NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH







VOÕ THÒ BÍCH VAÂN



NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM
PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM
SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN
CẦN GIỜ


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT
MÃ SỐ: 06-005







NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS: TRẦN THANH THỦY

TP. Hồ Chí Minh. 2010
THƯ
VIỆN
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy, người đã tận tình chỉ dẫn tôi
trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn thành luận văn. Cô đã động viên, giúp đỡ và tạo
điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban chủ nhiệm cùng các thầy cô trong Khoa Sinh và Phòng
thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi
trong thời gian thực hiện luận văn.
Xin gởi lời cảm ơn đến Phòng Khoa học Công nghệ- Sau đại học Trường Đại học Sư phạm
Thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn được hoàn thành đúng tiến độ.
Xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp và những người thân
trong gia đình đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn.

MÔÛ ÑAÀU
NS hay còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp
điều kiện khí hậu nóng ẩm. Trong tự nhiên, NS phân bố rất rộng rải và tham gia tích cực vào các
vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ hình thành chất mùn.
Một trong những đặc điểm nổi bật của NS là có hệ enzym ngoại bào rất phong phú. Trong
đó, protease là một trong những enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản

xuất nhờ protease của chúng có tính chất bền vững rất cao và có khoảng pH hoạt động rộng hơn so
với protease từ động vật, thực vật và vi khuẩn. [22]
Trong cơ thể động vật, thực vật quá trình tổng hợp enzym thường gắn liền với yêu cầu sống
của cơ thể. Vì vậy, muốn thu được enzym cần phải phá bỏ tổ chức đó, nguồn thu enzym thường
phải tươi và quá trình thu enzym phải lệ thuộc vào điều kiện tự nhiên. Bên cạnh đó, thời gian thu
họach dài làm cho việc sử dụng động vật, thực vật để sản xuất enzym là không kinh tế và không
đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao về enzym của con người.
Hiện tại và tương lai gần, NS vẫn là một trong những đối tượng quan trọng nhất, kinh tế nhất
trong sản xuất enzym ở qui mô công nghiệp vì:
- Chúng có hệ enzym vô cùng phong phú với hoạt tính cao hơn các sinh vật khác.
- Tốc độ sinh trưởng, phát triển nhanh nên có thể sản xuất lượng lớn enzym trong thời gian
ngắn.
- Có thể sử dụng nguồn nguyên liệu đơn giản, dễ kiếm, rẻ tiền trong nuôi cấy NS sinh enzym.
- Việc tinh chế thu enzym ngoại bào thường dễ dàng với mức chi phí thấp.
Các enzym từ NS được sử dụng rộng rải trong CN chế biến thực phẩm (làm tương, nước
chấm…), trong CN enzym (sản xuất amylaza, proteaza, cellulaza…), CN dược phẩm (sản xuất KS,
steroid…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng TV, sản xuất sinh khối NS để
phục vụ chăn nuôi và dinh dưỡng cho người (mycoprotein), dùng NS để xử lý ô nhiễm MT. [4]
Để tận dụng tối đa nguồn lợi to lớn từ NS đồng thời hạn chế các tác hại do NS gây ra, con
người đã tập trung nghiên cứu các vấn đề liên quan đến NS. Trước đây, các nhà nghiên cứu thường
tập trung tìm hiểu NS phân bố ở đất liền. Những năm gần đây, con người mới nhận thấy hết được
tầm quan trọng của hệ sinh thái RNM - HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST. Với
điều kiện sinh thái của RNM con người có thể nghiên cứu khả năng chịu đựng và phục hồi của các
tổ hợp gen. Từ đây, có thể tìm được các chủng NS có hệ gen bền vững, mang nhiều đặc tính có lợi
cho con người.
Hệ sinh thái RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật q hiếm, bền vững và có
khả năng chịu đựng điều kiện sống đặc biệt khắc nghiệt. Đây là nơi có hệ VSV vơ cùng phong phú
và đa dạng như NS, vi khuẩn, xạ khuẩn …., trong đó NS chiếm số lượng rất lớn. Có thể thấy RNM
Cần Giờ là kho dự trữ các chủng NS có hoạt tính enzym cao chưa được khai thác.
Thảm thực vật và các hệ động vật có trong RNM Cần Giờ thật sự là các nguồn thức ăn tốt

nhất cho VSV sống trong RNM đặc biệt là hệ NS. NS có khả năng tiết ra hệ enzym cellulase phân
hủy hợp chất cellulose có trong lá cây, thân cây ở RNM thành glucose để sử dụng. Ngồi ra, NS
còn có thể sinh các loại enzym khác như protease, amylase, kitinase… phân hủy xác, vỏ tơm, cua,
ốc, xác chết các lồi động vật khác thành các chất dinh dưỡng chúng có thể hấp thu. Vậy hệ NS là
một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố khơng thể thiếu trong chu trình chuyển
hóa vật chất ở RNM Cần Giờ

Ở Việt Nam các cơng trình nghiên cứu về NS sinh protease khá nhiều và chỉ tập trung trên
đất liền. Các cơng trình khoa học chính thức nghiên cứu về NS sinh protease từ RNM Cần Giờ đã
có song còn nhiều hạn chế.
Để góp phần nâng cao hiểu biết giá trị tài ngun sinh học từ RNM, đặc biệt là khu hệ NS
chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng sinh enzym protease của một số chủng NS
phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”
Mục tiêu của đề tài:
Phân lập và tuyển chọn một chủng NS có khả năng sinh protease cao từ RNM Cần Giờ
TP. Hồ Chí Minh.
Nhiệm vụ đề tài.
- Phân lập NS từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh
-Tuyển chọn chủng NS có hoạt tính protease cao nhất
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và phân loại chủng NS được chọn.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp protease của chủng NS từ
đó xác định động thái
q trình tổng hợp protease của chủng NS nghiên cứu.
- Nghiên cứu một số đặc điểm của chế phẩm protease thơ từ NS
- So sánh hoạt độ enzym của chủng NS nghiên cứu với chế phẩm enzym trên thị trường.
Thời gian, địa điểm làm đề tài
- Thời gian: từ tháng 9/2008- 7/ 2009
- Địa điểm thí nghiệm: PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí
Minh.

CHƯƠNG 1.


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh
Huyện Cần Giờ tiếp cận với biển Đơng hiện hữu một khu RNM đan xen với hệ thống sơng
rạch dày đặc chứa đựng các HST mang tính đa dạng sinh học cao với nhiều lồi động thực vật đặc
hữu của miền dun hải Việt Nam. Đó là khu RNM Cần Giờ nằm gọn trong địa giới huyện Cần
Giờ và rừng Sác huyện Nhơn Trạch tỉnh Đồng Nai
Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sơng Đồng Nai – Sài Gòn
nằm ở cửa ngõ Đơng Nam thành phố Hồ Chí Minh. Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp
biển Đơng, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đơng giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.
Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó, vùng lõi 4.721 ha,
vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha.

RNM Cần Giờ
giới hạn bởi các đoạn sơng, rạch, tắc như sơng Sồi Rạp, sơng Vàm Sát, rạch
Đơn, tắc An Nghĩa, sơng Lòng tàu, tắc Rổi, sơng Đồng Tranh, tắc Nước Hội, sơng Thị Vải, sơng
Gò Gia , sơng Cái Mép và biển Đơng, từ bắc xuống Nam dài 28km, từ Đơng sang Tây dài 30km.
Thổ nhưỡng phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sơng Sài Gòn và sơng Đồng Nai
mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi q trình trầm tích sét, q
trình phèn hố và q trình nhiễm mặn.
Khí hậu Cần Giờ nóng ẩm và chịu chi phối của qui luật gió mùa cận xích đạo với hai mùa
mưa nắng rõ rệt.
Lượng mưa: thấp nhất TP. Hồ Chí Minh, trung bình 1300 – 1400mm/năm, mùa mưa thường
bắt đầu từ tháng 4 và kết thúc vào tháng 10, lượng mưa thường tập trung vào tháng 6 và tháng 9.

[35]
- Chế độ nhiệt: Biên độ nhiệt trong ngày từ 5 – 7

0
C, nhiệt độ trung bình 25,8
0
C, nhiệt độ thấp
tuyệt đối 18,8
0
C, nhiệt độ cao tuyệt đối 35
0
C
[35].

- Độ ẩm khơng khí: cao hơn các nơi khác trong TP. Hồ Chí Minh. Mùa mưa độ ẩm từ 79 –
83%, mùa khơ độ ẩm từ 74 – 77%, ẩm nhất vào tháng 9, khơ nhất vào tháng 4
[36].

- Chế độ thuỷ triều: chế độ bán nhật triều khơng đều, hai lần nước lớn và hai lần nước ròng
trong ngày. Các tháng có đỉnh triều cực đại là tháng 10 và tháng 11, đỉnh triều thấp nhất là tháng 4
và tháng 5
[36].

- Độ mặn:

trung bình từ 1,5 – 2,5% , tùy theo khu vực có thể lên đến 18% lớn nhất khi triều
cường và nhỏ nhất khi triều kém. Nước mặn xâm nhập sâu vào tháng 4 và bị đẩy xa vào tháng 9 và
tháng 10 [13].
* Khu hệ thực vật
Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ có trên 150 loài TV, các loài chủ yếu như bần trắng,
mấm trắng, các quần hợp đước đôi - bần trắng cùng sú, ổi, trang, đưng v.v… và các loại nước lợ
như bần chua, các quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng v.v… Thảm cỏ biển với các loài ưu thế
Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, các loại

đậu, dừa và các vườn cây ăn trái [34].
* Khu hệ động vật
Theo khảo sát sơ bộ của dự án khả thi khu bảo tồn tự nhiên RNM Cần Giờ năm 1999 cho
thấy:
+ Khu hệ ĐV thuỷ sinh không xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài
có vú. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (gekko gekko), kỳ đà
nước (varanus salvator), trăn đất (python molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong
(bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia
mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)…

[34].

+ Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 loài chim nước và 79
loài không phải chim nước sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau [35].

Phân vùng khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ: Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần
Giờ là 75.740 ha, trong đó vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyển tiếp 29.880 ha
[35] .

* Khu hệ VSV
- Vi khuẩn
VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM. Là những SV
phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong HST này. Số lượng VK trong RNM
chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước
trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát [34]. Nhiều loài sống trên các giá thể
bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám. Do đó, VK có thể tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo
điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển.
- Nấm
Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng. Phần lớn là vi nấm, chỉ có một số loài có kích
thước lớn. Nấm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh

xác lá TV (Fell và cộng sự 1975). Người ta có thể phân loại nấm dựa trên môi trường RNM: trên tán
cây, trên thân, rễ hô hấp và trong đất, nhưng cũng có một số loài có thể sống được từ hai MT trở lên
[33].
Nấm đóng một vai trò rất quan trọng trong HST bởi vì NS tham gia các chu trình sinh địa hóa
ở nhiều lưới thức ăn. Khi sống hoại sinh hay cộng sinh, chúng phân hủy những vật chất hữu cơ
thành những phân tử vô cơ, rồi sau đó những chất này sẽ được đồng hóa ở TV hay những SV khác
[46].

Bản thân NS từ RNM cũng trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài ĐV nhỏ và ấu
trùng của một số loài (Odum, 1980; Alongi, 1989).
VSV ở RNM ngoài VK và NS còn có nấm men, xạ khuẩn,… chúng đóng vai trò hết sức quan
trọng đối với chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái nơi này. Chúng tham gia bảo vệ MT
sinh thái RNM nói riêng và MT sinh thái nói chung, cũng như vai trò to lớn trong mối quan hệ sinh
học giữa các loài SV. Từ đó, đóng góp vào việc giữ cân bằng cho HST đặc biệt này.


Vai troø cuûa RNM

Một số loài TV ở RNM có thể xếp vào nhóm công dụng chủ yếu: 30 loài cây cho gỗ, than, củi,
14 loài cây cho tannin, 24 loài cây làm phân xanh, 21 loài cây dùng làm thuốc, 9 loài cây chủ thả
kiến cánh đỏ, 21 loài cây cho mật nuôi ong, 1 loài cây cho nhựa để sản xuất nước giải khát [2].
Ngoài ra, RNM còn có nguồn tài nguyên ĐV phong phú như 9 loài lưỡng cư, 22 loài bò sát, 67
loài chim, 21 loài thú,… Các SV ở nước rất phong phú gồm 64 loài cá thuộc 35 họ, 25 loài tôm, 66
loài TV phiêu sinh, 26 loài ĐV phiêu sinh và 22 loài ĐV đáy [2] .

Ngoài ra các nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu Hệ sinh thái RNM đã phát hiện
trong đất RNM có vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) và chủng NS Paecilomyces farinosUIs. Các
loại vi sinh vật này tạo được protein tinh thể độc, có khả năng tiêu diệt một số loài côn trùng gây hại
cho người và động thực vật như các loài sâu róm, sâu tơ, bọ nẹt, ấu trùng muỗi sốt rét Anopheles
minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti và muỗi Culex quinquefasciatus gây bệnh chân voi.

Bên cạnh các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc… RNM còn đóng vai trò
quan trọng trong việc điều hòa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi, hạn chế xói lở và quá trình xâm
thực bờ biển.

RNM

cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển, là nơi sinh sản hoặc
ươm nuôi của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như tôm, cua, cá,…
Mặt khác, RNM còn có tác dụng làm chậm dòng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm
mạnh độ cao của sóng khi triều cường. Hạn chế tác hại của sóng thần và bão lớn, hạn chế xâm nhập
mặn và bảo vệ nước ngầm. RNM bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, làm
sạch MT nước khi có lũ lụt, lũ quét, sạt lở đất [4][18].



1.2 Sơ lược veà NS RNM Cần Giờ
1.2.1 Vị trí phân loại.
Theo G.C.Ainsworth (1973): Hệ thống của giới nấm bao gồm hai ngành: Myxomycota và
Eumycota. Eumycota bao gồm 5 ngành phụ: Mastigomycotina, Deuteromycotina, Zygomycotina,
Ascomycotina và Basidiomycotina [41]
Ngành phụ Deuteromycotina được chia

theo 3 lớp: [42
]
+ Blastomycetes: Khuẩn ty không phát triển hoặc phát triển yếu; dạng cơ thể giống như nấm
men và có sự nảy chồi.
+ Hyphomycetes: Khuẩn ty thật, không nảy chồi; sợi nấm bất dục hoặc sinh BT trên cuống,
không có sự tập trung thành túi BT hay cụm cuống BT.
+ Coelomycetes: Khuẩn ty thật, BT tập trung trong túi BT hoặc trên cụm cuống BT:
Lớp Hyphomycetes được chia thành 3 bộ: Moniliales, Melanconiales và Sphaeropsidales.

Theo C. J. Alexopoulos (2002), nấm có 3 phần trong giới nấm, giới Stramenopila (một giới
mới bao gồm các SV có cấu trúc lông roi được tách ra từ protista) và giới Protista. Giới nấm có 4
ngành: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota. Phần của nấm trong giới
Stramenopila có 3 ngành: Oomycota, Hyphochytriomycota, Labryrinthulomycota. Bốn ngành khác
của nấm được xem như là các SV nguyên sinh trong giới protista: Plasmodiomycota,
Dictyosteliomycota, Acrasiomycota, Myxomycota. Lý do của sự phân chia này là từ những bằng
chứng mới của các nghiên cứu về rRNA và hoá sinh học. Các bằng chứng chứng minh sự tồn tại của
3 nhóm nấm khác nhau. Gần đây, sau khi hệ thống phân loại giới xuất hiện, giới nấm được tái cấu
trúc và sắp xếp lại. Tất cả các phần trong các giới khác nhau được tập hợp lại chỉ trong một giới
nấm. Các nhà nấm học phân chia giới này thành hai phần: nấm giả, bao gồm 7 ngành: Oomycota,
Hyphochytridiomycota, Labyrinthulomycota, Plasmodiophoromycota, Dictyosteliomycota,
Acrasiomycota và Myxomycota và nấm thật là những phần còn lại [43].
1.2.2 Hình thái, cấu trúc
Các nấm bậc thấp thường có sợi nấm không vách ngăn. Ngược lại, các nấm bậc cao thường
mang sợi nấm có vách. Sợi nấm không vách ngăn mang nhiều nhân nhưng vẫn có thể gọi là đơn
bào. Ở các nấm không vách ngăn thì vách ngăn vẫn có thể hình thành khi cơ thể sinh sản hoặc tại
các bộ phận sợi nấm bị thương tổn. Đó là loại vách ngăn liền, không có lỗ thủng, có tác dụng bảo vệ
cơ thể [5].
Sợi nấm có vách ngăn là cơ thể đa bào. Mỗi tế bào có 1 nhân hoặc nhiều nhân. Tuy nhiên, sợi
nấm vẫn không phải do nhiều tế bào hợp thành mà là do các vách ngăn tách sợi nấm ra thành nhiều
tế bào.
Vách ngăn ngang được hình thành từ thành tế bào. Lúc đầu là một gờ nhỏ hình khuyên sao
đó tiến dần vào trong và lấp kín lại. Tuy nhiên, vách ngăn thường có một hay nhiều lỗ thủng. Các lỗ
có kích thước bằng nhau hay có một lỗ lớn nhất ở giữa và nhiều lỗ nhỏ ở xung quanh.

Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên trong chứa chất nguyên sinh có thể
chuyển động, đường kính 1-30µm (thông thường là 5-10 µm).
Đỉnh sợi nấm có hình chóp nón không tăng trưởng, có tác dụng bảo vệ phần ngọn của sợi
nấm. Phần này chất nguyên sinh không có nhân và chứa ít cơ quan tử. Tiếp đến là phần tăng trưởng
chứa nhiều nhân, nhiều cơ quan tử và nhiều enzym. Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và phân
nhánh của sợi nấm. Dưới nữa là phần thành cứng - phần thành thục của sợi nấm. Bắt đầu từ phần
này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nấm [4] [44].
Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ nhỏ, trong nhân có
hạch nhân (nucleolus). Trong tế bào nấm còn có ty thể (mitochondrion), mạng nội chất
(endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), ribosome, bào nang (vesicle), thể
golgi [4], các giọt lipid, các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), các
thể vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể chitô đường kính 40-70 nm (chitosome)…
Ngoài ra trong tế bào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25 nm (microtubule), các vi sợi
đường kính 5-8 nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome)






Hình 1.1: Sợi nấm có vách ngăn và sợi nấm không có vách ngăn

Ribosome của nấm thuộc loại 80S đường kính khoảng 20-25nm, gồm 2 tiểu phần: tiểu phần
lớn 60S và tiểu phần nhỏ 40S
[45]
Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm có sợi mang sắc tố tạo nên màu tối hay
màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài MT và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển.
Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt KL. Vì BT của nấm thường
cũng có màu nên cả KL thường có màu.

Ngoài những đặc điểm chung thì NS từ RNM còn có những đặc trưng riêng đáng được quan
tâm và cần có nhiều công trình nghiên cứu hơn nữa trên những đối tượng này bởi các lý do sau:
Ở MT sống khắc nghiệt, kiểu trao đổi chất của chúng sẽ khác biệt hơn so với các nấm ở đất
liền. Do đó, các sản phẩm trao đổi chất, đặc biệt là chất KS cũng mang tính chất khác lạ hơn [14].
Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả năng thích nghi của NS từ
RNM. Do đó, phần lớn các NS từ RNM đều có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học
nhằm giúp chúng thích ứng với điều kiện sống. Điển hình là khả năng sinh nhiều loại enzym, nhất là
các enzym ngoại bào có chức năng phân giải xác động thực vật là thành phần hữu cơ chính của
RNM, các chất KS và các độc tố giúp làm tăng khả năng đối kháng của NS trong quá trình cạnh
tranh ở MT sống. Gần đây, người ta phát hiện ra nấm biển và NS ở RNM là nguồn VSV có tiềm
năng sinh các chất KS mới, chống lại các VSV nhờn thuốc.
Sống trong MT biến động, MT chịu ảnh hưởng của chất thải từ đất liền, ô nhiễm do tràn
dầu…đã tạo cho các nấm sợi RNM có những cơ chế phản ứng lại với những tác động này bằng khả
năng sinh tổng hợp được hệ enzym phân giải các chất độc hại.
RNM là một HST chịu nhiều tác động của gió bão. Sau những tác động trên, vấn đề ô nhiễm
là điều không thể tránh khỏi, nhất là ô nhiễm VSV gây bệnh [13]. Nhờ có những đặc tính sinh học
(a) Cấu tạo của phần ngọn sợi nấm
Hình 1.2: Cấu tạo phần ngọn và cấu trúc của sợi


(b) Cấu trúc của sợi nấm

Vách tế bào
Màng tế bào
Nhân
Thể
golgi
Không bào
Ti thể
Luới
nội chất
Nhân

đáng quí như khả năng sinh ra các sản phẩm giúp khống chế VSV có hại mà NS có thể cải thiện MT
sống cũng như giúp con người nâng cao khả năng điều trị bệnh tật.
Đa số các NS từ RNM đều có khả năng chịu mặn cao. Chúng có thể sinh trưởng ở nồng độ
muối từ 1,5 % - 2,5%. Thậm chí, một số nấm sợi RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30%
[13]. Đây là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM.
Tóm lại, NS ở RNM có những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục
vụ nhu cầu và lợi ích của con người. Tuy nhiên, những nghiên cứu về NS RNM còn rất khiêm tốn,
chưa tương xứng với qui mô và tiềm năng của chúng,
1.2.3 Sinh sản của NS

Nói chung, NS sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính
Sinh sản vô tính
NS sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển
dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử.
Bào tử kín: được tạo thành từ đỉnh một sợi nấm được phân hóa làm nhiệm vụ sinh sản.
Bào tử trần: là loại bào tử vô tính thường gặp nhất ở nấm. Chúng có hình dạng, kích thước,
kết cấu hết sức phong phú. Tế bào sinh bào tử trần gọi là giá (hay cuống) bào tử trần (conidiophore).

Hình 1.3 Bào tử kín (a) và bào tử trần ( b) của NS
Sinh sản hữu tính
Xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái (gametes) có trải qua giai đoạn giảm phân.
Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn:

Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với sự hòa hợp 2 tế bào trần (protoplast) của 2 giao tử

Tiếp hợp nhân (karyogamy) với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị
bội (diploid)

Giảm phân (meiosis) giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội (haploid) qua sự giảm phân
từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội).


a

b b
b





Hình 1.4: Sự tiếp hợp của NS

1.2.4 Vai troø cuûa NS
NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có họat
tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh tế cao như: nguồn enzym, các chất kháng sinh,
các axit hữu cơ, các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydrat [5],[9].

Họat tính enzym thủy phân ngoại bào.
Enzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ
thể [22]. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzym, trong đó phần lớn là
enzym từ thực vật và VSV. NS có tiềm năng lớn nhất sinh các lọai enzym ngoại bào mạnh, phân
giải và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên. Một số enzym đã được tinh
sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: xellulase, protease, amylase, pectinase và kinase
[5].
 Enzym cellulase: Cellulase là một nhóm nhiều enzym xellulase C
1
( endo cellulase),
cellulase C
x
(exoxellulase) và xellobiaza có tác dụng thủy phân cellulose tạo thành glucose. Các
VSV có hoạt tính cellulase cao là các loài vi khuẩn, xạ khuẩn chịu nhiệt và NS. Trong đó, các
chủng NS thuộc chi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus,….có khả năng sinh enzym cellulase
được sử dụng trong chăn nuôi để nâng cao sự tiêu hóa cellulose ở động vật. Ngoài ra chúng còn
được dùng trong sản xuất glucose từ bã và sản phẩm thải ở của công nghiệp rừng, làm phân bón,
xử lí rác thải[17],[18].
 Enzym protease: Protease là nhóm enzym thủy phân protein thành peptit và axit amin
bằng cách cắt đứt các liên kết peptid. Protease gồm có proteinaza và peptidaza chúng có tính đặc
hiệu tương đối rộng. Protease NS có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease động vật và vi
khuẩn, người ta chia protease NS thành ba nhóm: protease axit, protease kiềm và protease trung
tính. NS có khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi Penicillium, Aspergillus…
Protease NS thường được dùng nhiều trong sản xuất nước chấm, sản xuất bánh mì, bánh quy
….[8], [10],[20].

 Enzym amylase: Xúc tác quá trình phân giải glycogen và các polysacarit thành đường
glucose. Nhiều loại NS có khả năng sinh amylase. Tổ chức phức hệ enzym amylase của NS gồm α
amylase, γ amylase (glucoamylase), α- glucozidaza (mantaza) và dextrinaza sẽ cắt đứt các liên kết
α- 1,4- glucoside và α- 1,6 glucoside trong phân tử tinh bột, glycogen và các polysacarit tạo ra sản
phẩm cuối cùng là glucose. NS có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là các chủng thuộc chi
Penicillium, Aspergillus, Trichoderma Rhizopus, Mucor,… Amylase được dùng trong sản xuất siro,
sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, …[20], [21].
 Enzym kitinase: Kitinase phân giải kitin, kitin là các biopolyme chứa các gốc N- acetyl-
glucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β- 1,4- glucoside. Trong RNM, lượng kitin trong vỏ
tôm, cua, ốc …rất nhiều. NS thuộc chi Trichoderma, Chaetominum,… sinh enzym kitinase phân
giải kitin, đồng thời tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh có thành tế bào là kitin,
chống các loài côn trùng có vỏ kitin.
Như vậy, NS còn có vai trò làm tác nhân kiểm soát sinh học chống các VSV gây bệnh và côn
trùng có hại trong nông – lâm – ngư – nghiệp [16].
Các chủng NS thuộc các chi Acremoium, Penicillium, Aspergillus còn có khả năng sinh
enzym phân giải dầu mỏ là hợp chất có cấu tạo phức tạp và khó phân giải, góp phần xử lí ô nhiễm
dầu. Đặc biệt là ở RNM Cần Giờ, các loài NS có khả năng phân giải dầu sẽ sử dụng dầu như nguồn
thức ăn và bảo vệ MT ở đó.
 Khả năng sinh kháng sinh của NS.
KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm
trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác.
Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỉ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất toàn. Chất KS
được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephaco- sporin- C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ
khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch hầu, uốn ván…
Trong phẫu thuật , KS dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương.
Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những
phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS. Những vấn đề về chất kháng có
nguồn gốc từ VSV của RNM đang được quan tâm nghiên cứu hàng đầu và ứng dụng mạnh mẽ
trong nhiều lĩnh vực hiện nay [14].
 Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng.

Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ từ VSV ngày càng nhiều. Các axit hữu cơ như axit
acetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến mủ
cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học. Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất
axit citric bằng A. niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì. Ngoài ra, các nhà khoa học Nhật Bản
tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberelin từ hai chủng F. monoforme và F. oxysporum
[19], [20]
1.2.5 Tình hình nghiên cứu nấm sợi RNM trên thế giới và Việt Nam
Hiện nay, có khoảng 800 - 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995;
Jones, 1995), trong khi đó có một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại. Sự hiểu
biết của loài người về nấm RNM và vai trò của chúng đối với khu HST này còn quá ít và chưa đầy
đủ (Agate A.D., Subramania, C.V và Anuci, V.1998). Sự nghiên cứu về nấm RNM mới chỉ được
các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950.
Theo cơ sở dữ liệu (chưa đầy đủ) của mạng nấm RNM toàn cầu có thể thấy nhiều nước đã và
đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hoá các loài nấm biển có mặt ở vùng RNM của họ.
Cụ thể: Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kông: 170 loài, Đài Loan: 7 loài, Trung Quốc: 2
loài, Singapore: 116 loài, Nhật: 26 loài, Úc: 67 loài, Mỹ: 18 loài, Malaysia: 164 loài, Indonesia: 7
loài, Thái Lan: 83 loài, Brasil: 48 loài, Mexico: 94 loài, Kuwait: 14 loài, Đức: 4 loài. Qua đó, có thể
thấy phân loại nấm biển RNM còn rất ít và chưa đáp ứng đủ yêu cầu cấp bách cho sự tiến bộ của
ngành VSV học [35].
Năm 1988, Agate A.D, Subramania C.V và Vanuci M đã nêu ra tám lĩnh vực nghiên cứu
cấp bách của VSV học RNM cần được các nhà khoa học giải quyết. Trong đó, có lĩnh vực phân loại
và hệ thống hoá cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới.
Năm 1979, Kohlmeyer là người đầu tiên đánh giá vai trò quan trọng của các nấm đối với các
chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM. Ông đã nhận dạng được 43 loài nấm bậc cao,
bao gồm 23 loài thuộc Ascomycetes, 17 loài thuộc Deuteromycetes và 3 loài thuộc Basidiomycetes.
Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nấm RNM trên toàn thế giới. Trong đó, bao gồm 87 loài
thuộc Ascomycetes, 31 loài thuộc Deuteromycetes và 2 loài thuộc Basidiomycetes.
Những nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra một số lượng lớn loài mới, thậm chí là chi mới.
Bộ sưu tập nấm RNM ở Macau và Hồng Kông tìm được 45 loài mới, 28 loài trong số mới này tìm
được ở Macau và 21 loài được tìm thấy ở Hồng Kông (Vrijmoed et al., 1994)

Năm 1990, Sivakumar và Kathiresan đã phân lập được 10 loài nấm từ bề mặt lá của 7 loài
cây ngập mặn. Trong số đó, loài chiếm ưu thế trên bề mặt lá là các loài Alternaria alternate,
Rhizopus nigricans, Aspergillus sp [41].
Một số NS còn có hoạt tính diệt côn trùng mạnh, có thể sử dụng để sản xuất các chế phẩm
diệt côn trùng một cách an toàn. Đây là một nguồn gen quí, rất có giá trị đối với sinh học và y học
(theo Mai Thị Hằng và cộng sự ) [11].
Theo nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007) đã phân lập, tuyển chọn các chủng NS
có hoạt tính cellulaza cao, có khả năng đường hoá giấy in, giấy báo cũ, chuyển hoá nhanh rơm rạ
thành mùn làm phân bón cho cây trồng. Với đặc tính này NS góp phần quan trọng giúp phân giải
xác TV ở RNM Cần Giờ [1].
Bên cạnh đó, công trình nghiên cứu của Phạm Thị Thanh Thuý (2007) đã tuyển chọn được
các chủng NS có khả năng phân giải dầu, góp phần làm phong phú thêm nhóm VSV phân giải dầu,
xử lý ô nhiễm MT dầu ngày nay [20].

NS ở RNM có vai trò lớn đối với việc làm sạch MT sống và
với việc phân giải các chất độc hại trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng
[13]. Bên cạnh đó chúng còn có chức năng là tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu trong việc giữ
cân bằng sinh thái, bảo vệ môi trường.
Kết quả nghiên cứu của Phan Thanh Phương (2007) đã tuyển chọn được các chủng NS có
hoạt tính đối kháng với VSV gây bệnh, hoạt tính phân giải phốt phát khó tan, cùng với khả năng
chịu mặn. Điều này, có ý nghĩa hết sức quan trọng trong chu trình photpho của RNM Cần Giờ [18].
Năm 2009 công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương đã tuyển chọn được các chủng
NS có hoạt tính amylase cao. Với đặc tính này của NS người ta có thể sử dụng những nguyên liệu rẻ
tiền như bã mía, bã khoai mì để sản xuất rượu, bia cho năng suất cao.
Cùng năm 2009 Võ Thị Bích Viên đã khảo sát tính đối kháng của một số chủng nấm sợi thuộc
chi Aspergillus và Penicillium từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh. Đây là một
nguồn gen quí, rất có giá trị trong y học.
1.3 Protein và enzym protease
1.3.1 Protêin
Protein là một loại hợp chất hữu cơ cao phân tử có kết cấu hoá học phức tạp. Protein được

cấu thành từ 4 nguyên tố chính là cácbon, hiđro, oxy và nitơ
.
Các loại prôtêin đơn giản gồm các axit
amin nối nhau nhờ các liên kết peptit bền vững. Các loại prôtêin phức tạp hơn có liên kết thêm với
các nhóm bổ sung. Prôtêin chiếm tới trên 50% khối lượng khô của tế bào và là vật liệu cấu trúc của
tế bào
.

Cấu trúc của prôtêin
Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi pôlipeptit. Đầu mạch
pôlipeptit là nhóm amin (của axit amin thứ nhất), cuối mạch là nhóm cacbôxyl (của axit amin cuối
cùng). Một phân tử prôtêin đơn giản có thể chỉ được cấu tạo từ vài chục axit amin nhưng cũng có
những phân tử prôtêin bao gồm nhiều chuỗi pôlipeptit với số lượng axit amin rất lớn.
Chức năng của protein
Prôtêin là thành phần không thể thiếu được của mọi cơ thể sống. Chúng đóng vai trò cốt lõi
của cấu trúc nhân, của mọi bào quan, đặc biệt là hệ màng sinh học Các enzym có bản chất là prôtêin
đóng vai trò xúc tác cho các phản ứng sinh học.
Một số prôtêin có vai trò như những “xe tải” vận chuyển các chất trong cơ thể (ví dụ
hêmôglôbin).
H
2
O
Tham gia cấu thành các kháng thể có tác dụng bảo vệ cơ thể tránh khỏi sự xâm hại của vi
khuẩn, nâng cao sức đề kháng của cơ thể
Điều tiết áp lực thẩm thấu: Nếu trong bữa ăn bị thiếu protein lâu ngày, hàm lượng protein
trong huyết tương sẽ hạ thấp, thành phần nước trong máu sẽ thấm quá nhiều vào các mô xung
quanh, gây ra phù nề do thiếu dinh dưỡng.
Các hoocmôn - phần lớn là prôtêin – có chức năng điều hoà quá trình trao đổi chất trong tế bào
và trong cơ thể (ví dụ insulin điều hoà lượng đường trong máu).

. Nhiều loại prôtêin tham gia vào chức năng vận động của tế bào và cơ thể (ví dụ miozin trong
cơ, các prôtêin cấu tạo nên đuôi tinh trùng).
Lúc thiếu hụt cacbohiđrat và lipit, tế bào có thể phân giải prôtêin dự trữ cung cấp năng lượng
cho tế bào và cơ thể hoạt động.
Tham gia cấu thành và bồi bổ các tổ chức của cơ thể: là công dụng sinh lý chủ yếu nhất của
protein thần kinh, cơ bắp, nội tạng,…Sự sinh trưởng phát triển của cơ thể, sự đổi mới của các tổ
chức suy lão, sự phục hồi các tổ chức sau tổn thương đều cần đến protein [40].
Ngoài ra, một số prôtêin còn có vai trò là giá đỡ, thụ thể… Sự đa dạng của cơ thể sống do tính
đặc thù và tính đa dạng của prôtêin quyết định.
1.3.2 Đặc điểm của protease từ NS.
Enzyme protease là nhóm enzym xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-
NH-)n trong phân tử protein hoặc các polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài
ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin.







Hình 1.5 : Enzyme protease xúc tác thủy phân liên kết peptid
.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống và enzym này có trong nhiều đối tượng từ vi sinh vật
(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease
động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết, hệ protease VSV
là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình
dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
H
2
NCH CO N

H CHCO – NH CH COOH


R
1
R
2
R
n

H
2
N CH COOH + H
2
NCHCO – NHCHCOOH

R
1
R
2
R
n


H
2
O
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc
hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.

Protease VSV được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid : pH 2- 5
- Protease trung tính : pH 7-8
- Protease kiềm : pH 9.5 - 10.5
Phần lớn những protease acid thương mại được thu từ NS. Các NS được nghiên cứu kỹ nhất
và được sử dụng nhiều nhất để thu enzym là Asperillus saitoi, Asperillus niger, Asperillus oryzae (
Keay etal). Khá nhiều protease acid khác được thu từ Rhizopus sp ( Wang và Hesseltine ) đã được
nghiên cứu.
1.3.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng protease NS trên thế giới và Việt Nam.
Protease VSV được nghiên cứu và thu nhận đầu tiên vào năm 1884 do người Nhật tên là
Takamine. Đó là chế phẩm được tách từ chủng nấm mốc Asperillus oryzae (Kretovitch). Tiếp theo
đó, vấn đề nâng cao khả năng tạo protease của các chủng nấm mốc ứng dụng cho công nghiệp rượu
bia đã được nghiên cứu ở Nhật (Yosida, ) và ở Mỹ ( Matsushima, ).
Đến những năm 70, chế phẩm protease của các chủng nấm mốc Asperillus oryzae có tên
thương mại là Proteorizin Px đã được dùng nhiều ở Liên Xô (Iarovenko, 1973). Protease của các NS
có tính chất bền vững rất cao và tùy thuộc vào từng chủng giống và điều kiện nuôi cấy mà nó mang
tính chất kiềm, axit hay trung tính (Harigara, 1971).
Trong công nghệ thực phẩm người ta sử dụng protease NS để sản xuất phomat ( Mohanty et
al, 1999), sản xuất bánh mì (Hozova et al, 2003) hay chế biến các sản phẩm từ đậu tương (Ghazi et
al ,2003; Ma et al, 2004)
Ở Việt Nam, năm 1993- 1994 TS. Trương Thị Hòa và các cộng sự Viện Công nghiệp thực
phẩm đã nghiên cứu và ứng dụng enzym protease của A.oryzae để thủy phân protein trong hạt ngũ
cốc tạo điều kiện xử lí bia tốt hơn.
Từ năm 2000-2001 nhóm tác giả Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh cùng các cộng sự phòng
vi sinh, Viện Sinh học nhiệt đới đã nghiên cứu cải thiện quy trình công nghệ sản xuất nước tương

bằng phương pháp sử dụng hệ enzym protease của nấm mốc Aspergilus oryzae . Quy trình mới này
rút ngắn được thời gian sản xuất, cho chất lượng nước tương ổn định, mùi vị thơm ngon tự nhiên.
Năm 2003, Lê Thị Cẩm Tú tiến hành chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải protêin cao
và chịu mặn. Luận văn thạc sĩ sinh học Trường ĐHKHTN – TP.HCM.

Năm 2007 Th.S Phan Thị Thanh Quế sử dụng hệ enzym protease của nấm mốc Aspergilus
oryzae để thủy phân protein thịt cá trong chế biến nước mắm.
Ngoài những nghiên cứu về protease của NS còn có những công trình nghiên cứu về các chất
có hoạt tính sinh học từ NS như:
Các chế phẩm từ NS được nghiên cứu và sử dụng phòng trừ nhiều loại côn trùng, VSV gây
hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau ( Harman và Kubicek, 1998)
Từ NS RNM người ta đã thu được một số chất kháng sinh mới có khả năng chống các VSV
gây bệnh đã nhờn các loại thuốc kháng sinh hiện có ( Isaka M, Suyarnsestakorn C, Tanticharoen M,
Kongsaeree P, Thebtaranonth Y, 2002)
Năm 2007 Phan Thanh Phương khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi
phân lập từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh.
Năm 2001 Nguyễn Quang Huy, Cù Việt Nga, Lưu Thị Bích Thảo, Đặng Thị Cẩm Hà phân
lập được một số chủng NS phân giải các thành phần hydrocacbua thơm và các hợp chất mạch vòng
benzen trong dầu mỏ.
Năm 2007 Phạm Thị Thanh Thuý đã nghiên cứu khả năng phân giải carbuahydro của một số
chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ.
 Một số ứng dụng của protease [39], [28]
Trong chế biến thực phẩm

Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một
phần protein trong thịt. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được
chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ. Để
thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các
protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng. Muốn vậy, người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại
protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần
thuỷ phân
Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thời gian chế biến
thường dài, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén,
nguyên liệu cá. Hiện nay, quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện, trong đó sử
dụng chế phẩm protease thực vật (bromelain và papain) và từ VSV để rút ngắn thời gian làm và cải

thiện hương vị của nước mắm.
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ
sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được
dùng trong sản xuất pho mát . Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm
thời gian trộn bột, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.
Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của
bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ
cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn [6].
Công nghiệp dệt

Trong công nghiêp dệt, protease VSV được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi
được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ
tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng.
Công nghiệp thuộc da
Protease được sử dụng để làm mềm da, làm sạch và tẩy lông da. Các protease sẽ làm mềm lớp
biểu bì, phân giải không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một số liên kết của sợi
colagen. Khi xử lý bằng enzym, tính đàn hồi của da cũng tăng lên, rút ngắn được quá trình tẩy lông.
Ở Mỹ, chế phẩm enzyme protease được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Kết quả
đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn
thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ
quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B.
subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công
nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng [4] .
Chế biến các loại bột giặt

Ngày nay, enzyme được dùng nhiều trong việc chế biến các loại bột giặt, nhiều chức năng tẩy
vết bẩn protein, vết máu, vết hồ...
Hương mỹ phẩm

Chế phẩm protease có thể pha chế trong mỹ phẩm như xà bông, dầu gội, kem xoa, dầu chải tóc,

có tác dụng làm da, tóc mềm mại, tách biểu bì đã chết, tạo sự phát triển lớp da non.
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong số ngành khác như:
- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản
xuất một số thức ăn kiêng.
- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm
thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao.
- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, KS
1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp protease của NS a. Nguồn
cacbon
Trong MT nuôi cấy NS sinh protease nhất thiết phải có protein làm chất cảm ứng và nguồn
cacbon. NS có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbohydrat là dễ hấp
thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu trình
chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [24],[25]. Nguồn
cacbon cho sinh trưởng của NS thường dùng là glucose.
b. Nguồn nitơ
Các nguồn nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của NS. Nguồn nitơ dễ hấp thụ
nhất là NH
4
+
và NO
3
-
, chúng thâm nhập vào tế bào dễ dàng và ở đó chúng tạo nên các nhóm imin
và amin.
Các muối amon của axit hữu cơ thích hợp đối với dinh dưỡng của NS hơn là muối amon vô
cơ. Cơ chất dùng để cảm ứng NS sinh protease thường là bột đậu nành, cám, ngô, casein, cao
thịt,…[28].
c. Độ ẩm
Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước có trong cơ chất rắn. Các cơ chất khác
nhau có khả năng giữ nước khác nhau từ 30-80% (Moo-Young, 1983). Trong quá trình nuôi cấy NS

thu protease, độ ẩm tối ưu là 50-60%. Nếu độ ẩm vượt quá 60% tạo điều kiện cho VK phát triển,
nếu độ ẩm <60% gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở NS, hoạt tính enzym sẽ giảm.[25]
d. pH
Sự sinh trưởng của NS sẽ gây ra sự thay đổi pH đáng kể trong cơ chất. Cơ chất bị oxy hóa
không hoàn toàn sẽ sinh ra axit hoặc hấp thụ ion amonium sẽ làm giảm pH. Ngược lại, sự giải
phóng amonium qua sự loại nhóm amin của urea hoặc các amin khác sẽ làm tăng pH. pH tối ưu
cho các loài NS khác nhau từ 3-8 ( Prior, 1992) tùy vào từng chủng . Nhưng đa số NS pH tối thích
là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 [26].
e. Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh protease. Nhiệt độ tối ưu
cho sự sinh trưởng của đa số NS từ 30-32
0
C [26]. Nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được
là 35 - 40
0
C, cá biệt có một số ít loài có thể sống sót ở 0
0
C và ở 60
0
C. Nếu nhiệt độ xuống dưới
24
0
C NS phát triển chậm , sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài dẫn đến làm giảm khả năng sinh
tổng hợp enzym. Nếu nhiệt độ quá cao có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzym bị ức chế
[25].
f.
Thời gian

Thời gian nuôi cấy NS thu enzym trong khoảng 36-60 giờ. Tùy từng chủng và tùy loại enzym
mà thời gian nuôi cấy có thể ngắn hơn hay dài hơn. Đối với A.oryzae và A. awamori nuôi trên MT

cám để sản xuất amylase khoảng 36-40 giờ, nhưng nuôi A .oryzae để thu protease khoảng 48 – 52
giờ [25].
1.3.5 Nuôi cấy và thu nhận enzym từ NS [20]
Nuôi cấy
Nuôi cấy NS để thu enzym người ta thường dùng MT bán rắn
Môi trường bán rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên như: cám, ngô, bột đậu tương,… Môi
trường bán rắn hay dùng nhất là cám. Chất lượng cám ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp
enzym, muốn nâng cao hoạt tính một số enzym cần thêm vào cám các chất cảm ứng như bột đậu
tương giàu protein, bã khoai mì giàu tinh bột, củ cải đường giàu pectin và xelullose,….Ngoài ra, cần
bổ sung thêm khoảng 15 – 20% trấu, rơm băm vụn, mùn cưa…để tạo độ xốp.cho MT.
Môi trường bán rắn cần được làm ướt tới độ ẩm 60 – 65% rồi đem thanh trùng. Môi trường
được tãi mỏng ra các khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2-2.5cm hoặc trong các bình
tam giác, để nguội tới 30
0
C thì tiến hành cấy giống.
Quá trình nuôi cấy NS trên môi trường bán rắn được chia làm 3 thời kì:
Khoảng 10-14 giờ đầu bào tử trương nở bắt đầu nảy mầm, thời kì này chưa hình thành enzym
Thời kì giữa kéo dài khoảng 14-18 giờ, mốc phát triển nhanh hô hấp mạnh, sợi nấm có thể
quan sát thấy bằng mắt thường
Thời kì thứ ba kéo dài trong khoảng 10-20 giờ ,thời gian này các quá trình trao đổi chất vẫn
tiếp tục nhưng yếu dần việc tạo thành enzym của tế bào vẫn tiếp tục
Tùy thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng NS, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm
mà lượng enzym tạo thành tối đa.
Các phương pháp thu nhận enzym [20], [24]
* Chiết rút enzym từ MT bán rắn :
Nguyên tắc: dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzym
Các bình tam giác đã cấy giống sau khi nuôi đủ thời gian, thu lấy MT đem nghiền mịn bằng
cách giã trên cối với sự trợ giúp của cát thạch anh hoặc bột thủy tinh đã được rửa sạch và sấy khô.
Cát hay bột thủy tinh làm tăng khả năng phá vỡ tế bào của VSV mà không làm thay đổi bản chất
enzym.

Sau khi nghiền MT, cho vào đó lượng nước (ở nhiệt độ 25- 28
0
C) gấp 4-5 lần khối lượng MT
để hòa tan enzym. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một ít focmalin hoặc chất sát trùng khác.
Dịch chiết thu được có màu sẫm , khá trong, chứa 10-15% chất khô hoà tan. Tiến hành lọc hoặc
quay ly tâm 3000 vòng/ phút /15 phút, thu và bảo quản dịch lọc trong tủ lạnh 4
0
C. Chế phẩm này
gọi là chế phẩm enzym thô.
* Thu nhận enzym từ dịch nuôi cấy chìm:
Dịch nuôi cấy chìm sau khi lọc sinh khối NS và các tạp chất rắn không tan để thu nhận enzym.
Về nguyên tắc tách enzym từ dịch lọc nuôi cấy chìm cũng tương tự như tách từ dịch chiết từ MT
bán rắn.
Tinh sạch enzym
Nguyên tắc:
Dung môi hữu cơ vào dung dịch protein sẽ làm giảm hằng số điện ly của dung dịch, kết quả là
làm protein mất nước và tạo tủa.
Trong dung dịch, protein tồn tại nhờ sự cân bằng giữa các lực tỉnh điện và các tương tác kị
nước. Vì thế, khi ta đưa muối vào với nồng độ cao, sự cân bằng trên sẽ bị phá vỡ dẫn đến sự tạo
thành tập hợp các protein và tạo tủa.
Tiến hành:
Tủa với các tác nhân : ethanol 96
0
, acetone, muối sunfatamon bão hòa ở nồng độ thích hợp.
Thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30-45 phút. Đối với ethanol và acetone
quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu
2.1.1 Đối tượng
- Các chủng nấm sợi phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây ở 4 xã RNM Cần Giờ TP.
HCM: Tam Thơn Hiệp, An Thới Đơng, Long Hòa, Lý Nhơn
-
Bột đậu tương ,mua ở chợ Tân Định – TP. HCM
-

Cám gạo, trấu

mua ở Vĩnh Long

- Các VSV kiểm định: E.coli, B. subtilis được cung cấp từ viện Pasteur – TP. HCM
- Chế phẩm enzym protease của Cơng ty TNHH dinh dưỡng Á Châu (VN) tỉnh Đồng Nai.
2.1.2 Hóa chất – thiết bị
 Hóa chất
- Glucose, sorbitol, maltose, sucrose, lactosse, pepton, cazein, kitin, tinh bột tan, agar, cồn.
- K
2
HPO
4
, KCl, NaCl, NaOH, NaNO
3
, MgSO
4

7H
2
O, HgCl
2
, NH
4
NO
3
 Thiết bị, dụng cụ
- Các thiết bị:
Nồi hấp vơ trùng Huxley (Đài Loan)
Tủ cấy vơ trùng ( Việt Nam)
Tủ sấy Memmert (Đức)
Tủ ấm Binder (Đức)
KHV quang học, máy chụp hình kỷ thuật số Olympus 5.1 (Nhật)

Tủ lạnh (National - Nhật)
Máy đo pH Hana (Nhật)
Máy li tâm Heraeus( Đức)
Cân điện tử Scientech ( Mỹ)

Máy lắc (Gerhardt - Đức)

- Các dụng cụ thí nghiệm: Thước đo khuẩn lạc, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn,
diêm quẹt, que gạt, que cấy, giấy lọc, lame, lammel, bơng mỡ , bơng thấm nước….
2.1.3 Mơi trường
 MT1: (Czapek) Mơi trường phân lập NS [22], [32]
NaNO
3
3,0g

K
2
HPO
4
1,0g
MgSO
4
0,5g
KCl 0,5g
FeSO
4
0,1g
Glucose 20g
Agar 20g
Nước biển 1000ml
pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút
 MT2: Glucose Yeast Agar (YEA) MT nuôi cấy NS [32]
Cao nấm men 4g
Agar 20g
Glucose 20g
Nước biển 1000ml
pH = 5,5 – 6.0. Khử trùng 1 atm/30 phút
 MT3 thử hoạt tính enzym cellulose [30]
NaNO
3
3,5g
K
2
HPO
4

1.5g
MgSO
4
.7H
2
O 0,5g
KCl 0,5g
FeSO
4
.7H
2
O 0,01g
CMC 10g
Agar 20g
Nước biển 1000ml
pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút
 MT 4: thử họat tính protease [14]
K
2
HPO
4
1.5g
MgSO
4
.7H
2
O 0,5g
KCl 0,5g
FeSO
4

.7H
2
O 0,01g
Cazein 10g
Agar 20g
Nước biển 1000ml
pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút
 MT 5: thử hoạt tính amylase [30]
NaNO
3
3,5g
K
2
HPO
4
1.5g
MgSO
4
.7H
2
O 0,5g
KCl 0,5g
FeSO
4
.7H
2
O 0,01g
Tinh bột tan 15g
Agar 20g
Nước biển 1000ml

pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút
 MT6 thử hoạt tính kitinase [16]
NaNO
3
3,5g
K
2
HPO
4
1.5g
MgSO
4
.7H
2
O 0,5g
KCl 0,5g
FeSO
4
.7H
2
O 0,01g
Bột kitin 10g
Agar 20g
Nước biển 1000ml
pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút
 MT7 :Môi trường nuôi cấy NS tạo enzym protease [16]
Cám :70%
Trấu :25%
Các nguyên liệu chứa chất cảm ứng:(Bột đậu nành ) :5%
Độ ẩm môi trường 60-65%

Khử trùng 121
0
C trong 30 phút
 MT 8: thử hoạt độ enzym protease [20]
Dung dịch NaOH 0,5N
Acid trichloacetic 10%
Casein 1% (R55)
Tyrosine (R57)
Thuốc thử Folin- Ciocalteu (R56)
 MT9: MT phát hiện khả năng phân giải dầu [21]
KH
2
PO
4
: 3.3g
MgSO
4
: 0.4g
KNO
3
: 3g
Na
2
HPO
4
: 0.7g