Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất kháng nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn Bacillus amyloliqueciens CP16.04

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN PHƢƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƢƠNG PHÁP
TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ
VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN PHƢƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƢƠNG PHÁP
TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ
VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. TRỊNH THÀNH TRUNG
TS. TRẦN THỊ THANH HUYỀN

Hà Nội – 2016


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luận văn cao học này, tôi xin chân thành cảm ơn TS.
Trịnh Thành Trung và TS. Trần Thị Thanh Huyền đã động viên, hướng dẫn và tạo
mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trính học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị đang làm việc tại Viện Vi
sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong
quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học
nói riêng và Khoa Sinh học nói chung đã dạy dỗ tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên,
giúp đỡ, hỗ trợ để tôi có thể hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, tháng 05 năm 2016
Học viên

Nguyễn Phương Liên


MỤC LỤC

MỤC LỤC .................................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH .........................................................................................v

CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................ vi
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Chƣơng 1 - TỔNG QUAN .................................................................................3
1.1.

Vi khuẩn Bacillus ..........................................................................................3

1.1.1.

Giới thiệu chung về chi vi khuẩn Bacillus ..............................................3

1.1.2.

Hệ thống phân loại chi vi khuẩn Bacillus ...............................................4

1.1.3.

Hệ thống phân loại Bacillus hiện đại ......................................................5

1.1.4.

Phương pháp phân lập và phân loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus ...........7

1.2.

Chất kháng sinh từ vi khuẩn Bacillus ..........................................................12

1.2.1.

Lipopeptide mạch vòng mang điện tích dương ....................................13

1.2.2.

Lipopeptide mạch vòng không mang điện tích dương .........................15

1.2.3.

Lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương ...................................17

1.3.

Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus .................................................................18

1.4.

Mục đích nghiên cứu ...................................................................................19

2. Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........20
2.1.

Nguyên liệu nghiên cứu ...............................................................................20

2.1.1.

Chủng vi sinh vật ..................................................................................20

2.1.2.

Môi trường nghiên cứu .........................................................................20

i


2.2.

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22

2.2.1.

Xác định khả năng sinh chất kháng nấm và chất kháng khuẩn ............22

2.2.2.

Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào ..........................................22

2.2.3.

Xác định khả năng phân giải phosphate khó tan ..................................23

2.2.4.

Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA ....................23

2.2.5.

Dấu vân tay rep-PCR và phân tích tính tương đồng kiểu gen ..............23

2.2.6.

Phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại ..........24

2.2.7.

Tách chiết chất kháng nấm và kháng khuẩn .........................................24

2.2.8.

Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn ..........................................25

2.2.9.

Xác định đặc tính sinh hóa lý của chất kháng nấm và kháng khuẩn ....26

2.2.10. Thử nghiệm tính an toàn của chất kháng nấm và kháng khuẩn ...........27
3. Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................28
3.1.

Lựa chọn chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum và đánh giá các đặc

tính sinh học của chủng nghiên cứu ......................................................................28
3.1.1.

B. amyloliquefaciens subsp. plantarum phân lập tại các vùng sinh thái

khác nhau của Việt Nam ....................................................................................28
3.1.2.

Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn .........................................................28

3.1.3.

Enzyme ngoại bào .................................................................................32

3.1.4.

Khả năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh

trưởng IAA .........................................................................................................33
3.2.

Phân tích đa dạng kiểu gen của các chủng B. amyloliquefaciens subsp.

plantarum ...............................................................................................................34
3.2.1.

Phân tích dấu vân tay rep-PCR .............................................................34

3.2.2.

Phân tích trình tự đa gen .......................................................................36

ii


3.3.

Tách chiết, tinh sạch và xác định bản chất sinh học của chất kháng nấm và

chất kháng khuẩn từ chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CP 1604 ......39
3.3.1.

So sánh hiệu quả tách chiết chất kháng nấm và chất kháng khuẩn ......39

3.3.2.

Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn ..........................................40

3.3.3.

Xác định các tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn ...............41

3.4.

Thử nghiệm tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn...........46

3.4.1.

Thử nghiệm nẩy mầm hạt .....................................................................47

3.4.2.

Thử nghiệm khả năng sinh trưởng của cây...........................................47

KẾT LUẬN ..............................................................................................................49
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................50
PHỤ LỤC .................................................................................................................57

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1.

Thông tin cơ bản của 15 chủng B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum.

Bảng 3.2.

Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn

Bảng 3.3.

Khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào

Bảng 3.4.

Khả năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh
trưởng IAA

Bảng 3.5.

Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn của dịch chiết thô

Bảng 3.6.

Khả năng bền nhiệt của chất kháng nấm và kháng khuẩn

Bảng 3.7.

Khả năng bền pH của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn

Bảng 3.8.

Khả năng bền với các enzyme thủy phân

Bảng 3.9.

Khả năng nẩy mầm của hạt khi xử lý với chất kháng sinh

Bảng 3.10.

Khả năng sinh trưởng của cây non khi xử lý với chất kháng sinh

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.

Mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại của các loài Bacillus nhóm
lớn.

Hình 1.2.

Kết quả phân loại vi khuẩn Bacillus trên phần mềm ApiwebTM.

Hình 1.3.

Cấu trúc chuỗi peptide của chất kháng sinh polymyxin.

Hình 1.4.

Cấu trúc chất kháng sinh iturin.

Hình 1.5.

Cấu trúc nhóm kháng sinh fengysin.

Hình 1.6.

Cấu trúc lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương ceraxin.

Hình 3.1.

Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu
vân tay rep - PCR sử dụng mồi ERIC

Hình 3.2.

Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu
vân tay rep - PCR sử dụng mồi GTG5.

Hình 3.3.

Mối quan hệ giữa chủng SP 1901 và CP 1604 trên cây phát sinh chủng
loại và các loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis.

Hình 3.4.

Sắc ký đồ HPLC của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn tinh sạch
từ dịch nuôi cấy chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CP
1604.

Hình 3.5.

Khối phổ phân đoạn chất có hoạt tính kháng nấm và phân đoạn chất
có hoạt tính kháng khuẩn.

Hình 3.6.

Hoạt tính của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn khi xử lý nhiệt ở
các nhiệt độ khác nhau.

v


CÁC CHỮ VIẾT TẮT

API:

Thanh định danh API (Anatical Profile Index)

D:

Đường kính ( Diameter)

Da:

Daton

Dab:

2,4 - diaminobutyric acid

GTTB:

Giá trị trung bình

HPLC:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IAA:

Hóc môn thực vật IAA (Indole-3-Acetic Acid)

KBT:

Khoảng biến thiên

MIC:

Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration)

MS:

Khối phổ (Mass Spectrometry)

NA:

Thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar)

NRPSs:

Enzyme sinh tổng hợp peptide không phụ thuộc ribosome
(NonRibosomal Peptide Synthetases)

PCR:

Phản ứng khuếch đại ADN

PDA:

Thạch khoai tây (Potato Dextrose Agar)

vi


MỞ ĐẦU

Chi Bacillus là một nhóm các loài vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình que,
phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái. Bacillus có khả năng sinh nội bào tử, một
dạng nghỉ của tế bào để giúp vi khuẩn có thể chống chịu và tồn tại trước các điều
kiện bất lợi của môi trường như khô hạn và thiếu dinh dưỡng. Theo hệ thống phân
loại hiện nay, chi Bacillus có khoảng gần 300 loài và các loài phụ dưới loài. Trong
số đó, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum (hay còn gọi là B. velezensis, B.
methylotrophicus và B. oryzicola) là một trong tám loài vi khuẩn thuộc nhóm B.

subtilis. Đây là những loài vi khuẩn an toàn, sở hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho
cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây,
sản sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có
khả năng tăng cường tính miễn dịch của cây chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi
sinh vật gây bệnh. Do sở hữu các đặc tính quý, vi khuẩn B. amyloliquefaciens
subsp. plantarum được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ từ
giải mã hệ genome đến nghiên cứu các chất trao đổi, nghiên cứu phân loại, nghiên
cứu ứng dụng trong nhà kính và ngoài thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có lợi
và ứng dụng trong đấu tranh sinh học để phòng ngừa các loại dịch bệnh hại cây
trồng. Một số chủng như B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 cũng đã
được sản xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học và chế phẩm phòng
trừ bệnh cây. Nhiều báo cáo đã công bố hiệu quả sử dụng các chủng B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum trong phòng trừ và làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh
cũng như mức độ nhiễm bệnh của cây do vi khuẩn và nấm gây bệnh cây gây ra. Sản
lượng nông sản thu hoạch cũng tăng lên đáng kể khi bổ sung chủng B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 vào phân bón.
B. amyloliquefaciens subsp. plantarum sản sinh ra nhiều loại chất trao đổi
bậc hai có hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây. Các chất trao đổi
đó bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore và protein kháng khuẩn.
Đa số các chất này được tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally synthesized

1


peptide) nhờ sự có mặt của nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases
(NRPS). Nhiều chất trong số này đã được nghiên cứu tỉ mỉ về cấu trúc hóa học, đặc
tính sinh học cũng như tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và y - dược học.
Nhằm tìm kiếm, đánh giá và lựa chọn các chủng vi khuẩn có tiềm năng ứng
dụng trong sản xuất nông nghiệp xanh và bền vững, trong luận văn này, chúng tôi

trọng tâm nghiên cứu các đặc tính có lợi cho cây trồng từ các chủng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum có trong bộ sưu tầm vi khuẩn Bacillus thu thập
tại các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam. Bên cạnh việc tìm hiểu các điều kiện
nuôi cấy thích hợp, chúng tôi còn tiến hành tách chiết, tinh sạch và xác định đặc
tính sinh học cũng như tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn sinh ra
từ chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CP 1604.

2


1.

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN

1.1. Vi khuẩn Bacillus
1.1.1. Giới thiệu chung về chi vi khuẩn Bacillus
Định nghĩa khái quát
Bacillus là nhóm vi khuẩn khá quen thuộc, hay được nhắc đến trong các tài
liệu vi sinh vật học. Trước kia, Bacillus được biết đến như những vi khuẩn hình
que, bắt màu thuốc nhuộm Gram (+), sinh nội bào tử, sống hiếu khí hoặc kỵ khí
không bắt buộc. Tuy nhiên, khái niệm đó giờ đây bao quát cho cả Bacillus nhóm
lớn (Bacillus sensu lato) gồm ít nhất 37 chi thuộc 3 họ Bacillaceae, Paenibacillaceae
và Alicyclobacillaceae. Chi Bacillus chỉ là một chi trong Bacillus nhóm lớn và
thường được gọi là Bacillus nhóm nhỏ (Bacillus sensu stricto).
Môi trường phân bố
Vi khuẩn Bacillus phân bố ở mọi nơi trong sinh quyển. Chúng ta có thể bắt
gặp các loài vi khuẩn này trong bất kỳ công bố nào về đa dạng vi sinh vật ở các khu
hệ sinh thái, từ trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn, từ vùng ven bờ
đến đáy các Đại Dương [14, 48]. Trong các hệ sinh thái trên cạn, vi khuẩn Bacillus
có thể phân bố ở các vùng đất chua, đất kiềm hay đất trung tính. Một số loài có thể

tìm thấy trong các loại đất nhiễm kim loại nặng hay nhiễm asen. Một số loài có khả
năng sống ký sinh và gây bệnh cho người, động vật và côn trùng như B. cereus, B.
anthracis và B. thuringiensis. Một số loài là vi sinh vật vùng rễ hay sống cộng sinh
trong rễ của một số loại thực vật. Gần đây, một số loài vi khuẩn mới thuộc chi
Bacillus còn được tìm thấy ở độ cao từ 24 đến 41 km trong tầng bình lưu của khí
quyển [44].
Các đặc điểm phân loại đặc trưng của chi Bacillus
Bacillus là vi khuẩn hình que, bắt màu thuốc nhuộm Gram (+), sinh nội bào
tử, có thể di động bằng tiêm mao, đa số sống hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc.

3


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Abriouel, H., C. M. Franz, N. Ben Omar and A. Galvez (2011), "Diversity and
applications of Bacillus bacteriocins", FEMS Microbiol Rev, 35, pp. 201-232.
2. Arguelles-Arias, A., M. Ongena, B. Halimi, Y. Lara, A. Brans, B. Joris and P.
Fickers (2009), "Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent
antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens",
Microb Cell Fact, 8, pp. 63.
3. Ash, C., F. J.A.E., A. Wallbank and S. M. D. Collin (1991), "Phylogenetic
heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of smallsubunit-ribosomal RNA sequences", Letters in Applied Microbiology, 13, pp.
202-206.
4. Borriss, R., X. H. Chen, C. Rueckert, J. Blom, A. Becker, B. Baumgarth, B.
Fan, R. Pukall, P. Schumann, C. Sproer, H. Junge, J. Vater, A. Puhler, and H. P.
Klenk (2011), "Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated
with strains DSM 7T and FZB42T: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens
subsp. amyloliquefaciens subsp. nov. and Bacillus amyloliquefaciens subsp.
plantarum subsp. nov. based on complete genome sequence comparisons", Int J

Syst Evol Microbiol, 61, pp. 1786-1801.
5. Chakraborty, K., B. Thilakan, and V. K. Raola (2014), "Polyketide family of
novel antibacterial 7-O-Methyl-5′-hydroxy-3′-heptenoate-macrolactin from
seaweed-associated Bacillus subtilis MTCC 10403", J Agric Food Chem, 62,
pp. 12194-12208.
6. Chen, X. H., J. Vater, J. Piel, P. Franke, R. Scholz, K. Schneider, A.
Koumoutsi, G. Hitzeroth, N. Grammel, A. W. Strittmatter, G. Gottschalk, R. D.
Sussmuth, and R. Borriss (2006), "Structural and functional chracterization of
three polyketide systhase gene clusters in Bacillus amyloliquefaciens FZB42", J
Bacteriol, 188, pp. 4024-4036.

50


7. Chen, D., X. Liu, C. Li, W. Tian, Q. Shen, and B. Shen (2014), "Isolation of
Bacillus amyloliquefaciens S20 and its application in control of eggplant
bacterial wilt", J Environ Manage, 137, pp. 120-127.
8. Chowdhury, S. P., A. Hartmann, X. Gao, and R. Borriss (2015), "Biocontrol
mechanism by root-associated Bacillus amyloliquefaciens FZB42 - a review",
Front Microbiol, 6, pp. 780.
9. Chun, J., J. H. Lee, Y. Jung, M. Kim, S. Kim, B. K. Kim and Y. W. Lim (2007),
"EzTaxon: a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S
ribosomal RNA gene sequences", Int J Syst Evol Microbiol, 57(Pt 10), pp.
2259-2261.
10. Chung, E. J., M. T. Hossain, A. Khan, K. H. Kim, C. O. Jeon, and Y. R. Chung
(2015), "Bacillus oryzicola sp. nov., an Endophytic Bacterium Isolated from the
Roots of Rice with Antimicrobial, Plant Growth Promoting, and Systemic
Resistance Inducing Activities in Rice", Plant Pathol J, 31, pp. 152-164.
11. Cochrance, S. A. and J. C. Vederas (2014), "Lipopeptides from Bacillus and
Paenibacillus spp.: A golden mine of antibiotic cadidates", Med Res Rev, 36,

pp. 4-31.
12. Copping L. G. and J. J. Mann (2000), "Biopesticides: a review of their action,
applications and efficacy", Pest Mag Sci, 56, pp. 651-676.
13. Dunlap, C. A., S. J. Kim, S. W. Kwon, and A. P. Rooney (2015), "Bacillus
velezensis is not a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens;
Bacillus methylotrophicus, Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum and
'Bacillus oryzicola' are later heterotypic synonyms of Bacillus velezensis based
on phylogenomics", Int J Syst Evol Microbiol.
14. Dworkin, M., S. Falkow, E. Rosenberg, K. H. Schleifer and E. Stackebrandt
(2006), "The Prokaryotes".
15. Freitas D. B., M. P. Reis, C. I. Lima-Bittencourt, P. S. Costa, P. S. Assis, E.
Chartone-Souza, and A. M. Nascimento (2008), "Genotypic and phenotypic

51


diversity of Bacillus spp. isolated from steel plant waste", BMC Research
Notes, 1, pp. 92-103.
16. Gabor E. M., Vreis E. J., and D. B. Janssen (2003), "Efficient recovery of
environmental DNA for expression cloning by indirect extraction methods",
FEMS Microbiol Ecol, 44, pp. 153-163.
17. Glickmann E. and Y. Dessaux (1995), "A critical examination of the specificity
of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic
bacteria", Appl Environ Microbiol, 61, pp. 793-796.
18. Goldman, E. and L. H. Green (2009), "Practical handbook of microbiology".
19. Gong, M., J. Wang, J. Zhang, H. Yang, X. Lu, Y. Pei, and J. Cheng (2006),
"Study of the antifungal ability of Bacillus subtilis strain PY-1 in vitro and
identification of its antifungal substance (iturin A)", Acta Bioch Bioph Sin, 38,
pp. 233-240.
20. Gong, A. D., H. P. Li, Q. S. Yuan, X. S. Song, W. Yao, W. J. He, J. B. Zhang,

and Y. C. Liao (2015), "Antagonistic mechanism of iturin A and plipastatin A
from Bacillus amyloliquefaciens S76-3 from wheat spikes against Fusarium
graminearum", PLoS One, 10, pp. 0116871.
21. Gustafson, K., M. Roman, and W. Fenical (1989), "The macrolactins, a novel
class of antiviral and cytotoxic macrolides from a deep-sea marine bacterium",
J Am Chem Soc, 111, pp. 7519-7524.
22. Han, Y., B. Zhang, Q. Shen, C. You, Y. Yu, P. Li, and Q. Shang (2015),
"Purification and Identification of Two Antifungal Cyclic Peptides Produced by
Bacillus amyloliquefaciens L-H15", Appl Biochem Biotechnol, 176, pp. 22022212.
23. He, Z., D. Kisla, L. Zhang, C. Yuan, K. B. Green-Church, and A. E. Yousef
(2007), "Isolation and identification of a Paenibacillus polymyxa strain that
coproduces a novel lantibiotic and polymyxin", Appl Environ Microbiol, 73, pp.
168-178.

52


24. He, S., H. Wang, X. Yan, P. Zhu, J. Chen, and R. Yang (2013), "Preparative
isolation and purification of macrolactin antibiotics from marine bacterium
Bacillus amyloliquefaciens using high-speed counter-current chromatography in
stepwise elution mode", J Chromatogr A, 1272, pp. 15-19.
25. Holman W. I. M. (1943), "A new technique for the determination of phosphorus
by the molyndenum blue method", Biochem, 37, pp. 256-259.
26. Hopwood D.A. (2007), "Streptomyces in Nature and Medicine: The antibiotic
Makers", Oxford Univesity Press.
27. Huang, J., Z. Wei, S. Tan, X. Mei, Q. Shen, and Y. Xu (2014), "Suppression of
bacterial wilt of tomato by bioorganic fertilizer made from the antibacterial
compound producing strain Bacillus amyloliquefaciens HR62", J Agric Food
Chem, 62, pp. 10708-10716.
28. Idriss, E. E., O. Makarewicz, A. Farouk, K. Rosner, R. Greiner, H. Bochow, T.

Richter and R. Borriss (2002), "Extracellular phytase activity of Bacillus
amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant-growth-promoting effect",
Microbiology, 148(Pt 7), pp. 2097-2109.
29. Kubo Y., Rooney A., Tsukakoshi Y., Nakagawa R., Hasegawa H., and K.
Kimura (2011), "Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis strains applicable to
Natto (fermented soybean) production", Appl Environ Microbiol, 77, pp. 64636469
30. Ji, S. H., N. C. Paul, J. X. Deng, Y. S. Kim, B. S. Yun, and S. H. Yu (2013),
"Biocontrol Activity of Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 against Fungal
Plant Diseases", Mycobiology, 41, pp. 234-242.
31. Kim D. H., H. K. Kim, K. M. Kim, C. K. Kim, M. H. Jeong, K. H. Moon, and J.
S. Kang (2011), "Antibacterial activities of macrolactin A and 7-O-succinyl
macrolactin A from Bacillus polyfermenticus KJS-2 against vancomycinresistant enterococci and methicillin-resistant Staphylococcus aureus", Arch
Pharm Res, 34, pp. 147-152.

53


32. Kang, S. M., R. Radhakrishnan, and I. J. Lee (2015), "Bacillus
amyloliquefaciens subsp. plantarum GR53, a potent biocontrol agent resists
Rhizoctonia disease on Chinese cabbage through hormonal and antioxidants
regulation", World J Microbiol Biotechnol, 31, pp. 1517-1527.
33. Lecadet, M. M., E. Frachon, V. C. Dumanoir, H. Ripouteau, S. Hamon, P.
Laurent and I. Thiery (1999), "Updating the H-antigen classification of Bacillus
thuringiensis", J Appl Microbiol, 86(4), pp. 660-672.
34. Lee, H. and H. Y. Kim (2011), "Lantibiotics, class I bacteriocins from the genus
Bacillus", J Microbiol Biotechnol, 21(3), pp. 229-235.
35. Madhaiyan, M., S. Poonguzhali, S. W. Kwon, and T. M. Sa (2010), "Bacillus
methylotrophicus sp. nov., a methanol-utilizing, plant-growth-promoting
bacterium isolated from rice rhizosphere soil", Int J Syst Evol Microbiol, 60, pp.
2490-2495.

36. Maragakis, L. L. and T. M. Perl (2008), "Acinetobacter baumannii:
epidemiology, antimicrobial resistance, and treatment options", Clin Infect Dis,
46(8), pp. 1254-1263.
37. Meena K. R. and S. S. Kanwar (2015), "Lipopeptides as the antifungal and
antibacterial agents: Application in food safety and therapeutics", Biomed Res
Int, pp. 173050.
38. Moyes, R. B., J. Reynolds and D. P. Breakwell (2009). "Differential staining of
bacteria: gram stain", Curr Protoc Microbiol, 3.
39. Romero-Tabarez, M., R. Jansen, M. Sylla, H. L nsdorf, S. H ußler, D. A.
Santosa, K. N. Timmis, and G. Molinari (2006), "7-O-Malonyl macrolactin A, a
new macrolactin antibiotic from Bacillus subtilis active against methicillinresistant Staphylococcus aureus, vancomycin-resistant enterococci, and a smallcolony variant of Burkholderia cepacia", Antimicrob Agents Chem, 50, pp.
1701-1709.
40. Rooney, A. P., N. P. Price, C. Ehrhardt, J. L. Swezey, and J. D. Bannan (2009),
"Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex

54


and description of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum subsp. nov", Int J Syst
Evol Microbiol, 59, pp. 2429-2436.
41. Ruiz-Garcia, C., V. Bejar, F. Martinez-Checa, I. Llamas, and E. Quesada
(2005), "Bacillus velezensis sp. nov., a surfactant-producing bacterium isolated
from the river Velez in Malaga, southern Spain", Int J Syst Evol Microbiol, 55,
pp. 191-195.
42. Pyoung, K., J. Ryu, Y. H. Kim, and Y. T. Chi (2010), "Production of
biosurfactant lipopeptides iturin A, fengycin, and surfactin a from Bacillus
subtilis CMB32 for control of Colletotrichum gloeosporioides", J Microbiol
Biotechn, 20, pp. 138-145.
43. Schneider, K., X. H. Chen, J. Vater, P. Franke, G. Nicholson, R. Borriss, and R.
D. Sussmuth (2007), "Macrolactin is the polyketide biosysthesis product of the

pks2 cluster of Bacillus amyloliquefaciens FZB42", J Nat Prod, 70, pp. 14171423.
44. Shivaji, S., P. Chaturvedi, K. Suresh, G. S. Reddy, C. B. Dutt, M. Wainwright,
J. V. Narlikar and P. M. Bhargava (2006), "Bacillus aerius sp. nov., Bacillus
aerophilus sp. nov., Bacillus stratosphericus sp. nov. and Bacillus altitudinis sp.
nov., isolated from cryogenic tubes used for collecting air samples from high
altitudes", Int J Syst Evol Microbiol, 56(Pt 7), pp. 1465-1473.
45. Van D. T. T., B. N. H. Linh, D. V. Hop, D. M. Phuong, and T. T. Trung (2014),
"Identification of antibiotic-producing Bacillus sensu lato isolated from national
parks of Hoang Lien and Phu Quoc in Vietnam", J Viet Env, 6, pp. 77-83.
46. Vos, P. D., G. M. Garrity, D. Jones, N. R. Krieg, W. Ludwig, F. A. Rainey, K.
H. Schleifer and W. B. Whitman (2009), "BERGEY’S MANUAL OF
Systematic Bacteriology".
47. Wang, X., and G. Liang (2014), "Control efficacy of an endophytic Bacillus
amyloliquefaciens strain BZ6-1 against peanut bacterial Wilt, Ralstonia
solanacearum", Biomed Res Int, pp. 465435.

55


48. Wu, Y., J. Yuan, W. Raza, Q. Shen, and Q. Huang (2014), "Biocontrol traits
and antagonistic potential of Bacillus amyloliquefaciens strain NJZJSB3 against
Sclerotinia sclerotiorum, a causal agent of canola stem rot", J Microbiol
Biotechnol, 24, pp. 1327-1336.
49. Yuan J, Li B, Zhang N, Waseem R, Shen Q & Huang Q (2012), "Production of
bacillomycin- and macrolactin-type antibiotics by Bacillus amyloliquefaciens
NJN-6 for suppressing soilborne plant pathogens", J Agric Food Chem, 60, pp.
2976-2981.

56