NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG VẬT LIỆU γ– Al 2 O 3 ĐỂ TẠO CAO VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CÓ HOẠT TÍNH HẠ ĐƯỜNG HUYẾT TỪ LÁ DÂU TẰM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
…………………...

CƠNG TRÌNH THAM DỰ
GIẢI THƯỞNG “SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC “
NĂM 2014
Tên cơng trình: NGHIÊN CỨU Q TRÌNH SỬ DỤNG VẬT LIỆU γ–
Al2O3 ĐỂ TẠO CAO VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CĨ HOẠT TÍNH HẠ
ĐƯỜNG HUYẾT TỪ LÁ DÂU TẰM
Họ và tên sinh viên: Đỗ Hồng Giang
Lớp, khóa: KTHH 5 – K54
Họ và tên sinh viên: Bùi Văn Dũng
Lớp, khóa: KTHH 1 – K55
Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Hồng Nhung
Lớp, khóa: CNKTHH 1 – K56
Họ và tên sinh viên: Đặng Khánh Chi
Lớp, khóa: KTHH 3 – K56
Họ và tên sinh viên: Ngơ Thị Vui
Lớp, khóa: KTHH 5 – K56
Viện: Kỹ thuật hoá học
Giảng viên hướng dẫn: TS. Trần Thượng Quảng

Nam
Tel: +84 975335463
Nam
Tel: +84 966783392
Nữ
Tel: +84 1696804365
Nữ
Tel: +84 1669828806

Nữ
Tel: +84 973167826

Hà Nội, tháng 5 năm 2014


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

TĨM TẮT CƠNG TRÌNH
MÃ ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU Q TRÌNH SỬ DỤNG VẬT LIỆU γ– Al2O3 ĐỂ TẠO CAO VÀ SẢN
XUẤT CHẾ PHẨM CĨ HOẠT TÍNH HẠ ĐƯỜNG HUYẾT TỪ LÁ DÂU TẰM
Sinh viên:

Đỗ Hồng Giang – Lớp KTHH5 – Khóa 54
Bùi Văn Dũng – Lớp KTHH1 – Khoá 55
Nguyễn Thị Hồng Nhung – Lớp CNKTHH1 –Khoá 56
Đặng Khánh Chi – Lớp KTHH3 – Khố 56
Ngơ Thị Vui – Lớp KTHH5 – Khoá 56
Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Thượng Quảng
Khoa/Viện Kỹ thuật hố học
Qua nghiên cứu cơng nghệ sử dụng vật liệu γ– Al2O3 để phân lập các hợp chất có hoạt
tính sinh học từ lá Dâu tằm, chúng tơi nhận thấy rằng, các phân đoạn chất thu được từ quá
trình hấp phụ và nhả hấp dịch chiết lá dâu tằm trên vật liệu γ– Al2O3 có hoạt tính hạ đường
huyết rất tốt. Vì vậy, trong cơng trình này, chúng tơi tiếp tục hồn thiện cơng nghệ và đưa ra
quy trình sử dụng hạt hấp phụ γ– Al2O3 để tạo cao chiết Dâu tằm có hoạt tính hạ đường huyết.
Bên cạnh đó, với sự trợ giúp từ các đối tác, nhóm nghiên cứu đã tiến hành tạo chế phẩm viên
nén từ cao chiết Dâu tằm. Các thử nghiệm về hoạt tính sinh học cũng như độc tính cấp cho

thấy, viên nén có thành phần cao Dâu tằm khơng chỉ có khả năng hạ đường huyết, ức chế
Glucosidase mà cịn khơng gây độc hại cho cơ thể. Với những ưu điểm vượt trội đó, sản phẩm
này hứa hẹn sẽ là một giải pháp hiệu quả trong cơng tác phịng chống và điều trị căn bệnh tiểu
đường hiện nay.

1.
2.
3.
4.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà
Nội, 345.
Bộ y tế – viện dược liệu (1990), Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ
thuật Hà Nội, 275–276.
Đỗ Tất Lợi (1981), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật
Hà Nội.
Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam – trồng hái chế biến trị bệnh ban đầu, Nhà
xuất bản nông nghiệp, Hà Nội, 889–890.

2


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Tiểu đường hiện đang là một trong những căn bệnh đe doạ lâu dài tới sức

khoẻ của con người. Với số lượng người mắc bệnh tăng nhanh chóng trong khi
các thuốc hạ đường huyết hiện tại chưa tỏ rõ hiệu quả và gây nhiều tổn thương
nặng nề cho người sử dụng thì việc tạo ra các chế phẩm giúp phòng và điều trị
bệnh tiểu đường có nguồn gốc từ tự nhiên là rất có ý nghĩa. Nắm bắt được thực
tế này, dựa trên kết quả nghiên cứu trong nhiều năm qua, chúng tôi đã thử
nghiệm và bước đầu tạo ra một chế phẩm có khả năng hạ đường huyết từ lá Dâu
tằm. Với hoạt tính sinh học cao, độc tính thấp, dạng bào chế dễ sử dụng, đây hứa
hẹn là một sản phẩm có giá trị cao cả về khoa học, y học lẫn giá trị kinh tế.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài tập trung vào nghiên cứu quy trình tạo cao có hoạt tính hạ đường
huyết rồi sử dụng cao này để tạo chế phẩm viên nén có khả năng thương mại
hoá dưới dạng thực phẩm chức năng.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu quá trình sử dụng vật liệu γ– Al 2O3 để tạo cao có hoạt
tính từ lá Dâu tằm và sử dụng sản phẩm sau hấp phụ để tạo chế phẩm dạng viên
nén có hoạt tính

4. Phương pháp nghiên cứu
Dựa trên các kết quả nghiên cứu trước đó, nhóm nghiên cứu đưa ra một số
thử nghiệm mới về quy trình tạo cao. Kế đến, chúng tơi tiến hành thử hoạt tính
chống tiểu đường của chế phẩm này, hợp tác với đơn vị chuyên môn về bào chế
để tạo thành chế phẩm viên nén rồi sau đó thử hoạt tính, độc tính của chế phẩm.

3


Bộ mơn Hố hữu cơ

5.

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Kết cấu của đề tài
Kết cấu của đề tài gồm những phần sau:
- Tóm tắt đề tài.
- Đặt vấn đề
- Kết quả nghiên cứu
- Kết luận
- Tài liệu tham khảo.
Nhóm sinh viên nghiên cứu chúng em xin được gửi lời cảm ơn tới TS.
Trần Thượng Quảng đã tạo điều kiện hướng dẫn và giúp đỡ các thành viên
trong nhóm thực hiện đề tài này. Trong quá trình thực hiện chắc hẳn sẽ cịn
những sai sót. Kính mong hội đồng xét duyệt đóng góp ý kiến để nhóm nghiên
cứu của chúng em có thể hồn thiện hơn cơng trình của mình.
Chúng em xin chân thành cảm ơn!

6.

4


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

II. NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1.

Cơ sở khoa học của nghiên cứu

1.1. Tổng quan về cây dâu tằm
1.1.1 Đặc điểm
Tên Việt Nam:

Cây dâu tằm

Tên khoa học:

Mulberry, White mulberry L

Hình 1 : Lá dâu tằm
Cây dâu tằm (Mulberry hay White mulberry) thuộc họ dâu (Moraceae),
thuộc bộ Moreae, giống Morus, loài M. Alba trong tự nhiên cây dâu tằm có 16
chi, trong đó chi Morus alba L là một loại chi điển hình có nhiều hoạt tính sinh
học hữu ích. Vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học của các cây trong chi là
điều hết sức cần thiết tạo cơ sở cho các ngành y học và dược học.
Trên thế giới, lá cây dâu tằm từ lâu đã được các nhà Hoá học hợp chất
thiên nhiên quan tâm nghiên cứu bởi các đặc tính dược lí quý báu như: Chữa
bệnh tăng huyết áp, chữa bệnh tăng cholesterol trong máu dẫn đến hiện tượng
bệnh đái tháo đường rất có hiệu quả [14,17].
5


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

1.1.2 Thực vật học và thành phần hợp chất trong cây dâu tằm

1.1.2.1 Thực vật học
Cây dâu tằm thuộc cây thân gỗ, sống lâu năm, tuổi thọ khoảng 8–12 năm,
năm đầu tiên cao khoảng 1–1,5m, năm thứ hai cao khoảng 2,3–3 m, rễ ăn sâu và
rộng 2–3 m, nhưng phân bố nhiều ở tầng đất 10–30 cm và rộng theo tán cây, lá
mọc so le, hình bầu dục, chia 3 thùy, có gân nổi rõ, đầu lá nhọn hoặc hơi tù. Phía
cuống lá hơi trịn hoặc hơi bằng, mép có răng cưa to. Từ cuống lá tỏa ra 3 gân rõ
rệt. Hoa đực mọc thành bơng, có lá đài, 3 đến 4 nhị. Hoa cái cũng mọc thành
bông hay thành khối hình cầu, có 4 lá đài. Quả mọc trong các lá đài, màu đỏ, sau
đen sẫm, ăn ngon – ngọt, dùng làm thuốc hoặc ngâm rượu để uống, mùi thơm, vị
chua ngọt.
Cây dâu tằm trồng ở nhiệt độ thích hợp là 25–32°C, trên 40°C hoặc dưới
12°C bị hạn chế sinh trưởng, là cây ưa ánh sáng.
Đất trồng dâu tằm cần tơi xốp, giữ ẩm, giữ nhiệt, tầng canh tác dầy, đất
không quá chua hoặc quá mặn, mực nước ngầm thấp.
Các dinh dưỡng cần thiết như: Đạm – Lân – Kali – Canxi.
1.1.2.2 Thành phần hợp chất trong cây dâu tằm
a) Rễ cây dâu tằm
Năm 1976 – 1978 Taro Nomura đã phân lập và xác định cấu trúc của 3
dẫn xuất Flavone là morusin, cyclorusin và hợp chất trong dịch chiết benzene từ
rễ cây dâu tằm Morus alba L [18,19].

6


Bộ mơn Hố hữu cơ
OH

HO
O

Báo cáo nghiên cứu khoa học

O

OH
O

O
O

OH

O

OH

O

Cyclomorusin

Morusin
OH
O

O

O

HO

O
OH

O

OH

O

OH

Compound A

OH

O

Kuwanon A

HO
HO

OH

O

OH

O

Kuwanon C
OH

HO
HO

O

O

O

OH

OH

Albanol B

7


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

HO
HO

OH

OH
O

O

OH

OH
HO

Chalcomoracin

Năm 1989, Yoshio Hano phân lập được mulberrofuran I, mulberrofuran
S, mulberrofuran P từ Morus alba L
HO
HO

OH

O

O

OH
O

OH

OH

Mulberrofuran I
OH

HO
HO

O
OH

O

O

OH

OH

Mulberrofuran P

Năm 2003, Jiang Du và KM.Park đã phân lập được 8 flavonoids từ rễ
Morus alba L

8


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học
OH
HO

HO

O

OH O

O

OH
OH O

HO

Kuwanon S

Moralbanon
HO
O

OR

O

OH

Mulberrosid C
OH
O

OH
O

O

O
OH

O
OH O

OH O

OOH

OOH

Eudraflavone B hydroperoxit

HO

O

OH O

Oxydihyromorusin

OH
OH

Leachianon G

AcO

a -Acetyl-amyrin

9


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học
OH

OH
HO

HO

OH O
HO

OH

O

OH O

Kuwanon G

Năm 2003, Toshio Fukai đã phân lập artonin E, licoricidin, licochalcon A,
licorisoflavan A
HO
O

O

OH
OH

OH
HO

OH O

OCH3
O

Artonin E
HO

Licorisoflavan A

O

OCH3

HO

Licoricidin

H3CO

OH

O

OCH3

HO

OH

Licochalcon A

Năm 2005, Abdel Nasser B.Singab đã phân lập được neocyclomorusin,
kuwanon E

10


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

OH
O

HO
HO

O

OH

O

O
OH O

OH O

OH

Kuwanon E

Neocyclomorusin

Năm 2009, Mi Zhang, Man Chen đã phân lập được mulberrosid A và
steppogenin–4’–O–β–D–glucosid từ rễ .
HO

HO

HO
OH

O-glc

O

OR

OH O
OH

Steppogenin-4'-O -D-glucosid

Mulberrosid A

Năm 2009, Mi ZHANG, Rong–Rong WANG, Man CHEN, Han–Qing
ZHANG, đã phân lập một Flavanone Glycoside có tác dụng ức chế tế bào ung
thư từ vỏ rễ cây [16].

HO
HO
HO

HO
O

O

O

O

O
HO

OH
OH
OH

OH
OH

O

5,2'-dihydroxyflavanone-7,4'-di-O-b-D-glucoside
(steppogenin-7,4'-di-O-b-D-glucosiade)

b) Lá cây dâu tằm

11


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

OH

OH
OH

OH

O

HO

HO
O

OH

O

H2C O
O
HO
OH

OH
O
H3C

O
OH
OH

O

OHOH

OH

Rutin

Quercetin
OH

OH
HO

HO

OH

O
OH

O

O

OH

OH

O
O

OH

OH

HO

OH O

Isoquercetin

Kaemferol
OH
HO

OH

O
OH

O
OH

OH

O
O

O
Glc

O

OH

OH

HO

O
O

O Glc

O

Quercetin 3-(6-malonylglucoside)

Moracin

HO
O

OH

O

OH

OH

Acid ascorbic

ClN+
HO

S H2N

N
N

Vitamin B

12


Bộ mơn Hố hữu cơ
O

Báo cáo nghiên cứu khoa học
O

OH

HO

-

2+
O- Ca

O

O

OH O

Acid succinic

Calcium malat

OH O

HO
O

OH

N
HN

OH

NH2
N

Acid tartaric

N

Adenin
COOH

OH

HO
OH

axit gallic

a -Caroten
OH
OH
HO

O

OH
OH

Catechin

13


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

1.1.3 Những tác dụng dược lý của cây dâu tằm
Các nghiên cứu gần đây cho thấy một số hợp chất cô lập từ rễ cây dâu tằm
có nhiều hoạt tính sinh học thú vị đặc biệt là các hợp chất flavonoid.
Năm 1986, Hirakura đã cô lập được hợp chất mulberrosid C từ rễ cây dâu
tằm và đã thử nghiệm thành công hoạt tính kháng virus Herpes simplex–1 (HSV–1:
một loại virus gây viêm não) (IC50 = 75.4 µg/mL, CC50 = 250 µg/mL) [24]
Năm 1993, Linuma [25] đã cô lập được leachianon G và cũng đã thử
nghiệm thành cơng hoạt tính kháng virus HSV–1 trên tế bào in vitro, hợp chất

này có khả năng kháng khuẩn mạnh hơn mulberrosid C (IC50=1,6 µg/mL)
Các cơng trình nghiên cứu của một số tác giả Nhật Bản (1994)[21], Trung
Quốc (1996)[26] đã chứng minh polyphenol chứa trong lá dâu có nhiều tác dụng
quý và có thể ứng dụng trong sinh y học như: làm hạ glucose máu, chống oxy
hóa, hạn chế rối loạn lipid máu.
Năm 2003, K.M. Park và các cộng sự đã cô lập được hợp chất kuwanon G
từ rễ cây dâu tằm và phát hiện chúng có thể kháng lại vi khuẩn Streptococcus (vi
khuẩn gây ra nhiễm trùng) và các loại vi khuẩn Cariogenic như: S. mutans ( loại
khuẩn này chuyên bám trên bề mặt răng và tạo cao răng), S. sobrinus, S.
sanguis, Periodontal bacterium (gây viêm nướu), P. gingivalis (vi khuẩn gây
bệnh lợi)... [11]
Vi khuẩn

IC50 (Hg/mL)

Streptococcus mutans

8

Streptococcus sanguis

8

Streptococcus sobrinus

8

Porphyromonas gingivalis

8

Staphylococcus aureus

125

14


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Actinobacillus actinomycetemcomitans

1000

Candida albicans

1000

Lactobacillus acidophilus

>1000

Lactobacillus casei

>1000

Bảng 1: Hoạt tính sinh học của kuwanon G với các loại vi khuẩn
Khi dùng cloroform để chiết suất các hợp chất hữu cơ từ rễ cây dâu, các

nhà khoa học Hàn Quốc phát hiện dung dịch thu được có tác dụng bổ trợ cho
trực khuẩn Bacillus subtilis phát triển mạnh, trực khuẩn này sinh nhiều loại
kháng sinh, vitamin và đặc biệt là các loại men tiêu hóa như: proteaza,
amylaza ... có tác dụng ngừa tiêu chảy hữu hiệu. Ngoài ra, nếu dùng acid acetic
để chiết suất thì có thể kháng được vi khuẩn Staphylococcus aureus (một nhóm
vi khuẩn sống trên da tay chân con người; hầu hết vụ ngộ độc thực phẩm cấp
tính đều do Staphylococcus aureus gây ra) và Escherichia coli (vi khuẩn này là
nguyên nhân gây tiêu chảy, nhiễm trùng đường tiết niệu như viêm thận, viêm
bàng quang, nhiễm trùng huyết)[27].
Mặc dù có nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy cây dâu tằm có hoạt tính
kháng virus rất mạnh nhưng cho đến nay vẫn khơng có nhiều hợp chất được phát
hiện và cơ lập được. Chính vì vậy mà các nhà khoa học ngày nay vẫn khơng
ngừng nghiên cứu về lồi cây này để tìm ra các hợp chất mới có khả năng trị
bệnh và ứng dụng được trong y học.
1.2. Tổng quan về vật liệu hấp phụ γ–Al2O3

1.2.1.Giới thiệu về γ –Al2O3
Cấu trúc của oxyt nhôm được xây dựng từ đơn lớp của các quả cầu xếp
chặt. Lớp thứ nhất có dạng tâm đối mà ở đó mọi ion O2– được định vị ở vị trí 1.
Lớp tiếp theo được phân bố trên lớp thứ nhất, ở đó tất cả những quả cầu thứ hai
nằm ở vị trí lõm sâu của lớp thứ nhất ( vị trí 2). Lớp thứ 3 nằm trên các lỗ sâu
15


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

khác của lớp thứ nhất ( vị trí 3) hình 2.

1: vị trí 1
2: vị trí 2
3: vị trí 3
γ

Hình 2: Cấu trúc khối của –Al2O3

Hình 3: Hai lớp đầu tiên của tinh thể γ– Al2O3
Các thông số của γ–Al2O3:
 Khối lượng riêng của γ–Al2O3: 3,20 – 3,77 g/cm3;
 Hệ số khuếch tán của tinh thể γ–Al2O3: no=1,73, Ng=1,69, Np= 1,69;
 Thông số ô mạng cơ sở của γ–Al2O3 (A0):
a = 7,70 – 7,96, c = 7,82 – 7,92.
 γ–Al2O3 có diện tích bề mặt khá lớn, chứa nhiều lỗ xốp có đường kính
vào khoảng 30 ÷ 120Å.
 Thể tích lỗ xốp: 0,5 ÷ 1 cm3/g.

16


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Dạng γ–Al2O3 khơng tìm thấy trong tự nhiên, mà nó được tạo thành khi
nung Gibbsit, Bayerit, Nordstrandit và Boemit ở nhiệt độ khoảng 450÷6000C,
hay trong q trình phân hủy muối nhơm từ 900÷9500C.
Trên bề mặt của γ–Al2O3 tồn tại hai loại tâm axit, đó là tâm axit Lewis và
tâm axit Bronsted.
1.2.2.Ứng dụng làm chất hấp phụ của γ–Al2O3

Ứng dụng của các vật liệu mao quản là rất rộng trong nhiều ngành, nhiều lĩnh
vực. Nhơm oxit hoạt tính có độ phân tán cao và cấu trúc khuyết, ở dạng γ–Al2O3
do có thể tích mao quản và diện tích bề mặt lớn, nên được sử dụng làm vật liệu
hấp phụ, đặc biệt là trong cơng nghiệp dược phẩm, đặc tính hấp phụ của γ–Al2O3
dùng để tách asen, flo trong nước sinh hoạt, tách các hợp chất đa vòng, các chất
hữu cơ dễ bay hơi và nghiên cứu khả năng tách một số chất độc trong khói thuốc
lá. Nhơm oxit cịn có vai trị quan trọng trong việc làm khơ chất lỏng và khí, hấp
phụ chọn lọc trong ngành xăng dầu.
Lương
Thông số kĩ thuât/
vật liệu mang

Protein trên
chất mang
(mg/g)

Lipolytic
Phản ứng
(U/g)

Lipolytic
Phản ứng

Hiệu

(U/g)

suất

(sau phản ứng)

(%)

1.Chất hấp phụ đơn
giản
Silicagel
Polypropylene

9,3
8,1

14
333

1,5
41,1

53
61

Polyethylene

1,5

n.d.*

–

88

SiO2

15,7

95

6,1

76

Influsorial earth
2.Hấp phụ có hình

20,0

17

0,9

89

n.d.

95

–

98

thành liên kết

Polypropylene +
Glutaraldehyde

17


Bộ mơn Hố hữu cơ
Polyethylene +

Báo cáo nghiên cứu khoa học
n.d.

n.d.

–

95

Amberlite IRC–50 (H)

14,9

600

40,3

75

Amberlite IR–4B (OH)

5,3

402

75,9

55

Dowex 2X8

7,1

280

39,4

50

Colophony
4.Vật liệu hấp phụ

17,5

255

14,6

88

CaSO4.2H2O

19,5

571

29,3

91

CaCO3

19,7

529

26,9

92

Al2O3
5.Zeolite

19,7

181

9,2

96

Zeolite Mox1

6,1

12

2,0

62

Zeolite X

14,3

10

0,7

95

Zeolite UCC
6. Vật liệu bẫy

16,7

4

0,2

93

Sodium alginate

13,4

54

4,0

67

Glutaraldehyde
3.Hạt nhựa

dạng gel

Bảng 2: So sánh khả năng hấp phụ của các chất mang ảnh hưởng đến hiệu suất
phản ứng của enzim trong quá trình thủy phân dầu[28]

18


Bộ mơn Hố hữu cơ
2.

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Quy trình thực nghiệm

2.1. Tạo cao từ lá Dâu tằm bằng vật liệu γ–Al2O3

1. Phơi, sấy lá dâu tằm, nghiền để tạo bột lá.
2. Chiết 300g bột lá bằng 3 lít Etanol 30%, chia làm 2 lần bằng nhau, đánh siêu âm
bằng máy UltraSonic trong 60 phút ở 40oC, ngâm chiết trong 3 ngày, thu được
dịch chiết.
3. Hấp phụ dịch chiết lên 300g hạt γ–Al2O3 trong vòng 48h thu được hạt hấp phụ
và dịch khơng hấp phụ.
4. Rửa bằng 2 lít nước cất.
5. Nhả hấp bằng dung dịch EtOH có nồng độ giảm dần từ 90 % đến 0 % – pH=9,
chia làm hai phân đoạn. Phân đoạn thứ nhất gồm tồn bộ dịch nhả hấp bằng
EtOH có nồng độ 90–60%, phân đoạn hai từ 50%–0% EtOH.
6. Cất loại dung môi trong dịch nhả hấp thu được cao Dâu tằm.

19


Chiết với 3 lít Etanol 30%, chia làm 2 lần, đánh siêu âm bằng máy UltraSonic trong 60 p

Bộ môn Hoá hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Cao DT KHP

Hấp phụ lên cột chứa hạt γ-Al2O3
Dịch nhả hấp phụ EtOH 30
Hạt γ-Al2O3 đã hấp phụ chất
Cất loại dung môi

Dịch chiết
Cao DT30

Sơ đồ 1: Quy trình tạo cao Dâu tằm

Bột lá Dâu tằm

Dịch không hấp phụ

20


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

2.2. Thử hoạt tính cao DT
2.2.1. Hoạt tính hạ đường huyết
 Vật liệu – Hố chất
• Hoạt chất nghiên cứu

Rửa nước cất
Nhả hấp bằng Ethanol có nồn

Phân đoạn: DT EtOH 30, DT KHP
• Hóa chất: Alloxan monohydrate (Sigma Aldrich).
• Động vật: chuột thuần chủng dịng
mạnh,90
khơng mắc bệnh, có
Dịch BALB/c
nhả hấp khoẻ
phụ EtOH

khối lượng từ 22– 26g, không phân biệt giống, được nuôi tại khu nuôi động vật
của Viện Công nghệ sinh học. Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nước
uống tự do.
• Dụng cụ thí nghiệm: kim cong đầu tù dùng
uống, kim tiêm và các thiết bị phụ
Caođể
DT90
trợ khác.
• Thiết bị xác định nồng độ glucose: Nồng độ glucose trong huyết thanh chuột được định lượng bằng phương pháp so màu, thực hiện trên máy định lượng sinh
hoá bán tự động AU680 của hãng Beckman Coulter.
 Phương pháp
• Phương pháp pha mẫu thử
Động vật cho uống 0,2 ml mẫu /con/ngày. Và chất đối chứng uống nước
cất 0,2 ml/con/ngày.
• Phương pháp gây tăng đường huyết bằng Alloxan monohydrate
o

Chuẩn bị chuột thí nghiệm: Lấy máu định lượng glucose trong huyết
thanh (Chuột được nhịn đói hồn tồn trước đó 12 giờ), loại bỏ những con chuột
có glucose huyết ban đầu quá cao hoặc q thấp
o Q trình thí nghiệm:

-

Gây tăng đường huyết cho chuột bằng cách tiêm dung dịch Alloxan
monohydrate ở nồng độ 180 mg/kgP/1 lần duy nhất, tiêm dưới da bụng (Chuột

21

Cất loại du

Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

được nhịn đói hồn tồn trước đó 12 giờ theo phương pháp của Yanarday và
Colak, 1998)
-

Sau 72 giờ tiêm Alloxan monohydrate, lấy máu định lượng glucose trong
huyết thanh (chuột được nhịn đói hồn tồn trước đó 12 giờ), những con chuột
có glucose huyết lớn hơn hoặc bằng 8 mmol/L thì được coi là mắc bệnh tiểu
đường (N.A.Rahman et al, 2011).
• Phương pháp kiểm tra hoạt tính hạ glucose huyết của các chất chiết
Sau khi gây tăng đường huyết cho chuột bằng cách tiêm dung dịch
Alloxan monohydrate ở nồng độ 180 mg/kgP/1 lần duy nhất, tiêm dưới da bụng
(Chuột được nhịn đói hồn tồn trước đó 12 giờ) theo phương pháp của
Yanarday và Colak, 1998)
Ngày 0: Những con chuột có nồng độ glucose trong huyết thanh lớn hơn
hoặc bằng 8 mmol/L được chọn để nghiên cứu hoạt tính hạ glucose huyết của
các mẫu chiết bằng phương pháp uống qua kim uống đặc biệt. 20 con chuột thí
nghiệm (được lựa chọn trong tổng số 25 con chuột được tiêm Alloxan
monohydrate) được chia thành 4 lơ thí nghiệm sao cho các lơ có trị số glucose
huyết trung bình ban đầu tương đương nhau (5 con/lơ).
• Lơ 1: Chứng bệnh lí, uống dung mơi nước hịa tan mẫu (0,2 ml/con/ngày)
• Lơ 2: Thuốc thử phân đoạn DT 30 ở nồng độ 500 mg/kgP/ngày
• Lơ 3: Thuốc thử phân đoạn DT KHP ở nồng độ 400 mg/kgP/ngày
• Lơ 4: Thuốc thử phân đoạn DT 90 ở nồng độ 500 mg/kgP/ngày
Ngày 9: Cho chuột uống mẫu thử hoặc nước trong 9 ngày, mỗi ngày cho chuột

uống 1 lần vào buổi sáng. Ngày thứ 9, sau 1 giờ uống thuốc lần cuối cùng, lấy
máu chuột để định lượng glucose huyết (chuột đã được nhịn đói 12 giờ trước).
• Phương pháp xử lí số liệu

22


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Số liều được xử lí trên Excell. Tính mức độ giảm glucose huyết của từng
lô sau khi được thử mẫu với lô đối chứng. So sánh mức độ giảm giữa các lô thử
và lô đối chứng theo phương pháp thống kê sinh học qua phần mềm Prism 4.0.
 Kết quả
• Khối lượng của chuột trước và sau khi thí nghiệm
Khi bị bệnh tiểu đường thì khối lượng của cơ thể sẽ bị sụt giảm do rối
loạn chuyển hóa cacbohydrat khi hormone insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác
động trong cơ thể. Do vậy, kiểm tra khối lượng cơ thể trước và sau q trình thí
nghiệm sẽ phần nào đánh giá được tình trạng bệnh. Kết quả kiểm tra khối lượng
động vật thí nghiệm được trình bày ở bảng 1.

Lơ

Chất nghiên cứu

Khối lượng chuột

Khối lượng chuột

trước khi thí

sau khi thí nghiệm

nghiệm (g/con)

(g/con)

1

H2O (ĐC)

28.06 ± 2.13

27.95 ± 2.10

2

DT 30

28.22 ± 3.15

28.03 ± 2.34

3

DT KHP

28.67 ± 0.58

27.67 ± 1.75

4

DT 90

28.89 ± 3.54

27.85 ± 3.0

Bảng 3. Khối lượng của chuột trước khi và sau khi thí nghiệm
Các kết quả trên chưa cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Do vậy,
kết quả kiểm tra sự sụt giảm khối lượng là không rõ ràng. Kết quả này có thể do
thời gian thực hiện thí nghiệm ngắn (9 ngày) nên khơng cho thấy sự sụt giảm
khối lượng ở chuột thí nghiệm.
• Nồng độ glucose trong máu chuột thí nghiệm

23


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

Để kiểm tra tình trạng mắc bệnh tiểu đường thì việc lấy máu xác định
nồng độ glucose trong huyết thanh là cần thiết và rất quan trọng. Bởi vì, khi
kiểm tra mức độ glucose trong huyết thanh sẽ cho biết tình trạng bệnh ở mức độ
nào, cũng như khả năng phục hồi của người bệnh sau khi được điều trị bằng
những hoạt chất có tác dụng hạ đường huyết và có tiềm năng sử dụng để chữa trị
đái tháo đường. Đồng thời từ đó đưa ra những giải pháp phù hợp để kiểm sốt

cũng như phịng ngừa sớm bệnh. Kết quả kiểm tra nồng độ glucose trong huyết
thanh được trình bày ở bảng 2.

Lô

1
2
3
4

Chất nghiên cứu

Nước cất (ĐC)
DT 30
DT KHP
DT 90

% Glucose

% Glucose

giảm so với

giảm so với

ngày 0

đối chứng

14.25

31.74
25.78
4.82

0
17.49
10.84
0

Bảng 4. Nồng độ glucose trong máu chuột trước và sau khi được sử dụng
các chất chiết
Kết quả bảng 2 cho thấy: Sau khi gây bệnh tiểu đường bằng Alloxan và
sau 9 ngày sử dụng chất chiết DT 30, DT KHP cũng như khơng sử dụng ĐC
H2O thì nồng độ glucose huyết thanh đều giảm so với lúc chưa sử dụng chất
chiết. DT90 không gây giảm nồng độ Glucose huyết.
Nồng độ glucose huyết thanh trong các mẫu thử giảm 31.74%, 25.78%,
một cách tương ứng so với lúc chưa sử dụng chất chiết. Trong khi đó, ĐC nước
cũng giảm 14.25% một cách tương ứng. Điều này cho thấy hiệu quả gây đường
huyết cao cấp tính của Alloxan monohydrate đã bị suy giảm phần nào. Tuy

24


Bộ mơn Hố hữu cơ

Báo cáo nghiên cứu khoa học

nhiên, DT EtOH 30, DT KHP so với đối chứng vẫn giảm 17.49%, 10.84% một
cách tương ứng.
2.5.1. Hoạt tính ức chế α –amylase và α –glucosidase

 Phương pháp
o Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế α–amylase :
– Hố chất, thiết bị: DMSO (Merck), đệm Photphat pH 7,0, α–glucosidase
(G0660,

Sigma–Aldrich),

p–nitrophenyl–α–D–glucopyranoside

(Sigma–

Aldrich), acarbose (Sigma–Aldrich). Máy đọc phiến vi lượng Mark
Microplate Absorbance Spectrophotometer.
– Hoạt tính ức chế α–glucosidase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân
p–nitrophenyl–α–D–glucopyranoside (pNPG) dưới xúc tác α–glucosidase trong
sự có mặt/khơng có hoạt chất nghiên cứu. Cụ thể, tra 2 μL mẫu (pha trong
DMSO ở các nồng độ phù hợp) cùng với 40 μL enzym α–glucosidase (0,5
U/mL) vào phiến 96 giếng có chứa sẵn 120 μL đệm Photphat rồi ủ trong 5 phút.
Sau đó bổ sung 40 μL pNPG (5 mM pha trong đệm phốt–phát) rồi tiếp tục ủ hỗn
hợp trong 30 phút ở 37°C. Hoạt động của enzym được định lượng bằng cách đo
độ hấp thụ của sản phẩm p–nitrophenol ở bước sóng dài 405 nm. Acarbose được
sử dụng làm đối chứng dương.
o Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế α–amylase :
– Hoá chất, thiết bị: DMSO, đệm phốt phát pH 7,0, α–amylase (A3176, Sigma–
Aldrich), p–nitrophenyl–α–D–maltohexaoside (Sigma–Aldrich), Máy đọc phiến
vi lượng xMark Microplate Absorbance Spectrophotometer.
– Hoạt tính ức chế α–amylase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân p–
nitrophenyl–α–D–maltohexaoside (pNPM) dưới xúc tác α–amylase trong sự có
mặt/khơng có hoạt chất nghiên cứu. Cụ thể, tra 2 μL mẫu (pha trong DMSO ở
các nồng độ phù hợp) cùng với 45 μL enzym α–amylase (10 U/mL) vào phiến

96 giếng có chứa sẵn 110 μL đệm Photphat rồi ủ trong 5 phút. Sau đó bổ sung
25