nghiên cứu nhân giống và tạo rễ củ in vitro cây địa hoàng (rehmannia glutinosa)

GIÁO DỤC VÀO ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

---------------

NGUYỄN THỊ THANH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÀ TẠO RỄ CỦ IN VITRO
CÂY ĐỊA HOÀNG (Rehmannia glutinosa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀO ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

---------------

NGUYỄN THỊ THANH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÀ TẠO RỄ CỦ IN VITRO
CÂY ĐỊA HOÀNG (Rehmannia glutinosa)

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ

: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH
TS.NGUYỄN THANH HẢI

HÀ NỘI, NĂM 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác.
Tôi cũng xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều
được ghi rõ nguồn gốc.
Học viên

Nguyễn Thị Thanh

i


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp
đỡ của nhiều cá nhân và cơ quan đơn vị. Nay luận văn đã hoàn thành, tôi xin bày
tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới:
PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi
điều kiện, giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài.

Các thầy giáo, cô giáo thuộc Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông
nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành
khóa học.
Các cán bộ, kỹ thuật viên Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông
nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi
thực hiện luận văn. Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Sinh học Nông
nghiệp đã cung cấp mẫu vật nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và
bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Hà Nội, tháng 10 năm 2015
Học viên

Nguyễn Thị Thanh

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục chữ viết tắt

vi

Danh mục bảng

vii

Danh mục hình

viii

MỞ ĐẦU

1

1. Đăt vấn đề

1

2. Mục đích và yêu cầu

2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1 Cây địa hoàng

3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật học

3

1.1.2. Yêu cầu về điều kiện sinh thái

4

1.1.3. Giá trị sử dụng, kinh tế của cây địa hoàng

6

1.1.4. Tình hình sản xuất địa hoàng trong nước

7

1.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro

8

1.2.1 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật.

8

1.2.2 Các bước cơ bản của quá trình nhân giống in vitro

9

1.2.3 Ảnh hưởng của một số nhân tố đến nhân giống in vitro

11

1.2.4. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng và phát triển của cây
địa hoàng in vitro

16

1.3. Ảnh hưởng của các loại phân bón đến sự sinh trưởng và phát triển của
cây invitro khi trồng trong điều kiện tự nhiên.

17

1.4. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây địa hoàng

19

1.4.1. Trên thế giới

19

1.4.2 Ở Việt Nam

20

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

21

2.1 Đối tượng nghiên cứu

21

iii


2.2 Vật liệu nghiên cứu

21

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

21

2.4 Nội dung nghiên cứu

21

2.4.1 Xác định chế độ khử trùng của mẫu cấy

21

2.4.2 Xác định môi trường nhân nhanh in vitro

22

2.4.3. Nghiên cứu chống thủy tinh hóa mẫu cấy

23

2.4.4. Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

23

2.4.5 Nghiên cứu môi trường tạo củ in vitro

24

2.4.6. Nghiên cứu xác định giá thể và phân bón lá thích hợp cho cây địa
hoàng in vitro tại vườn ươm

25

2.5 Phương pháp nghiên cứu

25

2.5.1 Bố trí thí nghiệm

25

2.5.2 Phương pháp tiến hành

26

2.6. Các chỉ tiêu theo dõi

27

2.7. Xử lý số liệu

29

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

30

3.1. Tạo vật liệu khởi đầu

30

3.1.1. Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% kết hợp Sodium dichloroisocyanuric
axit (NaDCC 0.5%) đến hiệu quả khử trùng.
3.2. Nhân nhanh in vitro

30
31

3.2.1.Ảnh hưởng của BA đến nhân nhanh chồi

31

3.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh
chồi in vitro cây địa hoàng

32

3.2.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi in
vitro cây địa hoàng

34

3.2.4: Ảnh hưởng của pepton đến khả năng nhân nhanh chồi

35

3.3 Chống hiện tượng thủy tinh hóa mẫu cấy

36

3.4.1. Ảnh hưởng của α-NAA (Axit α-naphtylaxetic) đến khả năng ra rễ
cuả cây địa hoàng

38

3.4.2. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ cuả cây địa hoàng

39

iv


3.5. Tạo củ in vitro cây địa hoàng

42

3.5.1: Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo củ in vitro cây địa
hoàng

42

3.5.2. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tạo củ in vitro
của cây địa hoàng

43

3.5.3 Ảnh hưởng của tổ hợp đường và α-NAA đến khả năng tạo củ in
vitro cây địa hoàng.

45

3.6. Xác định giá thể và dinh dưỡng thích hợp cho cây in vitro tại vườn
ươm

46

3.6.1. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây
in vitro

46

3.6.2. Ảnh hưởng của dinh dưỡng qua lá đến sinh trưởng của cây in
vitro của vườn ươm

47

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

49

Kết luận:

49

Đề nghị:

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

50

PHỤ LỤC

52

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4D

Dichlorophenoxyacetic acid

BA

Benzyl adenine

CT

Công thức

CV%

Sai số thí nghiệm

ĐC

Đối chứng

IBA

Indol butyric acid

LSD5%

Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa nhỏ hơn 5%

MS

Murashige and Skoog

NXB

Nhà xuất bản

TB

Trung bình

α -NAA

α- naphtyl axetic acid

vi


DANH MỤC BẢNG
Số bảng
3.1

Tên bảng

Trang

Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% kết hợp Sodiumdichloroisocyanuric acid
(NaDCC 0.5%) đến hiệu quả khử trùng

3.2

Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây
địa hoàng

3.3

31

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA đến khả năng nhân nhanh chồi
in vitro cây Địa hoàng

3.4

33

Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây
địa hoàng

3.5

34

Ảnh hưởng của pepton đến khả năng nhanh nhanh chồi in vitro cây
địa hoàng

3.6

30

35

Ảnh hưởng của chất kháng Ethylene (Thiosunfat Bac) đến khả năng
chống thủy tinh hóa của cây

37

3.7

Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của cây địa hoàng in vitro

38

3.8

Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây địa hoàng in vitro

40

3.9

Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo củ in vitro cây địa hoàng

42

3.10

Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tạo củ in vitro của
cây địa hoàng

3.11

43

Ảnh hưởng của tổ hợp đường và α-NAA đến khả năng tạo củ in vitro
cây địa hoàng

3.12

45

Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây in
46

vitro
3.13

Ảnh hưởng của dinh dưỡng qua lá đến sinh trưởng của cây in vitro
ngoài vườn ươm

47

vii


DANH MỤC HÌNH

Số hình
3.1

Tên hình

Trang

Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây địa
hoàng

3.2

32

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
in vitro cây địa hoàng

3.3

33

Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây
địa hoàng

35

3.4

Ảnh hưởng của pepton đến khả năng nhanh nhanh chồi

36

3.5

Ảnh hưởng của chất kháng Ethylene

37

3.6

Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của cây địa hoàng in vitro

39

3.7

Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây địa hoàng in vitro

41

3.8

Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây địa hoàng in vitro

41

3.9

Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo củ in vitro cây địa hoàng

42

3.10a Ảnh hưởng của đường đến khả năng tạo củ in vitro của cây địa
hoàng

44

3.10b Ảnh hưởng của đường đến khả năng tạo củ in vitro của cây địa
hoàng
3.11

44

Ảnh hưởng của tổ hợp đường và α-NAA đến khả năng tạo củ in vitro

cây địa hoàng

3.12

45

Ảnh hưởng của dinh dưỡng qua lá đến sinh trưởng của cây in vitro
ngoài vườn ươm

48

viii


MỞ ĐẦU
1. Đăt vấn đề
Ở Việt Nam nền y học cổ truyền rất phát triển, nhiều cây dược liệu quý đã
được sử dụng trong đó có cây địa hoàng (Rehmania glutinosa Gaertn Libosch).
Cây có nguồn gốc từ Trung Quốc có khoảng cách đây 2000 năm trước đến năm
1958 nhập trồng ở nước ta, hiện nay được phát triển trồng ở nhiều nơi từ Bắc đến
Nam ( Vũ Minh Tuấn, 2009). Rễ địa hoàng thu hái về, rửa nhanh, phân loại củ to,
nhỏ để riêng, đem sấy từ từ đến khi củ mềm rồi phơi hay sấy nhanh đến khô.
Loại củ to dùng ngay (dạng sống), tên thuốc là sinh địa. Dược liệu sau khi được
chế biến có tên thuốc là thục địa.
Dịch chiết từ củ địa hoàng tươi theo phương pháp hiện đại có tác dụng
cầm máu, ức chế tế bào ung thư, chống loét dạ dày, bảo vệ gan, tăng cường miễn
dịch cho cơ thể, điều chỉnh nội tiết và chuyển hóa.
Cây địa hoàng nhân giống vô tính bằng củ nên qua nhiều năm cây bị
nhiễm bệnh đặc biệt các bệnh về virut dẫn đến giảm năng suất và chất lượng sản
phẩm. Để đáp ứng nhu cầu về phát triển sản xuất cây địa hoàng cần phải có

nguồn giống chất lượng tốt. Hiện nay công nghệ nuôi cấy mô tế bào là công cụ
hữu hiệu cho nhân nhanh và phục hồi chất lượng cây giống, vì công nghệ này
cho hệ số nhân giống cao, cây giống được trẻ hóa, loại bỏ được mầm bệnh nấm
khuẩn. nhiều loại giống cây trồng bị thoái hóa đã được phục tráng thành công
bằng công nghệ nuôi cấy mô như: khoai lang, khoai tây, lily, hành tỏi… (Nguyễn
Thị Lý Anh, 2014),
Xuất phát từ những cơ sở trên với mong muốn góp phần phát triển sản
suất cây địa hoàng ở nước ta,chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân
giống và tạo rễ củ in vitro cây địa hoàng (Rehmannia glutinosa)”

1


2. Mục đích và yêu cầu
+ Mục đích
Xác định được yếu tố kỹ thuật làm cơ sở cho việc xây dựng quy trình
nhân nhanh và tạo củ in vitro cây địa hoàng phục vụ cho nhu cầu sản suất cây địa
hoàng ở nước ta
+ Yêu cầu
Xác định được chế độ khử trùng mẫu để tạo nguồn nguyên liệu cho nuôi
cấy in vitro
Xác định được môi trường nuôi cấy để nhân nhanh in vitro
Xác định được môi trường tạo rễ cho các chồi in vitro ở vườn ươm
Xác định môi trường tạo củ in vitro
Xác định được giá thể và chế độ dinh dưỡng cho cây in vitro ở vườn ươm
+ Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của đề tài
Kết quả của đề tài sẽ cung cấp thêm nguồn tài liệu cho khoa học về khả
năng sử dụng kỹ thuật mới trong nhân giống vô tính của cây địa hoàng nói riêng
và cây dược liệu nói chung.Đồng thời nó là tài liệu tham khảo về ứng dụng kỹ
thuật nhân nhanh giống trong trồng cây địa hoàng cho người dân và các cơ sở

trồng cây dược liệu.
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần tích cực vào hoàn thiện quy
trình nhân giống và tạo củ của cây địa hoàng. Khi hoàn thiện được quy trình nhân
giống và tạo củ cây địa hoàng bằng kỹ thuật in vitro sẽ tạo điều kiện chủ động
sản xuất cây giống địa hoàng với chất lượng tốt và giá thành cạnh tranh, phát huy
hết tiềm năng năng suất, chất lượng cây địa hoàng đáp ứng nguồn dược liệu trong
nước và xuất khẩu.

2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Cây địa hoàng
1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật học
● Nguồn gốc: Cây địa hoàng có nguồn gốc từ Trung Quốc. Năm 1958 cây
địa hoàng được di thực vào Việt Nam từ Trung Quốc (Vũ Tuấn Minh, 2009).
Những tỉnh trước đây trồng nhiều địa hoàng là: Hưng Yên, Hà Bắc, Hà Nam,
Nam Định, Thái Bình, Vĩnh Phúc, ngoại thành Hà Nội. Các tỉnh khác có trồng
nhưng ít hơn. Sau giải phóng miền Nam, địa hoàng còn được trồng ở một số tỉnh
phía Nam
● Phân loại: Cây địa hoàng còn có tên gọi là cây sinh địa, thục địa, địa
hoàng hoài. Tên khoa học: Rehmannia glutinosa Gaertn Libosch, Giới (regnum)
Plantae, Ngành (division) Mangnoliopsida, Lớp (class) Magnoliopsida, Bộ (ordo)
Lamiales, Họ (familia) Scruphulariaceae, Chi (genus) Rehmannia,
● Đặc điểm thực vật học:
Thân: thân thảo, cao khoảng 20 – 40cm, chỉ đến khi ra hoa thì mới mọc
thành ngồng hoa cao 40 - 50 cm, vỏ màu xanh nâu.
Toàn thân có lông tiết dài, mịn màu tro trắng (Chu thị Thơm và cs, 2006)
Lá: lá đơn, mọc cách màu xanh vàng, mọc vòng quanh gốc ở đốt thân,
phiến lá màu xanh, hình trứng lộn ngược đến hình bầu dục dài. Ngọn lá hơi tròn,

đuôi lá tù, lá dài 3 – 15cm, rộng 1.5 – 6cm, mép lá có răng cưa không đều nhau.
Mặt phiến lá có nhiều nếp nhăn nổi lên chia lá thành những múi nhỏ, lá dưới gốc
dài hẹp. Toàn thân lá và hoa có lớp lông tơ nhỏ màu tro bao phủ. Cả chu kỳ sống
cây địa hoàng ra được 50-55 lá, từ trồng đến ra hoa cây mọc 18-22 lá. Bình quân
có 0.3 lá ra trong một ngày.
Rễ: rễ củ, sau trồng 8 – 10 ngày rễ bắt đầu đâm ra ở củ hom, thường xuất
hiện ở mắt sát vết bẻ, đối diện với cực sinh ngọn. Sau khi trồng 20 – 25 ngày rễ
xuất hiện nhiều và có thể chia làm 3 loại:
+ Rễ tơ: xuất hiện trên những mắt của củ hom và cả ở trên các rễ củ sau
này; ít có khả năng hình thành củ, có nhiệm vụ chính là hút dinh dưỡng cho cây.

3


Rễ có kích thước ngắn, nhỏ, số lượng nhiều, xuất hiện sau khi trồng 30 ngày và
cả khi cây có củ cần hạn chế loại rễ này.
+ Rễ củ: xuất hiện sau trồng 45 – 50 ngày, là loại rễ tạo củ sau này. Rễ
này thường xuất hiện ở mắt sát vết bẻ hoặc ở ngay vết bẻ (chỗ sùi callus), vết bẻ
đối diện với với mầm chồi tạo thân, cũng có thể xuất hiện ở trên thân cây (phần
sát mặt đất).
+ Rễ nửa chừng (rễ đực): không có khả năng hình thành củ do những
nguyên nhân nội tại hoặc điều kiện ngoại cảnh không thích hợp như hạn hán, ẩm
độ cao, thiếu dinh dưỡng… rễ to và dài hơn rễ tơ (15 – 20cm), số lượng ít 6 – 10
rễ, rễ này tồn tại không có lợi vì nó làm tiêu hao chất dinh dưỡng.
Rễ củ hình thành nhiều hay ít, sớm hay muộn phụ thuộc vào sự phân hóa
bên trong của rễ và chịu ảnh hưởng rất lớn của điều kiện ngoại cảnh. Củ có
cuống dài 4 – 7cm, vỏ màu hồng nhạt, vàng nhạt… trên củ có nhiều mầm, rễ tơ
nên rất dễ nhân bằng phương pháp vô tính. Củ dài 15 – 20cm, đường kính thân
củ 1 – 4cm, ruột có màu trắng xung quanh có viền vàng. Thời gian ngủ nghỉ của
mầm chồi trên củ ngắn từ 5 – 7 ngày do đó thu hoạch xong phải đem trồng ngay

là tốt nhất.
Hoa, quả và hạt: Hoa tự mọc thành chùm trên ngọn thân cây, đài hình
chuông, bên trên nứt thành 5 cánh, tràng hình ống hơi uốn cong dài 3 – 4cm, đầu
khía 5 cánh, mặt ngoài đỏ tím mặt trong mầu vàng có vân tím. Nhị cái 1, nhị đực
2. Mỗi trục hoa có 70-90 hoa, hoa màu phớt hồng. Hoa thức: K(5)C(5)A4G(2)
Quả bế đôi, hình tròn trứng, cánh đai bao úp. Quả nhiều hạt 200- 300 hạt, hạt
nhỏ, trọng lượng 1000 hạt = 0,15g hạt màu nâu nhạt.(Vũ Văn Vụ, 1997)
1.1.2. Yêu cầu về điều kiện sinh thái
● Nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp từ 18- 250C nếu t < 100C cây ngừng sinh
trưởng lá biến dạng biểu hiện ra bên ngoài từ màu lá xanh chuyển sang màu lá
tím thẫm, nếu nhiệt độ thấp và kéo dài 10 ngày thì lá không thể khôi phục được
chức năng quang hợp và dần dần sẽ chết. Nếu t > 300C làm cho cây sớm phát
triển gây mất cân đối, cây sớm ra hoa, số lá ít, sự tích luỹ dinh dưỡng về củ
kém.Nhiệt độ cao kéo dài thì lá sẽ bị cháy, bệnh phát triển mạnh. Giai đoạn làm

4


củ yêu cầu về nhiệt độ thấp hơn từ 10- 180C, chênh lệch nhiệt độ ngày đêm tương
đối lớn, tạo điều kiện củ lớn và tích lũy vào củ nhiều, nhanh đạt năng suất cao.
Căn cứ vào nhiệt độ mà người ta chú ý bố trí thời vụ thích hợp. Vùng miền núi
thời vụ trồng thích hợp vào tháng 3 - 4, thời vụ thu hoạch vào tháng 9-10 là tốt
nhất. Vùng trung du, đồng bằng Bắc Bộ có thể trồng được hai vụ; vụ xuân trồng
thán g 2-3, thu hoạch tháng 6 - 7; Vụ này có tiềm năng năng suất cao, nhưng
năng suất không ổn định, hay bị mất mùa do mưa lụt. Vụ thu đông trồng và
tháng 9 và thu hoạch vào tháng 2-3, là vụ có điều kiện trồng trọt thuận lợi hơn vụ
xuân, năng suất không cao nhưng chất lượng củ tốt. Như vậy vụ thu đông sản
xuất để làm thuốc, vụ xuân trồng để nhân giống.( Vũ Tuấn Minh, 2009)
● Ánh sáng: Khả năng sinh trưởng của cây địa hoàng tương đối yếu, chỉ
thích nghi với khí hậu ôn hòa,đủ ánh sáng mới cho chất lượng củ tốt nhất. Nếu

thiếu ánh sáng cây sẽ mọc chậm, yếu ớt, cây sinh trưởng không bình thường. Lá
mỏng không ra hoa hoặc ra hoa không đều. Song ánh sáng quá mạnh thì lá sẽ
nhỏ, phiến lá dày, hoa cũng biến sắc. địa hoàng là loại cây ưa sáng, nếu trồng
trong vườn rợp, cây sẽ chi chit lại, củ bé.
● Nước: Ẩm độ và lượng mưa lượng mưa trung bình 700- 800 mm/năm
và tập trung vào giai đoạn khi mới trồng là rất tốt. Mưa cuối vụ thường gây nấm
bệnh, thối củ dẫn đến thất thu (vụ hè ở miền Bắc). Tưới và tiêu nước đảm bảo độ
ẩm đất 70 – 80% trong tháng đầu, tưới ngay sau khi bón phân nếu đất khô và
nhiệt độ cao. Khi cây đã xanh tốt kín luống, việc tưới có thể thưa hơn hoặc có thể
tát nước ngập rãnh luống rồi tháo nước ngay. Làm như vậy sẽ thoả mãn độ ẩm
cho đất.(Chu Thị Thơm, 2006)
● Đất: Đất trồng địa hoàng: ưa đất cát pha, thịt nhẹ, đất phù sa, đất lạ mới
khai phá, đất có độ phì cao, tầng canh tác sâu, đất tơi xốp có điều kiện tưới và
thoát nước thuận lợi. Đất tới xốp có độ dốc 5- 10 độ có thể trồng được. pH = 5,57 hoặc hơi kiềm là thích hợp
● Dinh dưỡng: Địa hoàng ưa phân chuồng, phân bắc, phân dê ủ mục, ưa
khô jdầu. Phân lân, kali làm cho cây khỏe, cứng phát triển thân lá nhanh, nhiều
củ. Bón cân đối NPK. Lượng phân bón cho 1 ha: Phân chuồng: 20 – 30 tấn Phân

5


ure: 100 – 150 kg Phân lân (supe lân): 200 – 300 kg Phân Kali: 400 – 600 kg Tỷ
lệ N:P:K = 1:1:2
1.1.3. Giá trị sử dụng, kinh tế của cây địa hoàng
Địa hoàng là một cây thuốc quý được mệnh danh là thần dược. Bộ phận
dùng làm là củ dưới 2 dạng chính là sinh địa và thục địa. Ở nước ta, 3/4 đơn
thuốc, bài thuốc đông dược cần sinh địa và thục địa. Một số bài thuốc chính đã
đưa vào sản xuất công nghiệp như: sâm nhung đại bổ hoàn, ninh khôn, hà sa đại
tạo hoàn, thập toàn đại bổ, lục vị hoàn, bát vị hoàn, bổ huyết hoàn, bổ tâm đan…
+ Sinh địa (củ địa hoàng sấy khô): theo tài liệu cổ, sinh địa có vị

đắng, tính hàn. Năng lực của sinh địa là bổ chân âm, lương nhiệt huyết là vị
thuốc bổ dương cường tráng. Theo y học cổ truyền, sinh địa vào 4 kinh Tâm,
Can, Thận và Tiểu trường, có tác dụng thanh nhiệt, mát máu, ức chế huyết
đường, lợi tiểu, mạnh tim nên thường được dùng trong các bệnh thiếu máu, suy
nhược, tiểu đường, rong kinh, chữa thương hàn, yết hầu sưng tấy, thổ huyết, băng
huyết, kinh nguyệt không đều, động thai. Theo Dược điển, ngày dùng 9-15g dưới
dạng thuốc sắc hoặc phối hợp với các vị thuốc khác do lương y kê đơn.
+ Thục địa (sinh địa đã được chế biến) Thục địa vị ngọt, tính ấm, vào 3
kinh: Tâm, Can, Thận có tác dụng tư âm, dưỡng huyết, bổ thận, sáng mắt, thính
tai, đen râu tóc (tư dưỡng), làm cường tráng cơ thể, người lao tâm khổ tứ lo nghĩ,
hoại huyết nên dùng. Ngoài ra, còn dùng thục địa làm thức ăn mùa hè có tác
dụng bồi dưỡng cơ thể và giải nhiệt. Liều dùng 8-16g một ngày, có thể dùng tới
40g dưới dạng thuốc sắc hoặc phối hợp với các loại thuốc khác.
Yêu cầu sử dụng trong nước hàng năm khoảng 1000 tấn, ngoài ra còn có
thể xuất khẩu sang thị trường Nhật, Hồng Kông. Giá trị 1 ha sinh địa ngang 3 – 5
tấn lúa. Để thỏa mãn nhu cầu trong nước và xuất khẩu, hàng năm phải sản xuất
khoảng 1000 – 2000 tấn sinh địa. Trên thực tế không đáp ứng được nhu cầu trong
nước và xuất khẩu nên phải nhập từ Trung Quốc
Trung Quốc là nước xuất khẩu chủ yếu nên địa hoàng đạt giá trị rất cao và
ổn định. (Vũ Tuấn Minh, 2009). Hiện nay với giá 7000 USD một tấn địa hoàng
khô. Cách đây hàng ngàn năm người Trung Quốc đã trồng trọt và sử dụng địa

6


hoàng, do tác dụng dược lý tốt nên đến nay được sử dụng chữa bệnh ở nhiều dân
tộc trên thế giới.
1.1.4. Tình hình sản xuất địa hoàng trong nước
Để thỏa mãn nhu cầu trong nước và xuất khẩu, hàng năm phải sản xuất
khoảng 1000-2000 tấn địa hoàng.Trên thực tế không đáp ứng được lượng như

vậy nên chúng ta phải nhập khẩu nguyên liệu từ Trung Quốc. Năm 1958 chúng ta
tiến hành nhập các giống địa hoàng từ Trung Quốc là các giống: trạng nguyên hồng,
đại thanh anh, tiểu thanh anh trồng ở các vùng như Hải Hưng, Hưng Yên, Bắc Ninh,
Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Phú Thọ và đã có những mô hình đạt năng suất cao.
Để có hiệu quả kinh tế cao, thì sản sản xuất địa hoàng ở nước ta nên đi
theo chiều hướng thâm canh, chọn thời vụ tối ưu, đảm bảo năng suất ổn định ở
mức từ 7 - 8 tấn/ha thì mới có thể cạnh tranh được với các sản phẩm cây này của
Trung Quốc. Tại Bắc Giang từ tháng 7-2011 đến tháng 6-2012, Công ty cổ phần
Dược phẩm Bắc Giang chủ trì thực hiện đề tài khoa học công nghệ cấp tỉnh
"Nghiên cứu trồng trọt, thu hoạch, chế biến địa hoàng theo hướng thực hành tốt,
trồng trọt, thu hái cây thuốc (GACP) và quy trình chế biến thành phẩm thục địa”.
Kết thúc thời hạn, công ty đã hoàn thành các mục tiêu đề ra như: điều tra, khảo
sát một số vùng trồng địa hoàng tại Bắc Giang, xây dựng 2 mô hình canh tác theo
hướng GACP-WHO (đạt tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới). Trong đó có 2 ha
địa hoàng giống tại xã Minh Đức (Việt Yên) năng suất khoảng 8,5 tấn/ha và 1 ha
địa hoàng nguyên liệu tại xã Dĩnh Trì (TP Bắc Giang) đạt 16,8 tấn/ha. Công ty đã
nghiên cứu, thiết lập quy trình chế biến xanh địa hoàng từ địa hoàng tươi bằng
thiết bị sấy công nghiệp; quy trình chế biến thục địa từ can địa hoàng trên nồi
hơi… Tháng 10 - 2012, Sở Khoa học và Công nghệ tổ chức nghiệm thu, đánh giá
cao hiệu quả của đề tài. Kết quả nghiên cứu được chuyển giao cho Công ty
TNHH MTV Dược Bắc Giang (đơn vị trực thuộc Công ty cổ phần Dược phẩm
Bắc Giang) ứng dụng và triển khai. Từ tháng 7 năm nay, doanh nghiệp đã đầu tư
máy móc, thiết bị chế biến địa hoàng. Hiện các sản phẩm thục địa, can địa hoàng
đã được bán ra thị trường.Nhờ ứng dụng thành công kỹ thuật mới, ngày 16-102013, Công ty TNHH MTV Dược Bắc Giang được Sở Khoa học và Công nghệ

7


trao giấy chứng nhận Doanh nghiệp Khoa học Công nghệ. Mô hình trồng, chế
biến địa hoàng theo tiêu chuẩn GACP-WHO đã mở ra triển vọng nhân rộng diện

tích cây trồng này trên địa bàn tỉnh, tạo nguồn dược liệu phục vụ sản xuất thuốc
trong nước và xuất khẩu.
1.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro
1.2.1 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật.
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học thuyết
về tính toàn năng của tế bào. Theo Gottlide Haberlandt (1902) ,mỗi tế bào của
bất kì cơ thể nào đều mang toàn bộ hệ thống di truyền cần thiết và đầy đủ thông
tin của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp,mỗi tế bào đều có thể phát triển
thành cơ thể hoàn chỉnh.Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ
thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loại cây trồng đã được
nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân
tạo vô trùng và tái sinh thành cây hoàn chỉnh với số lượng vô cùng lớn
(Murashige,1980)
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là
kết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa. Tất cả các tế bào trong các
cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi
sinh. Sau đó từ các tế bào phôi sinh này tiếp tục được biến đổi thành các tế bào
chuyên hóa đặc hiệu cho các mô,cơ quan có chức năng khác nhau gọi là sự phân
hóa tế bào.Ví dụ: mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp,mô bì làm nhiệm vụ bảo
vệ,mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dinh dưỡng.
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần
thiết,ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng phôi sinh và phát triển mạnh
mẽ. Đó là quá trình phản phân hóa. Ví dụ: khi nuôi cấy mô thuốc lá,các tế bào
phân hóa của lá gặp điều kiện thích hợp sẽ phản phân hóa và liên tục phân chia
liên tục tạo thành mô sẹo. Các mô sẹo không còn là các tế bào có chức năng như
tế bào lá nữa, khi cấy chuyển trên môi trường thuận lợi thì chúng sẽ tạo thành cây
hoàn chỉnh.

8

Về bản chất,đó là các quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Trong quá trình
phát triển của cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định
được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị ngừng hoạt động.
Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử
ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật
luôn được hài hòa. Mặt khác, khi nằm trong một khối mô bình thường, tế bào
luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác
dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa
và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một chương trình đã được thiết lập.
1.2.2 Các bước cơ bản của quá trình nhân giống in vitro
Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn:
Lấy mẫu và xử lý mẫu
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định vi nhân giống. Khả năng nhiễm
bệnh của mẫu phụ thuộc vào các lấy mẫu, xử lý mẫu trong điều kiện khử trùng.
Mỗi cây đều có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu.
Với cây nhiệt đới thì nhiệt độ 25oC, độ ẩm 75% là điều kiện giữ mẫu thích hợp,
tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Debergh và Zimmerman, 1991). Cây mẹ phải là cây sạch
bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh.Việc trồng các cây
mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu
bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng
sống, sinh trưởng của mẫu nuôi cấy.
Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ qua từ mẫu nuôi cấy, thường
là chồi ngọn, chồi nách hay lát cắt đốt thân, mảnh lá tùy thuộc vào đối tượng và
mục đích nghiên cứu. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp
để tạo thể nhân giống in vitro. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đăc
điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng.Đối với những loài không có khả
năng nhân giống, người ta thường dùng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo. Trong

môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác
(Nguyễn Đức Thành, 2000).

9


Nhân nhanh chồi
Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp
nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống.
Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy giống môi trường tạo
thể chồi và được bổ sung thểm hoocmon điều tiết sinh trưởng, đôi khi nồng độ
chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Tăng
thời gian chiếu sáng lên 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng thối thiểu là 1000lux,
nhiệt độ thích hợp 20-30oC. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng
sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giông in vitro ở trạng thái trẻ hóa và dược duy trì
trong thời gian dài.
Tạo cây hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi phải cấy chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang
môi trường tạo rễ. Môi trường ra rễ thường bổ sung 1 lượng nhỏ auxin. Tuy
nhiên có một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân
nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Đối
với cac phôi vô tính thường chỉ gieo trên môi trường không có chất điều tiết sinh
trưởng hoặc môi trường có nồng độ cytokinin thấp để phôi phát triển thành cây
hoàn chỉnh (Nguyễn Như Khanh, 2002).
Chuyển cây in vitro ra vườn ươm
Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt
trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp... Sau khoảng
2 tuần, cây đã thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ
chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân
giống in vitro vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống in vitro

và ex vitro. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định dinh dưỡng ,ánh
sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn
khác hẳn về các yếu tố trên dẫn đến cây con dễ bị stress, dễ mất nước và mau héo
dẫn đến hiện tượng chết. Để tránh hiện tượng này.vườn ươm phải mát mẻ, cường
độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao. Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ
chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ ẩm. Trong những ngày đầu tiên cần phủ nylon để

10


giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường từ 7-10 ngày). Rễ được tạo ra trong quá trình
nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và mọc ra rễ mới. Thông thường người ta thường
dùng chất kích thích ra rễ phun lên lá hoặc ngâm rễ vào dung dịch với nồng độ
thấp nhằm rút ngắn thời gian ra rễ. Giá thể ra cây cũng phải được xử lý trước vài
ngày để loại bỏ các yếu tố như nấm bệnh gây hại cho cây con bằng cách sử dụng
chế phẩm sinh học.
1.2.3 Ảnh hưởng của một số nhân tố đến nhân giống in vitro
1.2.3.1 Khử trùng mẫu cấy
Với nguồn mẫu là cây địa hoàng trồng ngoài điều kiện tự nhiên, chúng
tôi chọn HgCl2 0,1% hợp Sodium dichloroisocyanuric axit (NaDCC 25%)
(Troclosene sodium NaDCC) là chất khử trùng, các chất này có khả năng
thấm sâu vào bên trong mẫu cấy.
Cây địa hoàng sau khi cắt tỉa bỏ hết lá được rửa dưới vòi nước chảy.
Sau đó được rửa sạch bằng nước xà phòng, lắc đều 2 - 3 lần trong 10 phút và
rửa sạch dưới vòi nước. Trong buồng cấy vô trùng, tráng lại mẫu bằng nước
cất vô trùng sau đó khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút,
tráng lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần. Tiếp theo khử trùng mẫu trong 0,5%
Troclosene sodium (NaDCC) ở các ngưỡng thời gian 5, 10 và 15 phút. Rửa sạch
lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó cấy vào môi trường cơ bản là MS +
30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar. Kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy.

1.2.3.2 Chất điều tiết sinh trưởng thực vật
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung
một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là
rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung
cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất
này thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh
trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia
thành các nhóm chính sau đây:

11


● Nhóm các auxin
Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: 1H- indole -3acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic`acid(NAA),1H-indole-3-butyricacid (IBA),
2,4-dichlorophenoxyaceticacid(2,4-D)`và naphthoxyacetic acid (NOA).
Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone
thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng),
tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn. Nói
chung, các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng. (Vũ
Minh Tuấn, 2009).
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành
phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo,
huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối
hợp sử dụng với các cytokinin. Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào..
Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc
nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, tính hướng, tính ưu
thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn. Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin
được khái quát dưới đây:
o Kích thích phân chia và kéo dài tế bào

o Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. Ưu
thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách. Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn
đến sự phát chồi nách. Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh bằng một lớp chất keo
có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng. Cơ chế ức chế của chồi
đỉnh liên quan đến một chất điều hoà sinh trưởng khác là ethylene. Auxin (IAA)
kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh.
o IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn
o Tạo và nhân nhanh mô sẹo.
o Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp)
o 1H- indole-3-acetic acid (IAA),
o Tạo phôi soma (2,4-D). (Hoàng Tấn Minh, 2006).

12


● Nhóm các cytokinin
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan
chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong
nuôi cấy mô. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6benzylaminopurine

(BAP)

hoặc

6-benzyladenin

(BA),

6-γ-γ-dimethyl-

aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-(43-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin
tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Nói chung, chúng được
hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối
với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi
để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược
lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách. Vấn đề quan trọng không kém là
nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này. Chẳng hạn 2,4-D cùng
với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis nhưng nếu
dùng ở nồng độ 0, 1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường
hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1. Cơ chế hoạt động của cytokinin là chưa được
biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt
tính cytokinin trong RNA vận chuyển. Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp
RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định. Chức năng chủ
yếu của các cytokinin được khái quát như sau:
o Kích thích phân chia tế bào
o Tạo và nhân callus
o Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô
o Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh
o Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào
o Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài
o Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)
o Ức chế sự hình thành rễ
o Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục .
o Ức chế sự kéo dài chồi (Hoàng Tấn Minh, 2006).

13


Ảnh hưởng một số yếu tố khác
Agar (thạch): là thành phần quyết định trạng thái vật lý của môi trường

nuôi cấy. Độ cứng của agar phụ thuộc vào nồng độ agar sử dụng và PH môi
trường nuôi cấy. Nồng độ agar thường sử dụng là 5-10 %, nồng độ này cho phép
ổn định trong môi trường nuôi cấy
PH của môi trường:
PH của môi trường là yếu tố rất quan trọng. sự ổn định Ph của môi trường
là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. Giá trị của PH trong môi trường thích
hợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thức vật biến đổi từ 5,5-6,0.
Theo Nguyễn Như Khanh (1990) và khi PH thấp (môi trường axit) sẽ hoạt hóa
các enzyme hydrolaza dẫn đến kìm hãm sự sinh trưởng, đồng thời kích thích sự
lão hóa tế bào trong mô cấy. Ngoài ra, sự bền vững và hấp thu một loạt các chất
phụ thuộc vào PH môi trường : gibberelin và các vitamin rất mẫn cảm với PH.
Sự hấp thu sắt cũng phụ thuộc vào PH môi trường.
Độ PH ảnh hưởng tới khả năng hòa tan của ion, độ đông tụ của agar, khả
năng hấp thụ dinh dưỡng của mẫu cấy, sự tăng trưởng của tế bào. Để điều chỉnh
PH, ta sử dụng HCL, NaOH, KOH
1.2.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Sự hình thành củ là một quá trình sinh lý phức tạp, liên quan mật thiết đến
trạng thái ngủ nghỉ của mô nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1997; Okubo, 2000). Do đó, để
tạo củ thì vấn đề quan trọng nhất là xác định được các yếu tố cảm ứng cho quá
trình ngủ nghỉ xảy ra.
Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không
quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần
cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế
bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng làSacarose,
d-glucose, d-fructose (Dood và Roberts, 1987). Sacarose là nguồn carbon được
sử dụng rộng rãi nhất cho các loại cây.
Ngoài việc cảm ứng ngủ nghỉ bằng các chất điều hòa sinh trưởng, đường
cũng có vai trò quan trọng trong quá trình tạo củ in itro. Nó ảnh hưởng đến tính

14

thẩm thấu của môi trường tức là tác động vào áp lực nước đối với mô tế bào đang
biệt hóa và kích thích chúng phát triển (Kumar et. al., 2005). Nồng độ đường dao
động từ 2 - 6%, tùy thuộc loài và loại mô nuôi cấy (Pelkonen, 2005).
Tuy nhiên theo nhiều báo cáo, nồng độ đường thích hợp cho phản ứng tạo
củ có thể cao hơn, khoảng 9 - 12%. Đặc biệt, sacarose có vai trò như một loại
đường vận chuyển quan trọng nhất ở các cây có củ như: Lilium, Narcissus...; và
hàm lượng đường cao có ảnh hưởng tích cự đến sự hình thành củ và sự sinh
trưởng phát triển của củ (Mei-Lant, 2003; Staikidou et. al., 2005). Hàm lượng
đường 90g/l tỏ ra thích hợp nhất trong giai đoạn tạo củ và tăng trọng lượng củ,
chủ yếu do làm tăng tích lũy chất khô (Nhut et. al., 2001b). Nghiên cứu của
Staikidou và cộng sự (2005) ở Narcissus cũng cho thấy vai trò quan trọng của
đường saccarose trong phản ứng tạo củ, việc bổ sung các loại đường rượu:
manitol, sorbitol hay các monosaccharide, glucose, fructose vào môi trường nuôi
cấy có 30 g/l saccarose đều không có hiệu quả tốt bằng việc sử dụng lượng
đường saccarose 90 g/l.
Nguyễn Thị Lý Anh và cs (2005) đã nghiên cứu ảnh hưởng của hàm
lượng đường và chế độ chiếu sáng đến sự hình thành củ in vitro ở cây Lily trên 2
giống: đỏ (Oriental) và vàng (Asiatic) với việc sử dụng hàm lượng đường
saccaroza ở các nồng độ khác nhau 3%, 6%, 9% và 12%. Kết quả cho thấy ở hàm
lượng đường càng cao thì quá trình tích lũy vào củ càng mạnh mẽ. Tại nồng độ
đường 12% thì khối lượng trung bình củ đạt 1,25 g/củ với hệ số nhân củ đạt 3,0
lần (đối với giống Oriental) và 1,2 g/củ với hệ số nhân củ đạt 2,7 lần (đối với
giống Asiatic). Trịnh Khắc Quang và cs (2011) đã thành công trong việc nghiên
cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng và hàm lượng đường tới khả
năng tạo củ từ vảy củ hoa Lily, kết quả sau 8 tuần nuôi cấy tại môi trường MS +
90 g/l saccarose + 0,5 mg/l αNAA cho tỷ lệ mẫu tạo củ đạt 100%; hệ số tạo củ
3,43 lần và khối lượng củ trung bình là 0,15 g.
1.2.3.4.Tác dụng của một số hợp chất hữu cơ (nước dừa, pepton)

Nước dừa: dịch chiết bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường
sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy. Miller và Skook (1961) đã cho rằng

15