
nghiệm Dược Bộ y tế - Hai Bà Trưng, Hà Nội.
tinh khiết
HPLC, dung dịch gốc được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 oC. Các dung dịch chuẩn
được pha từ dung dịch gốc bằng dung môi giống như pha động chạy sắc ký để tránh
pic ảo do sai khác dung môi gây ra.
Metanol (MeOH), axetonitril (ACN), axít axetic, muối natri axetat loại tinh

khiết HPLC của hãng Meck, Đức.
Dung dịch đệm được chuẩn bị bằng cách: chuẩn bị 2 dung dịch:

24


Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

- Dung dịch CH3COONa.H2O có nồng độ 100mM: cân một lượng chính xác
chất phân tích loại tinh khiết đã tính trước, hoà tan bằng nước cất hai lần, chuyển
vào bình định mức dung tích 250ml, định mức.
- 250ml dung dịch axit acetic nồng độ 100mM: được chuẩn bị bằng cách pha
loãng từ axit acetic đặc của Meck.
- Chỉnh pH của dung dịch bằng cách trộn dung dịch CH3COONa.H2O và axit
acetic với tỉ lệ xác định, sao cho nồng độ đệm bằng 10mM.
2.8.2. Dụng cụ
Máy quang phổ UV-Vis 8453 của hãng Agilent - Mỹ, điều khiển bằng phần
mềm Chemstation cho phép quét phổ từ 190 – 1100 nm.
Máy đo pH TIM 800 của hãng Radiometer – Đan Mạch với điện cực thuỷ tinh
Red – Rod cho phép đo pH và bổ chính nhiệt độ tự động.
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của hãng Shimadzu, Nhật Bản gồm:
 Bộ loại khí cho dung môi, Degasser – DGU-14AM
 Van trộn dung môi FCV-10ALVP.
 Bơm dung môi bốn kênh LC-10ATVP.
 Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO-10 ASVP
 Van bơm mẫu 6 chiều VS-7725i của Rheodyne, Mỹ với thể tích vòng
mẫu (sample loop) 20µl.
 Detector UV – Vis SPD- 10AVVP.

 Hệ điều khiển SCL-10AVP
 Phầm mềm điều khiển và xử lý LC solution Version 1.11SP1.
Cột chiết pha rắn : ODS, Sbề mặt : 546 m2/g ; kích thước lỗ trung bình : 60Ao,
pH =7, kích thước hạt : 54µm.
Cattrige lọc cỡ 0,45 m, 0,2 m, bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy,
máy sinh khí nitơ, cột chiết pha rắn, và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác.

25