thu nhan bromelin tu dua bang song sieu am

i

MỤC LỤC ........................................................................................................ i
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ......................................................................... vi
MỤC LỤC
Mở đầu..............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3
1.1.

Enzyme bromelain................................................................................... 3

1.1.1. Một số tính chất của enzyme bromelain................................................... 3
1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly bromelain............................ 4
1.1.3. Ứng dụng của enzyme bromelain trong công nghiệp thực phẩm.............. 5
1.2.

Sóng siêu âm và ứng dụng trong quá trình trích ly................................... 6

1.2.1. Khái niệm................................................................................................ 6
1.2.2. Cơ chế tác dụng của sóng siêu âm trong quá trình trích ly ....................... 6
1.2.3. Ứng dụng sóng siêu âm trong quá trình trích ly ....................................... 9
1.2.4. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính enzyme................................. 9
1.2.4.1.Ảnh hưởng của công suất siêu âm......................................................... 10
1.2.4.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm........................................................... 10
1.2.4.3.Ảnh hưởng của thời gian siêu âm ......................................................... 11
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................... 13
2.1.

Nguyên liệu ........................................................................................... 13

2.2.

Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 14

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu................................................................................... 14
2.2.2. Cách thực hiện thí nghiệm..................................................................... 14
2.2.2.1.Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu................................................. 14
2.2.2.2.Ảnh hưởng công suất siêu âm............................................................... 15
2.2.2.3.Ảnh hưởng của pH ............................................................................... 16
2.2.2.4.Ảnh hưởng của nhiệt độ........................................................................ 16


ii

2.2.2.5. nh hưởng của thời gian xử lý ............................................................. 17
2.2.2.6. T i ưu hóa hai thông số công nghệ của quá trình xử lý siêu âm để trích ly
bromelain .............................................................................................. 17
2.2.2.7. . Xác định trọng lượng phân tử và hoạt tính bromelain từ qui trình trích ly
có xử lý siêu âm ....................................................................................
2.3.

Phương pháp phân tích ..........................................................................

2.3.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan theo Lowry ..............
2.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bromelain...............................
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính riêng....................................................
2.3.4. Phương pháp xác định trọng lượng phân tử protein ............................... 19
2.4.

Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 19

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................... 20
3.1.

Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu.................................... 20

3.2.

Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm............................................ 21

3.3.

Khảo sát ảnh hưởng của pH................................................................... 23

3.4.

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ........................................................... 26

3.5.

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm.............................................

3.6.

Tối ưu hóa công suất và thời gian siêu âm ............................................. 31

3.7.

Xác định trọng lượng phân tử và hoạt tính bromelain từ qui trình trích ly có

xử lý siêu âm. ........................................................................................ 33

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................. 36
4.1.

Kết luận................................................................................................. 36

4.2.

Kiến nghị............................................................................................... 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO


iii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Đặc điểm của các cysteine protease trong dứa......................................... 3
Bảng 1.2. Giới thiệu một số ứng dụng của enzyme bromelain trong công nghiệp
thực phẩm .............................................................................................. 5
Bảng 3. 1.Các biến độc lập và mức độ dao động của chúng trong thiết kế bề mặt đáp
ứng .......................................................................................................31
Bảng 3. 2. Bảng thí nghiệm qui hoạch thực nghiệm tối ưu hóa quá trình xử lý siêu
âm để trích ly enzyme bromelain và kết quả thực nghiệm ......................32
Bảng 3. 3. Kết quả kiểm tra các hàm mục tiêu ở điều kiện tối ưu. ..........................34


iv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. 1. Các vùng tần số sóng siêu âm và lĩnh vực ứng dụng ................................ 6
Hình 1. 2. Tác động của sóng siêu âm lên bề mặt tế bào thực vật. ........................... 7
Hình 1. 3. Sự nổ vỡ bong bóng khí và giải phóng các hợp chất trong quá trình trích
ly tinh dầu từ cây húng quế . ................................................................... 7
Hình 1. 4. Ảnh chụp TEM của cellulose từ thực vật sau khi xử lý siêu âm ..............
Hình 1. 5. Trọng lượng phân tử trung bình của cellulose từ cây bông vải thay đổi
theo thời gian xử lý siêu âm. ...................................................................
Hình 2. 1. Quy trình thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa .......................... 13
Hình 2. 2. Sơ đồ nghiên cứu...................................................................................14
Hình 3. 1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (thời gian xay thay đổi) đến hoạt
tính bromelain trong dịch trích từ chồi dứa ............................................ 20
Hình 3. 2. Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt tính tổng của bromelain trong
dịch trích từ chồi dứa .............................................................................21
Hình 3. 3. Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hàm lượng protein trong dịch trích
..............................................................................................................22
Hình 3. 4. Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt tính riêng của bromelain ....23
Hình 3. 5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính tổng của bromelain trong dịch trích...24
Hình 3. 6.Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng protein trong dịch trích ....................25
Hình 3. 7. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính riêng của bromelain ...........................25
Hình 3. . Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính tổng của bromelain trong dịch trích
.. ......................................................................................................... 26
Hình 3. 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein trong dịch trích ...........27
Hình 3. 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính riêng của bromelain .................
Hình 3. 11. Ảnh hưởng của thời gian xử lý siêu âm đến hoạt tính tổng của
bromelain trong dịch trích......................................................................29
Hình 3. 12. Ảnh hưởng của thời gian xử lý siêu âm đến hàm lượng protein trong
dịch trích................................................................................................30


v

Hình 3. 13. Ảnh hưởng của thời gian xử lý siêu âm đến hoạt tính riêng của
bromelain...............................................................................................30
Hình 3. 14. Đồ thị bề mặt đáp ứng của quá trình tối ưu hóa công suất và thời gian
siêu âm sau khi xử lý siêu âm ................................................................33
Hình 3. 15. Kết quả chạy điện di trên SDS age ....................................................35


vi

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

PL 1. Cách pha đệm phosphate .............................................................................41
PL 2. Các bước tiến hành trong phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan
theo Lowry ....................................................................................................41
PL 3. Các bước tiến hành trong phương pháp xác định hoạt tính enzyme bromelain
......................................................................................................................42
PL 4. Các bước tiến hành trong phương pháp xác định trọng lượng phân tử protein
bằng điện di trên gel polyacrylamide (SD

age) ..........................................42

PL 5. Bảng khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (thời gian xay thay đổi)
đến hoạt tính bromelain trong dịch trích từ chồi dứa ......................................44
PL 6. Giá trị các hàm mục tiêu theo công suất siêu âm...........................................45
PL 7. Giá trị các hàm mục tiêu theo pH của dung dịch enzyme bromelain khi không
xử lý siêu âm .................................................................................................45
PL . Giá trị các hàm mục tiêu theo pH của dung dịch enzyme bromelain sau khi xử
lý siêu âm ......................................................................................................46
PL 9. Giá trị các hàm mục tiêu theo nhiệt độ dung dịch xử lý ................................46

PL 10. Giá trị các hàm mục tiêu theo thời gian xử lý siêu âm.................................47


1

MỞ ĐẦU
Tính cấp t ết của đề
Bromelain là enzym thuộc nhóm protease – xúc tác thủy phân protein thành
các acid amin. Enzyme này có nhiều ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.
Bromelain được tìm thấy trong tất cả các bộ phận của quả dứa, đặc biệt là ở
chồi. Ở qui mô công nghiệp, người ta đã sử dụng chồi dứa làm nguồn nguyên liệu
để sản xuất chế phẩm bromelain.
Để thu được enzyme, các nhà sản xuất cần phải phá vỡ lớp thành tế bào, để
giải phóng enzyme. Các phương pháp truyền thống như nghiền xé, trích ly… không
thu triệt để lượng enzyme có trong nguyên liệu.
Kỹ thuật siêu âm có thể làm tăng hiệu suất thu hồi chất chiết với nhiều ưu
điểm:
+ Kỹ thuật đơn giản, dễ vận hành, tự động hóa (Wang và Weller, 2006).
+ Sóng siêu âm gây ra hiện tượng xâm thực khí phá hủy thành tế bào và mô
thực vật, làm tăng sự truyền khối của dung môi và chất tan, từ đó làm tăng tốc độ
trích ly.
+ Sóng siêu âm làm tăng mức độ phân tán, tăng khả năng khuấy trộn, giúp
nguyên liệu phân bố đều trong dung môi, làm tăng khả năng tiếp xúc giữa dung môi
và nguyên liệu nên hiệu suất trích ly sẽ tăng theo (Shah và cộng sự, 2008).
+ Có thể trích ly được những hợp chất không bền nhiệt hay những hợp chất
dễ bay hơi, có thể sử dụng với bất kỳ dung môi nào (Wang và Weller, 2006).
Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm trên, xử lý nguyên liệu bằng sóng siêu âm
trong thời gian dài có thể làm thay đổi cấu hình trung tâm hoạt động enzyme
(Huang và cộng sự, 2007), từ đó có thể làm giảm hoạt tính enzyme.
Như vậy, việc sử dụng sóng siêu âm với công suất, nhiệt độ và thời gian thích

hợp có thể giúp cho quá trình trích ly bromelain từ chồi dứa được triệt để hơn và
không làm vô hoạt enzyme.


2

M c

u ngh ê n c u

Nâng cao hiệu suất trích ly thu enzyme bromelain từ chồi dứa bằng cách sử
dụng quá trình trích ly có hỗ trợ của sóng siêu âm.
Ý ngh a khoa học và thực ễn của đề
− Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu các tác động của sóng siêu âm đến hiệu suất
trích ly enzyme từ chồi dứa và tác động của sóng siêu âm đến hoạt tính của enzyme
bromelain.
− Ý nghĩa thực tiễn: làm tăng hiệu quả kinh tế của qui trình sản xuất đồ hộp
dứa thông qua việc thu nhận chất có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm của qui trình
(chồi dứa).


3

CHƯƠNG 1.
1.1.

T NG QUAN TÀI LI U

Enzym brom la n

1.1.1. M t số tính chất của nzym brom

n

Ananas comosus là một loại cây trồng ở vùng nhiệt đới thuộc họ
Bromeliaceae. Nó chứa các loại enzyme thuộc nhóm cysteine protease, bao gồm:
fruit bromelain, stem bromelain, ananain, và comosain (Feijoo-Siota và Villa,
2010).
Bromelain có trong dịch chiết từ thân và quả của cây dứa (loài Ananas
comosus L. merryl). Nó là một hỗn hợp gồm các protease như stem bromelain
(80%), fruit bromelain (10%), ananain (5%) (Chobotova và cộng sự, 2010), và các
enzyme khác như phosphatase, glucosidase, peroxidase, cellulase.
Loại protease hiện diện chủ yếu trong phần chiết của thân (thân cây, cuống, lá,
chồi), được gọi là stem bromelain (EC 3.4.22.32) và có ở hầu hết các loại dứa. Loại
enzyme được tìm thấy từ phần dịch ép của quả dứa, được gọi là fruit bromelain (EC
3.4.22.33). Chế phẩm bromelain được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực
phẩm và dược phẩm (Maurer, 2001).
Bromelain được cấu thành từ 283 amino acid và có các đặc điểm sau:
Bảng 1. 1. Đặc điểm của các cysteine protease trong dứa (Maurer, 2001; FeijooSiota và Villa, 2010)
Enzyme

Khối lượng

Điểm

phân tử (kDa)

đẳng điện

Từ thân dứa:

− Stem bromelain (EC 3.4.22.32)

23.8

9.5

− Ananain (EC 3.4.22.31)

23.464

>10

− Comosain

24.509 và 23.560

>10

23.0

4.6

Từ trái dứa:
− Fruit bromelain (EC 3.4.22.33)

Các enzyme trên có hoạt tính thủy phân protein mạnh, đặc biệt là trên các liên
kết peptide.


4

Bromelain là một cysteine protease thuộc nhóm endopeptidase, được hoạt hóa
bởi cysteine, H2S, hoặc NaCN. Vì tâm hoạt động có chứa nhóm –SH nên enzyme dễ
bị ức chế bởi chất oxi hóa H2O2 và mất hoạt tính bởi các kim loại nặng như Hg2+,
Ag+…
pH hoạt động tối thích cho stem bromelain từ 6.0 đến 8.5 (Polaina và
MacCabe, 2007; Fileti và cộng sự, 2009), hoạt tính cao nhất trên cơ chất casein
trong khoảng 6.0–7.0 (Shi và cộng sự, 2007). Nhiệt độ hoạt động tối thích trong
khoảng 50–600C (Polaina và MacCabe, 2007; Gautam và cộng sự, 2010; Ketnawa
và cộng sự, 2010).
Hoạt tính của bromelain giảm dần ở môi trường acid (đệm 50mM Na-acetate
pH 4.0-5.0, 50mM glycine-HCl pH 3.0), và kiềm mạnh (đệm 50mM tris-HCl pH
8.0-10.0, 50mM Na-carbonate pH 11.0-12.0).
1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly brom

n

Dung dịch đệm và pH
Hebbar và cộng sự (2008) đã khảo sát quá trình trích ly bromelain trong nước
cất và trong dung dịch đệm phosphate pH 6.5. Kết quả cho thấy, hoạt tính của
bromelain tăng 63% so với khi trích ly bromelain bằng nước cất. Như vậy, dung
dịch đệm pH 6.5 dùng để trích ly cho hoạt tính bromelain cao hơn so với trích ly
bằng nước cất.
Corzo và cộng sự (2011) cũng thu được kết quả tương tự: pH 6.5 là giá trị
thích hợp để trích ly bromelain. Khi tăng pH lên 6.8-7.2 thì hoạt tính bromelain
trong dịch trích bị giảm đi 10%. Nếu tiếp tục tăng pH dung môi đến 10.0 thì dịch
trích không còn hoạt tính bromelain.
Khi giảm pH xuống 4.0-6.0 thì hoạt tính bromelain trong dịch trích chỉ còn
27%. Nếu tiếp tục giảm pH xuống đến 2.0 thì không phát hiện được hoạt tính
bromelain trong dịch trích.

Nhiệt độ trích ly
Các kết quả nghiên cứu của Jutamongkon và Charoenrein (2010) khi trích ly
bromelain trong môi trường đệm sodium phosphate 0.1M (pH 8.0, 5mM EDTA và


5

25mM cystein) cho th y rằng, ở nhiệt độ dưới 400C, hoạt tính của bromelain không
thay đổi. Hoạt tính bromelain giảm 17% khi nhiệt độ lên 500C. Khi nhiệt độ trên
600C, hoạt tính bromelain chỉ còn lại 51%.
Thời gian trích ly
Thời gian trích ly thích hợp là 5 phút khi nhiệt độ trích ly là 500C. Nếu kéo dài
thời gian trích ly thì hoạt tính bromelain sẽ giảm, hoạt tính tổng còn lại lần lượt là
98%, 95%, 90% và 86% khi thời gian trích ly tăng lên 10, 20, 40 và 60 phút
(Jutamongkon và Charoenrein, 2010).
Khi trích ly trong thời gian dài và ở nhiệt độ cao, hoạt tính bromelain giảm
mạnh. Hoạt tính bromelain bị mất hoàn toàn trong thời gian 30 phút ở 600C
(Mehrlich và cộng sự, 1978).
1.1.3. Ứng ụng của nzym brom

n trong công ng ệp thực phẩm

Bảng 1.2. Giới thiệu một số ứng dụng của enzyme bromelain trong công nghiệp
thực phẩm (Grzonka và cộng sự, 2007)
Lĩnh vực
Công nghiệp bánh

Ứng ụng
Giảm lượng protein của bột mì trong sản xuất bánh biscuit,
giảm độ dính của bột nhào, tăng độ màu của sản phẩm.

Công nghiệp bia

Ngăn ngừa sự kết tủa protein trong quá trình bảo quản bia.

Công nghiệp bơ sữa

Whey hydrolysate.

Công nghiệp thịt và
các sản phẩm giàu
protein
Công nghiệp sản
xuất chất ngọt

Làm mềm thịt, nâng cao giá trị dinh dưỡng, tạo ra các sản
phẩm protein hòa tan, làm ổn định gelatin.

Tổng hợp aspartam.

Hải sản

Sản xuất protein hydrolyzate.

Thức ăn gia súc

Tăng hệ số sử dụng và chuyển hóa protein cho gia súc.


6

1.2.

g

ứ g ụ g

1.2.1. Kh

g

h

h

ệ

Sóng siêu âm là tên gọi của những sóng có tần số cao hơn 1 kHz.
Từ năm 2000 đến nay, người ta đã ứng dụng siêu âm trong sản xuất công
nghiệp nói chung và trong công nghiệp thực phẩm nói riêng ngày càng nhiều. Phần
lớn các nghiên cứu trong công nghệ thực phẩm đều áp dụng siêu âm với tần số sóng
trong khoảng từ 20 kHz đến 100 kHz (O’Donnell và cộng sự, 2010).

h 1. 1. Các vùng tần số sóng siêu âm và lĩnh vực ứng dụng
1.2.2.

ơ

ế

ụ

ủa

g

h

h

Khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các chu trình kéo và
nén liên tiếp được tạo thành. Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở
rất gần nhau nhờ liên kết hóa học. Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén, các
phân tử ở gần nhau nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa. Áp lực âm
trong chu trình kéo đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành
những bọt khí nhỏ.
Siêu âm tần số thấp (công suất 18-100 kHz) phát ra một lượng lớn các bong
bóng khí. Các bong bóng khí đó sinh ra, phát triển (gia tăng về kích cỡ), dao động
và vỡ ra. Đây là một hiện tượng vật lý. Hiện tượng xâm thực khí gây ăn mòn cơ
học, phá hủy thành tế bào và mô thực vật, thúc đẩy các phản ứng phân cắt hoặc bẻ
gãy các liên kết hóa học trong mạch cao phân tử như cellulose, pectin… tạo ra các
phân tử có kích thước nhỏ, giúp giải phóng các phân tử có kích thước nhỏ hơn nằm
bên trong mô và tế bào (như protein, enzyme).
Hình 1.2 giới thiệu tác động của sóng siêu âm trên thành tế bào thực vật do
hiện tượng xâm thực khí. Tại các chu kỳ nén, các bong bóng bị vỡ, làm xuất hiện
lực tác động lên bề mặt nguyên liệu, tăng nhiệt độ và áp suất tại các vị trí bong bóng


7

b vỡ, từ đó làm phá vỡ thành tế bào thực vật, đồng thời tạo ra những lỗ hổng trên
bề mặt nguyên liệu (hình 1.3), giải phóng các hợp chất nội bào vào dung môi, làm
tăng hiệu quả trích ly (Chemat và cộng sự, 2011).

h 1. 2. Tác động của sóng siêu âm lên bề mặt tế bào thực vật.
a) Bong bóng khí tiến gần đến bề mặt nguyên liệu thực vật.
b) Bong bóng khí bị vỡ trong chu kỳ nén.
c) Lỗ hổng trên bề mặt nguyên liệu.
d) Nhiệt độ và áp suất cao do nổ bong bóng khí sẽ phá hủy thành tế
bào thực vật và giải phóng ra môi trường.

h 1. 3. Sự nổ vỡ bong bóng khí và giải phóng các hợp chất trong quá trình trích
ly tinh dầu từ cây húng quế (Chemat và cộng sự, 2011).
Dưới tác động của sóng siêu âm, kích thước nguyên liệu (từ thực vật) sẽ giảm.
Dưới đây là hình biểu diễn kích thước nguyên liệu trước và sau khi xử lý siêu âm
(hình 1.4).


8

h 1. 4. Ảnh chụp TEM của cellulose từ thực vật sau khi xử lý siêu âm
a) Mẫu ban đầu
b) Mẫu sau khi xử lý siêu âm 30 phút
Trọng lượng phân tử cellulose trong cây bông vải giảm xuống một cách
tuyến tính theo thời gian xử lý siêu âm (hình 1.5) (Wong và cộng sự, 2009).
Bên cạnh đó, sóng siêu âm còn làm tăng cường sự khuấy trộn, giúp cho quá
trình xử lý nguyên liệu được đồng đều hơn, giúp tăng hiệu suất quá trình trích ly.

h 1. 5. Trọng lượng phân tử trung bình của cellulose từ cây bông vải thay đổi
theo thời gian xử lý siêu âm

9

1.2.3. Ứ g ụ g

g

h

h

Sóng siêu âm đã được sử dụng phổ biến cho quá trình trích ly các thành phần
trong thực phẩm như polysaccharide, lipid, protein, chất mùi, và các chất có hoạt
tính sinh học (các flavonoid, caroteinoid) (Sun và cộng sự, 2010). Ngoài ra, sóng
siêu âm còn hỗ trợ trích ly các dược chất như helicid, berberine hydrochloride, và
berberine từ các loại thảo dược (Zhao và cộng sự, 1991).
Từ trước đến nay, có rất ít công trình khoa học nghiên cứu sử dụng sóng siêu
âm để trích ly enzyme từ tế bào vi sinh vật. Chúng tôi không tìm thấy tài liệu tham
khảo về quá trình trích ly bromelain từ dứa có sử dụng sóng siêu âm.
Trích ly với sự hỗ trợ của sóng siêu âm là một kỹ thuật nổi trội hiện nay trong
công nghiệp hóa học và thực phẩm vì nó làm giảm đáng kể thời gian trích ly và làm
tăng hiệu suất thu hồi chất chiết.
Ví dụ như khi sử dụng sóng siêu âm để trích ly dầu từ quả hạnh ở tần số 20
kHz và công suất 50 W thì thời gian trích ly giảm 30%, hiệu suất trích ly tăng lên
20% so với kỹ thuật trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn ở 280 bar và nhiệt độ 550C
(Riera và cộng sự, 2004).
Ngoài ra, sử dụng sóng siêu âm trong quá trình trích ly còn làm giảm lượng
dung môi hữu cơ cần sử dụng. Do đó mức độ tinh sạch của sản phẩm cuối sẽ cao
hơn.

1.2.4. Ả h hưở g ủa

g

đế

ạ

h

e.

Theo Mason và cộng sự (1996), công suất siêu âm thấp và thời gian xử lý ngắn
kích thích hoạt động xúc tác của enzyme. Ví dụ như O’Donnell và cộng sự (2010)
nhận thấy khi xử lý siêu âm công suất thấp làm tăng hoạt tính của enzyme, tăng khả
năng thủy phân của α-amylase, invertase, và amyloglucosidase trên tinh bột,
sucrose, và glycogen.
Ngược lại, nếu công suất siêu âm cao và thời gian xử lý kéo dài thì hoạt tính
enzyme bị giảm đi. Trong công nghiệp thực phẩm, người ta sử dụng sóng siêu âm
công suất cao như là một phương pháp để vô hoạt enzyme.


10

Hoạt tính enzyme peroxidase trong cà chua giảm khi công suất siêu âm tăng từ
3. , 6.0, 7.5 và 11.3 W/ml (tần số 23 kHz) trong thời gian từ 0 đến 150 giây. Khi
công suất tăng đến 11.3 W/ml, peroxidase bị vô hoạt khi xử lý trong thời gian 90
giây, trong khi các mẫu xử lý ở công suất siêu âm thấp hơn hoạt tính peroxidase vẫn
còn trên 50% (Ercan và cộng sự, 2011).
1.2.4.1. Ả h hưở g ủa

g

ấ

Để nghiên cứu ảnh hưởng của công suất siêu âm, Özbek và Ülgen (2000) đã
tiến hành thí nghiệm trên dung dịch enzyme alkaline phosphatase ở các mức công
suất khác nhau từ 7 W đến 40 W trong 2x30 giây. Kết quả cho thấy hoạt tính của
alkaline phosphatase không thay đổi khi tăng công suất siêu âm.
Theo khảo sát của O’Donnell và cộng sự (2010), pectinmethylesterase trong
nước ép cam sau 10 phút xử lý siêu âm ở công suất 1.05 W/ml bị giảm hoạt tính
62%. Tuy nhiên, hoạt tính của polyphenoloxydase trong các loại nước quả khi xử lý
siêu âm 0.3 W/ml trong 30 phút lại tăng lên (Cheng và cộng sự, 2007). Kết quả
tương tự đối với alkaline phosphatase và lactoperoxidase trong sữa gầy. Hai loại
enzyme này không bị giảm hoạt tính khi xử lý siêu âm với công suất 0.95 W/ml ở
tần số 20 kHz trong 102.3 giây ở 610C (Villamiel và Jong, 2000).
Sóng siêu âm tạo ra hiện tượng khuấy trộn mạnh và sinh ra các gốc tự do nên
có thể làm thay đổi cấu hình không gian của các phân tử protein enzyme. Tùy theo
mức độ thay đổi này mà hoạt tính enzyme có thể tăng lên hoặc giảm đi. Sự vô hoạt
enzyme ngoài ảnh hưởng của công suất siêu âm còn phụ thuộc vào giá trị pH và
nhiệt độ trong quá trình siêu âm.
1.2.4.2. Ả h hưở g ủa hiệ độ
Kuldiloke và cộng sự (2002) đã có những công bố về ảnh hưởng của sóng siêu
âm đến sự tăng nhiệt độ và áp suất. Theo đó, quá trình xử lý siêu âm sẽ sinh ra các
bong bóng khí, khi các bóng khí này vỡ ra tại các chu kỳ nén sẽ làm tăng nhiệt độ
và áp suất trong mẫu xử lý.


11

Xử lý siêu âm không th

làm mất hoạt tính của enzyme bền nhiệt

pectinesterase có trong chanh và các loại cam quít. Hoạt tính của enzyme này chỉ
giảm nhẹ khi kết hợp xử lý siêu âm với xử lý nhiệt.
Ở nhiệt độ phòng, hoạt tính của pectinesterase không bị ảnh hưởng khi xử lý
siêu âm (công suất 0.5 W/ml, tần số 20 kHz) sau 1 giờ tại pH 7. Khi chiếu siêu âm
trong khoảng nhiệt độ 40-500C, hoạt tính của enzyme này chỉ giảm nhẹ.
Özbek và Ülgen (2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và các thông số
khác như công suất siêu âm (0-40 W) và thời gian xử lý (2x30 giây) đến độ bền của
một số enzyme: alcohol dehydrogenase (ADH), malate dehydrogenase (MDH),
glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6PDH), L-lactic dehydrogenase (LDH),
alkaline phosphatase (AP) và β-galactosidase (βG) (các chế phẩm enzyme trên đã
được tinh sạch và thương mại hóa bởi hãng Sigma Chemical). Nhóm nghiên cứu đã
tiến hành thí nghiệm trong điều kiện dung dịch đệm phosphat 20mM, pH 7.5, sử
dụng sóng siêu âm với công suất 40 W ở tần số 20 kHz.
Kết quả cho thấy, ở 27 W, nhiệt độ dung dịch mẫu xử lý tăng 15.80C (từ
23.70C đến 39.50C) trong 2x30 giây. Nếu tăng thời gian xử lý lên 3x30 giây thì
nhiệt độ tăng đến 360C.
Do đó, để hạn chế sự tăng nhiệt độ trong quá trình xử lý siêu âm, người ta cần
làm lạnh mẫu hoặc xử lý siêu âm ở các mức năng lượng xung khác nhau để hạn chế
sự gia tăng nhiệt độ.
1.2.4.3. Ả h hưở g ủa

ời gia

Hoạt tính của các enzyme alkaline phosphatase (AP), γ-glutamyltranspeptidase
(GGTP), lactoperoxidase (LPO) không bị giảm nhiều trong quá trình xử lý siêu âm
sữa nguyên chất và sữa gầy sau 102.3 giây ở công suất 20 kHz. Kết quả thực

nghiệm cho thấy hoạt tính của ba enzyme trên còn lại lần lượt là 98.2% AP, 77.9%
GGTP, và 85.6% LPO trong sữa nguyên chất; và 100.0%, 82.8%, 100.0% trong sữa
gầy sau khi xử lý siêu âm. Điều đáng lưu ý là AP và LPO (trong sữa gầy) không bị
giảm hoạt tính sau 102.3 giây xử lý siêu âm (O’Donnell và cộng sự, 2010).


12

Theo nghiên cứu của Nabarlatz và cộng sự (2010) thu được khi trích ly
protease từ bùn hoạt tính, kết quả cho thấy nếu xử lý bằng sóng siêu âm (công suất
siêu âm 3.9 W/cm2) thì thời gian trích ly chỉ mất 10 phút, trong khi trích ly protease
bằng phương pháp khuấy trộn phải mất 60 phút.
Tuy nhiên, nếu tăng thời gian xử lý siêu âm thì hoạt tính enzyme sẽ giảm
mạnh. Nghiên cứu của Özbek và Ülgen (2000) cho thấy hoạt tính enzyme alcohol
dehydrogenase và malate dehydrogenase tỉ lệ nghịch với thời gian xử lý (từ 0-240
giây) khi xử lý siêu âm dưới điều kiện công suất siêu âm 15 và 27 W.
Sóng siêu âm ngoài tác động lên phân tử enzyme còn làm tăng nhiệt độ mẫu
lỏng khi thời gian siêu âm kéo dài (Ercan và cộng sự, 2011), từ đó tạo nên tác động
kép ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Vì vậy, cần phải kiểm soát thời gian siêu
âm để không làm vô hoạt enzyme.


13

ƯƠNG 2.
2.1.

Nguy

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

ệ

Dứa (Ananas comosus): sử dụng giống dứa Queen.
Chồi dứa được mua tại Chợ đầu mối nông sản thực phẩm Thủ Đức.

Chồi dứa

Gọt sạch lá

Xay nguyễn

Xử

Lọc

Ly tâm lạnh

Dịch enzyme
thô

h 2. 1. Quy trình thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa
Chồi dứa sau khi loại bỏ phần lá được đem phối trộn với dung dịch đệm
phosphate pH 6.5 rồi xay nhuyễn trong một khoảng thời gian xác định ở nhiệt độ
phòng. Tỷ lệ khối lượng chồi dứa và dung dịch đệm là 1:1. Sau đó đem hỗn hợp thu
được đi xử lý siêu âm (công suất, pH, nhiệt độ và thời gian xử lý siêu âm sẽ thay đổi
theo từng thí nghiệm). Cuối cùng đem hỗn hợp lọc qua giấy lọc thô để thu lấy dịch.
Tiến hành ly tâm phần dịch này với tốc độ 3500 rpm trong 20 phút để tách bỏ phần

14

xơ, chúng tôi thu được dung dịch enzyme bromelain thô và xác định các hàm mục
tiêu:
+ Hàm lượng protein hòa tan.
+ Hoạt tính tổng của enzyme bromelain.
+ Hoạt tính riêng.
Trong từng đợt thí nghiệm, chúng tôi thực hiện một mẫu đối chứng là mẫu
không có qua quá trình xử lý siêu âm.
2.2.

ng ngh

Nộ

ứ

ghi

2.2.1. Sơ

ứ

Xác định kích thước nguyên liệu để trích ly bromelain
(Xác định thời gian xay nhuyễn nguyên liệu)

Khảo sát ảnh hưởng của công suất, pH, nhiệt độ và thời gian siêu âm đến
quá trình trích ly bromelain

Tối ưu hóa hai thông số công nghệ của quá trình xử lý siêu âm để trích

ly bromelain

Xác định trọng lượng phân tử và hoạt tính bromelain từ qui trình trích ly
có xử lý siêu âm
h 2. 2. Sơ đồ nghiên cứu
2.2.2.

h

ự hiệ

h

ghiệ

Sử dụng thanh siêu âm của hãng Sonic & Materials có tần số cố định
là 20 kHz, công suất tối đa là 750 W.
2.2.2.1. Ả h hưở g ủa

h

ướ

g

ệ

Mục đích: xác định kích thước nguyên liệu phù hợp cho quá trình
trích ly bromelain có sử dụng sóng siêu âm.

15

Cách thực hiện:
−
•

Thông số thay đổi:
Thời gian xay nhuyễn nguyên liệu: 3, 6, 9 phút (chúng tôi cho

rằng thời gian xay nguyên liệu càng lâu thì kích thước nguyên liệu sẽ càng
nhỏ).
Thông số cố định:
•

Tỉ lệ khối lượng nguyên liệu : dung dịch đệm pH 6.5 = 1:1.

•

Công suất siêu âm: 4.7 W/g nguyên liệu.

•

Nhiệt độ xử lý siêu âm: nhiệt độ phòng.

•

Thời gian siêu âm: 60 giây.

Hàm mục tiêu:

−

Hoạt tính tổng của enzyme bromelain.

2.2.2.2. Ả h hưở g

ấ

Mục đích: xác định công suất siêu âm thích hợp cho quá trình trích ly
bromelain.
Cách thực hiện
−
•

Thông số thay đổi:
Công suất siêu âm: 0, 3.8, 4.7, 5.6, 6.6, 7.5 W/g nguyên liệu.
Thông số cố định:

•

Thời gian xay: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.1.

•

Tỉ lệ khối lượng nguyên liệu : dung dịch đệm pH 6.5 = 1:1.

•

Thời gian xử lý siêu âm: 60 giây.

•

Nhiệt độ xử lý siêu âm: nhiệt độ phòng.

Hàm mục tiêu
−

Hoạt tính tổng của enzyme bromelain.
Hàm lượng protein hòa tan.
Hoạt tính riêng.


16

2.2.2.3. Ả h hưở g ủa H
Mục đích: xác định pH thích hợp cho quá trình trích ly bromelain.
Cách thực hiện
−
•

Thông số thay đổi:
pH dung dịch mẫu: 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0.
Thông số cố định:

•

Kích thước: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.1.

•

Công suất: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.2.

•

Thời gian xử lý siêu âm: 60 giây.

•

Nhiệt độ xử lý siêu âm: nhiệt độ phòng.

Hàm mục tiêu:
−

Hoạt tính tổng của enzyme bromelain.
Hàm lượng protein hòa tan.
Hoạt tính riêng.

2.2.2.4. Ả h hưở g ủa hiệ độ
Mục đích: xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly
bromelain.
Cách thực hiện
−
•

Thông số thay đổi:
Nhiệt độ dung dịch mẫu: 10, 20, 30, 40, 500C.
Thông số cố định:

•

Kích thước: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.1.

•

Công suất: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.2.

•

pH: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.3.

•

Thời gian xử lý siêu âm: 60 giây.

Hàm mục tiêu:
−

Hoạt tính tổng của enzyme bromelain.
Hàm lượng protein hòa tan.


17

Hoạt tính riêng.
2.2.2.5. Ả h hưở g ủa

ời gia

ử

Mục đích: xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly
bromelain.
Cách thực hiện
Thông số thay đổi:

−
•

Thời gian xử lý: 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 giây.
Thông số cố định:

•

Kích thước: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.1.

•

Công suất: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.2.

•

pH: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.3.

•

Nhiệt độ: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.4.

Hàm mục tiêu:
Hoạt tính tổng của enzyme bromelain.
Hàm lượng protein hòa tan.

Hoạt tính riêng.
2.2.2.6. ối ư
h

hai
b

g ố

g ghệ ủa

ử

để

i

Trong phần thí nghiệm này, chúng tôi chọn hai yếu tố công nghệ của
quá trình xử lý siêu âm có ảnh hưởng nhiều nhất đến tổng hoạt tính enzyme
bromelain trong dịch trích để tối ưu hóa. Yếu tố có ảnh hưởng nhiều đến hoạt
tính enzyme là yếu tố khi thay đổi giá trị của nó trong một khoảng hẹp thì sẽ
làm thay đổi đáng kể hoạt tính bromelain trong dịch trích.
Chúng tôi sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm trực giao bậc
hai, hai yếu tố, cấu trúc có tâm để thực hiện thí nghiệm tối ưu hóa. Chúng tôi
dùng phần mềm Mode 5.0 để thiết kế thí nghiệm, mỗi yếu tố được khảo sát ở 5
mức. Hàm mục tiêu là hoạt tính tổng của enzyme bromelain trong dịch trích.


18

2.2.2.7.

h
h

ọ g ượ

ử

ạ

hb

e ai

ừ

i

ử

Chúng tôi thực hiện thí nghiệm với các kết quả và thông số tối ưu đã
tìm được trong phần 2.2.2.1 – 2.2.2.6. Dịch trích bromelain thu được sẽ đem
đi xác định trọng lượng phân tử và hoạt tính tổng.
2.3.

Phương pháp phân tích

2.3.1. Phương pháp xác

nh hàm lượng prot n hòa tan th o Lowry

Nguyên tắc:
− Hầu hết các protein đều chứa hai amino acid là tyrosin và tryptophan, hàm
lượng của những amino này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein
của cùng một loại với nhau sẽ chứa hàm lượng amino acid như nhau.
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử folin sẽ tạo thành một phức chất có
màu, màu này tỉ lệ thuận với hàm lượng tyrosin và tryptophan (hàm lượng
protein). Vì thế có thể dùng phương pháp so màu và xác định được hàm
lượng protein khi đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm.
2.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính nzym brom

n

Nguyên tắc:
− Dùng protein “casein” làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của
enzyme bromelain (protease) trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong
phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để
tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng
của enzyme.
Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme bromelain là lượng enzyme cần xúc
tác để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 µg Tyrosin trong 1 ml
mẫu ban đầu dưới điều kiện thí nghiệm.
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính

g

− Từ kết quả định lượng ở mục 2.3.1 và 2.3.2, hoạt tính riêng của enzyme
bromelain được tính là số đvht/mg protein enzyme.

19

2.3.4. Phương pháp xác định trọng lượng phân tử pro

n

Nguyên tắc:
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel) là một kỹ
thuật điện di trên gel polyacrymide với SDS là tác nhân làm biến tính và tích
điện âm các phân tử. Phương pháp này dùng để xác định trọng lượng phân tử
protein, thành phần và độ sạch chế phẩm protein trong quá trình tinh sạch.
Trong kỹ thuật này protein được xử lý với SDS và tác nhân khử cầu nối
disulfit là mercaptoethanol hoặc dithithreitol (DDT) làm cấu trúc bậc 2, 3, 4
của protein bị biến đổi thành bậc 1 và tích điện âm. Do đó, khi điện di, các
phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước để di chuyển trong gel, những
phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích
thước nhỏ.
2.4.

Phương pháp xử lý số ệu
Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần để lấy kết quả trung bình và độ lệch
chuẩn.
Sử dụng phần mềm thống kê: Stagraphic plus 3.0 để xử lý kết quả thực
nghiệm.