Ứng dụng Vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm

II. Ứng dụng vi sinh vật trong
bảo quản thực phẩm

Các khái niệm
• Kiểm soát sinh học (biocontrol)
• Vi sinh vật ñối kháng (antagonistic
microorganism)
• Bảo quản bằng phương pháp sinh học
(bio-preservation)
• Vi sinh vật bảo vệ (protective culture)

1


II.1. Kiểm soát sinh học (biocontrol)
• Biocontrol- Biological Control
– Google 2.390.000 kết quả; tiếng Việt: 8.910 kết quả
– PubMed: 7988 bài báo

• Kiểm soát sinh học gắn liền với phát triển nông
nghiệp bền vững
• ðịnh nghĩa kiểm soát sinh học:
“Dùng một loài sinh vật hoặc sản phẩm của sinh vật
sống ñể hạn chế, tiêu diệt sinh vật khác”

Kiểm soát sinh học ñối với sản
phẩm sau thu hoạch
• Có từ lâu ñời
• Thế kỷ 19: Có một số công bố của các
nhà khoa học
• Khoảng những năm 60: Dịch bệnh trên

cây
Phát triển các sản phẩm trừ sâu
sinh học
• Những năm 80: Phát triển ứng dụng vi
sinh vật ñối kháng ñối với sản phẩm sau
thu hoạch

2


II.2. Tác nhân kiểm soát sinh học
Vi sinh vật ñối kháng
• Vi sinh vật có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi
sinh vật có hại (antagonistic microorganism)
– Trichoderma kháng mốc thối xám (Botrytis) ở dâu tây
– Pseudomonas syringae Van Hall có khả năng kháng
Botrytis, Penicillium, Mucor và Geotricum
– Candida oleophila Montrocher kháng Botrytis,
Penecillium spp.

Yêu cầu của vsv ñối kháng
1. Bền về di truyền
2. Hoạt ñộng có hiệu quả ở nồng ñộ thấp
3. Có khả năng kháng nhiều loại vsv gây
hỏng, gây bệnh
4. Nhu cầu dinh dưỡng ñơn giản
5. Có khả năng sống trong môi trường
không thuận lợi

3

Yêu cầu của vsv ñối kháng
6. Có thể sinh trưởng trên cơ chất ñơn
giản trong thiết bị phản ứng
7. Không gây ñộc hại ñối với vật chủ,
không sinh ñộc tố gây hại cho người
8. Bền dưới tác dụng của các chất bảo
quản khác, chịu ñược các công ñoạn xử
lý hóa học và vật lý

II.3. Cơ chế hoạt ñộng của các tác
nhân kiểm soát sinh học
Vật chủ
(thực phẩm)

VSV gây hại,
gây bệnh
VSV khác

VSV ñối kháng

4


Cơ chế hoạt ñộng
1. Khả năng sinh kháng sinh
2. Cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian
3. Khả năng bám lên VSV có hại hoặc tác
dụng trực tiếp lên chúng (ký sinh)

4. Kích thích khả năng chống chịu VSV gây
bệnh của vật chủ

1. Khả năng sinh kháng sinh
• ðây là cơ chế hiệu quả nhất
• Bacillus subtilis sinh
– Iturin: một peptide có tính kháng nấm
– Gramicidin S

• Cơ chế này thường phối hợp một số cơ
chế khác theo “công nghệ rào cản” (hurdle
technology)

5


Kiểm soát sinh học bằng
Pseudomonas cepacia
P.d: Penecillium
digtatum gây mốc
xanh lam
P.i: Penecillium italicum
gây mốc xanh lục
Theo nghiên cứu của Dr. Wojciech
Janisiewicz, USDA-ARS,
Kearneysville, WV
(www.ars.usda.com)

Kiểm soát sinh học bằng
Pseudomonas cepacia

• Xử lý bằng pyrrolnitrin
sinh tổng hợp từ P.
cepacia với nồng ñộ
khác nhau
• VSV gây bệnh
Penecillium digitatum
Theo nghiên cứu của Dr. Wojciech
Janisiewicz, USDA-ARS,
Kearneysville, WV
(www.ars.usda.com)

6


Kiểm soát sinh học bằng
Pseudomonas cepacia

• Kiểm soát mốc xanh lục gây ra do Penecillium
expansum bằng pyrrolnitrin sinh tổng hợp từ P. cepacia
Theo nghiên cứu của Dr. Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV
(www.ars.usda.com)

2. Cạnh tranh dinh dưỡng và
không gian
• Cơ chế này thường gặp ở nấm men
• Nấm men thường cạnh tranh với VSV gây
hại, ức chế sinh trưởng, nhưng không tiêu
diệt chúng
• Khả năng ức chế hiệu quả hơn nếu nguồn
dinh dưỡng khan hiếm

7


Cạnh tranh dinh dưỡng và không
gian
• Nấm men có khả năng tổng hợp màng
polysaccharide
tăng khả năng bám
dính lên bề mặt của rau quả
• VSV ñối kháng sinh trưởng rất nhanh và
xâm chiếm vị trí vết dập ở rau quả
• Sự sinh trưởng và nhu cầu dinh dưỡng
của vsv ñối kháng làm cho một số nấm
mốc không có ñủ dinh dưỡng ñể phát triển

Sự tạo thành Biofilm bởi Candida
oleophila

Wisniewski et al. (2007). Post harvest biocontrol: New concepts and applications

8


3. Sự ký sinh
• Pichia guilliermondii có khả năng bám dính trên
sợi nấm Botrytis cinerea, tiêu diệt nấm bằng một
số enzym phân hủy màng tế bào
• Aspergilus pullulans ở vết dập của táo có khả
năng sinh tổng hợp enzym exochitinase và β1,3-glucanase

• Một số nấm men khác có khả năng giảm sự
bám dính của bào tử và ngăn cản bào tử nảy
mầm

Sự bám dính của Pichia guillemondii lên sợi
nấm Botrytis cinerea

Wisniewski et al. (2007). Post harvest biocontrol: New concepts and applications

9


4. Kích thích khả năng chống chịu
• Một số vsv có khả năng tương tác với vật
chủ, thúc ñẩy quá trình lành sẹo
• Một số nấm men biểu hiện tính ñối kháng
khi ñược ñưa vào trước khi cấy vsv gây
hại

II.4. Các bước phát triển một sản phẩm
kiểm soát sinh học

Khả năng
tương thích

Thu thập các
tác nhân KSSH

Xác ñịnh ñặc tính
và phân loại

ðánh giá áp dụng
thử nghiệm

ðánh giá trong
PTN

Phát tri n
Phá

Nhân giống
hàng loạt

M r ng

Áp dụng trên diện rộng

Phối trộn ñịnh dạng
sản phẩm

Cải thiện chủng

Tương tác với
vùng rễ

Lưu kho và
phân phối

Sản phẩm cuối cùng

Nghiên c u

Xác ñịnh
sự nhiễm tạp

ðánh giá sự chấp nhận sản phẩm

10


Một số chế phẩm kiểm soát sinh
học ñã thương mại hóa
Tên chế
phẩm

Tác nhân
kiểm soát
sinh học

Bio-save 100
Bio-save
1000
Bio-save 110

Pseudomonas
syringae ESC10
Pseudomonas
syringae ESC11

BlightBan

A506

Pseudomonas
fluorescens
A506

Tác nhân
gây hư hỏng

Dạng chế
phẩm

Ứng dụng

Nước sản
xuất

Botrytis
cinerea,
Penecillium
spp., Mucor
pyroformis,
Geotrichum
candidum

Tế bào viên
nhỏ dạng lạnh
ñông

Bảo quản quả

sau thu hoạch
bằng cách dội
qua, nhúng,
hoặc phun

EcoScience
Corp., USA

Hỏng do ñông
ñá, Erwinia
amylovora, vi
khuẩn gây nâu
ñỏ

Bột pha nước

Phun vào hoa
lúc mới nở
hoặc trực tiếp
lên quả

Plan Health
Technology,
USA

Một số bước tiếp cận nhằm ứng dụng
sản phẩm KSSH trong bảo quản rau
quả
Áp dụng sau thu hoạch
• Thông thường VSV ñối kháng ñược phân lập

ngay từ bề mặt rau quả
• Số lượng tự nhiên của VSV ñối kháng thường
không ñủ ñể biểu hiện hoạt tính mạnh
• ðưa vào một lượng lớn VSV ñối kháng ñối với
sản phẩm sau khi thu hoạch
• Tăng sinh ñối với VSV ñối kháng ñã có sẵn trên
sản phẩm

11


Áp dụng sau thu hoạch
• Ưu ñiểm
– ðơn giản, dễ thực hiện ngay sau thu hoạch
bằng cách phun, ngâm, tưới
– Nếu ñúng cách, ñúng thời ñiểm (trước khi
VSV gây bệnh xâm nhập) sẽ có hiệu quả cao
– Ít tốn kém hơn việc phun thuốc cả diện tích
lớn, có thể dùng VSV nồng ñộ cao

Candida oleophila, Cryptococcus albidus,
Pichia membranefaciens

Áp dụng sau thu hoạch
• Giới hạn
– Cần ñưa vào ngay lập tức sau thu hoạch
trước khi VSV gây hại xâm nhập
– Một số vết thương ở vỏ quả họ cam chanh có
chứa tinh dầu, khó khăn hơn cho VSV ñối
kháng bám vào

12


Áp dụng sau thu hoạch
Giới hạn
• Hiệu quả của VSV ñối kháng tương ñối
hẹp
• Phụ thuộc loại rau quả
• Phụ thuộc vào hoạt tính ñặc hiệu ñối với VSV gây
bệnh

• Khả năng bám dính của VSV ñối kháng
lên bề mặt là khác nhau ñối với những sản
phẩm sau thu hoạch khác nhau

Áp dụng trước khi thu hoạch
• Phun ñịnh kỳ vào cây trước khi thu hoạch
• Giới hạn
– Có thể ảnh hưởng môi trường
– VSV ñối kháng bị tiếp xúc và biểu hiện hoạt tính trong
ñiều kiện khắc nghiệt (nhiệt ñộ, ñộ ẩm, ánh sáng,
VSV khác, các thuốc diệt sâu bọ,…)

• Biện pháp:
– Lựa chọn VSV có khả năng thích nghi tốt
– Cho VSV làm quen, thích nghi với một số stress
trước khi ứng dụng

13

Dùng những chủng biến ñổi
• Các loại hạt lạc, ñậu ñỗ:
– Ứng dụng nấm mốc Aspergillus flavus không
sinh ñộc tố aphlatoxin ñể cạnh tranh với
những chủng hoang dã sinh ñộc tố

• Thường ít ứng dụng ñối với rau quả tươi

II.5. Vi khuẩn Lactic trong bảo
quản thực phẩm
Vi khuẩn lactic làm hư hỏng
thực phẩm hay bảo quản
thực phẩm?

14


Giới thiệu chung
• Vi khuẩn lactic: lactic acid bacteria, vi khuẩn làm
chua sữa
• 1873: J. Lister thu nhận Bacterium lactis (nay có
thể là Lactococcus lactis)
• 1919: Orla-Jensen phân loại vi khuẩn lactic dựa
theo ñặc ñiểm
–
–
–
–

Hình thái (cầu, que, …)
Kiểu lên men glucoza: ñồng hình, dị hình
Nhiệt ñộ sinh trưởng
Khả năng sử dụng các loại ñường

15


II.5.1. ðặc ñiểm chung
• Vi khuẩn G+
• Không sinh bào tử (còn tranh cãi,
Sporolactobacillus)
• Catalase –
• Yếm khí tùy tiện
• Chịu ñược axit
• Lên men ñường tạo thành chủ yếu là axit lactic
• Vi khuẩn lactic thường sống ở nơi có môi
trường dinh dưỡng dồi dào (thực phẩm), có một
số sống trong cơ thể ñộng vật

Các ñặc ñiểm phân loại của vi
khuẩn lactic
Hình que

ðặc ñiểm

Carnob.

Hình cầu

Lactob.

Aeroc.

Enteroc
.

Lactoc
Vagoc

Leucon
Oenoc.

Pedioc
.

Streptoc
.

Tetragenoc
.

Weissella

Tạo tứ cầu

-

-

+

-

-

-

+

-

+

-

Sinh CO2 từ
glucoza

-

±

-

-

-

+

-

-

-

+

Sinh trưởng ở
10oC

+

±

+

+

+

+

±

-

+

+

Sinh trưởng ở
45oC

-

±

-

+

-

-

±

±

-

-

Chịu muối
6,5%

ND

±

+

+

-

±

±

-

+

±

Chịu muối
18%

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

Sinh trưởng
pH4,4

ND

±

-

+

±

±

+

-

-

±

Sinh trưởng
pH9,6

-

-

+

+

-

-

-

-

+

-

Axit lactic

L

D, L, DL

L

L

L

D

D, DL

L

L

D,D L

16


II.5.2. Cơ chế tác dụng của vi
khuẩn lactic trong bảo quản
thực phẩm
• Cạnh tranh
không gian
• Cạnh tranh
dinh dưỡng

• Sinh ra một
số chất kháng
vi sinh vật

Cạnh tranh không gian
• Nhiều loài thuộc giống Lactobacillus có
khả năng ngăn chặn sự bám dính của vi
sinh vật gây bệnh trên bề mặt
• Bản chất chất ức chế chưa ñược nghiên
cứu nhiều
• Chất hoạt ñộng bề mặt (surlactin),
glycoprotein, glycolipid

17


Các chất kháng vi sinh vật từ vi
khuẩn lactic

• Axit hữu cơ
• H2O2
• CO2
• Diacetyl
• Các chất phân tử lượng thấp
• Bacteriocin

Yếu tố ảnh hưởng ñến tác dụng
của axit hữu cơ
• Trong thực tế thường ứng dụng trong thực
phẩm_ hệ phức tạp các chất hữu cơ

• Các chất trong thực phẩm ảnh hưởng ñến
khả năng kháng VSV của vi khuẩn lactic
– Cao nấm men làm giảm khả năng kháng
khuẩn của vk lactic và axetic
– Sữa và máu tăng cường khả năng kháng
khuẩn của axit axetic

18


H2O2
• Vi khuẩn lactic khi có O2 chuyển thành H2O2
dưới tác dụng của oxidases, NADH oxidases có
chứa flavoprotein và superoxide dismutase
• Một lý do nào ñó lactic không sinh catalase ñể
phân hủy H2O2 hoặc hệ phân hủy yếu hơn hệ
sinh ra
• Thực tế theo một số nhà nghiên cứu H2O2 không
tích tụ lại nhiều in vivo, thường bị phân hủy
nhanh chóng

Cơ chế tác dụng của H2O2
• Tính kháng khuẩn dựa vào khả năng oxy hóa
các ñại phân tử của H2O2 khi bị phân hủy
• Protein hoặc lipid ở phía vỏ tế bào bị ôxy hóa
• Một số phản ứng xảy ra ñối với vi khuẩn lactic
ñể tạo H2O2 lấy hết oxy, tạo môi trường yếm khí,
không có lợi cho một số vsv
• Vi khuẩn lactic sinh H2O2 có mặt ở ñường tiết
niệu, ñóng vai trò quan trọng trong việc tránh

viêm nhiễm

19


H2O2
• Trong tự nhiên, tác dụng kháng khuẩn của
H2O2 ñược tăng lên do lactoperoxidase và
thiocyanate (SCN-).
• SCN- + H2O2
OSCN- + H2O
lactoperoxidase
• Cấu trúc màng tế bào vsv bị thay ñổi khi
tiếp xúc với OSCN• Hiệu quả chủ yếu do chu trình glycolysis bị
chặn do các enzym bị ảnh hưởng
• Tác dụng nhanh ñối với VK G-, lâu hơn ñối
với G+

CO2
• Tạo môi trường yếm khí, ức chế một số vi
khuẩn
• Quá trình decarboxyl hóa bị ức chế
• Tích tụ CO2 ở màng lipid của tế bào làm
vô hoạt sự thẩm thấu của các chât qua
thành tế bào
• Vi khuẩn G- nhạy cảm hơn vi khuẩn G+

20

Tác dụng của Diacetyl
• Diacetyl kháng vi sinh vật tốt hơn khi pH<7
• Diacetyl tác dụng trên vi khuẩn G-, nấm
men, nấm mốc tốt hơn trên vi khuẩn G+
• Vi khuẩn lactic bền với diacetyl nhất
• Diacetyl tác dụng với protein bám arginin
của vi khuẩn G-, ngăn cản quá trình sử
dụng axit amin của vi khuẩn

Các hợp chất kháng vi sinh vật
phân tử lượng thấp
•
•
•
•
•

Phân tử lượng thấp
Hoạt ñộng tốt ở pH thấp
Bền nhiệt
Phổ hoạt ñộng rộng
Hòa tan trong acetone

21


Reuterin
3-hydroxypropanal, reuterin

o Sinh ra do Lactobacillus reuteri sinh trưởng trên môi

trường chứa hỗn hợp glucose và glycerol hoặc
glyceraldehyde
o Ở pha log: chưa có reuterin. Pha cân bằng reuterin
bắt ñầu tích tụ
o Khi tiếp xúc với tế bào của vsv mục tiêu, Lb. reuteri
ñược kích thích sinh ra reuterin

Reuterin
• Dưới dạng dung dịch hòa tan trong nước,
reuterin tồn tại dưới dạng ñơn phân tử
(monomer), ngậm nước hoặc dimer dạng
vòng
– Chưa có số liệu ở dạng nào reuterin thể hiện
tính kháng khuẩn mạnh hơn

• Phổ tác dụng rộng: kháng vi khuẩn, nấm
mốc, nấm men, một số ñộng vật nguyên
sinh, kháng virus

22


Reuterin
• Chưa có số liệu tác dụng gây hại cho
người
• Cơ chế kháng vi sinh vật của reuterin dựa
trên tác dụng lên enzyme sulfhydryl
• Reuterin có tác dụng ức chế subunit gắn
lên cơ chất của ribonucleic reductase
ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp

ADN

Reutericyclin
• Phân tử lượng 349 Da, tích ñiện âm,
không ưa nước
• Kích thích bởi sự có mặt của các axit béo
• Sinh reutericyclin tăng khi hàm lượng
muối khoảng 2%, pH < 4,5
• Nồng ñộ ức chế nhỏ nhất
– ðối với VK G+: 0,05-1 mg/l
– ðối với G- và nấm men: > 100 mg/l

23


2-Pyrrolidone-5-carboxylic Acid

• Tìm thấy ở Lactobacillus casei ssp.
casei, Lb. casei ssp.pseudoplantarum
và Streptococcus bovis
• Bền nhiệt (121oC, 20 phút), giảm hoạt
tính khi pH tăng trên 2,5

Bacteriocin
•
•
•
•
•

Hợp chất sinh tổng hợp tại ribosome
Bản chất Protein
Ức chế các vi khuẩn khác
Có mặt ở hầu hết các vi khuẩn
Phổ ức chế tương ñối hẹp:
– Nhược ñiểm
– Ưu ñiểm: Tiêu diệt có chọn lọc vi sinh vật ñặc
hiệu mà không ảnh hưởng ñến hệ sinh vật có
ích

24


Bacteriocin và kháng sinh
ðặc ñiểm

Bacteriocin

Ứng dụng
Sinh tổng hợp

Thực phẩm
Ribosome

Hoạt ñộ
Miễn dịch của
sinh vật chủ
Cơ chế thích
nghi của vsv ñích

Phổ hẹp
Có

Kháng sinh
Y dược
SP trao ñổi chất
bậc hai
Phổ khác nhau
Không

Sự thích nghi
Có thể biến ñổi
của màng tế bào về mặt di truyền
ở vị trí tác dụng
Cơ chế tác dụng Thường tạo lỗ ở Màng tế bào
màng tế bào
hoặc nội bào
Phản ứng phụ
Chưa có báo cáo Có

Tác dụng của Pediocin AcH lên
Listeria monocytogenes
L. monocytogenes
chưa xử lý

Sau 30 phút xử lý với
Pediocin

Sau 5 giờ xử lý với
Pediocin

Ennahar et al. (1996). Production of pediocin AcH by Lactobacillus plantarum WHE 92
isolated from cheese. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12) 4381-4387

25