Nghiên cứu khả năng sinh acid lactic của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ dưa muối

MỤC LỤC


Trang
Trang phụ bìa
Trang chấp nhận của Hội Đồng ............................................................................ i
Lời cảm tạ ............................................................................................................. ii
Tóm tắt
................................................................................................................................ ii
i
Trang cam kết
................................................................................................................................ i
v
Mục lục .................................................................................................................. v
Dang sách bảng
................................................................................................................................ v
ii
Danh sách hình
................................................................................................................................ v
iii
Danh sách từ viết tắt và từ thay thế
................................................................................................................................ i
x

CHƢƠNG 1 – GIỚI THIỆU
1.1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 1
1.3. . Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 2
1.4. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 2
1.5. Những đóng góp của đề tài ............................................................................. 2

CHƢƠNG 2 – TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
2.1. Vi khuẩn lactic ................................................................................................ 3
2.1.1. Giới thiệu đặc điểm hình thái ....................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa ......................................................................... 3

v


2.1.3. Vai trò của vi khuẩn lactic ........................................................................... 4
2.2. Acid lactic ....................................................................................................... 4
2.3. Quá trình lên men lactic .................................................................................. 5
2.4. Dưa muối là sản phẩm lên men lactic truyền thống Việt Nam ....................... 5
2.4.1. Quy trình sản xuất theo phương pháp truyền thống .................................... 6
2.4.2. Ưu điểm và nhược điểm phương pháp truyền thống ................................... 7

CHƢƠNG 3 – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Hóa chất, thiết bị và vật liệu nghiên cứu ......................................................... 8
3.1.1. Thiết bị và dụng cụ....................................................................................... 8
3.1.2. Môi trường VL ............................................................................................. 8
3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 8
3.2.1. Phương pháp thu mẫu .................................................................................. 8
3.2.2. Phương pháp phân lập .................................................................................. 9
3.2.3. Phương pháp bảo quản
................................................................................................................................ 1
0
3.2.4. Phương pháp định tính, định lượng acid lactic
................................................................................................................................ 1
1
3.2.5. Phương pháp định danh vi khuẩn lactic
................................................................................................................................ 1

2
3.2.6. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
quá trình lên men lactic
14
3.2.7. Phương pháp sử dụng phần mềm thống kê để xử lý số liệu
15

CHƢƠNG 4 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic
................................................................................................................................ 1
6

vi


4.2. Đặc điểm sinh học của hai chủng lactic
................................................................................................................................ 2
1
4.2.1. Đặc điểm hình thái
................................................................................................................................ 2
1
4.2.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
................................................................................................................................ 2
3
4.3. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh acid lactic
của 2 chủng vi khuẩn lactic
................................................................................................................................ 2
5
4.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh acid lactic
................................................................................................................................ 2

5
4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh acid lactic
................................................................................................................................ 2
6
4.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh acid lactic
................................................................................................................................ 2
7
4.3.4. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh acid lactic
................................................................................................................................ 2
8

CHƢƠNG 5 – KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
5.1. Kết luận
................................................................................................................................ 3
1
5.2. Khuyến nghị
................................................................................................................................ 3
1

vii


5.3. Hạn chế
................................................................................................................................ 3
1

TÀI LIỆU THAM KHẢO
................................................................................................................................ 3
2

PHỤ LỤC
................................................................................................................................ 3
3

viii


DANH SÁCH BẢNG


Trang
Bảng 1 – Khuẩn lạc và hình thái 12 chủng vi khuẩn phân lập
................................................................................................................................ 1
6
Bảng 2 – Kết quả định lượng của 12 chủng vi khuẩn lactic
................................................................................................................................ 1
9
Bảng 3 – Kết quả định lượng của 4 chủng vi khuẩn lactic
................................................................................................................................ 2
0
Bảng 4 – Một số đặc điểm sinh lý – sinh hóa của 2 chủng L1 và L2
................................................................................................................................ 2
3
Bảng 5 – Kết quả định danh sơ bộ của 2 chủng L1 và L2
................................................................................................................................ 2
5
Bảng 6 – Kết quả khảo sát nhiệt độ
................................................................................................................................ 2
5
Bảng 7 – Kết quả khảo sát độ mặn

................................................................................................................................ 2
6
Bảng 8 – Kết quả khảo sát pH
................................................................................................................................ 2
7
Bảng 9 – Kết quả khảo sát thời gian
................................................................................................................................ 2
9
Bảng 10 – Kết quả khảo sát các yếu ảnh hưởng của 2 chủng L1 và L2
................................................................................................................................ 3
1
Bảng 11 – Kết quả phân tích thống kê Descriptives và ANOVA
theo
nồng
độ
NaCl
của
chủng
L1
................................................................................................................................ 3
5
ix


Bảng 12 – Kết quả phân tích thống kê Descriptives và ANOVA
theo
nhiệt
độ
của
chủng

L1
................................................................................................................................ 3
6
Bảng 13 – Kết quả phân tích thống kê Descriptives và ANOVA
theo
pH
của
chủng
L1
................................................................................................................................ 3
7
Bảng 14 – Kết quả phân tích thống kê Descriptives và ANOVA
theo
thời
gian
của
chủng
L1
................................................................................................................................ 3
9
Bảng 15 – Kết quả phân tích thống kê Descriptives và ANOVA
theo
NaCl
của
chủng
L2
................................................................................................................................ 4
0
Bảng 16 – Kết quả phân tích thống kê Descriptives và ANOVA
theo

nhiệt
độ
của
chủng
L2
................................................................................................................................ 4
1
Bảng 17 – Kết quả phân tích thống kê Descriptives và ANOVA
theo
pH
của
chủng
L2
................................................................................................................................ 4
3
Bảng 18 – Kết quả phân tích thống kê Descriptives và ANOVA
theo
thời
gian
của
chủng
L2
................................................................................................................................ 4
4

DANH SÁCH HÌNH


Trang
Hình

1

–

Kết

quả

định

tính

của

12

chủng

vi

khuẩn

lactic

................................................................................................................................ 1
9

x

Hình 2 – Hàm lượng acid lactic của 12 chủng vi khuẩn lactic
................................................................................................................................ 2
0
Hình 3

–

Hàm

lượng acid

lactic của

4 chủng vi

khuẩn

lactic

................................................................................................................................ 2
1
Hình

–

4

Khuẩn

lạc

của

chủng

L1

................................................................................................................................ 2
1
Hình

5

–

Tế

bào

của

chủng

L1

dưới

kính

hiển

vi

40X

................................................................................................................................ 2
2
Hình

–

6

Khuẩn

lạc

của

chủng

L2

................................................................................................................................ 2
2
Hình

7

–

Tế

bào

của

chủng

L2

dưới

kính

hiển

vi

40X

................................................................................................................................ 2
3
Hình

8

–

Khả

năng

sinh

khí

của

2

chủng

L1

và

L2

................................................................................................................................ 2
5
Hình 9 – Hàm lượng acid lactic sinh ra theo các nhiệt độ
của
2
chủng
L1
và
L2
................................................................................................................................ 2

6
Hình 10 – Hàm lượng acid lactic sinh ra theo các pH
của
2
chủng
L1
và
L2
................................................................................................................................ 2
7
Hình 11 – Hàm lượng acid lactic sinh ra theo các NaCl
của
2
chủng
L1
và
L2
................................................................................................................................ 2
8
Hình 12 – Hàm lượng acid lactic sinh ra theo các thời gian
xi


của
2
chủng
L1
và
L2
................................................................................................................................ 2

9
Hình 13 – Khuẩn lạc của 20 mẫu vi khuẩn phân lập lần đầu
................................................................................................................................ 3
3
Hình 14 – Dịch lên men và khuẩn lạc chủng L1 trong môi trường VL lỏng
................................................................................................................................ 3
3
Hình 15 – Kết quả định lượng acid lactic bằng phương pháp chuẩn độ
................................................................................................................................ 3
4

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT VÀ TỪ THAY THẾ


Vi khuẩn lactic

LAB

Vi sinh vật

VSV

Lame

Phiến kính

Lamel

Lamen, lá kính

Oxy

O2

Độ mặn

Nồng độ NaCl

Glycolysise

Đường phân

xii


CHƢƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường
xuyên và trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân khác
nhau có thể gây ra ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp là có
nguồn gốc từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự có mặt
của độc tố tiết ra bởi các vi sinh vật này trong nước uống, thực phẩm.
(Trần Linh Thước, 2012)
Nguồn gốc của quá trình bảo quản rau quả bằng phương pháp lên men có
từ thời cổ đại. Trên thế giới, hầu hết rau quả được lên men với qui mô nhỏ, hiện
nay có một số mặt hàng sản xuất như dưa chuột muối chua, bắp cải muối chua…
có ý nghĩa thương mại quan trọng.
Việc nghiên cứu vi sinh vật trong quá trình lên men rau quả sớm bắt đầu
vào những năm đầu 1990. Nhiều công trình nghiên cứu vẫn có giá trị đến ngày

nay, nhưng có nhiều thay đổi trong quá trình lên men rau quả với qui mô thương
mại.
Sử dụng các vi khuẩn lactic làm chất bảo quản thức ăn tự nhiên với mục
đích làm tăng độ an toàn và bảo đảm được chất lượng thực phẩm. Việc tăng hàm
lượng acid lactic trong sản phẩm thức ăn bảo quản có tác dụng chống lại sự hoạt
động của các vi sinh vật gây hư hỏng. Vấn đề này được quan tâm đã được loại bỏ
việc sử dụng những chất bảo quản nhân tạo mà thường xuyên gây nên nhiều mối
lo ngại từ phía người tiêu dùng.
Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn được sử dụng cho lên men, dùng vi khuẩn
lactic cho lên men thu acid lactic có độ tinh khiết cao (trên 90%). Acid này sau
đó được dùng vào nhiều ngành, nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực
phẩm, công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt, công nghiệp chất dẻo, y dược và cả
trong nông nghiệp.
Qua đó, việc nghiên cứu một số chủng vi khuẩn lactic là cần thiết. Đề tài
được thực hiện nhằm tìm ra chủng vi khuẩn lactic thuần đồng thời cũng tìm ra
điều kiện môi trường thích hợp để vi khuẩn lactic sinh trưởng tối ưu có khả năng
sinh acid lactic cao. Đó là cơ sở để chế biến dưa muối có thể rút ngắn được thời
gian chế biến và an toàn vệ sinh. Cũng là lí do lựa chọn đề tài “Nghiên cứu khả
năng sinh acid lactic của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ dƣa
muối”.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Phân lập và tuyển chọn 2 chủng vi khuẩn lactic thuần và tìm điều kiện môi
trường tối ưu để vi khuẩn sinh acid lactic cao.

1


1.3. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Một số chủng vi khuẩn lactic có trong dưa muối.
1.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 Phân lập, tuyển chọn 2 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh acid lactic cao.
 Nghiên cứu đặc điểm sinh thái, sinh lí, sinh hóa và định danh 2 chủng đã chọn.
 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh acid lactic của 2 chủng tuyển
chọn.
1.5. NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI
 Đóng góp về mặt khoa học: Đóng góp vào bảo tàng giống vi sinh vật lên men
lactic có khả năng ứng dụng cao trong thực tiễn.
 Đóng góp công tác đào tạo: Bổ sung vào đặc điểm sinh lí, hình thái của vi
khuẩn lactic cho sinh viên tìm hiểu, học tập và nghiên cứu sâu hơn về vi khuẩn
lactic.
 Đóng góp phát triển kinh tế xã hội: Tạo môi trường nuôi cấy thuận lợi để các vi
khuẩn lên men lactic hoạt động tốt nhất nhằm rút ngắn thời gian chế biến, đảm
bảo về dinh dưỡng và vệ sinh an toàn. Khắc phục được những thiếu sót trong quá
trình chế biến dưa muối.

2


CHƢƠNG 2
TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
2.1. VI KHUẨN LACTIC (LAB)
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn lên men hidrat cacbon khi có hoặc
không có oxy và tạo nên sản phẩm chính cuối cùng là acid lactic. LAB chịu đựng
cao với điều kiện acid, tham gia tạo thành sữa chua, phomat, dưa muối và thức ăn
ủ chăn nuôi, là nguyên nhân làm hư hại thực phẩm và một số tác nhân gây bệnh
nhiễm khuẩn ở vùng mũi họng. LAB được chia thành hai nhóm: nhóm lên men
lactic đồng hình (sản phẩm lên men chỉ thuần acid lactic) và nhóm lên men lactic
dị hình (sản phẩm lên men ngoài acid lactic còn có enol, CO2 hoặc acid acetic).
2.1.1. Giới thiệu đặc điểm hình thái
LAB đồng hình gồm 3 nhóm: cầu khuẩn (Streptococcus lactic, S.faecalis,

Pediococcus cerevisia), trực khuẩn ưa nhiệt (Lactobacillus lactic, L.helvetcus,
L.bulgaricus), trực khuẩn ưa ấm (Lactobcillus casei, L.planrum)
LAB thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên
men đường để tạo acid lactic. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ
Lactobacteriaccae và được xếp vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc và Bifidobacterium Aerococcus. Ngoài ra chúng còn
có các chi khác như Carnobacterium, Aerococcus, Enterococcus, Vagococcus,
Oenococcus, Tetragenococcus và Weissella. LAB có rất nhiều hình dạng khác
nhau: dạng trực khuẩn ngắn hoặc dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi, hình
cầu hoặc cầu trực khuẩn ở dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành chuỗi. Khuẩn lạc
của LAB tròn nhỏ, trong bóng, có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng
kem hoặc khuẩn lạc có kích thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc
tỏa ra mùi chua của acid. (Nguyễn Thị Bích Thùy, 2009). Tất cả vi khuẩn lactic
đều không chuyển động, Gram dương, hô hấp yếm khí tùy nghi. Đường kính của
các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5
. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp
hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước trực khuẩn lactic từ 1 – 8
. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi.
2.1.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
LAB có thể lên men được các đường monosaccharid, đường disaccharid,
protein n, peptone và acid. Phần lớn chúng không lên men được tinh bột và các
polisaccharid khác. Theo khóa phân loại của Bergey (1974) giới thiệu về các
giống của LAB, thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic:
Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc và Aerococcus. Trong 5
giống thuộc vi khuẩn lactic thì có 4 giống được mô tả và nghiên cứu nhiều nhất
đó là: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc đây là những trực
khuẩn hoặc cầu khuẩn không tạo bào tử.

3

Các loài LAB có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong
môi trường và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau. Đa số các trực
khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn liên cầu khuẩn. Các trực
khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8 – 4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở
môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5,5 – 6.
Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25 – 35 0C, ưa nhiệt là
40 – 45 0C và ưa lạnh là thấp hơn 5 0C. Khi tăng nhiệt độ khoảng 60 – 80 0C thì
hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Một số loài có khả năng đối kháng với thể
hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm. Như vậy,
ngoài khả năng tạo thành acid lactic các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt
tính kháng sinh, những chất kháng sinh này không dùng trong y học mà chỉ được
dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan.
(Lương Đức Phẩm, 2005)
2.1.3. Vai trò của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua
rau quả, làm yaourt, cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính
khác của vi khuẩn lactic đã được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra
bacteriocin (chất kháng khuẩn) như laccin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin,
plancin có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển
của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubemet et al., 2002)
Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong
không khí nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại
rau, quả, sữa, thịt). (Nguyễn Lân Dũng, 2010)
2.2. ACID LACTIC
Acid lactic là một hợp chất hữu cơ sinh học, nó được sản sinh từ quá trình
oxy hóa glucose yếm khí hay còn gọi là quá trình đường phân (glycolysise).
Acid lactic đã được cô lập đầu tiên vào năm 1780 bởi một nhà hóa học
Thụy Điển Carl Wilhelm Scheele.






Tên hóa học: 2 - hydroxypropanoic acid
Công thức thô: C3H6O3
Công thức hóa học: CH3-CHOH-COOH
Công thức hình:

 Trọng lượng phân tử: 90.08 g/mol
 Điểm nóng chảy:
4


 L : 53 0C
 D : 53 0C
 D/L : 53 0C
 Điểm sôi: 122 0C.
 Đơn vị tính: Hàm lượng acid lactic có trong huyết tương được tính bằng đơn vị
(mg%; mg/100mL).
Acid lactic được ứng dụng rộng rãi trong muối dưa rau, củ, ủ chua các
thức ăn cho gia súc để tận dụng tối đa nguồn thức ăn phong phú mà chưa sử
dụng. Ngoài ra, acid lactic còn được ứng dụng đa dạng vào các ngành công
nghiệp thuộc da như là gia vị, giữ hương vị cho sản phẩm, chất nhũ hóa, chất hóa
dẻo, chất điện hoạt, các este của acid lactic cũng được dùng làm chất giữ hương
vị cho thực phẩm.
2.3. QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic và các sản
phẩm khác. Tùy thuộc vào các sản phẩm tạo thành mà các quá trình lên men
lactic được chia làm hai loại: lên men đồng hình và lên men dị hình.

Trong quá trình lên men đồng hình, sản phẩm chính là acid latic. Ngoài ra
còn có một lượng nhỏ acid bay hơi, rượu ethanol và các sản phẩm khác.
Ở quá trình lên men dị hình, acid lactic không phải là sản phẩm chủ yếu mà
còn có nhiều sản phẩm khác như acid acetic, ethanol, CO2, H2 cũng được tạo
thành với lượng đáng kể.
Các vi sinh vật tham gia vào quá trình này là các vi khuẩn thuộc các giống:
Streptoccocus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc,…
Trong công nghiệp thực phẩm, việc sử dụng quá trình lên men lactic để chế
biến các sản phẩm rau, quả, thịt, cá, sữa không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà
còn nhằm đưa ra thị trường các loại sản phẩm có tính chất và hương vị mong
muốn. Đây là một trong những phương pháp bảo quản thực phẩm phổ biến nhất
trên thế giới hiện nay. Trong một số trường hợp quá trình lên men thực phẩm
được thực hiện bằng cách lợi dụng các vi sinh vật tự nhiên có sẵn trong nguyên
liệu. Trong một số trường hợp khác người bổ sung các chủng vi sinh vật thuần
khiết để điều khiển quá trình lên men.
(Lương Đức Phẩm, 2005)
2.4. DƢA MUỐI LÀ SẢN PHẨM LÊN MEN LACTIC TRUYỀN THỐNG
VIỆT NAM
Từ xưa con người đã biết ứng dụng vi khuẩn lactic vào sản xuất và chế
biến các sản phẩm lên men trong đó có dưa muối là món ăn không thể thiếu trong
ngày tết cổ truyền, ăn kèm với món thịt kho trứng vịt để hương vị đậm đà mang
theo cả không khí tết. Bên cạnh đó, dưa muối còn mang giá trị dinh dưỡng cao có
lợi cho đường tiêu hóa với hệ lợi khuẩn phát triển.
5


2.4.1. Quy trình sản xuất theo phƣơng pháp truyền thống
Muối dưa là quá trình lên men lactic do vi khuẩn lactic. Các vi khuẩn này
phát triển mạnh ở khoảng nhiệt độ 34 – 40 0C. Khoảng nhiệt độ thích hợp cho
muối dưa là 20 – 22 0C.

Trong rau dưa thường có sẵn các vi khuẩn lactic và những tạp khuẩn gây
hỏng quá trình muối chua (vi khuẩn acetic, butyric, vi khuẩn hoại sinh và nấm
mốc) Vì vậy, trong việc này cần tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát
triển và đến khi đã tích tụ được acid lactic trong nước dưa sẽ ức chế các vi khuẩn
khác.
Quá trình lên men lactic trong dưa muối có thể chia thành ba giai đoạn:
Giai đoạn đầu vi khuẩn lactic phát triển cùng với tạp khuẩn
Muối dùng trong muối dưa vào khoảng từ 3 – 4%. Ở nồng độ chưa đủ diệt
các vi khuẩn hoại sinh. Nếu nồng độ muối cao hơn thì có thể ức chế tạp khuẩn
phát triển và cũng kìm hãm vi khuẩn lactic sinh trưởng. Muối ở đây có tác dụng
nâng cao áp suất thẩm thấu trong nước dưa giúp cho quá trình teo nguyên sinh ở
tế bào thực vật, làm cho dịch tế bào tiết ra ngoài, trong dịch này có các chất
đường, tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển. Nồng độ muối 8 – 10% giúp cho
quá trình teo nguyên sinh và tiết dịch tế bào trong rau quả được tốt nhất nhưng
cũng ức chế nhiều vi khuẩn phát triển, trong đó có vi khuẩn lactic. Để cho sự
thẩm thấu dịch tế bào rau ra nước muối được tốt cần phải nén chặt rau. Trong giai
đoạn này acid lactic dần dần được tích tụ và ức chế các vi khuẩn hoại sinh.
Giai đoạn thứ hai – lên men chính, chỉ có các vi khuẩn lactic phát triển và
acid lactic tích tụ đến mức xác định. Hàm lượng acid lactic trong nước dưa chua
thường vào khoảng 0,8 – 2%. Mùi vị dưa tốt nhất khi hàm lượng acid 0,8 – 1,2%.
Giai đoạn thứ ba : các vi khuẩn lactic bắt đầu bị ức chế bởi chính acid
lactic. Các vi khuẩn này không tạo thành acid nữa. Nếu trên bề mặt nước dưa
thấy có váng nghĩa là các nấm mốc, nấm men phát triển. Các vi sinh vật này ăn
acid lactic làm cho độ acid trong nước dưa giảm, tạo điều kiện cho các vi khuẩn
hoại sinh phát triển gây hư hỏng dưa. Trong sản xuất dưa theo phương pháp công
nghiệp cần kết thúc ở trước hoặc ở lúc acid đạt cực đại và cho đi bảo quản hoặc
đóng hộp trong các chai miệng rộng.
Thời gian muối dưa ở nhiệt độ 20 0C khoảng 10 – 12 ngày. Lên men lactic
bị ngừng khi acid tích tụ tới 1,4 – 2%. Trong quá trình lên men trên bề mặt nước
dưa xuất hiện bọt khí CO2 ở các bọt này chứa nhiều vi khuẩn gây hại, vì vậy cần

phải vớt bọt này bằng vợt vải sạch.
Đôi khi dưa muối bị thâm do tiếp xúc với oxy không khí trong trường hợp
nước dưa không đủ ngập rau. Hiện tượng dưa thâm còn do sự phát triển của các
tạp khuẩn, đặc biệt là trong trường hợp lên men ở nhiệt độ cao (trên 30 0C) hoặc

6


khi muối phân bố không đều đặn hoặc nồng độ muối quá cao làm cho vi khuẩn
lactic bị ức chế mà các vi khuẩn khác phát triển.
Những nấm dại phát triển làm giảm độ acid của nước dưa và làm cho dưa
có vị khác. Ngoài ra dưa muối thỉnh thoảng bị nhớt do các chủng sinh nhầy của vi
khuẩn lactic phát triển. Hiện tượng này hay gặp khi lên men ở nhiệt độ cao.
(Lương Đức Phẩm, 2005)
2.4.2. Ƣu điểm và nhƣợc điểm phƣơng pháp truyền thống
Quá trình chế biến dưa muối theo phương pháp lên men truyền thống
không thể đem lại chất lượng ổn định mong muốn cho sản phẩm, trong quá trình
lên men còn phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện môi trường bên ngoài do đó
phương pháp truyền thống vẫn còn những nhược điểm xen với ưu điểm mà
phương pháp công nghiệp có thể khắc phục.
Ƣu điểm





Không cần phải cấy giống vi sinh vật vào.
Các thao tác thực hiện đơn giản, tốn ít thời gian.
Phương pháp truyền thống lên men tự nhiên nên tạo ra hương vị đặc biệt.
Giá thành sản phẩm thấp.

Nhƣợc điểm
 Thời gian lên men lactic dài.
 Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm chính của quá trình lên men là
acid lactic còn có các sản phẩm khác như rượu etylic . . .
 Quá trình lên men phụ thuộc vào nhiệt độ.

7


CHƢƠNG 3
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. HÓA CHÁT, THIẾT BỊ VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.1.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
 Hóa chất:
 Các hóa chất có nguồn gốc từ Việt Nam: agar, nước cất, cồn,
 Các hóa chất có nguồn gốc từ Trung Quốc: MnSO4, Lactose, Saccarose, NaCl,
Mantose, Glucose, Peptone, Cao nấm men, MgSO4.7H2O, Phenolphtalin, HCl,
Lugol, Gaitrain Violet, H2O2, Vaselin, Fuchsin.
 Các hóa chất có nguồn gốc từ Merck: Fructose.
 Các thiết bị: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, tủ ấm, kính hiển vi, tủ lạnh, cân phân tích
điện tử, máy chụp ảnh kỹ thuật số, bếp điện,…
 Các dụng cụ thí nghiệm: bình tam giác 250 mL, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn,
diêm quẹt, que cấy, giấy pH, giấy lọc, giấy báo cũ, lame, lamel, bông mỡ, phễu,
bình tam giác 50 mL, pipet, cốc 100 mL, cốc 250 mL, cốc 500 mL, đũa thủy tinh,
ống đông 50 mL, giá để ống nghiệm, kẹp ống nghiệm.
3.1.2. Môi trƣờng VL
Hóa chất

Số lƣợng

Peptone

10 g

Cao thịt

2

g

Cao nấm men

5

g

Glucose

20 g

NaCl

5

Agar

10 g

Nƣớc cất

1

L

Dung dịch A

5

mL

Ghi chú

g

MnSO4

0,8

g

MgSO4.7H2O

5,125 g

Nước cất

25

mL

(Nguyễn Lân Dũng, 1978)
3.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Phƣơng pháp thu mẫu
 Mẫu dưa muối được mua ở chợ Mỹ Xuyên và lấy trực tiếp nước dưa lên men
để phân lập.
 Tiến hành thu mẫu 3 lần, mỗi lần 5 mẫu, lấy ngẫu nhiên. Tổng mẫu thu được là
15 mẫu.
8


3.2.2. Phƣơng pháp phân lập chủng vi khuẩn lactic
Mục đích
 Tách các khuẩn lạc rời rạc và để tạo thuận lợi cho giống thuần phát triển trên
môi trường nuôi cấy.
 Nhằm tạo ra các giống thuần.
 Duy trì giống thuần phân lập.
Cách thƣc hiện
 Pha loãng mẫu
 Chuẩn bị một số ống nghiệm chứa 9 mL nước cất vô trùng.
 Hút 1 mL mẫu nước dưa cho vào ống nghiệm có chứa 9 mL nước cất vô trùng.
 Lắc đều dung dịch được độ pha loãng 1/10 hay 10-1.
 Tiếp tục hút 1 mL ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cất vô
trùng thứ 2.
 Lắc đều dung dịch được độ pha loãng 1/100 hay 10-2.
 Tiếp tục như vậy, từ ống 2 sang ống 3, từ ống 3 sang ống 4, … sẽ có độ pha
loãng tương ứng 10-3, 10-4 …
 Cấy mẫu
Nguyên tắc
 Tách rời các tế bào vi khuẩn.

 Nuôi cấy tế bào trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng
rẽ, cách biệt nhau.
 Chuẩn bị đĩa petri (đã có môi trường), mỗi nồng độ cấy vào 2 đĩa (trên mỗi đĩa
ghi kí hiệu từng nồng độ riêng biệt tránh để nhầm lẫn).
Cách thực hiện
 Hút 0,1 mL dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường.
 Dùng que trang thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.
 Tiếp tục sử dụng que trang này trang mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa petri thứ
2.
 Cứ tiếp tục phương pháp trên với từng nồng độ, sau khi hoàn thành, gói các đĩa
đã có mẫu vào một khay, nuôi ở nhiệt độ phòng chờ khoảng 3 ngày để vi khuẩn
có thể phát triển.
Lƣu ý: các thao tác trên cần phải vô trùng, que gạt phải được ngâm trong cồn
960, rồi hơ trên đèn cồn cho đến khi đỏ thì mới được sử dụng. Thao tác cần phải
cận thận, tỉ mỉ, tránh nhiễm nấm từ môi trường.
 Cấy truyền
Nguyên tắc
 Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp
nhiễm.
9


 Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng triệt để.
 Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để VSV phát triển.
Cách thực hiện
 Ghi chú cụ thể ngày cấy vào thành ống nghiệm, dưới nút bông một chút.
 Tay trái cầm 2 ống nghiệm: 1 ống giống, 1 ống môi trường.
 Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn.
 Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn y xoay nhẹ, kéo nút ống
giống ra.

 Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm.
 Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong
ống giống.
 Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống
môi trường để thực hiện các thao tác cấy truyền.
 Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông.
 Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong.
(Trần Thanh Thủy, 1999)
3.2.3. Phƣơng pháp bảo quản chủng vi khuẩn lactic
Nguyên tắc
 Đảm bảo tốt các điều kiện trong quá trình bảo quản để không làm thay đổi
phẩm chất ban đầu của giống.
 Làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở VSV đồng thời ngăn cản sự sinh
sản của chúng.
Phƣơng pháp cấy truyền định kỳ lên môi trƣờng mới
 Sau khi đã phân lập được giống thuần, tiến hành cấy truyền vào ống nghiệm
chứa môi trường thuận lợi để giữ giống.
 Đối với vi khuẩn lactic sau khoảng 1 tháng cấy truyền 1 lần.
 Bảo quản trong nhiệt độ từ 3 – 5 0C.
Phƣơng pháp bảo quản dƣới dầu vaselin
Đây là một phương pháp rất tốt, tránh được môi trường khỏi bị khô. Dầu
đem dùng phải tinh khiết và trung tính, có độ nhớt cao, không chứa sản phẩm oxy
hóa hoặc chất độc đối với VSV, có trọng lượng riêng 0,8 – 0,9.
Cách tiến hành
 Vô trùng vaselin bằng cách hấp 121 0C trong 2 giờ, sấy khô ở 170 0C trong 1 –
2 giờ để nguội.
 Rót vào các ống giống đã phát triển tốt, sau đó để ở nhiệt độ thường.
 Chú ý lớp dầu không nên quá dày, chỉ cần cách trên mép ống thạch 1cm.
 Bằng phương pháp này có thể giữ giống 2 – 3 năm mới cấy lại một lần, giống
đảm bảo tốt.

(Nguyễn Đức Lượng, 2006)
10


3.2.4. Phƣơng pháp định tính, định lƣợng acid lactic
3.2.4.1. Phương pháp định tính
Mục đích: nhằm xác định sự có mặt của acid lactic trong dịch lên men.
Nguyên tắc chung: dựa trên các phản ứng màu đặc trưng của acid lactic với một
số hợp chất khác nhau để xác định sự có mặt của chúng trong quá trình lên men
lactic.
Cách thực hiện
 Phản ứng thử phenol.
 Nuôi vi khuẩn trong môi trường VL lỏng (không agar).
 Sau 3 ngày, hút 3 mL dịch lên men cho vào ống nghiệm.
 Nhỏ 3 giọt thuốc thử ufenmen vào ống nghiệm.
 Kết quả: nếu dung dịch có acid thì thuốc thử từ màu xanh tím chuyển sang màu
vàng.
(Trần Thanh Thủy, 1999)
3.2.4.2. Phương pháp định lượng
Mục đích: nhằm xác định hàm lượng của acid lactic trong quá trình lên men
lactic.
Cách thực hiện
 Nuôi vi khuẩn trong 3 ngày, thu dịch lên men.
 Cho vào ống nghiệm
 10 mL dịch lên men.
 20 mL nước cất.
 1 – 2 giọt phenolphtalein.
 Lắc thật kĩ để trộn đều các chất.
 Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,1N (cho đến khi dung dịch xuất hiện màu
hồng)

 Cách tính:
Khối lượng acid lactic =
(trong 10 mL dịch lên men)

Số mL dung dịch NaOH 0,1 N (dùng để chuẩn độ) x 0,009 g

(1 mL dung dịch NaOH tương đương 0,009 g acid lactic)
(Trần Thanh Thủy, 1999)
3.2.5. Phƣơng pháp định danh vi khuẩn lactic
3.2.5.1. Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc
 Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím
kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.

11


 Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị
rửa trôi khi xử lí bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc loại Gram dương.
 Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi
xử lí bằng cồn và bắt màu với thuốc nhuộm bổ sung, VSV loại này thuộc loại
Gram âm.
Cách thực hiện
 Trên lame kính nhỏ một giọt nước cất, dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc (vi
khuẩn).
 Làm vết bôi, đợi đến khi nước cất trên lame khô, nhỏ thêm một giọt cồn để khô
tự nhiên hay trên ngọn lửa đèn cồn.
 Nhuộm tiêu bản:
 Đặt một miếng giấy lọc lên vết bôi.
 Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút.

 Nhuộm Lugol trong 1 phút.
 Rửa lại bằng nước cất.
 Tẩy bằng cồn trong 30 giây, nghiên tiêu bản nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến
khi n hết màu.
 Rửa lại bằng nước.
 Nhuộm bổ sung bằng Fuchsin từ 30 giây – 1 phút.
 Rửa lại bằng nước.
 Làm khô và quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi đầu tiên từ vật kính 4X.
(Trần Thanh Thủy, 1999)
3.2.5.2. Quan sát hình thái tế bào
Sau khi phân lập và tách dòng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình thái tế
bào vi khuẩn. Các mẫu vi khuẩn sống được làm bằng phương pháp giọt ép, quan
sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 40X.
Cách thực hiện
 Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên lame.
 Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
 Dùng que cấy lấy một ít khuẩn rồi trải đều lên giọt nước trên lame.
 Dùng lamel đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc
với lame một góc 450, hạ lamel từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong tiêu bản không
có bọt khí.
 Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 40X, để thấy
được các hình dạng.
(Trần Thanh Thủy, 1999)

12


3.2.5.3. Phương pháp thử hoạt tính catalase
Nguyên tắc
 Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện chứa chuỗi truyền điện tử có

cytochrome đều có calase, có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức
hô hấp với oxy tạo ra H2O2.
 Calase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử có độc
tính cao này trong tế bào.
 Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.
Cách thực hiện
 Hóa chất sử dụng:
 Dung dịch H2O2 30% được giữ trong tủ lạnh với chai màu nâu tránh ánh sáng.
 Dung dịch đệm phosphate pH 7,0.
 Thử trên lame: dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt trên
một lame sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trên lame. Ghi
nhận sự sủi bọt nếu có. Hoặc có thể bằng cách chuyển một ít sinh khối của khuẩn
lạc lên lame, nhỏ một giọt H2O2 0,5% rồi đậy lại bằng lamel. Ghi nhận nếu có sự
xuất hiện của bọt khí bị giữ lại giữa lame và lamel.
Đọc kết quả
 Dương tính (+): khi có hiện tượng sủi bọt khí do khí O2 được tạo ra.
 Âm tính (-): khi không có hiện tượng sủi bọt khí.
(Trần Linh Thước, 2007)
3.2.5.4. Khảo sát nguồn cacbohydrate lên men
Mục đích: tìm ra nguồn cacbohydrate phù hợp với 2 chủng vi khuẩn phân lập
được.
Cách thực hiện
 Nuôi 2 chủng vi khuẩn trên môi trường VL lỏng với thành phần và tỉ lệ không
thay đổi.
 Thay thế glucose bằng saccarose, fructose, lactose, maltose với tỉ lệ 20 g trong
1 lít môi trường.
 Lên men 3 ngày.
 Định lượng lượng acid lactic sau khi lên men bằng phương pháp chuẩn độ
NaOH.

13


3.2.5.5. Khảo sát lên men ở nhiệt độ 4 0C và 45 0C
Mục đích: khảo sát khả năng lên men của 2 chủng tuyển chọn ở nhiệt độ 4 0C và
45 0C.
Cách thực hiện
 Lấy khuẩn lạc có đường kính 2 μm từ 2 chủng đã phân lập, cấy vào 2 ống
nghiệm có sẵn môi trường nuôi.
 Ủ ở 2 nhiệt độ khác nhau: 4 0C và 45 0C.
 Sau khi nuôi cấy được khoảng 3 ngày, tiến hành định lượng acid lactic bằng
phương pháp chuẩn độ.
3.2.6. Phƣơng pháp khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng quá trình lên men lactic
3.2.6.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh
acid lactic của chủng vi khuẩn lactic phân lập
Mục đích: tìm ra nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn lactic hoạt động mạnh để sinh acid
lactic cao nhất.
Cách tiến hành
 Lấy khuẩn lạc có đường kính 2 μm từ 2 chủng đã phân lập, cấy vào 2 ống
nghiệm có sẵn môi trường VL lỏng.
 Ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 25 0C, 30 0C, 35 0C, 40 0C.
 Sau khi nuôi cấy được khoảng 3 ngày, tiến hành định lượng acid lactic bằng
phương pháp chuẩn độ.
 Bố trí thí nghiệm với 1 nhân tố, 3 nghiệm thức và 2 đơn vị thí nghiệm.
3.2.6.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh acid
lactic của chủng vi khuẩn lactic phân lập
Mục đích: tìm ra pH thích hợp cho vi khuẩn lactic hoạt động mạnh để sinh acid
lactic cao nhất.
Cách thực hiện
 Lấy khuẩn lạc có đường kính 2 μm từ 2 chủng đã phân lập, cấy vào 2 ống

nghiệm có sẵn môi trường nuôi.
 Dùng HCl 5%, NaOH 5% điều chỉnh pH môi trường lỏng về các độ pH 4, 5, 6,
7, 8.
 Sau khi nuôi cấy được khoảng 3 ngày, tiến hành định lượng acid lactic bằng
phương pháp chuẩn độ.
 Bố trí thí nghiệm với 1 nhân tố, 3 nghiệm thức và 2 đơn vị thí nghiệm.

14


3.2.6.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh
acid lactic của chủng vi khuẩn lactic phân lập
Mục đích: tìm ra độ mặn thích hợp cho vi khuẩn lactic hoạt động mạnh để sinh
acid lactic cao nhất.
Cách thực hiện
 Lấy khuẩn lạc có đường kính 2 μm từ 2 chủng đã phân lập, cấy vào 2 ống
nghiệm có sẵn môi trường VL lỏng.
 Với thành phần môi trường VL lỏng, lượng muối được thay thế với các nồng độ
khác nhau: 2%, 3%, 4%, 5%, 6%.
 Sau khi nuôi cấy được khoảng 3 ngày, tiến hành định lượng acid lactic bằng
phương pháp chuẩn độ.
 Bố trí thí nghiệm với 1 nhân tố, 3 nghiệm thức và 2 đơn vị thí nghiệm.
3.2.6.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh
acid lactic của chủng vi khuẩn lactic phân lập
Mục đích: xác định ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh acid lactic của vi
khuẩn lactic là cao nhất.
Cách thực hiện
 Lấy khuẩn lạc có đường kính 2 μm từ 2 chủng đã phân lập, cấy vào 2 ống
nghiệm có sẵn môi trường VL lỏng.
 Nuôi trong môi trường ở các thời gian khác nhau: 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, 6

ngày, 7 ngày.
 Sau đó tiến hành định lượng acid lactic bằng phương pháp chuẩn độ.
 Bố trí thí nghiệm với 1 nhân tố, 3 nghiệm thức và 2 đơn vị thí nghiệm.
3.2.7. Phƣơng pháp sử dụng phần mềm thống kê để xử lý số liệu
Các kết quả thí nghiệm trong đề tài được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0
for Window. Do yêu cầu của đề tài, chỉ một số chức năng được sử dụng như:
Tính đại lượng thống kê mô tả (Decriptives) và phân tích ANOVA (analysis of
variance) ở mức ý nghĩa 0,05.

15


CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC
Tiến hành thu mẫu nước dưa muối ở chợ Mỹ Xuyên. Pha loãng mẫu, cấy truyền 3
lần, thu được 20 mẫu khác nhau, sau khi quan sát hình thái khuẩn lạc và hình
dạng tế bào xác định được 12 chủng vi khuẩn lactic khác nhau. Kết quả được
trình bày ở bảng 1
Bảng 1 – Khuẩn lạc và hình thái 12 chủng vi khuẩn phân lập
Chủng

Khuẩn lạc

Hình dạng tế bào

Đặc điểm

1

Khuẩn lạc màu
trắng đục, nổi. Tế
bào hình oval, kết
thành đám.

2

Khuẩn lạc màu
trắng đục, nổi. Tế
bào hình oval, kết
thành đám.

5

Khuẩn lạc màu
trắng đục, nổi. Tế
bào hình cầu, kết
thành đám.

16


9

Khuẩn lạc màu
trắng đục, nổi. Tế
bào hình cầu, kết
thành đám.

10

Khuẩn lạc màu
trắng đục, nổi.
Trực khuẩn, kết
thành đám.

11

Khuẩn lạc màu
trắng đục, nổi. Tế
bào hình cầu, kết
thành đám.

12

Khuẩn lạc màu
trắng đục, nổi.
Trực khuẩn, kết
thành đám.

17