nuôi cấy mô tế bào thực vật

Bài 1
CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
I/ CÁC CÔNG VIỆC CẦN CHUẨN BỊ TRƯỚC KHI TIẾN HÀNH PHA MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ THAO TÁC CẤY MẪU VÀO MÔI TRƯỜNG:
1.Các công việc cần thiết trước khi pha môi trường:

_Chuẩn bị các thiết bị và dụng cụ:
+

Cân phân tích, nồi hấp khử trùng, thiết bị chỉnh pH, tủ cấy vô trùng,..

Hình 1.Máy đo pH

Hình 2. Cân phân tích


+

Hình 3. Dụng cụ cấy
Dao, kẹp, giấy cấy, cốc thủy tinh, đèn cồn, ống nghiệm, lọ,...
Các dụng cụ phải được hấp khử trùng trước khi sử dụng.
-

Chuẩn bị hóa chất khử trùng: cồn 700, dd NACLO,...
Chuẩn bị hóa chất pha môi trường.
Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy:

Trước khi đưa vào sử dụng, phòng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót
formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc
hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi
formaldehyde còn thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng trong 24h. Bề mặt nơi chuẩn bị cấy,

bề mặt bên trong và ngoài tủ cấy phải được khử trùng trước khi cấy bằng cách lau sạch các
bề mặt này bằng cồn 90%. Bật tia UV trong 15 phút trước khi cấy để diệt mầm vi sinh trên
bề mặt tủ cấy.
2.Thao tác khử trùng và cấy mẫu vào môi trường:
- Khử trùng mẫu:
Để có thể đạt được mục đích khử trùng (loại bỏ hết mầm vi sinh vật, mô thực vật có thể
tăng trưởng, phát triển), thì việc khử trùng là phải tìm ra được ba yếu tố liên quan chặt chẽ
với nhau và liên quan tới mô thực vật đem khử trùng đó là:
+
+

Chất khử trùng
Nồng độ chất khử trùng


+

Thời gian khử trùng.
Bảng 1. Một số tác nhân khử trùng dùng cho thực vật.
Tác nhân vô trùng

Nồng độ (%)

Thời gian xử lý(phút)

Hiệu quả

Canxi hypoclorid

9-10

5-30

Rất tốt

Natri hypoclorid

2

5-30

Rất tốt

hydro peroxide

10-12

5-15

tốt

Nước Brom

1-2

2-10

Rất tốt

HgCl2

0.1-1

2-10

Trung bình

Chất kháng sinh

4-50

30-60

Khá tốt

Vô trùng mẫu là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên
trì tìm nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả.
-

Dụng cụ: kẹp, dao, giấy cấy, đèn cồn, cốc thủy tinh, cồn 960

Các dụng cụ bằng kim loại như kẹp cấy, dao mổ, que cấy vòng, kim mũi nhọn có thể được
khử trùng bằng cách đốt dưới ngọn lửa đèn cồn. Các dụng cụ phải nhúng vào cồn 96 0 cho
nhỏ hết giọt cồn thừa mới đưa vào ngọn lửa.
-Thao tác: khử trùng tại vị trí làm việc, tay, dụng cụ cấy, dụng cụ chứa môi trường nuôi như
chai, lọ.
II CÁCH PHA MÔI TRƯỜNG:
Môi trường nuôi cấy phù hợp là thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô tế
bào thực vật. Thành phần của môi trường dinh dưỡng thay đổi tùy theo loài, bộ phận nuôi
cấy, tùy theo sự phát triển và phân hóa của mô cấy, tùy theo việc muốn duy trì mô ở trạng

thái callus, tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh. Tuy vậy tất cả môi trường
nuôi cấy bao giờ cũng gồm 5 thành phần chính
Đường cung cấp nguốn carbon.
Các muối khoáng đa lượng.
Các muối khoáng vi lượng.


Các vitamin
Các chất điều hòa sinh trưởng
Bảng 2 .Thành phần môi trường MS (1962) và cách pha stock
Hóa chất

g/l

Stock x 10 g/l

MgSO4.7H2O

0.37

3.7

KH2PO4

0.17

1.7

KNO3

1.9

19

NH4NO3

1.65

16.5

CaCl2.2H2O

0.44

4.4

Hóa chất

mg/l

Stock x 100 g/l

Na2EDTA

37.3

3.37

FeSO4.7H2O

27.8

2.78

Hóa chất

mg/l

Stock x 1000 g/l

H3BO3

6.2

6.2

MnSO4.4H2O

22.3

22.3

ZnSO4.7H2O

11.5

11.5

Na2MoO4.2H2O

0.25

0.25

KI

0.83

0.83

CuSO4.5H2O

0.025

0.025

CoCl2.6H2O

0.025

0.025

Macro MS

FeEDTA

Micro MS

1.Cách pha stock đa lượng:

Stock đa lượng có 5 thành phần (MgSO4.7H2O, KH2PO4, KNO3, NH4NO3, CaCl2.2H2O)
Mỗi lần cho một loại khoáng vào phải khuấy tan hoàn toàn và bổ sung thêm 100ml nước
cất hai lần trước khi bổ sung thêm các khoáng khác vào ( phương pháp pha thể tích tăng
dần).


Chú ý: do CaCl2.2H2O có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO 4.7H2O nên hai chất này phải
pha tách rời nhau theo đúng trình tự , cho CaCl 2 vào sau cùng. Cho tất cả vào bình đựng,
dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng thể tích cần pha.
-

Cách pha stock vi lượng:

Stock vi lượng có 7 thành phần ( H 3BO3, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, KI,
CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O).
Cân đủ số mg/l của từng thành phần, làm tan hoàn toàn. Cuối cùng thêm nước cho đủ thể
tích cần pha như stock đa lượng.

Hình 4. Stock vi lượng

-

Cách pha stock sắt EDTA:

Sắt EDTA có 2 thành phần ( Na2EDTA, CaCl2.2H2O).
Nồng độ là 10ml/l môi trường.
Chuẩn bị 2 becher 250ml (mỗi becher chứa 100ml nước cất hai lần) đun ở 800C.


Cho lần lượt FeSO4.7H20 và Na2EDTA vào hai becher riêng biệt. Cho becher chứa

FeSO4.7H2O vào Na2EDTA khuấy đều, bổ sung thêm nước cho đủ thể tích cần pha. Bảo quản
trong chai màu ở 4-100C.

Hình 5. Stock FeEDTA
Cách pha vitamin:
Vitamin thường dùng là Pirydoxine (B6), Nicotinic Acid (P.P), Thiamin-HCl (B1) cần dùng
bao nhiêu thể tích thì tính toán rồi hút cho đủ thể tích.

Hình 6. Vitamin
+ Cách pha chất điều hòa sinh trưởng thực vật:
Nhóm cytokynin cân đủ mg cytokinin hòa tan trong 5 ml NaOH 1N. Cho thêm nước cất
cho đủ thể tích cần pha.


Nhóm auxin cân đủ mg auxin hòa tan trong 5 ml NaOH 1N. Cho thêm nước cất cho đủ thể
tích cần pha.


Bài 2
PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MẪU CẤY
I/Nguyên tắc
Ở đa số các loài thực vật, mỗi nách lá đều mang một chồi ngủ. Các chồi ngủ này có
đặc tính hoàn toàn giống với các đỉnh sinh trưởng, có khả năng tăng trưởng phát triển
thành một cơ thể thực vật toàn vẹn. Các chồi ngủ này đa số bị ức chế bởi sự phát triển các
chồi đỉnh (tính ưu thế ngọn). Nếu tách riêng một đoạn thân có mang chồi nách này ra
khỏi cơ thể thực vật, dưới tác động của các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh như
cytokinin, auxin thì từ một chồi nách có thể tạo ra nhiều chồi mới.
II/Mẫu vật, hóa chất, dụng cụ
Đoạn thân cành có mang chồi ngủ, cồn 70o, 96o, xà phồng bột, Javen, nước cất vô
trùng, cốc thủy tinh khử trùng, kẹp cấy, dao mổ, đèn cồn, bông gòn thấm nước.

III/Tiến hành thí nghiệm
Rửa dưới vòi nước máy (10p)
Cành cây tươi non
Cắt thành đoạn nhỏ
Ngâm, lắc trong nước xà phòng (15p)
Rửa dưới vòi nước máy (5p)
Ngâm trong javen/nước tỷ lệ 1:2 (20p)
Rửa nước cất vô trùng (4lần)
Cho vào tủ cấy lắc với cồn 700(1p)
Rửa nước cất vô trùng (3lần)
Cấy mẫu
Quan sát

TH1: Khử trùng đoạn thân cành chứa mầm ngủ phía trên mặt đất


Hình 7,8 Khử trùng mẫu phía trên mặt đất
Rửa dưới vòi nước máy (10p)

TH2: Khử trùng đoạn thân cành chứa mầm ngủ phía dưới mặt đất
Cành,củ chứa chồi ngủ

nhẹ

Ngâm,
trong
nước
phòng,
(30p)

Rửa
dưới
nước
máy
(5p)

Ngâm trong javen/nước tỷ lệ 1:1 (25p)
Rửa nước cất vô trùng (4lần)
Cho vào tủ cấy lắc với cồn 700(1p)
Rửa nước cất vô trùng (3lần)
Cấy mẫu
Quan sát

xà
chà

vòi


Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Nếu mô
non thì thời gian xử lý ngắn hơn
Đối với các bộ phận cây có nhiếu bụi đất, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng
dưới vòi nước chảy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng(3-5
lần)
Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước khi
đặt mô cấy lên môi trường.
Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp
bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi
trước khi đặt mô cấy lên môi trường.
Chú ý không ngâm mô trong cồn 90oC.

Nhận xét: Mẫu cấy chứa chồi ngủ đoạn thân cành ở phía trên mặt đất ít nhiễm hơn mẫu
phía dưới mặt đất vì mẫu dưới mặt đất nhiều vi vinh vật hơn, mẫu lớn khó khử trùng.
Kết quả sau1,2 tuần nuôi cấy:

Hình 11. Mẫu sống


BÀI 3
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO Ở THỰC VẬT
I/ Nguyên tắc
Trong các đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt vật lý
(những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do côn trùng tấn công) thực vật có khả năng
hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn thương đó. Những tế bào mới
được hình thành đó là mô sẹo.
Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện trong các giai đoạn
hóa ligin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng thượng tầng ( vùng
phân sinh) như thượng tầng liber- mộc, thượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành.
Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt. Khối mô sẹo có khả
năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích
sinh trưởng tạo mô sẹo.
Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện với các loài thực vật không có khả năng nhân giống
thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Những mô của thực vật có thể dùng nuôi cấy tạo
mô sẹo là: thượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp nhục, lá, trụ bì rễ,
tử diệp,… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô
sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là
trong sự tạo rễ. Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tạo mô
sẹo. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo . Sự tạo
mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi trường nuôi cấy được bổ sung một lượng auxin thích
hợp.

Hình 13. Mô sẹo


Hình 14. Nhân giống thông qua giai đoạn tạo mô sẹo
A. Mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy
B. Mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy
C. Tạo chồi từ mô sẹo
D. Cây tái sinh từ mô sẹo
E. Thu được từ cây con nuôi cấy mô thông qua tạo mô sẹo
II/ Mẫu vật, hóa chất, dụng cụ
Củ cà rốt sạch bệnh
Cồn 700C, 96oC.
Xà phòng bột, Javen, nước cất vô trùng
Cốc thủy tinh khử trùng, kẹp cấy, dao mổ, đèn cồn, bông gòn thấm


Hình 15. Dụng cụ
III/ Tiến hành nuôi cấy
+ Chuẩn bị môi trường
Môi trường MS đối chứng có sucrose 20g/l và agar 8g/l
Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 10mg/l
Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 10mg/l, BA 1mg/l
TH1: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng kích thích tạo mô sẹo
Mẫu ( cà rốt )

Rửa ( sạch đất, gọt vỏ )

Ngâm xà phòng 15’→ Rửa sạch xà phòng 5’


Ngâm mẫu trong dịch Javen/nước (1:3) →Rửa sạch Javen bằng nước cất vô trùng
4 lần.



Đưa mẫu vào tủ cấy→ Lắc cồn 70OC 1’ →Rửa sạch cồn bằng nước cất 3 lần

Loại bỏ phần mô bên ngoài →Cắt lát mỏng chứa phần thượng tầng củ cà rốt đặt
vào môi trường

Quan sát, ghi nhận các biểu hiện của mẫu cấy, vị trí phát sinh callus ở các môi
trường khác nhau
IV/ Quan sát , ghi nhận kết quả

Hình 16,17 . Mẫu nhiễm nấm mốc và nhiễm khuẩn


Hình 18. Mẫu carot sống
•

•

•
•
•

Tỉ lệ sống chết sau khi nuôi cấy
Tổng số mẫu nuôi cấy 25 mẫu:
Có 6 mẫu sống đạt 24%
Có 19 mẫu chết chiếm 76%, trong đó:

+ 10 mẫu chết do nấm mốc 52,63%
+ 9 mẫu chết do nhiễm khuẩn 47,36%
Nguyên nhân mẫu bị chết : Trong quá trình khử mẫu đã làm mẫu chết, mẫu
đã bị nhiễm trước khi cấy.
Các mẫu bị nhiễm nấm mốc do thao tác cấy chưa chính xác và điều kiện
vô trùng chưa đảm bảo tốt, que cấy quá nóng làm mẫu bị chết, môi trường
nuôi cấy khộng đảm bảo.Dụng cụ thủy tinh, dụng cụ cấy cũng chưa được vô
trùng tuyệt đối.
Điều kiện nuôi cấy, thời gian lấy mẫu của ảnh hưởng đến sức sống của
mẫu
Trong 6 mẫu sống chưa có mẫu nào phát sinh callus nên chưa lựa chọn được
môi trường thích hợp cho sự phát sinh callus
Theo lý thuyết môi trường thích hợp tạo callus là môi trường MS gồm
sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 10mg/l, BA 1mg/l.
Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình:
+ Sự phản phân hóa của tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi.
+ Sự phân chia của tế bào tượng tầng
+ Sự xáo trộn của mô phân sinh sơ khởi ( chồi hay rễ)


Bài 4
NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
I/ Nguyên tắc
Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào invitro được gọi là vi
nhân giống.
Nhân giống invitro: Sử dụng mô nuôi cấy có kích thước nhỏ, duy trì và nhân nhanh
các kiểu gen hiếm, làm vật liệu cho chọn giống, hiệu quả kinh tế cao.
Có nhiều phương pháp vi nhân giống khác nhau để tạo chồi từ đó tạo cây con invitro
hoàn chỉnh. Tùy từng đối tượng khác nhau mà sử dụng phương pháp phù hợp
Nuôi cấy cơ quan

Nuobvgf

Chồi

Cây

Nuôi cấy callus
Callus

Cây trưởng thành

Chồi

Cây


Callus

Tế bào đơn

Phôi

Cây

Nuôi cấy phôi

Nuôi cấy tế bào

Chồi, cụm

chồi, phôi củ
nhỏ

II/ Mẫu vật, hóa chất dụng cụ
Mẫu chồi bài thực hành 2,3

HÌnh 19. Mẫu lan nuôi cấy mô
Kẹp cấy, dao mổ và môi trường bài 3
III/ Tiến hành thí nghiệm
TH1: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi
Mẫu cấy là phần gốc chứa chồi ngủ, nguyên cây hoặc chồi ngọn.

Cây


Mẫu được cấy vào môi trường MS và môi trường MS có bổ sung chất điều hòa
sinh trưởng BA.
Môi trường nhân chồi
Môi trường MS đối chứng có sucrose 20g/l và agar 8g/l
Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, BA 2mg/l, NAA 1mg/l
TH2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ
Mẫu cấy là cụm chồi được tách ra từng chồi riêng rẽ và được cấy vào môi
trường MS có chứa than hoạt tính và môi trường MS có than hoạt tính và bổ sung NAA

Môi trường tạo rễ
Môi trường MS đối chứng có sucrose 20g/l và agar 8g/l, than hoạt tính 2g/l
Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 1mg/l và than hoạt tính 2g/l
IV/ Nhận xét kết quả

Hình 20. Mẫu lan bị nhiễm sau khi cấy chuyền

Nhận xét ảnh hưởng của BA và NAA lên quá trình kích thích nhân chồi, tạo rễ hoa lan
Từ kết quả nuôi cấy sau 1 đến 2 tuần tỉ lệ mẫu chết là 100%
Theo lý thuyết cho thấy sự kết hợp giữa môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và
NAA 1mg/l ảnh hưởng tích cực lên sự hình thành chồi và sinh trưởng chồi.


Môi trường MS có bổ sung NAA 1mg/l và than hoạt tính thích hợp cho sự tạo rễ
invitro hoa lan

BÀI 5
PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG
I/ Nguyên tắc
Đỉnh sinh trưởng là phần chóp của búp là hoặc thân cây nơi có thể sinh ra những phần
mới. Đỉnh sinh trưởng thường mềm yếu rất mẫn cảm với ánh sáng, chứa rất nhiều auxin
nơi diễn ra trao đổi chất mạnh.
Phương pháp tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được sử dụng trong nuôi cấy invitro
với mục đích chính nhằm phục hồi giống cây trồng bị nhiễm bệnh và tạo ra cây con hoàn
toàn sạch bệnh. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3-4
tiền phát khởi lá có kích thước từ 0,1-0,15mm tính từ chóp sinh trưởng. Kỹ thuật này khá
phức tạp, phải thực hiện dưới kính hiển vi và khả năng sống sót của mẫu có kích thước
nhỏ như vậy thường không cao, do đó đòi hỏi thao tác thật tỉ mỉ, chính xác và lựa chọn
môi trường thích hợp nhất.
Có 2 phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy:
Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở cây 2 lá mầm (dicotyledon) như cây khoai tây, thuốc
lá, cam chanh, hoa cúc…
Đỉnh sinh trưởng→ Chồi nách→ Cây


Phát triển cây gián tiếp: Chủ yếu gặp ở các đối tượng 1 lá mầm (monocotyledon) như
phong lan, dứa, huệ, … đỉnh sinh trưởng tạo protocorm từ protocorm phát triển thành cây

hoàn chỉnh.
Đỉnh sinh trưởng→ Protocorm→ Cây

II/ Mẫu vật, hóa chất dụng cụ

Hình21.Hoa huệ trắng
Cồn 70oC, 90oC, xà phòng bột, Javen, nước cất vô trùng, dao cấy, lưỡi dao cấy, đèn cồn,
kính lúp, đĩa petri.
III/ Tiến hành thí nghiệm
Chọn chồi cây huệ sạch, cắt bỏ lá.



Rửa sạch mẫu dưới vòi nước máy trong 10’

Ngâm mẫu trong xà phòng trong 30’→ Dùng bàn chải mềm chà nhẹ với xà phòng

Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước 5’

Ngâm mẫu trong dung dịch Javen/nước với tỉ lệ 1/1 → Rửa sạch Javen bằng nước cất
vô trùng 4 lần

Đưa mẫu vào tủ cấy, lắc cồn 70oC 1’ → Rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 3 lần.

Sau khi khử trùng tách bỏ các lá dưới kính lúp 2X và thị kính 10X

Chồi ngọn được giữ bằng một kẹp nhỏ trong lúc tiến hành tách lá.→ Đầu dao mổ phải
được khử trùng thường xuyên trong quá trình tách các lá

Khi đỉnh sinh trưởng chỉ còn 1-2 phát thể lá dùng dao mổ tách rời ra và đặt ngay vào môi

trường nuôi cấy để tránh mẫu bị khô.


Hình 22,23. Đỉnh sinh trưởng trên kính hiển vi

IV/ Kết luận
*Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:
Phục hồi giống cây trồng bị nhiễm bệnh, tạo cây con hoàn toàn sạch bệnh ít
nhiễm virus
Nhân nhanh số lượng cây giống sạch virus
Những cây bị nhiễm virus cũng có thể tạo ra cây sạch bệnh nhờ nuôi cấy dỉnh
sinh trưởng


Trạng thái vật lý của môi trường có ý nghĩa quan trọng trong nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng
* Để loại bỏ virus ở cây trồng thường có những phương pháp:
Kết hợp xử lý nhiệt và xử lý hóa chất với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chọn lọc bằng phương pháp thử virus
*Nếu đặt đỉnh sinh trưởng không ngay ngắn lên môi trường (mặt cắt không tiếp xúc được với
bề mặt môi trường) đỉnh sinh trưởng sẽ không lên. Vì mặt cắt không tiếp xúc được với môi
trường sẽ không tiếp xúc và hấp thu được các chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng. Vì vậy
phần đỉnh sinh trưởng sẽ không sống và phát triển được.


Bài 6
THUẦN DƯỠNG CÂY CON RA VƯỜN ƯƠM
I/Nguyên tắc
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trình
nhân giống invitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này tron thực tiễn

sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển con invitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn
toàn tự dưỡng.
Sự thành công của một kỹ thuật nhân giống thực vật thể hiện qua số cây con sống được
ngoài vườn ươm. Tỉ lệ cây nuôi cấy sống được ngoài vườn ươm phụ thuộc nhiều vào kĩ
thuật thuần hóa. Do đó, việc thuần hóa cây nhằm mục đích cho cây nuôi cấy thích nghi
được với những điều kiện của môi trường tự nhiên: Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, chế độ
dinh dưỡng, dịch bệnh,..
II. Vật liệu, dụng cụ
Các mẫu cây vitro đã tái sinh hoàn chỉnh đủ lá, rễ

Hình 24. mẫu lan nuôi cấy mô
Giá thể hỗn hợp để ươm cây (xơ dừa, tro trấu,…), khay ươm.


Hình 24. Giá thể ươm cây
III. Cách tiến hành
Thực hành 1: Chuẩn bị giá thể ươm cây con
Chuẩn bị giá thể:
50% đất+ 50% tro trấu, xơ dừa
+ phân ủ hoai mục
Điều chỉnh ẩm độ giá thể: 70%

Tiệt trùng giá thể:
Hấp hay hóa chất (24 giờ trước khi
trồng)

Giá thể hoàn thiện

Sơ đồ: chuẩn bị giá thể ươm cây con