Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm

Bacteriocin
1. Phân loại bacteriocin
2. Ứng dụng bacteriocin
trong bảo quản thực phẩm

1. Phân loại bacteriocin
Nhóm

Phân
nhóm

Nhóm I
A(I)
(Lanbiotics)
A(II)
B
Nhóm II

IIa
IIb
IIc

ðặc ñiểm
Dài, có tính cation, hoạt ñộng trên màng tế bào, tích
ñiện – hoặc + nhẹ
Dài, có tính cation, hoạt ñộng trên màng tế bào, tích
ñiện – hoặc + cao
Dạng hình cầu, ức chế hoạt ñộng của các enzym
Kích thước nhỏ (<10KDa), bền nhiệt (100oC ñến
120oC), là peptide không chứa lanthionine, hoạt
ñộng trên màng tế bào

Peptides hoạt ñộng trên Listeria với –Y–G–N–G–V–
X–C– gần ñầu chứa gốc amin
Bacteriocin có hai peptide
Các bacteriocin khác

Nhóm III

Kích thước lớn (>30KDa), kém bền nhiệt

Nhóm IV

Bacteriocin phức hợp: protein với lipid và/hoặc với
carbohydrate

1


Bacteriocin nhóm I
• Lanbiotics: chứa các axit amin thường
không tìm thấy trong tự nhiên (lanthionine
và β-methyllanthionine)
• Các axit min này sinh tổng hợp do những
thay ñổi sau quá trình dịch mã
• Là các peptide tương ñối dài, có thể ñến
34 gốc axit amin
• Kích thước <5kDa

2

Bacteriocin nhóm I

Nisin
• Rogers và cộng sự, 1927: phát hiện ra nisin
• ðược thương mại hóa và sử dụng tại trên 40
nước
• Ký hiệu E234
• Có tính kháng gần hết các vi khuẩn lactic, S.
aureus, L. monocytogenes, tế bào sinh
dưỡng Bacillus spp., Clostridium spp., ngăn
chặn sự nảy mầm của bào tử của các loài
Bacillus và Clostridium

3


Nisin: cơ chế kháng khuẩn
• Màng nguyên sinh chất là ñích ñầu tiên của nisin
• E.coli và các vi khuẩn G- khác thường bị nisin tác ñộng
nếu màng tế bào ñã bị phá hủy bởi một số chất khác
• Nisin ức chế sinh tổng hợp peptidoglycan
nisin tương
tác với các tiền chất lipid I và lipid II
• Nisin có khả năng tạo lỗ trên các tế bào
• Nisin sử dụng tiền chất lipid II như phân tử trung gian
(docking molecule) ñể tạo lỗ
• Các chất nội bào: amino acids and ATP ñi ra ngoài theo
các lỗ nhỏ,ngăn cản sinh tổng hợp các hợp chất (AND,
ARN, và protein)

Nisin
• Nisin ñược tìm thấy có khả năng kích thích quá
trình tự phân của những tế bào Staphylococcus
nhạy cảm
• Nisin tích ñiện dương có khả năng hoạt hóa hai
loại enzym thủy phân màng tế bào (Nacetylmuramoyl-L-alanine amidase và Nacetylglucosaminidase) dẫn ñến quá trình tiêu
hủy màng tế bào
• Vi khuẩn sinh ra nisin có khả năng tự bảo vệ
mình trước nisin

4


Bacteriocin nhóm II
• Kích thước nhỏ; <10kDa
• Không chứa lanthionine, hoạt ñộng trên màng tế
bào
• Phổ kháng khuẩn tương ñối hẹp
• Chia làm 3 phân nhóm:
– IIa lớn nhất, có chứa trình tự amin
YGNGVXC, hoạt tính kháng Listeria (vd:
leucocin A, pediocin PA-1)
– IIb: dipeptide (vd: lactacin F, lacticin 3147)
– IIc: các bacteriocin còn lại (vd: lactococcin A,
plantaricin A)

Bacteriocin nhóm IIa

5

Bacteriocin nhóm IIa

Phân nhóm IIa
• Nhóm có ứng dụng công nghiệp rộng rãi
nhất
• Có khả năng kháng Listeria, phổ hẹp,
không kháng những vi khuẩn có lợi hoặc
chủng khởi ñộng
• Cần có phân tử ñặc hiệu trên màng tế bào
vi khuẩn ñích ñể bám vào
• Pediocin-like bacteriocin

6


Phân nhóm IIa: cơ chế tác dụng
• Làm giảm ATP nội bào
• Không thấy có hiện tượng dịch bào chảy
ra ngoài do lỗ tạo thành tương ñối nhỏ so
với nhóm I
• Sự giảm ATP ñược cho là do nhu cầu
ATP của vi khuẩn lactic ñể duy trì lực vận
chuyển proton
• Tế bào không thể sinh tổng hợp ATP bởi
vì phosphat bị “rửa trôi”

Bacteriocin nhóm IIb

7

Bacteriocin nhóm IIc

Bacteriocin nhóm III
• Nhóm III bacteriocins tương ñối lớn (30
kDa), là protein không bền nhiệt
• Bao gồm enzymes ngoại bào (hemolysins
and muramidases) có thể bắt chước hoạt
ñộng sinh lý của bacterioncin
• Bacteriocins nhóm III hầu như mới ñược
phân lập từ giống Lactobaccillus

8


Bacteriocin nhóm III

Phương pháp nghiên cứu hoạt
tính kháng khuẩn
• Phương pháp cấy chấm
ñiểm (spot method,
overlay agar)
– Dùng que cấy chấm ñiểm
trên bề mặt thạch hoặc
nhỏ 1 giọt canh trường
– ðổ thạch có chứa vi sinh
vật chỉ thị lên trên
– Nuôi cấy và quan sát
vòng kháng khuẩn

9


Phương pháp nghiên cứu hoạt
tính kháng khuẩn
• Phương pháp ñục lỗ thạch
(well-diffusion method)
– Cấy vsv chỉ thị cùng môi trường
thạch, ñổ ñĩa
– ðục lỗ, nhỏ dịch nuôi cấy ñã loại
tế bào vi khuẩn
– Nuôi cấy và quan sát vòng kháng
khuẩn
– Dùng ñể kiểm tra bản chất chất
có hoạt tính

Phương pháp nghiên cứu hoạt
tính kháng khuẩn
• Dùng dịch nuôi cấy: loại dần các nguyên nhân
kháng khuẩn và thử trên ñĩa thạch với vi sinh vật
chỉ thị
– Trung hòa pH
– Dùng catalase loại H2O2
– Dùng các enzym protease ñể kiểm tra bản
chất protein
• Nuôi vi sinh vật chỉ thị trong dịch nuôi cấy ñã loại
bỏ vi khuẩn lactic, ñếm tế bào (ño ñộ ñục, nuôi
cấy trên ñĩa thạch và ñếm khuẩn lạc,…)

10


Phương pháp nghiên cứu hoạt
tính kháng khuẩn
• Nhuộm vi sinh vật chỉ thị bằng
carboxyfluorescein diacetate
• ðo huỳnh quang bằng máy ño dòng chảy
tế bào
• Nếu có chất kháng khuẩn tạo lỗ ở màng tế
bào
các chất huỳnh quang sẽ chảy ra
ngoài
giảm sự phát huỳnh quang
• Sử dụng vi sinh vật chỉ thị có gắn gen
nhạy với ánh sáng, ño ñộ hấp thụ quang

Phương pháp thu nhận và tinh
chế bacteriocin
• Nuôi cấy vi sinh vật, thu nhận dịch nuôi cấy
chứa bacteriocin thô
– ðiều chỉnh pH ñể tăng hiệu suất thu hồi bacteriocin
thô

• Kết tủa bằng sulfat amôn, làm sạch tăng nông
ñộ
• Dùng các phương pháp sắc ký ñể làm sạch
Nisin ở dạng bột màu trắng, hoạt lực 1000IU/mg.
Bền ở nhiệt ñộ thường và trong ñiều kiện pH thấp ở
nhiệt ñộ cao. Chịu ñược 30 min ở pH=2.0 , 121 oC

và 15 min ở pH=3.0 121 oC . Ở pH cao, ñộ ổn ñịnh
của hoạt tính có thể bị ảnh hưởng

11


2. Ứng dụng bacteriocin trong bảo
quản thực phẩm - biopreservation

2.1. Cách thức bổ sung bacteriocin
2.2. Các yếu tố trong thực phẩm ảnh
hưởng ñến hoạt tính của bacteriocin
2.3. Bacteriocin và công nghệ rào cản

Bacteriocin thích hợp trong bảo
quản thực phẩm
• Hợp chất sinh ra bởi vi khuẩn lactic (GRAS)
• Không hoạt ñộng ñối với sinh vật nhân chuẩn
• Có thể bị vô hoạt bởi protease ñường ruột, ít tác
dụng lên các vsv ñường ruột
• Bền pH, nhiệt
• Phổ kháng vsv tương ñối rộng
• Cơ chế tác dụng thường trên màng tế bào
• Thường mã hóa trên plasmid, dễ thao tác về
mặt di truyền

12


Lợi ích của việc ứng dụng

bacteriocin trong bảo quản
• Kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm
• Hỗ trợ việc bảo quản nếu nhiệt ñộ bảo quản bị
thay ñổi
• Giảm nguy cơ lây nhiễm vi sinh vật gây bệnh
trong dây chuyền SX thực phẩm
• Giảm thiểu hao hụt kinh tế do sự hư hỏng thực
phẩm
• Giảm việc dùng chất bảo quản tổng hợp hóa học
• Giảm quá trình xử lý nhiệt: giữ ñược chất dinh
dưỡng, vitamin, các tính chất cảm quan của thực
phẩm

2.1. Bổ sung bacteriocin vào thực
phẩm
• Bổ sung dạng chế phẩm bacteriocin không
có vi sinh vật sản xuất (ex situ)
• Bổ sung dạng vi sinh vật sản xuất, tạo
ñiều kiện thuận lợi cho vi sinh vật này sinh
bacteriocin (in situ)

13


Bổ sung dạng chế phẩm
bacteriocin
• Nuôi cấy vi khuẩn sinh bacteriocin, tách chiết,
cô ñặc và tinh chế bacteriocin rồi bổ sung
vào thực phẩm
• Cần ñược sự cho phép của các cơ quan

chức năng (hiện nay mới có nisin, E234)
• Một số nghiên cứu ban ñầu về ứng dụng chế
phẩm bacteriocin thô hoặc sơ chế
hiệu
quả thấp do nồng ñộ bacteriocin thấp

Bổ sung dạng chế phẩm
bacteriocin
• Bổ sung dạng dịch nuôi cấy trên cơ chất thực
phẩm (food grade): sữa hoặc whey
• Chế phẩm dạng này có thể coi là phụ gia thực
phẩm: tăng nồng ñộ protein, chất làm ñặc
(thickening)
• Chứa một số chất kháng vi sinh vật (vd: axit
lactic) trong ñó có bacteriocin
• Một số chế phẩm ñã thương mại hóa: ALTA™
2341, Microgard™, lacticin 3147, variacin

14


Bổ sung dạng chế phẩm
bacteriocin
• Cố ñịnh trên giá thể (chất mang)
• Cung cấp bacteriocin dần dần, liên tục trong
thực phẩm
• Cố ñịnh bacteriocin trên các giá thể: bảo vệ
bacteriocin khỏi các tác ñộng của môi trường
thực phẩm
• Cung cấp bacteriocin tại chỗ, ñỡ tốn kém so với

việc cung cấp bacteriocin cho toàn bộ sản phẩm

Cố ñịnh bacteriocin – giá thể
• Giá thể: dùng chính tế bào vi sinh vật sản xuất
• Hạt silica gel, tinh bột
• Bao bọc bởi liposome, các loại gel hoặc bản
mỏng (films) từ nhiều loại vật liệu: Canxi alginat,
gelatin, cellulose, protein ñậu tương, zein từ
ngô,
màng
collagen,
polysaccharide,
cellophane, silicon, hoặc các màng plastic khác
• Thường bổ sung trên bề mặt thực phẩm sau
quá trình chế biến
• ðóng gói bằng bao bì có bổ sung bacteriocin

15


Bổ sung dạng chế phẩm vi sinh vật
SX bacteriocin
• Ưu ñiểm: rẻ, không bị giới hạn nhiều bởi các
quy ñịnh luật pháp
• Yêu cầu:
– Có khả năng sống sót trong môi trường thực
phẩm
– Chịu ñược các ñiều kiện của quá trinh SX thực
phẩm
– Chiụ ñược các ñiệu kiện bảo quản

– Sinh ñủ lượng bacteriocin cần thiết

Bổ sung dạng chế phẩm VSV
• ðóng vai trò chủng khởi ñộng (starter culture)
• Bổ sung cùng chủng khởi ñộng
• Chỉ ñóng vai trò bảo quản (SP không lên
men)
• Yêu cầu:
– Không gây ra ảnh hưởng không mong muốn ñến
chất lượng thực phẩm
– Không ảnh hưởng ñến chủng khởi ñộng
– Không bị chủng khởi ñộng ức chế

16


2.2. Các yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt
ñộ của bacteriocin trong thực phẩm
• Các yếu tố liên quan ñến thực phẩm
• Hệ vi sinh vật trong thực phẩm
• Vi khuẩn ñích cần tiêu diệt

Yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng sinh
bacteriocin in situ

Galvez et al. Bacteriocin-based strategies for food biopreservation. International
Journal of Food Microbiology 120 (2007) 51–70

17

Các yếu tố liên quan ñến thực
phẩm
• ðiều kiện chế biến thực phẩm
• Nhiệt ñộ bảo quản
• pH thực phẩm
• Tác dụng của enzym trong thực phẩm
• Tác dụng của các chất bảo quản, chất bổ sung trong
thực phẩm
• Thành phần thực phẩm hấp thụ bacteriocin
• ðộ hòa tan kém và phân bố không ñều trong matrix
thực phẩm
• ðộ ổn ñịnh của bacteriocin trong quá trình bảo quản
thực phẩm

Hệ vi sinh vật của thực phẩm
• Nồng ñộ các vsv
• Sự ña dạng của các loại vsv
• ðộ nhạy Bacteriocin
• Tương tác giữa các vsv trong thực phẩm

18


Vi khuẩn mục tiêu
• Nồng ñộ VSV
• ðộ nhạy ñối với bacteriocin (phụ thuộc loại
Gram, giống, loài, chủng…)
• Trạng thái, giai ñoạn sinh lý (phát triển, nghỉ,
thiếu chất dinh dưỡng hoặc còn sống nhưng

không nuôi cấy ñược (non-culturable), bị stress
hoặc tế bào bị tổn thương, bào tử…)
• Sự cản trở vật lý, hóa lý (tạo màng, chất nhầy
bao bọc,…)
• Khả năng kháng hoặc thích nghi với bacteriocin

Khả năng giảm hiệu quả của chủng
sản xuất bacteriocin in situ
• Mất khả năng sinh bacteriocin tự phát
• Sự nhạy cảm của chủng sản xuất ñối với nhiễm
bacteriophage
• Sự kháng lại vsv sản xuất do các vsv khác gây
ra
• Lượng vsv không ñủ
• Khả năng sinh bacteriocin bị giảm trong hệ thực
phẩm

19


2.3. Bacteriocin và công nghệ rào
cản
Yếu tố
kháng VSV

VSV bị tiêu diệt

Gần gây chết
sublethal

VSV có sẵn
hệ chống chịu

VSV tăng khả năng
chống chịu

• Nếu áp dụng nhiều yếu tố kháng vsv: Quá trình chống lại
các yếu tố kháng VSV sẽ khó khăn hơn, tiêu tốn nhiều
năng lượng hơn
• Áp dụng nhiều yếu tố cùng lúc có thể giảm liều lượng
từng yếu tố riêng biệt

Công nghệ rào cản

20


Bacteriocin trong công nghệ rào cản

Phối hợp bacteriocin với các chất bảo
quản hóa học và tự nhiên
•
•
•
•

Muối vô cơ
Axit hữu cơ
Chất tạo càng (chelating agents)
Các hợp chất tự nhiên khác

21


Phối hợp bacteriocin với muối vô cơ
• NaCl tăng khả năng kháng VSV của nisin,
leucocin F10, enterocin AS-48, …
• Hiệu quả do tương tác ion giữa phân tử
bacteriocin các nhóm tích ñiện ñóng vai
trò trong việc gắn bacteriocin với tế bào
ñích
• NaCl có thể thay ñổi cấu trúc bacteriocin
và thay ñổi bề mặt tế bào vi sinh vật ñích

Phối hợp bacteriocin với muối vô cơ
• Phối hợp giữa nitrit và nisin làm giảm quá
trình tạo botulin, tăng hiệu quả lên bào tử
Clostridium
• Bổ sung nitrit cũng tăng khả năng kháng
listeria của vi khuẩn sinh bacteriocin trong
thịt

22


Phối hợp bacteriocin với axit hữu cơ
• Axit hữu cơ làm tăng khả năng kháng vsv
của bacteriocin
• Ở pH thấp, ñiện tích của bacteriocin tăng
bacteriocin dễ dàng ñược vận chuyển qua

thành tế bào
• Ở pH thấp, ñộ hòa tan của bacteriocin tăng
tăng sự khuếch tán bacteriocin
• Nisin khi ñưa vào cùng lactate
năng kháng Listeria
• Nisin phối hợp với sorbate
kháng B. licheniformis

tăng khả

tăng khả năng

Phối hợp bacteriocin với các chất tạo
càng (chelating agents)
• Các chất tạo càng (chelating agent) thấm qua
màng ngoài của tế bào G- , tách các ion Ca2+
và Mg2+ , ổn ñịnh màng lipopolysaccharide,
tạo ñiều kiện cho bacteriocin tác dụng
• Tác dụng của EDTA, natri pyrophosphat
(Na2H2P2O7), natri phosphat,… làm tăng hiệu
quả ức chế vi khuẩn G- của bacteriocin ñã
ñược chứng minh

23


Phối hợp bacteriocin với các chất
bảo quản tự nhiên
• Ethanol
• Tinh dầu

• Phối hợp nhiều loại bacteriocin
• Phối hợp bacteriocin với một số peptide
kháng khuẩn khác (không có tính chất
bacteriocin): nisin và lysozyme, nisin và hệ
lactoperoxydase, nisin và lactoferrine

Bacteriocin và quá trình xử lý nhiệt
• Nisin tác dụng phối hợp với nhiệt lên L.
plantarum và L. monocytogenes
• Chủng L. monocytogenes kháng Nisin
nhạy cảm với nisin ở nhiệt ñộ 55oC hơn
chủng dại
• Xử lý nhiệt ñối với vi khuẩn sinh bào tử có
thể nhẹ hơn khi phối hợp với nisin và
enterocin AS-48

24


Bacteriocin và ñóng gói trong môi
trường khí thay ñổi
• Vi khuẩn G- nhạy cảm với CO2, vi khuẩn
G+ không nhạy cảm bằng
• Bacteriocin ít tác dụng ñối với vi khuẩn G• Phối hợp hai yếu tố
• L. monocytogenes bị tiêu diệt hoàn toàn khi
nhúng trong 10 IU/ml nisin và ñóng gói
trong 80% CO2/20% không khí trong vòng
30 ngày bảo quản ở 4oC

Bacteriocins và xung ñiện trường

(pulsed electric fields)

25