Khoá luận tốt nghiệp tổng hợp các dẫn xuất cabamat của thuốc chống HIV 3TC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
= = = £ 0 È 3 os= = =

HOÀNG THỊ HẢI ANH

TỔNG HƠP CÁC DẪN XUẤT
CACBAMAT CỦA THUỐC CHỐNG
HIY- 3TC

KHÓA LUÂN
TỐT NGHIẼP
ĐAI
HOC
•
•
•
•
Chuyên ngành: H óa học hữu cơ

Ngưòi hướng dẫn khoa học
TS. ĐẶNG THỊ TUYẾT ANH

HÀ NỘ I-2016


LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Hóa dược, Viện
Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Với tất cả sự kính ttọng và biết ơn chân thành, sâu sắc em xin gửi lời

cảm ơn đến TS. Đặng Thị Tuyết Anh đã định hướng và hướng dẫn em tận
tình trong suốt thời gian em làm đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Nguyễn Văn Tuyến và
các Thầy Cô làm việc tại phòng Hóa Dược, Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm
Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ để em được
nghiên cứu, học tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình.
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2, ban chủ nhiệm khoa cùng toàn thể các Thày Cô trong Khoa
Hóa học đã hết lòng quan tâm, dìu dắt và giúp đỡ em trong suốt quá trình học
tập tại trường và hoàn thiện khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã luôn tạo điều
kiện động viên, khích lệ giúp em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu khóa luận
tốt nghiệp cuả mình.
Hà Nội, ngày 6 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Hoàng Thị Hải Anh


DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT

[a]D

Độ quay cực Specific Optical Rotation

*H - NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13c - n m r

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

2D -N M R

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Two - Dimentional NMR

DMF

Dimethylfomamide

E I-M S

Phổ khối lượng va chạm elctron

E S I-M S

Phổ khối lượng phun mù điện tử
Electron Spray ionizasion Mass Spectra

EtOAc

Ethylacetat

HMBC

Heteronuclear Mutiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Mutiple Quantum Coherence

IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

TCL

Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

uv

Phổ tử ngoại

Rf

Hệ số di chuyển

MeOH

Rượu Metylic

DMF

Dimethyl formamide

GC-MS

Gas Chromatography Mass Spectometry

LC-MS

Liquid Chromatograph

PBMCs

Peripheral blood mononuclear cells


DANH MỤC CÁC s ơ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Tổng họp lamivudin từ aldehyde glyco.......................................... 8
Sơ đồ 1.2: Tổng hợp lamivudin từ từ L-glucozo.............................................. 8
Sơ đồ 1.3: Tổng họp các họp chất este và cacbamat của 3TC....................... 10
Sơ đồ 3.2 : Tổng họp dẫn xuất 18................................................................... 30
Sơ đồ 3.3 : Tổng họp dẫn xuất 19................................................................... 31
Sơ đồ 3.4 : Tổng họp dẫn xuất 20................................................................... 33
DANH MUC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU
Hình 1.1: Một số chất thuộc nhóm NRT......................................................... 2
Hình 1.2: Mô hình phân tử lamivudin ttong không gian................................ 5
Hình 1.3: Nhóm các chất ức chế enzym phiên mã ngược................................ 6
Hình 1.4: Các thuốc ức chế HIV protease........................................................ 7

Hình 3.2: phổ ^-N M R của dẫn xuất 19........................................................ 32
Hình 3.3: phổ ^-N M R của dẫn xuất 20........................................................ 34
Bảng 2.1: Các thiết bị chính sử dụng trong phòng thí nghiệm...................... 22
Bảng 2.2 : Các dụng cụ chính sử dụng trong phòng thí nghiệm..................... 23


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề..............................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 5
1.1. Tổng quan về lamivudin........................................................................5
1.1.1. Công thức cấu tạo .............................................................................5
1.1.2. Mô hình phân tử trong không gian.................................................. 5
1.1.3. Công thức phân tử: C8H9N3S0 3 ....................................................... 5
1.2. Tình hình nghiên cứu...............................................................................5
1.2.1. Trên thế giới.......................................................................................5
1.2.1.1. Thuốc chống HIV/AIDS ức chế enzym phiên mã nguợc
nucleozit....................................................................................................6
1.2.1.2. Thuốc chống HIV/AIDS ức chế enzym phiên mã nguợc không
phải nucleozit............................................................................................6
1.2.1.3. Thuốc chống HIV/AIDS ức chế HIV protease..........................7
1.2.1.4. Các phucmg pháp tổng họp lamivudin...................................... 7
1.3. Hoạt tính kháng HIV của một số dẫn xuất lamivudin (3TC)................ 9
1.4. Tổng quan về các phuơng pháp nghiên cứu trong tổng họp hữu cơ .... 10
1.4.1. Phuơng pháp sắc kí bản mỏng.........................................................10
1.4.2. Chiết.................................................................................................11
1.4.3. Loại bỏ dung môi ở áp suất th ấp................................................... 12
1.4.4. Sắc kí cột..........................................................................................12
1.4.5. Phuơng pháp nhồi cột huyền phù.................................................. 12

1.4.6.1. Chọn chất hấp phụ.....................................................................13
1.4.6.2. Lụa chọn dung môi chạy cột sắc k í...........................................13
1.4.6.3. Tỉ lệ giữa luợng mẫu chất càn tách với kích thuớc cột........... 14


1.4.6.4. Tỉ lệ giữa chiều cao lượng silicagel và đường kính trong của cột
sắc k í.......................................................................................................14
1.4.6.5. Cách nạp silicagel vào cột....................................................... 14
1.4.6.5.1. Nạp silicagel ở dạng sệt....................................................... 14
1.4.6.5.2. Nạp silicagel dạng khô...........................................................15
1.5. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ..17
1.5.1. Điểm nóng chảy (Mp).................................................................... 17
1.5.2. Độ quay cực ([a]D) ...........................................................................17
1.5.4. Phổ khối lượng (Mass spectrocopy, M S).................................... 19
CHƯƠNG 2: TH ựC N GHIỆM ................................................................... 21
2.1. Mục tiêu của khóa luận........................................................................ 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết b ị ............................... 21
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu................................................................ 21
2.2.2. Hóa chất và dung môi..................................................................... 21
a. Thiết b ị:.............................................................................................. 22
b. Dụng cụ.............................................................................................. 23
c. Hóa chất............................................................................................ 24
2.2.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các họp chất bằng
sắc kí lớp mỏng..........................................................................................24
2.2.4. Định lượng phản ứng...................................................................... 24
2.2.5. Thiết bị xác định cấu trúc............................................................... 25
2.3. Tổng họp các dẫn xuất cacbamat của lamivudin(3TC)....................... 26
2.3.1. Tổng họp chất 18............................................................................ 26
2.3.2. Tổng hợp chất 19............................................................................ 27
2.3.3. Tổng họp chất 20............................................................................. 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................. 29
3.1 .Quy trình tổng hợp................................................................................. 29
3.1.1. Tổng hợp chất 18............................................................................ 30


3.1.2. Tổng hợp chất 19........................................................................... 31
3.1.3. Tổng hợp dẫn xuất 2 0 .................................................................... 33
KẾT LUÂN....................................................................................................35
DANH MỤC VÀ TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................36


MỞ ĐẦU
1. Lí do chon đề
Theo báo cáo của cơ quan điều phối về HIV/AIDS của Lên họp quốc
(ANAIDS) và Tổ chức y tế Thế giới (WHO), bệnh HIV/AIDS xuất hiện vào
những năm cuối của thập kỷ 70 và đầu thập kỷ 80 ở Châu Phi.
Tại Châu Á, dịch HIV/AIDS xuất hiện muộn và những năm cuối của
thập kỷ 80, vùng Đông Ầu và Trung Á phát hiện dịch vào những năm đầu của
thập kỷ 90. Dịch HIV/AIDS xuất hiện ở khu vực Đông Nam Á khá muộn,
trường họp nhiễm HIV đầu tiện ở khu vực này được phát hiện tại Thái Lan
vào năm 1985, đến cuối những năm 90 là Campuchia, Myanma.
Theo báo cáo toàn cầu của WHO và công tác phòng chống HIV/AIDS,
cho đến thời điểm hiện tại có 35 triệu người nhiễm HIV, 1.5 triệu ngưòi chết
do AIDS và 119 quốc gia báo cáo kết quả có khoảng 95 triệu người đã xét
nghiệm HIV.
Tại Việt Nam, ừong năm 2015 cả nước xét nghiệm phát hiện mới
10.195 trường họp nhiễm HIV, số bệnh nhân chuyển sang giai đoạn AIDS
6.130, số bệnh nhân tử vong 2.130 trường họp. Trong năm 2015 các tỉnh triển
khai rà soát lại người nhiễm Hrv, có thêm 5524 trường họp HIV, 10.144 bệnh
nhân AIDS và 13.254 người tử vong trong nhiều năm trước nay được báo cáo

bổ sung. Tính đến cuối năm 2015, toàn quốc có 227.154 người nhiễm HIV
đang còn sống với HIV được báo cáo, 85.194 người nhiễm HIV đang giai
đoạn AIDS và đã có trên 86.716 người nhiễm HIV đã tử vong. Trong số
227.154 người được báo hiện nay đang còn sống, nhưng có 24.717 người
nhiễm HIV không xác định được trên thực tế, những người này có thể trùng
với những người quản lý được nhưng thông tin cá nhân không chính xác nên
không loại trừ được, hoặc sợ kỳ thị họ cung cấp thông tin không đúng cho
nhân viên y tế, do đó số quản lý được theo dõi được ở các tỉnh chỉ có 202.437.
Theo ước tính, cả nước hiện có khoảng 254.000 người nhiễm HIV ừong cộng
1


đồng, mỗi năm có khoảng 12.000-14.000 trường họp mới nhiễm HIV. Như
vậy ước tính hiện nay có khoảng 80% người nhiễm HIV biết được tình trạng
HIV của họ.
Trong số những người được báo cáo xét nghiệm mới phát hiện nhiễm
HIV trong năm 2015, nữ chiếm 34,1%, nam chiếm 65,9%, lây truyền qua
đường tình dục chiếm 50,8%, lây truyền qua đường máu chiếm 36,1%, mẹ
truyền sang con chiếm 2,8%, không rõ chiếm 10,4%.
Tất cả các số liệu trên cho thấy HIV/AIDS có tác động mạnh như thế
nào đến sức khỏe mà sinh mạng của con người không chỉ ở Việt Nam mà còn
trên phạm vi toàn thế giới. Ngày nay, các nhà khoa học đã nghiên cứu ra một
số nhóm chất có hoạt tính chống HIV/AIDS tiêu biểu như: zidovudin (AZT),
stavudin (d4T), didanosin (ddl), Lamivudin(3TC).

3'
2'
Stavudin (1)

N3°

Zidovidin (2)

Lamivudin (3)

Hình 1.1: Một số chất thuộc nhóm NRT
Lamivudin(3TC) là họp chất nucleozit được dùng rất hiệu quả để chữa
bệnh HIV và bệnh viêm gan B. Lamivudin là 1 thuốc tổng họp kháng
retrovirus, thuộc nhóm dideoxynucleosid ức chế enzym phiên mã ngược của
virus. Để có tác dụng lamivudin phải được enzym tế bào phosphoryl hóa và
biến đổi thành một chất chuyển hóa có hoạt tính, chất chuyển hóa 5 triphosphat. Chất chuyển hóa này có cấu trúc tưomg tự deoxycytidin
triphosphat là cơ chất tự nhiên cho enzym phiên mã ngược. Thuốc có hoạt
tính cạnh tranh với deoxycytidin triphosphat tự nhiên để họp nhất vào DNA
của virus bởi enzym phiên mã ngược, gây kết thúc sớm tổng họp DNA của
virus. Lamivudin có độc tính rất thấp đối vói tế bào. Lamivudin có hoạt tính
2


kìm virus HIV typ 1 và 2 (HIV - 1, HIV - 2), và cũng có tác dụng ức chế viras
viêm gan B ở ngưòi bệnh mạn tính.
Tuy được dung nạp tốt, nhưng không dùng lamivudin đơn độc, vì dễ
sinh kháng thuốc. Sự kháng này do đột biến về enzym phiên mã ngược, làm
giảm tính nhạy cảm hơn 100 lần và làm mất tác dụng kháng virus trên người
bệnh. Liệu pháp phối họp lamivudin và zidovudin ở người bệnh chưa được
điều tìị trước đây, làm giảm khoảng 10 lần mật độ viras trong huyết tương,
tác dụng kéo dài hơn 1 năm, mặc dù có sự đột biến của enzym phiên mã
ngược. Nếu sử dụng một lượng lớn lumivudin đưa vào trong tế bào gây ngộ
độc tế bào, không thể đào thải ra bên ngoài gây tác dụng phụ nguy hiểm.
Người ta đang hướng tới tìm ra các dẫn xuất mới làm giảm độc tính của
thuốc, giải phóng thuốc qua quá trình ừao đổi chất, cho phép đưa lượng lớn
các thuốc vào trong màng tế bào và được giải phóng dàn dần nhờ quá trình

trao đổi chất.
Xuất phát từ thực tiễn trên, tội chọn đề tài khóa luận tốt nghiệp là:
“ Tổng hợp các dẫn xuất cabamat của thuốc chống HIV-3TC”
2. Mục đích nghiên cứu.
Nghiên cứu tổng họp thành công và xác định cấu trúc của một số dẫn
xuất của cacbamat của thuốc chống HIV-3TC có mạch nhánh là các
hydrocacbon no hoặc không no có khối lượng phân tử lớn. Từ đó tạo cơ sở cho
những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tổng hợp các họp chất hữu cơ nói
chung và nâng cao hoạt tính sinh học cho các dẫn chất của 3TC nói riêng, góp
phàn vào sự phát triển của y học thế giới cũng như y học Việt Nam về lĩnh vực
trống HIV hiện đại.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu.
- Nghiên cứu các tài liệu tham khảo liên quan đến đề tài (các đề tài,
bài báo cáo khoa học, các công trình khoa học đã làm thành công về đề tài).

3


- Nghiên cứu các hướng tổng hợp, các cơ chế và dự đoán các hướng
sản phẩm của các phản ứng.
- Tổng hợp một số dẫn xuất của 3TC có mạch nhánh là các
hiđrocacbon no hoặc không no có khối lượng phân tử lớn.
- Tiến hành đo phổ và giải phổ để kiểm tra cấu trúc của sản phẩm tổng
họp.

4


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về lamỉvudỉn

1.1.1. Công thức cẩu tạo

Lamivudin
(L-2',3 '-dideoxy-3 '-thiacytidine)
1.1.2. Mô hình phân tử trong không gian

Hình 1.2: Mô hình phân tử lamivudin trong không gian
1.1.3. Công thức phân tử: CịịHtịN3 S 0 3
1.2. Tình hình nghiên cứu
1.2.1. Trên thế giới
Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thuốc chống
HIV/AIDS và đạt đuợc những thành tựu nhất định buớc đầu tìm ra một số
nhóm chất chống HIV/AIDS.

5


1.2.1.1. Thuốc chổng HIV/AIDS ức chế enzym phiên mã ngược nucleozit
2’,3’-Dihydroxynucleozit (NRT) là nhóm chất quan họng nhất của
các chất chống HIV/AIDS, gồm có zidovudin (AZT), stavudin (d4T),
didanosin (ddl), lamivudin (3TC)... [5- 8,12,14,]. Các nucleozit này được
phosphat hoá nhờ enzym kinase tạo thành 5’-triphosphat và được gắn vào
mạch ADN của virus nhờ enzym phiên mã ngược của HIV. Do C-3’ của các
chất này vắng mặt nhóm OH nên không thể kéo dài mạch ADN của virut,
ngăn chặn quá trình mã hoá ngược ARN thành ADN, vì thế virus ngưng phát
triển [53].

Stavudin(1)

Zidovidin (2)

Lamivudin (3)

Hình 1.1: Một số chất thuộc nhóm NRT
1.2.1.2. Thuốc chổng HIV/AIDS ức chế enzym phiên mã ngược không phải
nucleozỉt
Nhóm các chất không phải là nucleozit (NNRT) có khả năng ức chế
enzym phiên mã ngược bao gồm nelviparin, efavirenz, delavidin... Nhóm
chất này hoạt động theo cơ chế khác vói các nucleozit ở trên.

N elvirapin (4)

E favirenz (5)

D elavirdin (6)

Hình 1.3: Nhóm các chất ức chế enzym phiên mã ngược.

6


1.2.1.3. Thuốc chổng HIV/AIDS ức chế HIVprotease
Các thuốc ức chế HIV protease là các chất có nguồn gốc peptit có chứa
hydroxyetylen isoster và hydroxyetylenlamin isoster. Những isoster này gắn
vào HIV protease tạo thành trạng thái chuyển tiếp gần giống với trạng thái
chuyển tiếp của sự thuỷ phân mạch peptit của HIV protein, nhưng thiếu nhóm
OH nên quá trình cắt mạch peptit bị ngừng lại và ngăn chặn sự phát triển của
virus. Một số ví dụ về nhóm thuốc này là saquinavir, neíinavir, indinavir,
lopinavir [5].

Hình 1.4: Các thuốc ức chế HIV protease

1.2.1.4. Các phương pháp tổng hợp lamỉvudỉn
Lamivudin được tổng hợp đầu tiên bởi Belleau và cộng sự trong nghiên
cứu của mình tại Đại học McGill (Montreal, Quebec, Canada)vào năm 1989.
Một số phương pháp tổng họp lamivudin:
❖ Phương pháp thứ nhất:

7


Năm 1991, Choi và cộng sự đã tìm ra phương pháp tổng hợp lamivudin
vói hiệu suất 98% (sơ đồ 1.1 )
OTBDF
DiBAL-H,AC,0
64%

Toulene-78°C
84%
10

OTBDF
AcO

12

11

80% TMS-cytosúie
DMC, stannic

chloride

Sơ đồ 1.1: Tổng họp lamivudin từ aldehyde glyco
❖ Phương pháp thứ hai:
Vào năm 1992, Jeong và cộng sự đã thành công ừong việc giải thích quá
trình tổng họp lamivudin từ L-glucozo.(Sơ đồ 1.2)

HQ

y r

hóN^0

OH
Sucessive Stegs

TBDPSO/

L- Glucose 14

15

Sơ đồ 1.2: Tổng họp lamivudin từ từ L-glucozo

8


1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Hiện tại, trong nước hầu như chưa có công trình nào nghiên cứu tổng
hợp lamivudin và các dẫn xuất của nó. Các nhà nghiên cứu chủ yếu nghiên

cứu vê hoạt tinh sinh học của lamivudin và dẫn xuất trong việc chống HIV và
viên gan B cho từng đối tượng hay các công trình nghiên cứu định lượng
lamivudin như đề tài: “Xây dựng phưomg pháp định lượng đồng thời
lamivudin zidovudin và nevirapin ừong chế phẩm viên nén bằng MEKC”.
Lamivudin có hoạt tính sinh học cao nhưng sử dụng lâu dễ gây độc tế
bào nên càn nhiều công trình nghiên cứu tổng họp ra các dẫn xuất mới của
lamivudin làm giảm thiểu tính kháng thuốc là vô cùng cần thiết.
1.3. Hoạt tính kháng HĨV của một số dẫn xuất lamỉvudỉn (3TC)
Hiện nay, phần lớn các tiền thuốc (este và cacbamat) được thiết kế cho
các mục đích khác nhau như: làm giảm độc tính của thuốc, giải phóng thuốc
qua quá trình trao đổi chất, cho phép đưa lượng lớn các thuốc vào trong màng
tế bào và được giải phóng dàn dàn nhờ quá trình trao đổi chất. Đe đạt được
mục đích đó, hiện nay việc gắn các chất có mạch dài ưa dầu vào liên kết 5’-0
của nucleozit như đưa nhóm este hoặc cacbonat có chứa mạch nhánh là một
trong những con đường hiệu quả được các nhà hóa học rất quan tâm. Mặc dù
có công trình nghiên cứu thấy rằng các dẫn xuất 5’-0-cacbamoyl-2’,3’dideoxynucleozit không có hoạt tính chống virut vì liên kết cacbamat bền với
thủy phân enzym. Tuy nhiên, các nghiên cứu hiện nay đã thông báo một số
axit amin liên kết với AZT thông qua liên kết cacbamat có hoạt tính chống
HIV-1 trên dòng tế bào PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) lây
nhiễm và hoạt tính chống HIV. Hoạt tính của nó đã được giả thiết rằng không
liên quan đến việc nhả AZT trong tế bào.
Gần đây, các dẫn xuất 5’-0-cacbamate-2’,3’-dideoxythiacytidin được
Anastasi nghiên cứu tổng họp (sơ đồ 1.3). Hoạt tính của các dẫn xuất này

9


được nghiên cứu trên dòng tế bào lây nhiễm HIV MT4 hoặc PBMCs. Kết quả
cho thấy một số hợp chất có hoạt tính cao hơn và ít độc hơn so vói 3TC [11].

,c

17
a. x= -NH-, Y= -NH-Boc, n=3, R=-Boc
u. A
= --NH-,
I N I T , Y=
1 = --NH-Boc,
i N n - D u u , In=4,R=-Boc
I= *t, n = - c
b.
x=
c. x= -NH-, Y= -OH, n=3, R=-Boc
d. x= -NH-, Y= -OH, n=4, R=-Boc
e. x= -NH-, Y= -OH, n=6, R=-Boc
f. x= -NH-, Y= -CH3, n=3, R=-Boc
g. x= -NH-, Y= -CH3, n=2, R=-Boc

Sơ đồ 1.3: Tổng hợp các hợp chất este và cacbamat của 3TC
Lamivudin là họp chất nucleozit được dùng rất hiệu quả để chữa bệnh
HIV và bệnh viêm gan B. Tuy nhiên, khi sử dụng lâu dài sẽ gây nhiều hiệu
ứng phụ vì chất này có độc tính cao. Việc nghiên cứu các dẫn xuất của nó như
đã đề cập ở trên là hướng nghiên cứu rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, cho
phép tạo ra các tiền chất ít độc và có thể đưa vào cơ thể một lượng lớn thuốc
nhờ quá trình ừao đổi chất, các tiền chất này sẽ được giải phóng dàn
lamivudin.
1.4. Tổng quan về các phương pháp nghiền cứu trong tổng họp hữu cơ
1.4.1. Phương pháp sắc kí bản mỏng
Sắc kí bản mỏng được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm.
Thông thường sản phẩm với giá trị Rf khác nhau màu sắc và sự phát quang

khác nhau... Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng xảy ra, không xảy
ra, kết thúc phản ứng.
Phương pháp sắc kí lớp mỏng gồm pha tĩnh là 1 lớp mỏng các chất hấp
phụ, thường là silica gel 6 0 F 254, aluminum oxide được phủ trên một mặt
phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong
dung môi thích họp và được hút lên sắc kí bỏi mao dẫn, tách dung dịch thí
nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phàn trong dung dịch.
10


Dùng mao quản chấm một vết nhỏ dung dịch nguyên liệu đầu, một vệt
là sản phản phản ứng khoảng lcm từ dưới lên. Bản sắc kí sau đó được nhúng
vào một hệ dung môi thích họp n-hexan/EtOAc được đặt trong bình triển
khai. Dung môi được chuyển lên bản sắc kí gặp phải mẫu thử và dung dịch
chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các chất với Rf khác nhau dịch chuyển với
tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau với pha tĩnh và độ tan khác
nhau trong dung môi. Họp chất có tính phân cực sẽ di chuyển lên cao hơn trên
bản sắc kí. Đối vói những chất có

uv ta kiểm tra uv có thể nhận được các

vết khác nhau. Dựa vào các vết trên bản mỏng cùng vói giá thị Rf tương ứng
ta có thể nhận biết được phản ứng đã xảy ra hay chưa, nguyên liệu đầu còn
hay hết.
Dựa vào tính chất đó chứng ta có thể tìm được dung môi hoặc hỗn họp
dung môi để các chất tách ra khỏi nhau (Rf khác nhau) tìm được hệ dung môi
cần để tinh chế các chất.
Có thể sử dụng một hỗn họp hai dung môi. Trong hai dung môi đó một
dung môi có khả năng hòa tan tốt chất kết tinh còn dung môi kia thì ngược lại
hoặc ít tan. Hỗn họp hai dung môi này phải hòa tan vào nhau tạo thành một

dung dịch đồng nhất trong suốt.
Thông thường một chất dễ hòa tan trong dung môi có cấu trúc hóa học
gàn gũi. Ví dụ các este dễ hòa tan trong cồn hoặc trong etylaxetat. Các
hidrocacbon dễ tan trong benzen, ete, dầu, n-hexan. Thường dung môi có
nhiệt độ sôi từ 60°c - 80°c là thích hợp.
1.4.2. Chiết
Chiết là quá trình tách và phân li các chất dựa vào quá trình chuyển một
chất hòa tan trong một pha lỏng (thường là nước) một pha lỏng khác không
hòa tan vào nó (thường là dung môi hữu cơ không hòa tan với nước). Như vậy
ta có quá trình chiết lỏng.

11


Chiết là phương pháp có ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích
tách, phân ly, làm giàu các chất đặc biệt khi cần tách một lượng nhỏ các tạp
chất ra khỏi một lượng lớn các chất khác. Ưu điểm của quá trình là thực hiện
nhanh. Các thiết bị chiết đơn giản chỉ là phễu chiết thường ngưòi ta không cần
thiết bị gì thêm.Chọn được dung môi (dung môi chiết CH2CI2) và điều kiện
chiết thích họp vói chất thử người ta có thể tách được bất kì cấu tử nào ra khỏi
hỗn họp bất kì. Trường hợp chất chiết có màu ta có thể sử dụng phần chiết
vào mục đích phân tích định lượng theo các phương pháp đo quang.
1.4.3. Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp
Dùng máy cất quay chân không. Sau khi loại bỏ dung môi để thu được
chất khô hoàn toàn ta dùng máy hút chân không hút làm khô chất.
1.4.4. Sắc kí côt
Nguyên tắc sắc kí cột dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất
thử đối với chất hấp phụ để tách các chất riêng ra. Nhưng trong sắc kí cột,
chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong ống hình trụ và vì thế mà gọi là
sắc kí cột. Với cột hấp phụ người ta có thể triển khai một dung môi liên tục,

hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.
Dụng cụ chủ yếu là cột để nhồi chất hấp phụ để làm thành cột kí. Cột
có thể là những ống hình trụ dài 30 - 100cm, đường kính từ 1 - 8cm tùy theo
chiều dài cột tỉ lệ giữa đường kính.
1.4.5. Phương pháp nhồi cột huyền phù
Cột đem dùng phải thật sạch, khi đối vói chất hấp phụ là nhôm oxit, có
thể dùng phương pháp nhồi cột khô, nghĩa là lắp cột thẳng đứng, chắc chắn.
Đổ lượng AI 2O 3 qua phễu, theo một ống đổ vào đáy cột. Rót từ từ đều
đặn để tạo nên một cột liên tục đều đặn, bằng phẳng không có chỗ rỗng, chỗ
dày, chỗ mỏng sau khi rót hết chất nhồi vào cột người ta có thể dùng một đũa

12


thủy tinh đàu gắn với một nút cao su và gõ nhẹ đều vào thành cột cho đến khi
nhận được một chiều cao nhất định.
1.4.6. Phương pháp lựa chọn chất hấp phụ và dung môi chạy cột sắc kí
1.4.6.1. Chọn chất hấp phụ
Thông thường ta sử dụng chất hấp phụ là Silicagel, ngoài ra còn dùng
Sephadex, Sắc kí trao đổi ion.
1.4.6.2. Lựa chọn dung môi chạy cột sẳc kí
Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột Sắc kí Silicagel ta phải
dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bước cơ bản sau:
- Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích
hợp.
- Chuẩn bị 4+6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi
tấm với lượng tương đương nhau.
- Mỗi bản mỏng được chạy với loại dung môi có độ phân cực khác
nhau. Tiếp theo hiện hình dưới đèn u v hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ
dễ dàng thấy được dung môi nào thích họp. Từ kết quả đó tìm được hệ dung

môi (ừong đó có một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, (ví
dụ n-hexan/EtOAc) phù họp để chạy cột sắc kí.
- Với mẫu chất được chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không
phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy
vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là dung
môi đẩy vết phân cực nhất lên Rf khoảng 0,2 trên bản mỏng.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù họp ta thực hiện chạy cột sắc kí
với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực.
Chú ý:
- Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột giống nhau.

13


- Dung môi ban đàu chạy cột là dung môi phù hợp đã chọn đuợc ở trên
nhưng cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hom một ít. Vì chất hấp phụ, YÍ dụ
như silicagel tráng trên bản mỏng có kích thước nhỏ hom, độ mịn và độ chặt
chẽ lớn hom so vói Silicagel khi thực hiện chạy cột sắc kí.
- Đối với sắc kí cột Sephadex ta thường dùng một dung môi là MeOH.
1.4.6.3. Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng
Silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hom khoảng 25 - 50 làn khối lượng của mẫu
chất cần tách. Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khó tách riêng thì
tỉ lệ này còn cao hom (khoảng 100 - 200 lần).
1.4.6.4. Tỉ lệ giữa chiều cao lượng Silicagel và đường kính trong của cột sắc
kí

Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì chiều cao
của silicagel trong cột và đường kính trong của cột cần đạt tỉ lệ khoảng 10:1.
Muốn biết lượng Silicagel có phù hợp với cột hay không thì cho

silicagel dạng khô (chưa có dung môi) vào cột để quan sát.
1.4.6.5. Cách nạp Silicagel vào cột
Để việc tách chất được tốt, silicagel phải được nạp vào cột một cách
đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thường. Silicagel được nạp vào cột
theo hai cách.
1.4.6.5.1. Nạp Silicagel ở dạng sệt
Cố định cột trên giá. Nếu đầu ra của cột không có lớp thuỷ tinh xốp thì
ta cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho Silicagel chảy xuống
bình hứng. Cho hệ dung môi chạy cột ban đầu vào bình đựng (cốc, ca nhựa).
Cân lượng silicagel càn thiết (đã tính toán xác định được ở trên) cho vào bình
đựng đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ và khuấy đều.

14


Lưu ý:
- Không nên thực hiện ngược lại nghĩa là rót dung môi vào Silicagel
bỏi vì silicagel khi gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, không
đồng nhất.
- Lượng dung môi phải vừa đủ để hỗn họp không được quá sệt khiến
bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng.
- Rót hỗn họp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung
môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được dùng để rót trở lại
đầu cột).
- Tiếp tục rót hỗn họp vào cột đến hết số lượng, vừa rót vừa gõ nhẹ
thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
- Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột
được đồng nhất.
Lưu ý:
- Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi

phủ trên phần đầu cột.
- Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng. Nếu mặt
thoáng chưa phẳng ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung môi sát mặt
thoáng làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho Silicagel lắng xuống từ
từ tạo nên mặt thoáng bằng phẳng.
- Vói sắc kí cột sephadex ta thao tác tương tự nhưng cần ngâm
sephadex vói dung môi một thời gian để sephadex trương nở trước khi cho
vào cột.
I.4.6.5.2. Nạp sỉlicagel dạng khô
- Cột được giữ thẳng đứng trên giá. Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột
(nếu cột không có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung môi chạy cột ban đầu vào
khoảng hai phần ba cột.

15


- Cho từ từ silicagel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa
gõ nhẹ thành cột. Khi lớp Silicagel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ
khoá và cho dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được rót
trở lại đầu cột).
- Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua vài ba lần để cột được ổn
định trước khi nạp mẫu vào.
- Thông thường người ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt.
1.4.6.53. Cách nạp mẫu vào cột
Có hai phương pháp nạp mẫu vào cột sắc kí là phương pháp khô và
phương pháp ướt.
* Phương pháp nạp cột khô:
Mau được nạp ở dạng khô. Thường áp dụng cho trường họp mẫu chất
không tan hoặc tan kém trong dung môi chạy cột ban đầu. Cách chuẩn bị mẫu:
Hoà tan hoàn toàn mẫu trong dung môi thích họp, cho một lượng silicagel vừa đủ

(lượng Silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhưng phải đủ để có thể cô quay mẫu
được khô hoàn toàn) vào rồi đem cất quay đuổi dung môi đến khô hoàn toàn. Lấy
mẫu đã gắn đều ưên Silicagel ra, nghiền thành bột mịn. Cột sau khi nạp Silicagel
được điều chỉnh lượng dung môi vừa đủ (đủ thấm ướt mẫu khô cho vào). Cho
mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để silicagel đã được gắn đều mẫu thấm đều
dung môi ưánh tạo bọt khí và tránh để mẫu bị vón cục.
* Phương pháp cột ướt:
Thường áp dụng khi mẫu tan hoàn toàn trong dung môi chạy cột ban
đàu. Lượng dung môi dùng hoà tan mẫu càng ít càng tốt, vì lớp dung dịch này
sẽ dàn trải một lớp mỏng ưên cột.
Có thể áp dụng tính toán cụ thể như sau: thể tích dung môi cần lấy để
hoà tan mẫu = 0,4.d2m/, với d là đường kính trong của cột tính bằng mm.
Mau được cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu
chảy vào từ từ theo thành cột. Với phương pháp nạp mẫu này chúng ta cho
16


dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silicagel ưong cột rồi khoá cột.
Sau đó, mở khoá để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel. Cho từng
lượng nhỏ dung môi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong
cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy
xuống được đồng đều).
1.5. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc họp chất hữu cơ
Cấu trúc của chất phân lập ra được xác định bằng sự kết họp của nhiều
phương pháp khác nhau. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng họp chất
mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau, cấu trúc càng phức tạp thì
yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao.
1.5.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Đối vói chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan
trọng. Thông thường việc phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm

kết tinh là việc xác định điểm chảy vì đó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ
tinh khiết của hợp chất mà chỉ càn lượng rất ít mẫu thử.
Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ
chênh lệch nhau không quá

0,5°c thì có thể xem sản phẩm kết tinh là tinh

khiết. Khi điểm chảy xác định được, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể
đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu.
1.5.2. Độ quay cực (fajo)
Ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trường bất đẳng hướng, trong điều
kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trường làm cho cường độ điện
trường chỉ còn dao động theo một phương nhất định được gọi là ánh sáng
phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần.
Mặt phẳng chứa tia sáng và phương dao động của vectơ điện trường
được gọi là mặt phẳng dao động, còn mặt phẳng chứa tia sáng và vuông góc
vói mặt phẳng dao động gọi là mặt phẳng phân cực.

17


Khi cho ánh sáng phân cực thẳng đi qua dung dịch một chất quang hoạt
thì mặt phẳng phân cực sẽ bị quay một góc a. Tuỳ theo chất quang hoạt mà
góc quay này có thể sang phải (+) hay sang trái (-). Độ lớn của góc quay a
phụ thuộc vào nồng độ

c (g/lOOml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung

môi) 1, nhiệt độ t và chiều dài sóng À,:

ot= [ặ £

Cỉ
ĩõ õ

1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân(Nuclear Magnetic
Resonancespectroscopy, NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu
hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ
nói chung và họp chất thiên nhiên nói riêng. Vói việc sử dụng kết họp các kỹ
thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định
chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý
chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng
hưởng ở các tần số khác nhau của các hạt nhân từ

và 13C) dưói tác dụng của

từ trường ngoài. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ
dịch chuyển hoá học. Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa
vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ vói nhau.
> Phổ 'ỉ ỉ - NMR: Trong phổ ’H - NMR, độ dịch chuyển hoá học (5)
của các proton được xác định trong thang từ 0 đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức
độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử. Mỗi loại
proton cộng hưởng ở một trường khác nhau vì vậy chúng được biểu diễn bằng
một độ dịch chuyển hoá học khác nhau. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch
chuyển hoá học cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà
người ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
> Phổ 13c - NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi
nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu
18