Nghiên cứu xác lập các điều kiện thích hợp để cố định nấm men saccharomyces cerevisiae trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn nhằm ứng dụng lên rượu vang nho

MỤC LỤC

1


DANH MỤC BẢNG

2


MỤC LỤC HÌNH

3


DANH MỤC MỘT SỐ THUẬT NGỮ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ADH
DCM
DEAE-cellulose
GAE

: Alcohol dehydrogenase
: Deligninfied cellulose material, cellulose đã tách lignin
: Diethylaminoethyl-cellulose
: Gallic acid equivalents, hàm lượng được tính theo acid gallic

MLF

: Malolactic fermentation, quá trình lên men malolactic

Nmcđ/A

Nmcđ/Akn

: Nấm men vang cố định trong gel alginate
: Nấm men cố định trong gel alginate không được ngâm trong dung
dịch CaCl2 sau mỗi chu kỳ tái sử dụng
: Nấm men cố định trong gel alginate được ngâm trong dung dịch
CaCl2 sau mỗi chu kỳ tái sử dụng
: Nấm men vang cố định trên cellulose vi khuẩn
: Nấm men tự do
: Scaned electronic microscope, kính hiển vi điện tử quét

Nmcđ/An
Nmcđ/B
Nmtd
SEM

-4-

4


MỞ ĐẦU

Rượu vang là một thức uống lên men từ dịch nho sử dụng nấm men
Saccharomyces cerevisiae [1], [2]. Rượu vang được nhiều người ưa thích do hương vị
hết sức đặc trưng và những tác dụng có lợi cho sức khỏe [3], [4].
Yếu tố quyết định chất lượng của một sản phẩm rượu vang, bên cạnh nguyên liệu
nho, là giống nấm men. Giống nấm men được xem là mấu chốt công nghệ để tạo ra
những loại rượu vang có chất lượng khác nhau. Những chủng nấm men vang thuộc
loài Saccharomyces cerevisiae đã được phân lập từ nho trong quá trình lên men rượu

vang tự nhiên và được cấy chuyền lưu giữ để phục vụ cho ngành công nghiệp rượu
vang. Hiện nay, hầu hết các nhà máy sản xuất rượu vang, bao gồm những nhà máy ơ
Việt Nam, vẫn sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae dạng tự do để lên men
rượu vang. Mặc dù chất lượng sản phẩm đã ổn định hơn so với rượu vang lên men tự
nhiên, nhưng việc sử dụng nấm men tự do để lên men rượu vang vẫn còn khá nhiều
nhược điểm. Đặc biệt khi tiến hành lên men trong những điều kiện không thuận lợi thì
sự sinh trương cũng như khả năng sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất của nấm men
tự do bị ức chế rõ rệt [5], [6], [7].
Một trong những giải pháp để khắc phục các nhược điểm trên là sử dụng nấm men
cố định. Các nghiên cứu về sử dụng nấm men cố định trong sản xuất rượu vang đều
cho thấy nấm men cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với nấm men tự do [8], [9].
Ngoài ra, khả năng tái sử dụng của nấm men cố định còn đem lại nhiều lợi ích về mặt
kinh tế vì chi phí sản xuất giảm.
Để cố định nấm men lên men rượu vang, phương pháp keo tụ tế bào tỏ ra không
thích hợp vì những tế bào nằm tại vùng tâm của khối keo tụ khó tiếp xúc với cơ chất
[10], [11]; phương pháp nhốt tế bào bằng màng membrane hay vi bao cũng ít được sử
dụng vì membrane dễ bị tắt nghẹt bơi các chất keo có trong dịch nho [12]. Đối với
phương pháp nhốt tế bào trong cấu trúc gel, nhiều loại chất mang đã được sử dụng như
alginate [13], [14], agar [15], gelatin [16], κ-carrageenan [17], polyacrylamide [18],
polystyrene [19]. Alginate là vật liệu được sử dụng phổ biến nhất; hơn 80% các nghiên
cứu về cố định tế bào trên thế giới đã sử dụng alginate. Chế phẩm nấm men cố định

-5-

5


trong gel alginate đã được thương mại hóa và được ứng dụng trong quy trình sản xuất
rượu vang ơ quy mô lớn.
Nấm men cố định bằng phương pháp hấp phụ trên bề mặt chất mang xốp như

kissiris [20], [21], vải cotton [22], mẫu thủy tinh xốp [23], ceramic [24], [25], hay trên
chất mang giàu cellulose như bã mía [26], miếng trái cây [27]… cũng được ứng dụng
để lên men rượu vang. Trong vài năm gần đây, có hai công bố khoa học về việc sử
dụng cellulose vi khuẩn làm chất mang cố định nấm men để ứng dụng trong quá trình
lên men sản xuất rượu vang và ethanol [28], [29]. Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có các
nghiên cứu chuyên sâu về nấm men vang cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn.
Chất mang cellulose vi khuẩn và chế phẩm tế bào cố định trên cellulose vi khuẩn vẫn
chưa được thương mại hóa ơ thị trường trong và ngoài nước.
Với những phân tích như trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xác lập các
điều kiện thích hợp để cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trong gel
alginate và trên cellulose vi khuẩn nhằm ứng dụng lên men rượu vang nho”.
Chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu một cách hệ thống về khả năng sử dụng nấm men
nhốt trong gel alginate và nấm men hấp phụ trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên
men chính rượu vang nho. Mục đích của nghiên cứu là so sánh hiệu quả sử dụng hai
chế phẩm nấm men vang cố định, trong đó có một chất mang đã được sử dụng phổ
biến (alginate) và một chất mang mới (cellulose vi khuẩn). Kế thừa kết quả đã công bố
của một số nhà khoa học trong nước, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chất
mang alginate và cellulose vi khuẩn có nguồn gốc tại Việt nam.
Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi tìm điều kiện thích hợp để cố định nấm
men vang trên hai loại chất mang alginate và cellulose vi khuẩn, so sánh khả năng lên
men rượu vang của nấm men cố định trên hai loại chất mang cùng với nấm men tự do,
so sánh khả năng tái sử dụng của nấm men cố định và thiết lập phương trình cân bằng
vật chất cho quá trình lên men chính rượu vang nho cho cả hai loại nấm men cố định
và nấm men tự do.

-6-

6

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1 Nấm men vang
1.1.1 Phân loại nấm men vang
Nấm men vang có thể được chia thành hai nhóm là Saccharomyces và nấm men
bản địa.
Saccharomyces cerevisiae là loài nấm men chủ lực thực hiện quá trình lên men
ethanol trong sản xuất rượu vang. Chính vì thế, Saccharomyces cerevisiae còn được
gọi là “nấm men vang” [1], [2], [30].
Nấm men bản địa bao gồm một số giống nấm men khác trong dịch nho lên men
như Kloeckera, Metschnikowia, Torulaspora, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces,
Candida, Pichia, Cryptococcus. Hầu hết các loài thuộc nấm men bản địa không có khả
năng tồn tại khi nồng độ ethanol cao hơn 6%v/v, ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis
có thể phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol lên đến 12%. Trước đây, nấm
men bản địa được xem là các vi sinh vật gây hư hỏng rượu vang. Tuy nhiên, những
nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, một số loài nấm men bản địa có lợi cho chất lượng
sản phẩm, làm đa dạng hóa hương vị của rượu vang [5], [31].
1.1.2 Quá trình lên men rượu vang
Lên men rượu vang tự nhiên là quá trình lên men vang xảy ra tự nhiên mà không
cần cấy giống. Thường thì các giống nấm men bản địa như Kloeckera, Hanseniaspora
và Candida chiếm tỷ lệ cao trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. Ở giai đoạn tiếp
theo, Pichia và Metschnikowia chiếm ưu thế. Ở giai đoạn lên men cuối cùng, chỉ còn
lại Saccharomyces cerevisiae tồn tại nhờ khả năng chịu được nồng độ ethanol cao. Các
giống nấm men khác như Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces,
Zygosaccharomyces, Brettanomyces cũng có thể sống sót trong quá trình lên men và là
nguyên nhân gây nên những “khuyết tật” liên quan đến giá trị cảm quan của sản phẩm
[3], [7], [32].
Lên men rượu vang nhân tạo bao gồm quá trình xử lý dịch nho bằng SO2, nhằm
hạn chế sự phát triển không mong muốn của một số loài nấm men bản địa, và chủ
-7-

7


động cấy giống Saccharomyces cerevisiae để khơi đầu quá trình lên men. Nhờ vậy,
quá trình lên men vang diễn ra nhanh hơn, an toàn hơn và có thể tạo ra rượu vang với
hương vị đặc trưng ổn định. Tuy nhiên, một số ít phân xương sản xuất vang ơ quy mô
nhỏ vẫn sử dụng phương pháp lên men tự nhiên vì quy trình đơn giản mặc dù chất
lượng sản phẩm kém ổn định [6], [30].
1.2 Các phương pháp cố định tế bào nấm men vang
Kỹ thuật cố định tế bào nấm men được ứng dụng trong ngành công nghiệp thức
uống lên men như rượu vang nho, vang táo, bia và nước trái cây lên men có nồng độ
ethanol thấp. Mục đích chính của việc sử dụng nấm men cố định là để rút ngắn thời
gian lên men, tái sử dụng nấm men và ổn định chất lượng sản phẩm. Bảng 1.1 tóm tắt
một số ứng dụng của nấm men cố định trong sản xuất thức uống chứa ethanol.
Bảng 1.1 Ứng dụng của nấm men cố định trong sản phẩm thức uống chứa ethanol
Sản phẩm
Vang nho

Vang táo
Vang dứa
Bia nghèo ethanol
Bia
Bia nồng độ cao

Vi sinh vật
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. bayanus
C. stellata + S. cerevisiae
S. cerevisiea

S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea+L. oenos
S. bayanus+L. oenos
S. cerevisiea
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae

Chất mang
DEAE-cellulose
Khoáng kissiris
Ca-alginate
Ca-alginate
Mảnh γ-alumina
Miếng táo
Cellulose vi khuẩn
Hạt lúa mì
Vỏ nho, lõi bắp
Ca-alginate
Ca-alginate
Ca-alginate
Miếng dứa
DEAE-cellulose
κ-caraageenan

Ca-alginate
DEAE-cellulose
Ca-alginate

Nguồn
Lommi H. et al., 1990 [33]
Bakoyianis V. et al., 1992 [20]
Busova K.et al., 1994 [34]
Ferraro L. et al., 2000 [35]
Loukatos P.et al., 2000 [36]
Kourkoutas Y. et al., 2001 [27]
Nguyen T.H. et al., 2008 [28]
Kandylis P., 2010 [37]
Genisheva Z., 2011 [38]
Kassim H.C, 2012 [39]
Cabranes C. et al., 1998 [40]
Nedovic V.A. et al., 2000 [41]
Diep T.X. et al.,2009 [42]
Van Iersel M., 1995 [43]
Smogrovicova D., 1999 [44]
Patkova J., 2000 [45]
Kourkoutas Y. et al., 2004 [46]
Tran Q. H., et al., 2008 [47]

1.2.1 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào
Chất mang vô cơ: chúng có độ bền cơ học và hóa học cao. Tuy nhiên sản phẩm lên
men thu được thường bị lẫn các tạp chất có xuất xứ từ chất mang. Chất mang vô cơ
thường gặp là hạt thủy tinh, ceramic dạng khối trụ hay dạng hạt, các kissiris khoáng,
gamma-alumina…
Chất mang hữu cơ: chúng không làm cho sản phẩm lên men bị lẫn tạp chất, bền

nhiệt và tương đối ổn định về mặt hóa học trong điều kiện lên men. Chất mang hữu cơ
-8-

8


cố định nấm men bao gồm các polymer tổng hợp như gel polyvinylalcohol,
polyvinylchloride, màng polyethylene, các chất mang tự nhiên bản chất polysaccharide
như agar, alginate, chitosan, pectin, carrageenan, dẫn xuất diethylaminoethylen của
cellulose (DEAE-cellulose), cellulose đã tách lignin (Delignified cellulose), cellulose
vi khuẩn (Bacterial cellulose), hạt lúa mì, lúa mạch, các miếng trái cây như miếng táo,
lê, mộc qua, quince, sung, nho… một số loại phế liệu như bã malt, bã mía, lõi bắp, vỏ
nho, bã nho ép, vỏ dưa hấu… và các chất mang tự nhiên bản chất protein như gelatin,
viên gluten (Bảng 1.2)
Bảng 1.2 Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang
Chất mang
Chất mang
vô cơ

Loại chất mang
Montmorilonite, polygorskite
Thủy tinh
Kissiris
γ-alumina

Chất mang
hữu cơ

Hydroxyapatite ceramics
κ-carrageenan

Acid pectic, agar
Alginate

Cellulose vi khuẩn
Cellulose đã tách lignin
Gelatin
Gluten
Polyvinyl alcohol
Polystyren
Miếng lê
Miếng mộc qua
Miếng táo
Nho khô
Quả sung
Miếng ổi
Hạt lúa mì, hạt lúa mạch
Củ cải đường
Vỏ nho
Vỏ dưa hấu
Bã mía
Vỏ kén tằm
Thân, gốc cây bắp
Chất mang
kết hợp

Nội nhũ hạt
Đĩa thủy tinh phủ alginate

Nguồn
Ageeva N.M. et al., 1985 [48]

Hamdy M.K., 1990 [49]
Bakoyianis V. et al., 1992,1997 [20], [21]; Argiriou T. et
al.,1996 [50]; Loukatos P. et al., 2003 [51]
Bakoyianis V. et al.,1997 [21]; Loukatos P. et al., 2000 [36];
Galanakis M.C. et al., 2012 [52]
Rapoport A., et al.,2011 [25]
Nakanishi K. et al.,1987 [53]; Goødia F. et al.,1991 [54]
Nakanishi K. et al.,1987 [53]
Mori S., 1987 [55]; Fumi M.D. et al.,1987,1988,1989 [56],
[57], [58]; Rosini G. et al.,1993 [59], Yokotsuka K. et
al.,1993,1997,2003 [60], [61], [62]; Busova K. et al.,1994
[34]; Suzzi G. et al.,1996 [63]; Bakoyianis V. et al.,1997
[21]; Ferraro L. et al.,2000 [35]; Silva S. et al., 2002,2003
[64], [65]; Kassim H.C., 2012 [39]
Nguyen T.H. et al., 2008 [28]; Yao W. et al., 2011 [29]
Bardi E.P. et al.,1996 [66]; Balli D. et al., 2003 [67];
Loukatos P. et al., 2003 [51]; Mallouchos A. et al., 2003 [68]
Parascandola P. et al.,1992 [16]
Bardi E.P. et al.,1996,1997 [66], [69]; Iconomopoulou M. et
al., 2002 [70]; Plessas S. et al., 2005 [71]
Martynenko N.N. et al., 2004 [72]
Tran T.H.C. et al., 2012 [19]
Mallios P., et al.,2004 [73]
Kourkoutas Y. et al., 2002,2003,2005 [74], [75], [76]
Kourkoutas Y. et al., 2001,2002,2006 [27], [77], [78]
Tsakiris A. et al., 2004 [79]
Bekatorou A. et al., 2002 [80]
Reddy V.L. et al., 2006 [81]
Kandylis P. et al., 2010, 2012 [37], [82]
Vucurovic M.V. et al., 2012 [83]

Mallouchos A. et al., 2002,2003 [84], [85]
Reddy V.L. et al., 2008 [86]
Yu J. et al., 2010 [26]
Rattanapan A. et al., 2011 [87]
Vucurovic M.V. et al., 2008 [88]; Razmovski R. et al., 2012
[89]
Kopsahelis N. et al., 2007 [90]
Ogbonna J.C. et al.,1989 [91]

-9-

9


1.2.2 Các phương pháp cố định tế bào nấm men vang
Cố định tế bào bằng cách gắn trên bề mặt chất mang rắn: Tế bào nấm men có thể kết
dính trên bề mặt chất mang rắn nhờ những tương tác vật lý như lực mao quản, liên kết
tĩnh điện, liên kết ion, liên kết kỵ nước, hoặc liên kết cộng hóa trị. Phương pháp này
yêu cầu bề mặt chất mang phải có cấu trúc xốp hoặc có chứa nhiều nhóm chức hóa học
khác nhau như hạt thủy tinh xốp, thanh ceramic, DEAE-cellulose, bã mía, hạt gluten,
miếng trái cây [23], [25], [26], [33], [70], [81].
Cố định tế bào bằng cách nhốt trong khung mạng xốp: Các tế bào được đưa vào bên
trong một khung mạng xốp để ngăn cản tế bào khuếch tán ra môi trường xung quanh
nhưng vẫn cho phép tế bào hấp thu các chất dinh dưỡng và trao đổi chất. Chất mang
thường là các loại polysaccharide (alginate, κ-carrageenan, agar, chitosan, pectin),
protein (gelatin, collagen), polymer tổng hợp (polyacrylamide, polyvinylalcohol,
polyurethane, polyvinylchloride, polystyrene). Chất mang thường có cấu trúc khung
mạng gel (ion gel, covalent gel, non-covalent gel, cryogel) [39], [46], [72], [92], [93],
[94].
Cố định tế bào bằng cách keo tụ: Các tế bào nấm men S. cerevisiae có khả năng tự

bám chặt với nhau và hình thành nên khối bao gồm hàng ngàn tế bào nhờ các tương
tác vật lý hay hóa học. Có 2 kiểu keo tụ tế bào: keo tụ tự nhiên (không sử dụng hóa
chất) và keo tụ nhân tạo (sử dụng hóa chất để tạo liên kết giữa các tế bào). Phương
pháp cố định này ít sử dụng cho nấm men vang vì các tế bào ơ bên trong khối nấm
men khó tiếp xúc với các chất dinh dưỡng có trong canh trường [46].
Cố định tế bào bằng cách nhốt bên trong một màng chắn: Sự khuếch tán của tế bào ra
môi trường bên ngoài được ngăn chặn bằng cách bao bọc chúng vào trong các
membrane nhưng vẫn đảm bảo quá trình trao đổi chất giữa chúng với môi trường.
Chất mang là sợi thủy tinh, nylon và một số màng bán thấm khác như polyvinyl
chloride, cellulose acetate, polyamide. Phương pháp này ít được sử dụng cho nấm men
vang vì các membrane dễ bị nghẹt bơi các hợp chất keo trong dịch nho khi thực hiện
quá trình lên men vang [29], [46], [95], [96], [97], [98], [99].

-10-

10


1.2.3 Nấm men vang cố định
1.2.3.1 Những thay đổi về đặc điểm sinh học của nấm men cố định
Việc cố định tế bào sẽ làm thay đổi hình thái, sinh lý và các hoạt động trao đổi chất
của nấm men [46], [100].
Khả năng sinh trưởng: Nấm men cố định thường có khả năng sinh trương kém
hơn so với nấm men tự do vì khả năng hấp thu oxy giảm. Tế bào nấm men cố định có
hình dạng và kích thước không đồng đều. Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm men cố định
sinh trương đến một giới hạn nhất định và giữ nguyên lượng sinh khối cho đến khi kết
thúc quá trình lên men [101], [102], [103].
Hoạt động trao đổi chất: Nấm men cố định có tốc độ sử dụng glucose, tốc độ sinh
tổng hợp ethanol và glycerol cao hơn nhiều so với nấm men tự do vì nấm men khi
được cố định trên chất mang sẽ có những thay đổi về đặc tính sinh lý, hoạt tính

enzyme và có pH nội bào thấp hơn so với nấm men tự do [21], [100], [104], [105].
Khả năng lên men trước những biến đổi bất lợi trong quá trình lên men: Nấm
men cố định có khả năng chịu được sự ức chế của cơ chất và sản phẩm trao đổi chất
cao hơn nấm men tự do [106], [107], [108], [109]. Ở những điều kiện lên men cực
đoan thì nấm men cố định cũng thể hiện ưu thế do chất mang đã bảo vệ tế bào trước
các tác động bất lợi của dịch lên men [110], [111], [112], [113], [114], [115], [116],
[117], [118], [119], [120], [121], [122].
Sự tạo thành hợp chất hương: So với nấm men tự do, nhìn chung nấm men cố
định tạo thành nhiều ester hơn, tạo thành ít diacetyl, acetaldehyde, methanol, acid dễ
bay hơi và rượu bậc cao hơn. Loại chất mang, phương pháp cố định cũng có ảnh
hương đến khả năng tạo thành hợp chất hương và các sản phẩm phụ khác [46], [85],
[123], [124], [125], [126], [127].
1.2.3.2 Ưu thế của nấm men cố định trong quá trình lên men vang
Việc sử dụng tế bào nấm men cố định để lên men vang có nhiều thuận lợi. Chất
mang đóng vai trò tác nhân bảo vệ tế bào trước những tác động bất lợi từ môi trường
lên men như sự thay đổi về nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất ban đầu và sản phẩm cuối,
từ đó làm ổn định và kéo dài hoạt tính lên men. Quá trình trao đổi chất của tế bào cố
định biến đổi theo chiều hướng tăng hiệu quả sử dụng cơ chất, sản phẩm được tạo ra
-11-

11


nhiều hơn. Mật độ tế bào nấm men cố định trên một đơn vị thể tích canh trường cao
nên làm giảm thời gian lên men [46], [109], [112], [122].
Khi sử dụng nấm men cố định để lên men vang, quá trình tách nấm men ra khỏi
dịch lên men được thực hiện nhanh và dễ dàng, từ đó làm giảm chi phí cho việc thu
hồi sản phẩm [81], [84].
Nấm men cố định có thể tái sử dụng được nhiều chu kỳ và có nhiều khả năng ứng
dụng trong quy trình lên men liên tục ơ quy mô công nghiệp, từ đó mang lại hiệu quả

kinh tế cao [21], [102].
Tuy vậy, sử dụng nấm men cố định cũng còn một số hạn chế khi hiện tượng tế bào
thoát ra khỏi chất mang quá nhiều, cấu trúc chất mang bị phá hủy trong quá trình sử
dụng, sự khuếch tán cơ chất đến tế bào ơ trung tâm của khối chất mang bị hạn chế
[46], [128].
1.3 Cố định nấm men vang trong gel aglinate
1.3.1 Alginate
Alginate hay algin là tên gọi thường được sử dụng cho muối alginic acid. Alginate
hiện diện trong thành tế bào của các loài rong nâu (Phaeophyceae), chiếm đến 40%
khối lượng chất khô và thường ơ dạng muối alginate của calcium, magnesium và
sodium. Mặc dù có một vài nguồn gốc khác nhau, tuy nhiên tất cả các alginate thương
mại hiện nay đều có nguồn gốc từ rong biển và dạng Ca alginate là thích hợp nhất để
tạo khung mạng gel cố định nấm men để lên men rượu vang [129].
1.3.1.1 Đặc điểm cấu tạo của alginate
Alginate là một copolymer không phân nhánh, bao gồm các monomer β-Dmannuronic acid (M) và α-L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thông qua liên kết
1,4-glycoside. Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block.
Tỷ lệ của mannuronic acid và guluronic acid (M/G) của alginate từ rong biển dao
động trong một khoảng rộng tùy theo loài rong và mùa thu hoạch. Tỷ lệ này ảnh
hương đến độ bền gel Ca alginate [129], [130], [131].

-12-

12


Hình 1.1. Cấu trúc của alginate [129]
(a-các monomer của alginate; b-chuỗi alginate; c-sự phân bố các block)

1.3.1.2 Cơ chế tạo gel của alginate
Alginate có khả năng kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao để tạo gel. Ái lực

của alginate đối với các ion hóa trị 2 giảm theo trình tự: Pb 2+ - Cu2+ - Cd2+ - Ba2+ - Sr2+
- Ca2+ - Co2+ - Ni2+ - Zn2+ - Mn2+. Tùy thuộc vào loại ion liên kết và nguồn gốc
alginate mà gel tạo thành có tính chất khác nhau. Thông thường, người ta thường sử
dụng Ca2+ để làm ion tạo gel [131], [132].

Hình 1.2. Sự hình thành gel của alginate với ion Ca2+ [129]
1.3.2 Các phương pháp cố định vi sinh vật trong gel alginate
1.3.2.1 Các phương pháp tạo gel alginate
Có hai phương pháp tạo gel alginate: tạo gel từ ngoài và tạo gel từ trong.
Phương pháp tạo gel từ ngoài phổ biến hơn vì tạo gel nhanh và thao tác đơn giản.
Khi nhỏ giọt dung dịch alginate vào dung dịch có chứa cation, thường là Ca 2+, bề mặt
ngoài của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hóa. Sau đó, các cation tiếp tục khuếch tán vào
bên trong hạt làm cho các phân tử alginate bên trong tiếp tục bị gel hóa [129], [133].
-13-

13


Phương pháp tạo gel từ trong mang lại tính đồng nhất và đa dạng về hình thức cho
cấu trúc gel. Cho muối chứa Ca2+ dạng không tan như CaCO3, CaSO4, EDTA-Ca, Ca
citrate… vào dung dịch alginate, sau đó thay đổi độ hòa tan của muối bằng cách chỉnh
pH dung dịch. Ca2+ giải phóng dần và tạo gel với alginate [134], [135], [136].
Đa số các nghiên cứu về cố định tế bào nấm men trong gel alginate đều sử dụng
phương pháp tạo gel từ ngoài. Sinh khối nấm men sẽ được thêm vào dung dịch
alginate rồi nhỏ giọt vào dung dịch CaCl 2. Các hạt gel chứa tế bào nấm men vừa tạo
thành sẽ được tiếp tục ngâm trong dung dịch CaCl 2 một thời gian để ổn định cấu trúc
trước khi được sử dụng trong quá trình lên men [13], [14], [137].

Hình 1.3. Cơ chế tạo gel của alginate từ bên ngoài (trái) từ bên trong (phải) [129]
1.3.2.2 Ảnh hưởng của các điều kiện tạo gel đến độ bền gel và quá trình lên men

Khối lượng phân tử alginate: khối lượng phân tử alginate ảnh hương nhiều đến độ
bền gel. Mạch alginate càng dài thì cấu trúc gel càng bền, nhưng ít ảnh hương đến khả
năng khuếch tán của glucose, tốc độ lên men và sự tạo thành ethanol của nấm men cố
định trong gel alginate [133], [138].
Tỷ lệ M/G: là phần mol của D-mannuronic acid (M) so với L-guluronic acid (G).
Alginate có hàm lượng G nhỏ hơn 20-25% sẽ không tạo gel được. Alginate có hàm
lượng G lớn sẽ tạo thành gel xốp, chắc, không biến dạng và giữ được độ cứng trong
một thời gian dài. Alginate có hàm lượng M cao tạo thành gel mềm, ít xốp và dễ bị rã
hơn. Gel alginate giàu G thích hợp để cố định nấm men hơn vì gel này ít gây cản trơ
đến khả năng khuếch tán của glucose và hạn chế sự sinh trương của tế bào nấm men
sau khi cố định [130], [132], [138], [139].
Nồng độ alginate: nồng độ alginate không ảnh hương đến kích thước, hình dạng
hạt gel nhưng ảnh hương đến độ bền của hạt gel. Khi tăng nồng độ dung dịch alginate
-14-

14


sẽ tăng độ bền hạt gel, khả năng giữ nước của gel cũng tốt hơn nhưng tốc độ lên men
và sinh tổng hợp ethanol lại giảm đáng kể. Nồng độ alginate thích hợp để cố định nấm
men thường là 2% [133], [140], [141].
pH tạo gel: Cấu trúc hạt gel alginate không bị ảnh hương bơi pH trong khoảng từ 4
– 10. Khi pH nhỏ hơn 4, thể tích của hạt sẽ giảm; khi pH cao hơn 10, thể tích của hạt
tăng; pH nhỏ hơn 2, các hạt gel rất nhỏ và không đàn hồi. pH của dung dịch alginate
thích hợp cho quá trình tạo gel cố định tế bào nấm men nằm trong khoảng từ 6,0 đến
8,0. Nằm ngoài khoảng này, khả năng khuếch tán của glucose và độ bền gel đều giảm.
Nhiệt độ tạo gel: nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo gel là thấp hơn 25 oC. Trong
điều kiện này, độ bền gel và khả năng khuếch tán của glucose gần như không bị ảnh
hương. Các tính chất này sẽ giảm nhanh khi nhiệt độ tạo gel cao hơn 27oC [138], [142]
Nồng độ cation tạo gel: khi tăng nồng độ cation tạo gel thì gel tạo thành sẽ bền

chắc hơn. Bản chất của cation tạo gel cũng ảnh hương đến độ bền gel. Độ bền gel tạo
thành từ các cation kim loại sẽ tăng dần theo thứ tự: Co 2+ - Ca2+ - Sr2+ - Ba2+ - Cd2+ Cu2+. Ion Ca2+ thường được sử dụng để tạo gel cố định tế bào nấm men. Nồng độ
CaCl2 thích hợp cho việc tạo gel alginate thường là 2%. Nếu giá trị này lớn hơn 10%
thì tốc độ tăng trương của Saccharomyces cerevisae bị ức chế [132], [136].
Kích thước hạt gel: kích thước hạt gel ảnh hương đến sự truyền khối trong quá
trình lên men. Các hạt có đường kính nằm trong khoảng 0,5-0,6mm là thích hợp cho
quá trình phát triển của tế bào cũng như hiệu quả lên men [135].
Mật độ tế bào trong hạt gel: khi tăng mật độ tế bào ban đầu trong hạt gel trong một
giới hạn xác định thì tốc độ lên men tăng lên nhưng hiệu suất sinh tổng hợp ethanol sẽ
giảm đi [46].
1.3.3 Ưu nhược điểm của phương pháp cố định nấm men trong gel alginate
Nấm men cố định trong gel alginate đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi
trong các quy trình sản xuất rượu vang chu kỳ hay liên tục do quá trình cố định
dễ thực hiện, hiệu suất cố định và mật độ tế bào trong hạt gel cao, điều kiện cố
định ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất nên các tế bào cố định
không bị mất hoạt tính lên men. Ngoài ra, alginate là chất mang trơ về mặt hóa
học, an toàn, độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản
phẩm, gel alginate khá bền khi lên men ơ nhiệt độ cao [46], [117].
-15-

15


Nhược điểm chính của phương pháp này là độ bền của hạt gel alginate chứa
nấm men cố định sẽ giảm dần theo thời gian lên men do sự sinh trương của các
tế bào và do sự giải phóng CO2 bên trong hạt gel làm phá vỡ cấu trúc của gel.
Giá trị pH cao và sự có mặt của hợp chất phosphate, citrate và lactate trong môi
trường lên men cũng làm cho độ bền gel giảm dần [46], [142], [143].
Một số giải pháp đã được nghiên cứu để tăng độ bền gel hoặc tăng hoạt tính
lên men của nấm men cố định trong gel alginate như tạo lớp gel kép [139]; đồng

cố định nấm men trong alginate và pectin [144].
1.4 Cố định nấm men vang trên cellulose vi khuẩn
1.4.1 Cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn là polymer do các gốc đường glucose liên kết với nhau bằng
liên kết β-1,4-glycoside. Các chuỗi glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der
Waals và liên kết hydro tạo nên cấu trúc tiền sợi, rồi kết tinh thành sợi, bó, dải.
Cellulose vi khuẩn được phân biệt với cellulose thực vật nhờ vào chỉ số kết tinh cao
(trên 60%). Độ trùng hợp của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật lần lượt dao
động trong khoảng 2.000–6.000 và 13.000–14.000. Ngoài ra, đường kính của sợi
cellulose vi khuẩn chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của sợi cellulose thực vật [145],
[146], [147].

Hình 1.4. Cấu trúc cellulose vi khuẩn (trái) và cellulose thực vật (phải) [148]

Hình 1.5. Cấu trúc cellulose vi khuẩn I (trái) và cấu trúc cellulose vi khuẩn II (phải)
[149]
-16-

16


Trong môi trường nuôi cấy tĩnh thường xuất hiện dạng sợi cellulose vi khuẩn I với
đường kính 0,05-0,1 m, kết lại thành màng dày trên bề mặt môi trường. Cellulose vi
khuẩn I có độ chịu lực cao, độ bền cơ học cao, sức căng lớn, khối lượng nhẹ, kích
thước ổn định, thích hợp với việc cố định tế bào vi sinh vật.
Cellulose vi khuẩn II là dạng sợi cellulose được tạo thành trong môi trường nuôi
cấy bề sâu. Các sợi cellulose này thường uốn cong, đường kính 0,1-0,2 µ m, phân bố
khắp môi trường nuôi cấy hoặc kết hợp lại với nhau thành các hạt dạng cầu hay hình
sao. Khi được sử dụng làm chất mang cố định tế bào vi sinh vật, cellulose vi khuẩn II
tuy có độ chịu lực không cao bằng cellulose vi khuẩn I nhưng có ưu thế là độ trương

nơ và ngậm nước cao [146], [148], [149].
Cellulose vi khuẩn là loại cellulose sinh học duy nhất không chứa lignin hay
hemicellulose, do đó việc thu nhận cellulose vi khuẩn không phải qua những bước xử
lý phức tạp, sợi cellulose bền hơn và vẫn giữ lại những đặc tính quan trọng. Màng
cellulose vi khuẩn có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút lượng nước gấp 60-700
lần khối lượng của nó. Độ xốp của cellulose vi khuẩn có thể điều chỉnh được nhờ khả
năng hút và giữ nước cao [102], [150], [151], [152].
1.4.2 Các phương pháp cố định vi sinh vật trên chất mang cellulose vi khuẩn
1.4.2.1 Phương pháp hấp phụ
Sự hấp phụ tế bào lên bề mặt cellulose vi khuẩn xảy ra là do chất mang có cấu trúc
xốp, nhiều mao quản. Phương pháp này được thực hiện bằng cách ngâm chất mang
trong dung dịch huyền phù vi sinh vật. Cellulose vi khuẩn sẽ trương nơ dần và vi sinh
vật sẽ tự động kết lắng và hấp phụ trên bề mặt chất mang [10].
Trong quá trình cố định, cellulose vi khuẩn sẽ trương nơ hoàn toàn, tạo điều kiện
hấp phụ tế bào nấm men tốt hơn so với những chất mang cellulose thực vật. Hiệu suất
cố định khá cao, có khả năng ứng dụng lên men ơ nhiệt độ thấp. Ngoài những nhược
điểm của phương pháp hấp phụ là thời gian cố định dài, tỷ lệ thoát bào cao, các nghiên
cứu cho thấy mật độ tế bào bên trong cấu trúc miếng cellulose vi khuẩn nhỏ hơn rất
nhiều lần so với mật độ tế bào hấp phụ trên bề mặt [10], [29], [149], [151].
-17-

17


1.4.2.2 Phương pháp hấp phụ- ủ
Vi sinh vật cố định trên cellulose vi khuẩn sau thời gian hấp phụ có thể sử dụng
chất dinh dưỡng đã được khuếch tán vào trong cấu trúc của chất mang để tăng sinh
khối trong giai đoạn ủ. Quá trình cố định gồm giai đoạn hấp phụ như đã nói ơ trên, và
giai đoạn ủ, tăng mật độ vi sinh vật trong cấu trúc cellulose vi khuẩn. Phương pháp
hấp phụ-ủ không những đã làm tăng mật độ vi sinh vật trong chất mang lên nhiều lần,

mà còn ổn định mật độ vi sinh vật cố định trên chất mang trong một thời gian dài
[149].
1.4.3 Ưu nhược điểm của phương pháp cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn
Nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn tuy chỉ mới được nghiên cứu trong
thời gian gần đây nhưng cũng chứng tỏ là có nhiều ưu điểm khi ứng dụng vào
quá trình lên men vang. Quá trình cố định dễ thực hiện, điều kiện cố định ôn
hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất nên các tế bào cố định không bị
mất hoạt tính lên men. Phương pháp hấp phụ – ủ còn tạo điều kiện cho nấm men
cố định trên miếng chất mang cellulose vi khuẩn tăng sinh khối, thích nghi với
môi trường lên men nhanh hơn. Ngoài ra, do chất mang cellulose vi khuẩn có
tính chất cơ lý bền và ổn định, độ trương nơ tốt nên vi sinh vật cố định trên
cellulose vi khuẩn có khả năng tái sử dụng nhiều chu kỳ [28], [29], [145], [148],
[149].
Nhược điểm chính của phương pháp này là hiệu suất cố định và mật độ tế
bào cố định trên cellulose vi khuẩn không cao bằng phương pháp cố định bằng
cách nhốt trong khung mạng xốp, đồng thời không thể cố định các vi sinh vật có
hoạt tính cellulase trên cellulose vi khuẩn vì cấu trúc chất mang sẽ bị phá hủy
[46], [149].
1.5 Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình lên men rượu vang
Lên men rượu vang là một quá trình khá phức tạp. Nó bao gồm nhiều biến đổi sinh
học, hóa sinh, hóa học, hóa lý và vật lý để chuyển hóa dịch nho thành rượu vang.
Ngoài hai sản phẩm chính là ethanol và CO 2, rượu vang còn chứa các sản phẩm phụ và
các sản phẩm trung gian từ quá trình trao đổi chất của nấm men vang như glycerol,
rượu bậc cao (propanol, butanol, iso amylic), acid hữu cơ (tartaric, malic, citric,
-18-

18


acetic), hợp chất carbonyl (aldehyde, diacetyl, acetoin), ester (ethylacetate,

isoamylacetate...) [4].
Khả năng lên men rượu vang của nấm men Saccharomyces cerevisiae phụ thuộc
vào rất nhiều yếu tố: điều kiện lên men (nhiệt độ, mật độ giống cấy ban đầu…), thành
phần của dịch lên men (nồng độ đường, tannin, SO 2, pH). Khi ơ ngoài giới hạn thích
hợp thì các yếu tố này có thể ảnh hương bất lợi đến tiến trình lên men của nấm men
vang [110], [153].
1.5.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Đường là cơ chất chính trong dịch nho được nấm men sử dụng để sinh tổng hợp
năng lượng cho tế bào đồng thời chuyển hóa thành ethanol, CO 2 cũng như các sản
phẩm phụ khác. Khi lên men trong môi trường lỏng, nấm men chịu tác động của áp lực
thẩm thấu tạo ra do các chất hòa tan, phần lớn là đường, lên màng tế bào. Khi nồng độ
chất hòa tan trong môi trường quá cao, màng tế bào không thể duy trì sự cân bằng áp
lực thẩm thấu giữa bên trong và bên ngoài được nữa. Tế bào chất có thể bị co lại làm
hoạt tính trao đổi chất của nấm men bị giảm đi. Để sản xuất rượu vang nồng độ
ethanol cao (13 – 16%v/v), người ta sử dụng dịch nho cô đặc hay bổ sung đường vào
môi trường lên men. Nấm men trong trường hợp này phát triển sinh khối chậm, kích
thước nhỏ, tốc độ lên men chậm, hàm lượng đường sót trong sản phẩm cao [1], [2].
Quá trình cố định làm thay đổi hoạt tính trao đổi chất của nấm men và làm tăng
khả năng chống chịu của nấm men đối với áp suất thẩm thấu cao. Chất mang còn giữ
vai trò bảo vệ tế bào, áp lực thẩm thấu từ môi trường lên men không tác động tức thời
đến tế bào, vì vậy, nấm men cố định vẫn có khả năng lên men ơ hàm lượng đường cao
và hàm lượng đường sót khi quá trình lên men kết thúc luôn thấp hơn so với nấm men
tự do. Holcberg (1981) đã nghiên cứu sự lên men của nấm men cố định trong gel agar,
alginate và nấm men tự do trong canh trường chứa đến 50% đường glucose và thấy
rằng ơ nồng độ đường này, nấm men tự do hầu như không thể hoạt động và chuyển
hóa đường trong khi nấm men cố định vẫn có thể lên men và dịch lên men có hàm
lượng ethanol là 5% [106]. Iconomopoulou (2002) sử dụng nấm men cố định trong
viên gluten và nấm men tự do để lên men dịch nho Rhotidis với hàm lượng đường là
306g/L; kết quả cho thấy thời gian lên men của nấm men cố định và nấm men tự do
-19-

19


lần lượt là 194 và 240h, tốc độ sinh tổng hợp ethanol lần lượt là 0,44 và 0,39g/L.h
[70].
1.5.2 Ảnh hưởng của pH
Kiểm soát pH và độ acid trong rượu vang là điều rất quan trọng để duy trì chất
lượng rượu vang trong suốt quá trình bảo quản. pH thấp sẽ làm tăng cường độ màu
(màu đỏ), độ sáng, độ tươi và tăng hương vị trái cây. pH cao làm giảm độ màu, giảm
độ bền sinh học và hóa học trong suốt quá trình bảo quản sản phẩm. Ngoài ra, pH còn
ảnh hương đến hoạt động của nấm men. Khi pH càng thấp, hàm lượng ion H + trong
dịch lên men càng cao; từ đó sẽ tạo ra sự chênh lệch lớn giữa nồng độ ion H + ơ bên
trong và bên ngoài tế bào, làm cho nấm men mất khả năng phát triển và làm vô hoạt
enzyme nội bào [27]. Nấm men cố định có khả năng chống chịu sự biến đổi của pH tốt
hơn nấm men tự do [154], [155], [156], [157], [158]. Theo Serra (2005), sự giảm pH
làm tăng năng lượng hoạt hóa của tế bào, nên tế bào sẽ sinh trương chậm và tốc độ
sinh trương riêng cực đại thấp hơn [159]. Ngoài ra, theo Arena (2005), ơ pH thấp, tế
bào dùng năng lượng để duy trì sự sống hơn là để sinh trương [160].
Szajani (1996) đã nghiên cứu hệ thống lên men liên tục với nấm men cố định trong
hạt cellulose được chế tạo từ cellulose xanthogenate do hãng Hungarian Viscose
Factory cung cấp. Kết quả cho thấy là trong khi hoạt tính lên men của nấm men tự do
chỉ ổn định ơ pH 4 thì nấm men cố định có thể hoạt động trong khoảng pH từ 3,0 đến
6,25 [161]. Jirku (1999) đã cố định nấm men trong mạng polymer tạo thành từ nhựa
epoxy và diaminopolyethylene oxide và ứng dụng để lên men dung dịch glucose cũng
đi đến kết luận là hiệu suất sinh tổng hợp ethanol của nấm men tự do đạt giá trị cao ơ
pH 4,5, còn hiệu suất sinh tổng hợp ethanol của nấm men cố định có thể ổn định trong
một khoảng pH rộng, 3,5-6,5 [162].
1.5.3 Ảnh hưởng của hàm lượng SO2
Sulfur dioxide được sử dụng phổ biến trong rượu vang và ngành công nghiệp thực

phẩm như tác nhân chống oxy hóa và diệt khuẩn. Hàm lượng SO 2 cho phép trong rượu
vang theo quy định của Hoa Kỳ là 350mg/L [29]. SO2 còn là chất phá vỡ cầu nối
disulfide trong phân tử enzyme, làm ức chế quá trình hóa nâu do enzyme, đồng thời

-20-

20


cũng là tác nhân chọn lọc các giống nấm men trong quá trình lên men vang truyền
thống [30], [163].
Saccharomyces cerevisiae có khả năng chống chịu SO2 tốt nhưng nếu hàm lượng
SO2 tăng quá cao sẽ ức chế quá trình trao đổi chất và sinh tổng hợp ethanol của nấm
men [4], [30], [164], [165]. Ngoài ra, SO2 còn làm tăng sự tích lũy một số hợp chất
khác trong quá trình lên men như glycerol, aceltaldehyde, diacetyl, acetoin… [163],
[166], [167].
Phần lớn những nghiên cứu về ảnh hương của SO2 đến quá trình lên men rượu
vang tập trung khảo sát khả năng ức chế các loài nấm men bản địa của SO2 [165],
[168]; ảnh hương của SO2 đến sự tạo thành các hợp chất hương và khả năng chuyển
hóa các loại acid amin [169], [170]. Egli (1998) đã khảo sát ảnh hương của lượng SO 2
ban đầu đến tiến trình lên men vang sử dụng tế bào tự do. Khi hàm lượng SO 2 cao hơn
112ppm thì tốc độ lên men chậm lại, tạo điều kiện cho một số vi khuẩn có nguồn gốc
từ trái nho chuyển hóa đường sót thành acid acetic [171]. Yajima (2001) đã nghiên cứu
lên men dịch nho Koshu, có bổ sung SO 2với nồng độ lên đến 325mg/L, sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố định trong gel Ca alginate. Kết quả là nấm men tự do và cố
định bị ức chế hoàn toàn ơ hàm lượng SO 2 195mg/L và 325mg/L dịch lên men. Khi
hàm lượng SO2 thấp hơn, tốc độ lên men của nấm men cố định luôn ổn định và cao
hơn so với nấm men tự do [172].
1.5.4 Ảnh hưởng của hàm lượng tannin
Tannin là loại polyphenol phổ biến trong dịch nho đỏ. Sự có mặt của tannin

trong rượu vang ảnh hương đến màu sắc và vị chát đặc trưng của sản phẩm.
Tannin còn làm tăng độ bền hóa lý của rượu vang nhờ khả năng liên kết với
protein và lắng xuống trong quá trình lên men và tàng trữ. Hàm lượng tannin
cao trong dịch nho cũng ảnh hương đến khả năng sinh trương và lên men của
nấm men vang vì tannin liên kết với protein trên thành tế bào nấm men, ngăn
cản sự khuếch tán chất dinh dưỡng và các sản phẩm trao đổi chất qua màng
[164], [173], [174], [175].
Soto (1968) khi nghiên cứu về quá trình lên men rượu champagne đã nhận
thấy rằng mật độ tế bào nấm men giảm khoảng 3,6; 11,7; 22,5 và 29,7% khi
thêm tannin với lượng 0,5; 1,7; 2,9 và 4,1 g/L vào dịch lên men đã chứa 0,3g/L
-21-

21


tannin [176]. Haslam (1992) lại cho rằng tannin có khả năng liên kết với thành
phần protein và polysaccharide trong dịch lên men bằng liên kết hydro hay liên
kết Van der Waals tạo thành kết tủa hay phức chất [177]. Khi sử dụng nấm men
tự do và nấm men cố định trên cellulose đã tách lignin để lên men bia, Bardi
(1996) nhận thấy hàm lượng polyphenol trong bia được lên men bơi nấm men
cố định thấp hơn nấm men tự do. Tác giả giải thích là do tannin cũng có khả
năng liên kết với polysaccharide nên một số chất mang có bản chất cellulose hay
gel polysaccharide đã hấp phụ một phần tannin có trong môi trường [151].
Yajima (2001) khảo sát thành phần hóa học dịch nho Koshu và nhận thấy rằng
hàm lượng tổng các hợp chất phenolic trong dịch nho là 477mg Gallic Acid
Equivalent/L (GAE/L). Tác giả này đã bổ sung các hợp chất phenolic có xuất xứ
từ hạt nho vào dịch nho Koshu để nồng độ dao động trong khoảng 477 –
2178mgGAE/L. Kết quả cho thấy trong khoảng hàm lượng khảo sát, cả nấm
men cố định trong gel alginate và nấm men tự do đều vẫn lên men tốt, tuy nhiên,
ơ 2178mgGAE/L thì tốc độ sinh tổng hợp ethanol của nấm men tự do thấp hơn

và hàm lượng ethanol cuối cũng thấp hơn 1%v/v [172]. Wauter (2001) còn cho
rằng acid tannic có thể kết hợp với sắt ơ trung tâm Fe-S trong chuỗi hô hấp, dẫn
đến hiện tượng thiếu hụt sắt, từ đó làm giảm tốc độ sinh trương của nấm men
[178], [179].
1.6 Ứng dụng nấm men cố định trong quá trình lên men vang tĩnh nhiều chu ky
Đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng nấm men cố định trên những chất mang khác
nhau để lên men sản xuất rượu vang. Alginate là một chất mang được sử dụng phổ
biến nhất [13], [20], [21], [39], [58], [57]. Nấm men cố định trong gel alginate đã được
sản xuất dưới dạng chế phẩm thương mại để cung cấp cho các nhà máy sản xuất thức
uống lên men. Hãng Proenol-Industria Biotechnologica, Ltd (Bồ Đào Nha) đã thương
mại hóa nấm men cố định để ứng dụng trong quá trình lên men ơ quy mô công nghiệp,
đặc biệt là để giải quyết sự cố khi quá trình lên men bị dừng lại dù hàm lượng đường
sót còn rất cao.
Việc sử dụng nấm men cố định trong phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kỳ là
hướng nghiên cứu được quan tâm trong thời gian gần đây vì có nhiều ưu điểm. Nhờ
tác động bảo vệ của chất mang, hoạt tính nấm men cố định sẽ được duy trì lâu hơn, do
-22-

22


đó có thể tái sử dụng nấm men cố định nhiều chu kỳ trong khi nấm men tự do chỉ được
sử dụng để lên men một chu kỳ [21], [68], [76]. Trong quá trình tái sử dụng, thời gian
lên men của nấm men cố định được rút ngắn đáng kể so với nấm men tự do. Với cùng
một nhiệt độ lên men, thời gian lên men của nấm men cố định ơ chu kỳ sau thường
ngắn hơn chu kỳ trước [78], [86], [180]. Do không có sự khác biệt lớn về hàm lượng
ethanol trong vang non nhưng thời gian lên men ngắn hơn, nên nấm men cố định có
tốc độ sinh tổng hợp ethanol cao hơn hẳn nấm men tự do và tốc độ này tăng dần theo
số chu kỳ tái sử dụng. Ngoài ra, so với nấm men tự do thì nấm men cố định qua các
chu kỳ tái sử dụng sẽ tạo ra rượu vang có hàm lượng acid dễ bay hơi thường thấp hơn

hoặc tương đương, thành phần cấu tử hương cũng ít thay đổi, hoặc thay đổi theo chiều
hướng có lợi. Vì vậy chất lượng sản phẩm không thay đổi hoặc tốt hơn so với rượu
vang sản xuất theo phương pháp truyền thống [68], [69], [78], [79], [81], [172].
Đối với gel alginate, Suzzi (1996) đã lên men dịch nho trắng Trebbiano bằng nấm
men Saccharomyces cerevisiae cố định trong chất mang này. Nghiên cứu khảo sát sự
tạo thành các hợp chất hương và có so sánh với nấm men tự do khi tái sử dụng nấm
men cố định trong 3 chu kỳ. Kết quả cho thấy, ơ chu kỳ 1, cả 5 chủng nấm men cố
định luôn tạo hàm lượng acetaldehyde, rượu bậc cao thấp hơn và hàm lượng
ethylacetate cao hơn nấm men tự do. Sau 3 chu kỳ tái sử dụng thì thành phần hợp chất
hương do nấm men cố định và nấm men tự do sinh ra là tương đương [63].
Đối với cellulose vi khuẩn, Nguyễn Thúy Hương (2008) đã lên men dịch nho bằng
nấm men Saccharomyces cerevisiae N28 cố định trên chất mang này và tái sử dụng 8
chu kỳ. Thời gian lên men là 6 ngày, hàm lượng đường sót là 4,8g/L và hàm lượng
ethanol trong vang non là 8,8%v/v. Các thông số này không khác biệt nhiều so với
mẫu đối chứng sử dụng nấm men tự do [28].
Kourkoutas (2001, 2006) sử dụng các miếng trái cây làm chất mang cố định nấm
men Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 để lên men vang từ dịch nho đỏ Rhotidis. Nấm
men cố định trên miếng táo được tái sử dụng 30 chu kỳ, cứ sau 5 chu kỳ lại hạ thấp
nhiệt độ lên men từ 25oC ơ các chu kỳ đầu tiên và xuống còn 1 oC ơ các chu kỳ cuối.
Kết quả là trong suốt 30 chu kỳ, các thông số lên men đều ổn định, hàm lượng đường
sót dưới 30g/L, hàm lượng ethanol trong vang non là 12%v/v, hàm lượng acid dễ bay
hơi là 0,3g acetic acid/L. Thời gian lên men cũng ổn định và dưới 90h trong 24 chu kỳ
-23-

23


đầu [27], [78]. Tác giả trên còn sử dụng miếng mộc qua để làm chất mang cố định nấm
men vang trong nghiên cứu năm 2003, tái sử dụng 40 chu kỳ, thời gian lên men dưới
100h và ổn định trong 35 chu kỳ đầu với nhiệt độ lên men 10oC [75].

Tsakiris (2004) sử dụng chất mang là miếng nho Sultanina đã sấy khô để cố định
nấm men Saccharomyces cerevisiae Uvaferme 299 để lên men vang trắng từ dịch nho
Saint Denis. Nấm men cố định được tái sử dụng trong 12 chu kỳ. Nho khô tỏ ra là một
loại chất mang tốt cho nấm men vang khi lên men ơ nhiệt độ 15-25 oC. Thời gian lên
men ngắn (3-5 ngày), hiệu suất chuyển hóa đường là 100%, hàm lượng acid dễ bay
hơi, methanol và acetaldehyde trong dịch lên men thấp [79].
Ngoài ra, Mallios (2004) đã tái sử dụng nấm men cố định trên miếng lê 20 chu kỳ
[73]; Reddy (2006, 2008) đã tái sử dụng nấm men cố định trên miếng ổi và cùi dưa
hấu 12 chu kỳ [81], [86]; Kandylis (2008, 2010, 2012) đã tái sử dụng nấm men cố định
trên chất mang khoai tây 35 chu kỳ; nấm men cố định trên chất mang hạt lúa mì và hạt
lúa mạch cho 30 chu kỳ lên men vang [37], [82], [181].
1.7 Những ứng dụng khác của vi sinh vật cố định trong sản xuất rượu vang
Nấm men cố định ngoài những ưu điểm về khả năng lên men còn có những ưu thế
trong việc tổ chức sản xuất như chi phí vận hành thấp, năng suất và chất lượng sản
phẩm cao. Vì vậy, có khá nhiều các nghiên cứu ứng dụng phương pháp lên men liên
tục sử dụng nấm men cố định trong sản xuất rượu vang. Nấm men cố định cũng được
sử dụng trong công nghệ sản xuất các loại rượu vang ngọt hay rượu vang có gas lên
men hai lần theo phương pháp Champenoise nhằm dừng quá trình lên men theo ý
muốn, tăng độ trong của sản phẩm và rút ngắn thời gian lên men.
Các loại nấm men bản địa cố định cũng được sử dụng kết hợp với nấm men
Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men vang để chuyển hóa acid malic,
ngăn chặn sự lên men kéo dài hoặc cải thiện hương vị cho sản phẩm rượu vang. Ngoài
ra, vi khuẩn Oenococcus oeni cố định cũng được ứng dụng để tiến hành quá trình lên
men malolactic trong các quy trình sản xuất rượu vang. Bảng 1.3 trình bày một số
nghiên cứu ứng dụng đã nêu ra ơ trên.
Bảng 1.3. Các ứng dụng của vi sinh vật cố định trong sản xuất rượu vang
Ứng dụng
Lên men liên tục

Nội dung và kết quả

Lên men dịch nho đỏ Rhotidis với chủng nấm men S. cerevisiae

-24-

Nguồn
Bakoyanis (1997) [21]

24


Rượu vang ngọt
Rượu vang có gas

Chuyển hóa acid
malic thành
ethanol
Ngăn chặn hiện
tượng thời gian
lên men bị kéo
dài
Cải thiện hương
vị rượu vang
Lên men
malolactic

Visanto cố định trên kissiris, γ-alumina và Ca-alginate. Lưu lượng
nhập liệu là 600mL/ngày. Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol cao hơn
3-10 lần so với nấm men tự do và quá trình lên men trong suốt 80
ngày không hề bị nhiễm.
Lên men dịch nho đỏ Rhotidis bằng chủng nấm men S. cerevisiae

AXAZ-1 cố định trên miếng mộc qua. Lưu lượng nhập liệu giảm
dần từ 1500mL/ngày xuống 150mL/ngày, tương ứng với nhiệt độ
giảm từ 30oC xuống 5oC. Hệ thống vận hành trong 46 ngày mà
hoạt tính lên men không thay đổi. Khi sử dụng chất mang là miếng
táo thì thời gian vận hành của hệ thống lên đến 93 ngày.
Sử dụng nấm men S. cerevisiae cố định trong gel alginate để sản
xuất rượu vang đỏ ơ quy mô công nghiệp. Dung tích hệ thống lên
men là 120hL. Thời gian thu sản phẩm rút ngắn còn 3 ngày, chất
lượng rượu vang thu được là tương đương với trường hợp lên men
tĩnh truyền thống.
Sử dụng nấm men S. cerevisiae W-3 cố định trong gel alginate để
dừng quá trình lên men theo ý muốn. Rượu vang có độ trong cao
và rất dễ lọc.
Sử dụng nấm men S. cerevisiae và bayanus cố định trong hạt gel
alginate để lên men lần hai với môi trường là rượu vang nền từ
giống nho Pinot. Nấm men cố định hầu như không làm thay đổi
chất lượng của rượu vang có gas so với nấm men tự do, kể cả các
thành phần hợp chất hương.
Sử dụng Schizosaccharomyces pombe cố định trong gel alginate để
lên men dịch nho đỏ có hàm lượng acid malic 11g/L. Sau 50h,
lượng acid malic được chuyển hóa là 100%, trong khi đó, nấm men
tự do cần đến 60h.
Sử dụng nấm men S. cerevisiae cố định trong gel alginate để xử lý
hiện tượng kéo dài thời gian lên men trong sản xuất rượu vang ơ
Pháp và Bồ Đào Nha. Tốc độ chuyển hóa đường khử đạt tới
2,8g/L.ngày, không làm tăng hàm lượng acid dễ bay hơi.
Kết hợp lên men dịch nho đỏ Pinot bằng Candida stellata và S.
cerevisiae cố định trong gel alginate. Phương pháp này đã làm cho
lượng đường sót trong rượu vang chỉ còn 0,3g/L so với 10,6g/L khi
chỉ lên men với S. cerevisiae.

Sử dụng vi khuẩn thuộc loài Oenococcus oeni cố định trên chất
mang cellulose vi khuẩn bằng phương pháp hấp phụ- ủ để lên men
malolactic.

Kourkoutas (2002) [74],
[77]

Kassim (2012) [39]

Yokotsuka (2003) [62]
Fumi (1988) [57]
Ciani (1991) [182]

Magyar (1989) [13]
Yokotsuka (1993) [60]
Silva (2003) [65]
Silva (2002) [64]

Ciani (2006) [183]

Nguyễn Thúy Hương
(2007) [184]

1.8 Tổng hợp tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng đề tài
Đối với những vấn đề liên quan đến luận án, sau khi thực hiện xong phần Tổng
quan tài liệu, chúng tôi có một số nhận định như sau:
Về việc sử dụng nấm men cố định trong gel alginate để lên men rượu vang:
Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu về phương pháp cố định nấm men trong gel
alginate. Lê Thị Lan Chi (2000, 2001) đã xác định điều kiện kỹ thuật thích hợp như
mật độ tế bào trong gel là 4,6.107 tb/mL; nồng độ alginate trong gel là 2,0% w/v và

nồng độ dung dịch CaCl2 là 1%w/v để lên men dịch nha 12oPt sản suất bia [185],
[186]. Trần Quốc Hiền (2008) đã xác định lại các điều kiện kỹ thuật để cố định nấm

-25-

25