Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG NGÔ KHÁNG MỌT (Sitophilus zeamais
Motsch.) BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN

Mã số: B2014-TN06-04

Chủ nhiệm đề tài: - PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh
- TS. Nguyễn Thị Hải Yến

Thái Nguyên, tháng 2 năm 2017


ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG NGÔ KHÁNG MỌT (Sitophilus zeamais
Motsch.) BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN

Mã số: B2014-TN06-04

Xác nhận của tổ chức chủ trì
(ký, họ tên, đóng dấu)

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

- PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh
- TS. Nguyễn Thị Hải Yến

Thái Nguyên, tháng 2 năm 2017


i

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI
VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
1. Thành viên tham gia nghiên cứu đề tài và đơn vị phối hợp chính
TT

Họ và tên

Đơn vị công tác và lĩnh vực chuyên môn
Trƣờng Đại học Sƣ phạm-ĐH Thái Nguyên

1

GS.TS. Chu Hoàng Mậu

2

TS. Hoàng Thị Thu Yến

Trƣờng Đại học Khoa học- ĐH Thái Nguyên
Di truyền học

3

ThS. Vũ Thanh Sắc

Trƣờng Đại học Khoa học- ĐH Thái Nguyên
Công nghệ tế bào thực vật

4

ThS. Nguyễn Phƣơng Thảo Trƣờng Đại học Khoa học- ĐH Thái Nguyên
Công nghệ sinh học

5

CN. Lê Đức Huấn

Trƣờng Đại học Khoa học- ĐH Thái Nguyên
Di truyền học

6

NCS Vì Thị Xuân Thủy
Học viên cao học và

Trƣờng Đại học Sƣ phạm-ĐH Thái Nguyên
Trƣờng Đại học Khoa học-ĐH Thái Nguyên

Di truyền học

2. Đơn vị phối hợp chính
Tên đơn vị
trong và ngoài nƣớc
Phòng thí nghiệm Trọng
điểm Quốc gia về Công
nghệ gen, Viện Hàn lâm
Khoa học & Công nghệ
Việt Nam
Phòng công nghệ AND
ứng dụng, Viện công
nghệ sinh học, Viện
Hàn lâm Khoa học &
Công nghệ Việt Nam

Nội dung phối hợp nghiên cứu

Họ và tên ngƣời đại
diện đơn vị

- Xác định trình tự gen
PGS.TS Chu Hoàng
- Sử dụng thiết bị của Phòng thí Hà
nghiệm trọng điểm

Phối hợp nghiên cứu một số nội PGS.TS. Lê Văn Sơn

dung sau:
- Thiết kế vector chuyển gen
- Tạo dòng ngô chuyển gen mang
gen kháng mọt


ii

MỤC LỤC
Trang
Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài và đơn vị phối hợp

i

Mục lục………………………………………………………………………… ii
Danh mục bảng…………………………………………………………………
Danh mục hình………………………………………………………………….
Danh mục ký hiệu, từ và chữ viết tắt…………………………………………...
Thông tin kết quả nghiên cứu bằ ng tiếng Việt và tiếng Anh………………….
MỞ ĐẦU………………………………………………………………………

1

1. Tính cấp thiết của vấn đề nghiên cứu……………………………………….

1

2. Những đóng góp khoa học của đề tài……………………………………….

2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài …………………………………..

3

Chƣơng 1. MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN VÀ 4
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………………..
1.1. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………. 4
1.2. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu………………………………………….

4

1.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………… 4
1.2.2. Vật liệu thực vật…………………………………………………………. 4
1.2.3. Các chủng vi khu n và các loại vector…………………………………..

5

1.2.4. Thiết kế cặp mồi PCR và trình tự nucleotide của các mồi………………..

5

1.2.5. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu……………………………………………

5

1.3. Phạm vi và địa điểm nghiên cứu………………………………………….

6

1.3.1. Phạm vi nghiên cứu……………………………………………………...

6

1.3.2. Địa điểm nghiên cứu…………………………………………………….

6

1.4. Cách tiếp cận và phƣơng pháp nghiên cứu………………………………..

7

1.4.1. Cách tiếp cận nghiên cứu………………………………………………..

7

1.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ……………………………………………….. 7
1.4.2.1. Phƣơng pháp đánh giá khả năng kháng mọt…………………………..

7

1.4.2.2. Phƣơng pháp nhân bản gen, tách dòng và giải tự trình tự gen ………

8

1.4.2.3. Thiết kế vector chuyển gen thực vật ………………………………….

9

iii

1.4.2.4. Phƣơng pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khu n A. tumefaciens..

10

1.4.2.5. Phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen……………………………….

14

1.4.2.6. Đánh giá khả năng ức chế α-amylase của protein tái tổ hợp…………. 16
Chƣơng 2. NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………

17

2.1. Tổng quan tính hình nghiên cứu…………………………………………... 17
2.1.1. Giá trị của cây ngô và tác hại của mọt ngô……………………………… 17
2.1.1.1. Giá trị của cây ngô…………………………………………………….

17

2.1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái, chu kỳ sống và lây nhiễm của mọt ngô..

18

2.1.1.3. Tổn thất do mọt ngô……………………………………………………. 21
2.1.2. Proteinase và chất ức chế proteinase ……………………………………

21

2.1.3. Defensin thực vật………………………………………………………... 24
2.1.4. Nghiên cứu chuyển gen vào phôi non ngô thông qua A. tumefaciens…...

26

2.2. Nội dung nghiên cứu………………………………………………………

27

2.3. Kết quả nghiên cứu………………………………………………………..

29

2.3.1. Đánh giá khả năng kháng mọt của các mẫu giống ngô nghiên cứu……..

29

2.3.2. Phân lập gen liên quan đến khả năng kháng mọt từ cây ngô……………

32

2.3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen liên quan đến khả năng ..

39

2.3.4. Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở cây ngô thông qua
nghiên cứu chuyển gen gus vào phôi ngô giống LVN99...................................

48

2.3.5. Kết quả chuyển chuyển cấu trúc mang gen ZmDEF1 vào phôi ngô nhờ
A. tumefaciens và tạo cây ngô chuyển gen................................................................ 54
2.3.6. Phân tích cây ngô chuyển gen…………………………………………… 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................

63

1. Kết luận ..................................................................................................................

63

2. Kiến nghị................................................................................................................. 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 65
THUYẾT MINH, HỢP ĐỒNG THỰC HIỆN ĐỀ TÀI VÀ VĂN BẢN ĐIỀU
CHỈNH ĐÃ ĐƢỢC PHÊ DUYỆT………………………………………….....

72


iv

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các giống ngô sử dụng trong nghiên cứu……………………….......

4

Bảng 1.2. Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu……………….

6

Bảng 1.3. Thành phần môi trƣờng tái sinh cây ngô chuyển gen……………….

11

Bảng 2.1. Khối lƣợng hao hụt (g) của các giống ngô nghiên cứu sau các thời
gian gây nhiễm mọt…………………………………………………………….

29

Bảng 2.2. Tỷ lệ bột ngô (%) tạo ra của các giống nghiên cứu ở các thời điểm 30
nhiễm mọt………………………………………………………………………
Bảng 2.3. Tỷ lệ nhiễm mọt (%) của các giống ngô nghiên cứu sau các thời gian gây
nhiễm………………………………………………………………………………. 31
Bảng 2.4. Hệ số gia tăng quần thể mọt của các giống ngô nghiên cứu sau các
thời gian gây nhiễm…………………………………………………………….

31

Bảng 2.5. Chỉ số mẫn cảm mọt tƣơng đối (S) của các giống ngô nghiên cứu…

32

Bảng 2.6. Kết quả phân tích khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của protein
tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt cây thuốc lá chuyển gen T1......................................

46

Bảng 2.7. Ảnh hƣởng của mật độ A. tumefaciens, nồng độ AS, thời gian nhiễm
khu n đến hiệu quả chuyển gen gus....................................................................

49

Bảng 2.8. Ảnh hƣởng của tuổi phôi đến hiệu suất biểu hiện gen gus và tạo mô
sẹo của giống ngô LVN99................................................................................... 50
Bảng 2.9. Nồng độ kanamycin cho ngƣỡng chọn lọc phôi ngô LVN99 mang
gen gus ................................................................................................................ 50
Bảng 2.10. Kết quả tái sinh cây chuyển gen ZmDEF1 của giống ngô LC1 và
LVN99................................................................................................................. 56
Bảng 2.11. Kết quả phân tích khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của protein
tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt cây ngô chuyển gen T1……………………………

62


v

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình thái hạt các giống ngô nghiên cứu…………………………….. 5
Hình 1.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang gen ZmDEF1........................

9

Hình 1.3. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào phôi non của ngô………………..

13

Hình 2.1. Hình ảnh Sitophilus zeamais Motsch. ………………………………. 19
Hình 2.2. Hai lớp defensin thực vật. …………………………………………..

25

Hình 2.3. Cấu trúc của chuỗi polypeptide defensin thực vật………………….

25

Hình 2.4. Cấu trúc không gian của defensin thực vật (VrD2) ………………… 26
Hình 2.5. A: Kết quả điện di kiểm tra sản ph m RT-PCR nhân gen ZmCysII
của các mẫu giống ngô nghiên cứu. B: Kết quả điện di kiểm tra plasmid tái tổ
hợp cắt bằng BamHI …………………………………………………………...

33

Hình 2.6. Trình tự gen ZmCysII của các mẫu ngô nghiên cứu và D38130 trên
Ngân hàng Gen Quốc tế……………………………………………………….

34

Hình 2.8. Trình tự gen ZmDEF1 của các giống ngô nghiên cứu và JF797205
trên Ngân hàng gen Quốc tế……………………………………………………

37

Hình 2.9. Trình tự amino acid suy diễn của protein ZmDEF1 ở các giống 37
nghiên cứu và JF797205 trên Ngân hàng gen Quốc tế
Hình 2.10. Trình tự gen ZmDEF1 của giống ngô SL và giống ngô lai LVN99
phân lập từ DNA……………………………………………………………….

38

Hình 2.11. Sơ đồ cấu trúc của gen ZmDEF1 của ngô………………………….

38

Hình 2.12. Kết quả điện di kiểm tra sản ph m PCR nhân gen ZmCysII từ các
dòng cây thuốc lá chuyển gen…………………………………………………... 40
2.13. Hình ảnh điện di sản ph m cắt plasmid tái tổ hợp bằng Hind III (A) và
hình ảnh điện di sản ph m colony-PCR bằng cặp mồi ZmDEF1FSalI/ZmDEF1R-HindIII từ khu n lạc A. tumefaciens CV58 (B)……………

41

Hình 2.14. Sơ đồ cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1. Phaso Pro: Promoter
Phaseolin……………………………………………………………………….. 41
Hình 2.15. Kết quả tái sinh và chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây
thuốc lá C9-1…………………………………………………………………...

42


vi

Hình 2.16. Kết quả điện di sản ph m PCR xác định sự có mặt của gen
ZmDEF1 trong các cây thuốc lá chuyển gen…………………………………..

43

Hình 2.17. Kết quả điện di kiểm tra sản ph m RT-PCR nhân gen ZmDEF1
của dòng cây thuốc lá chuyển gen……………………………………………..

44

Hình 2.18. Biểu đồ biểu hiện mức độ biểu hiện của gen ZmDEF1 từ các dòng
thuốc lá chuyển gen ……………………………………………………………

45

Hình 2.19. Kết quả lai Western các cây thuốc lá chuyển gen …………………

45

Hình 2.20. Hình ảnh định tính đánh giá khả năng ức chế α-amylase mọt ngô
của protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt cây thuốc lá chuyển gen ………………

47

Hình 2.21. Sơ đồ tái sinh và chuyển gen gus vào giống ngô LVN99 thông qua
A. tumefaciens………………………………………………………………………….

52

Hình 2.22. Hình ảnh tái sinh cây ngô từ phôi ngô non và chuyển gen gus vào
giống ngô LVN99 thông qua A. tumefaciens.....................................................

54

Hình 2.23. Hình ảnh tái sinh ngô chuyển gen ZmDEF1 từ phôi ngô non giống
LVN99 vụ hè - thu năm 2016.............................................................................. 55
Hình 2.24. Kết quả điện di sản ph m PCR xác định sự có mặt của gen chuyển
ZmDEF1 trong các cây ngô chuyển gen………………………………………

58

Hình 2.25. Kết quả lai Southern các cây ngô chuyển gen ZmDEF1……………

59

Hình 2.26. Kết quả lai Western các cây ngô chuyển gen ZmDEF1 thế hệ T1… 60


vii

DANH MỤC KÝ HIỆU, TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ABA
AS
bp
cs
Ct
DAB

Abscisic Acid
Acetylseringone
base pairs

ETDA
FAO
GFP
GM
Gus gen

Threshold of Cycle
3,3'-Diaminobenzidine
tetrahydrochloride
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
Food and Agriculture Organization
Green Fluorescene Protein
Germination Medium
β-Glucuronidase gene

IPTG
LB

IsoPropylThio-β-Galactoside
Luria Bertami

MS

Murashige và Skoog, 1962

OD
PCR
rZmDEF1
RM
RT-PCR

Optical Density
Polymerase Chain Reaction
Recombinant ZmDEF1 protein
Rooting Medium
Reverse Transcription Polymerase

Chain Reaction
Transfer DNA

T-DNA

Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid
TMB
3,3’,5,5’-TetraMethyl Benzidine
T0, T1
T0
T1
X-gal
ZmDEF1
ZmCysII

Cặp bazơ nitơ
Cộng sự
Chu kỳ ngƣỡng

Tổ chức Nông - Lƣơng thế giới
Protein huỳnh quang xanh
Môi trƣờng n y mầm
Gen mã hóa enzyme
β-Glucuronidace
Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản
nuôi cấy vi khu n
Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản
nuôi cấy mô thực vật
Mật độ quang
Phản ứng chuỗi polymerase

Protein tái tổ hợp ZmDEF1
Môi trƣờng tạo rễ
Phản ứng chuỗi polymerasephiên mã ngƣợc
Đoạn DNA đƣợc chuyển vào
thực vật
Plasmid gây khối u
Các thế hệ cây chuyển gen
Cây chuyển gen tái sinh từ chồi
trong ống nghiệm
Hạt của cây chuyển gen T0 nảy
mầm thành cây T1

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalacto-pyranoside
Gen defensin1 ở ngô
Gen cystatin II ở ngô


viii

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.)
bằng kỹ thuật chuyển gen
- Mã số: B2014-TN06-04.
- Chủ nhiệm đề tài: - PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh
- TS. Nguyễn Thị Hải Yến
- Tổ chức chủ trì: Đại học Thái Nguyên
- Thời gian thực hiện: 24 tháng.
2. Mục tiêu:
Mục tiêu tổng quát

Tạo đƣợc dòng ngô chuyển gen kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) làm
nguyên liệu chọn giống.
Mục tiêu cụ thể
(1) Đánh giá đƣợc khả năng kháng mọt của các giống ngô địa phƣơng khu vực
trung du miền núi phía bắc Việt Nam;
(2) Phân lập và phân tích đƣợc đặc điểm của gen liên quan đến khả năng kháng mọt
của cây ngô;
(3) Tạo đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc gen liên quan đến khả năng kháng
mọt dƣới sự điều khiển của promoter hoạt động đặc hiệu cho nội nhũ hạt;
(4) Tạo đƣợc dòng cây ngô chuyển gen kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.).
3. Tính mới và sáng tạo:
1) Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu đã xác định đƣợc
giống ngô SL có khả năng kháng mọt ngô tốt nhất và hai giống LC1 và LVN99 có
khả năng kháng mọt ngô kém nhất.
2) Gen ZmCysII và ZmDEF1 phân lập từ các giống ngô nghiên cứu đƣợc sử dụng
thiết kế cấu trúc vector chuyển gen biểu hiện ở hạt thực vật và đƣợc biểu hiện thành
công trên cây thuốc lá, cây ngô chuyển gen.
3) Protein tái tổ hợp rZmDEF1 tách chiết từ cây thuốc lá và cây ngô chuyển gen có
khối lƣợng phân tử khoảng10 kDa đã biểu hiện chức năng ức chế hoạt động của αamylase của ấu trùng mọt ngô.
4. Kết quả nghiên cứu:
(1) Đã đánh giá 5 mẫu giống ngô, trong đó có 4 giống ngô địa phƣơng (SL, LC1,
LC2, LC3) và giống ngô lai LVN99. Giống SL có khả năng kháng mọt tốt nhất và
hai giống LVN99, LC1 có khả năng kháng mọt kém.


ix

(2) Gen ZmCysII và ZmDEF1 của các giống ngô nghiên cứu đã đƣợc tách dòng
thành công và xác định trình tự nucleotide. Gen ZmCysII (cDNA) có kích thƣớc
405bp, mã hóa 134 amino acid. Gen ZmDEF1 có hai exon có kích thƣớc 243

nucleotide, mã hóa cho 80 amino acid và một intron chứa 102 nucleotide.
(3) Hai vector chuyển gen biểu hiện ở hạt pBetaPhaso-ZmCysII và pBetaPhasoZmDEF1 đã đƣợc thiết kế thành công và tạo đƣợc dòng A.tumefaciens tái tổ hợp
chứa vector pBetaPhaso-ZmCysII và dòng A.tumefaciens tái tổ hợp chứa
pBetaPhaso-ZmDEF1. Hoạt động của các vector chuyển gen đƣợc đánh giá trên cây
thuốc lá.
(4) Đã xác định đƣợc hệ thống tái sinh từ phôi ngô non có kích thƣớc 0,9 – 1,3 mm
là tối ƣu cho chuyển gen vào ngô thông qua A.tumefaciens. Quy trình chuyển gen
gus qua phôi non ở ngô nhờ A. tumefaciens chủng C58 với mật độ thích hợp ở giá
trị OD660nm 0,8 và thời gian nhiễm khu n tối ƣu là 30 phút, AS bổ sung là 150M
và tuổi phôi từ 10-12 ngày tuổi là tối ƣu cho khả năng tiếp nhận gen và sự tái sinh.
Ngƣỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin đối với phôi chuyển gen là 50mg l.
(5) Cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 đƣợc chuyển thành công vào hai giống ngô LC1,
LVN99 và tạo đƣợc dòng cây ngô chuyển gen ở thế hệ T1, với hiệu suất chuyển gen
lần lƣợt là 1,89% và 1,19%.
(6) Đã tạo đƣợc 3 dòng cây chuyển gen ở thế hệ T1 từ giống ngô địa phƣơng LC1
(T1-C1, T1-C3, T1-C5) và 2 dòng cây chuyển gen từ giống ngô lai LVN99 (T1-L1,
T1-L3). Protein rZmDEF1 biểu hiện ức chế hoạt động của α-amylase của ấu trùng
mọt ngô với hiệu suất ức chế α-amylase cao hơn từ 54,52% đến 63,09% so với
protein của cây không chuyển gen.
5. Sản phẩm:
5.1. Sản phẩm khoa học:
Các bài báo công bố:
1. Thi Xuan Thuy VI, Hoang Duc LE, Vu Thanh Thanh NGUYEN, Van Son LE,
Hoang Mau CHU (2016), “Expression of the ZmDEF1 gene and α-amylase
inhibitory activity of recombinant defensin against maize weevils”, Turk J Biol.
(2016) 40: © TÜBİTAK; Doi:10.3906 biy-1512-64; In Press (SCI-E).
2. Vì Thị Xuân Thủy, Lò Thị Mai Thu, Hồ Mạnh Tƣờng, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ
Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2016), “Nghiên cứu đặc điểm gen defensin1 và
thiết kế cấu trúc phục vụ tạo dòng ngô chuyển gen kháng mọt”, Tạp chí Công nghệ
Sinh học,14(2), tr. 1-8.

3. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Vì Thị Xuân Thủy, Nguyễn Thị Hợp, Lê Văn Sơn,
Chu Hoàng Mậu (2015, “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện mang gen cystatin
2 liên quan đến tính kháng mọt của cây ngô”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 13(1),


x

tr. 105- 111.
4. Vì Thị Xuân Thủy, Hồ Mạnh Tƣờng, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh,
Chu Hoàng Mậu (2014), “Tách dòng gen cystatin II phân lập từ một số mẫu ngô địa
phƣơng Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 36(1), tr. 110- 117.
5. Vì Thị Xuân Thủy, Hồ Mạnh Tƣờng, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh,
Chu Hoàng Mậu (2015), “Đặc điểm phân tử của gen defensin 1 phân lập từ một số
mẫu ngô có khả năng kháng mọt khác nhau”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, 2(9), tr. 38-43.
6. Vì Thị Xuân Thuỷ, Đặng Thị Hoa, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu,
(2014), “Đặc điểm trình tự nucleotide của gen Cystatin II phân lập từ mRNA của
hai mẫu ngô địa phƣơng Sơn La và Hà Giang”, Tạp chí Khoa học và Công nghệĐHTN, 119(5), tr. 101- 106.
Các trình tự gen đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế
1. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014),“Zea mays
mRNA for Cystatin protein (Cystatin gene), cultivar Simacai”, GenBank: LN650978.
2. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014),“Zea mays
mRNA for Cystatin protein (Cystatin gene), cultivar Maison”, GenBank: LN650977.
3. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014),“Zea mays
mRNA for Cystatin protein (Cystatin gene), cultivar Luthan”, GenBank: LN650976.
4. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014),“Zea mays
mRNA for Cystatin protein (Cystatin gene), cultivar Laocai”, GenBank: LN650975.
5. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014), “Zea mays
mRNA for Defensin protein (Defensin gene), cultivar Maison”, GenBank: LN650982.
6. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014), “Zea mays

mRNA for Defensin protein (Defensin gene), cultivar Laocai, GenBank: LN650980.
7. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2015), “Zea mays
defensin gene for mRNA_DEF, cultivar LVN99”, GenBank: LN878139.
8. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014), “Zea mays
mRNA for Defensin protein (Defensin gene), cultivar Luthan”, GenBank: LN650981.
9. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014), “Zea mays
mRNA for Defensin protein (Defensin gene), cultivar Simacai”, GenBank: LN650983.
10. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2015), “Zea mays
Defensin gene, cultivar MaiSon”, GenBank: LN809934.
5.2. Sản phẩm đào tạo:
Đào tạo thạc sĩ:


xi

- Nguyễn Thị Hợp (2014), Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen cystatin
liên quan đến khả năng kháng mọt ở ngô, Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học,
Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
- Lê Đức Huấn (2015), Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào một số giống ngô ở
Việt Nam, Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại
học Thái Nguyên.
- Nguyễn Văn Tuyên (2016), Nghiên cứu chuyển và biểu hiện gen cystatin 10 phân
lập từ cây ngô ở cây thuốc lá”, Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại
học Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
Đào tạo tiến sĩ:
- Vì Thị Xuân Thủy (2016), Nghiên cứu đặc điểm và biểu hiện gen liên quan đến
tính kháng mọt phân lập từ cây ngô, Luận án tiến sĩ sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ
phạm - Đại học Thái Nguyên (Bảo vệ cơ sở 2016).
5.3. Sản phẩm ứng dụng:
- Thiết kế thành công 02 cấu trúc vector chuyển gen biểu hiện đặc trƣng ở hạt:

pBetaPhaso-ZmCysII và pBetaPhaso-ZmDEF1.
- Tạo đƣợc 02 chủng A.tumefaciens tái tổ hợp chứa cấu trúc pBetaPhaso-ZmCysII
và pBetaPhaso-ZmDEF1.
- Tạo đƣợc 05 dòng cây ngô chuyển gen ZmDEF1 ở thế hệ T1 (T1-C1, C3-T1, T1C5, L1-T1, T1-L3).
6. Phƣơng thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ích đem lại của
kết quả nghiên cứu:
- Kết quả chuyển thành công cấu trúc gen liên quan đến kháng mọt ngô vào giống
ngô LC1, LVN99 là cơ sở để sử dụng các cấu trúc vector chuyển vào các giống ngô
khác, góp phần tạo các giống ngô kháng mọt, phục vụ sự phát triển ngành sản xuất
ngô ở nƣớc ta.
- Các kết quả nghiên cứu là cơ sở phát triển nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển
gen nhằm cải thiện một số đặc tính chống chịu của cây trồng tại các phòng thí
nghiệm: Công nghệ gen, Công nghệ tế bào thực vật của Trƣờng Đại học Sƣ phạmĐH Thái Nguyên và tại các phòng thí nghiệm của Trƣờng Đại học Khoa học-ĐH
Thái Nguyên.
- Kết quả nghiên cứu và các bài báo công bố trên các tạp chí khoa học- công nghệ
đƣợc sử dụng làm tài liệu phục vụ đào tạo và nghiên cứu khoa học cho sinh viên,
học viên cao học, nghiên cứu sinh của Trƣờng Đại học Khoa học, Trƣờng Đại học
Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên và một số trƣờng đại học khác.


xii

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information:
- Project title: Research on creation of maize cultivars against weevils (Sitophilus
zeamais Motsch.) by gene transfer technique.
- Code number: B2014-TN06-04.
- Coordinator: - Assoc. Prof. Dr. Nguyen Vu Thanh Thanh
- Dr. Nguyen Thi Hai Yen
- Implementing institution: Thai Nguyen University.

- Duration: 24 months.
2. Objective(s):
Gneral objective: Creating transgenic maize lines resistant to weevils (Sitophilus
zeamais Motsch.) to do breeding materials.
Specific objectives:
(1) Evaluate is resistant to the weevils of local maize cultivars in the mountains and
midland region at the Northern of Vietnam;
(2) Isolation and analysis of the characteristics of genes related to resistance to the
maize weevils;
(3) Creating transgenic vectors carrying genes related to resistance to weevils under
the control of the promoter to expression specific to the endosperm;
(4) Creating transgenic maize lines resistant to weevils (Sitophilus zeamais
Motsch.)
3. Creativeness and innovativeness:
1) The assessment results of resistance to weevils of five maize cultivars has
identified resistance to weevils of the cultivar SL is best, two cultivars LVN99 and
LC1 are poor resistance;
2) ZmCysII gene and ZmDEF1 gene isolated from maize have been used to design
the transgenic vectors for expression in seeds and successfully expressed in
transgenic tobacco and transgenic maize;
3) rZmDEF1 recombinant protein extracted from transgenic plants with about 10
kDa molecular weight was inhibit expression of α-amylase activity of the maize
weevil larvae.
4. Research results:
(1) Resistant ability to maize weevils of the maize cultivars, including 4 local maize
cultivars (SL, LC1, LC2, LC3) and maize hybrid cultivar LVN99 have been


xiii

evaluated. The assessment results of resistance to weevils of five maize cultivars
has identified resistance to weevils of the cultivar SL is best, two cultivars LVN99
and LC1 are poor resistance;
(2) ZmCysII and ZmDEF1 genes of maize cultivars have been successfully cloned
and determined the nucleotide sequence. ZmCysII gene (cDNA) has the size of 405
nucleotides, encoding 134 amino acids. ZmDEF1 gene with two exons has the size
of 243 nucleotides, encoding 80 amino acids and contains an intron has the size of
102 nucleotides.
(3) Two transgenic vector for expression in seeds pBetaPhaso-ZmCysII and
pBetaPhaso-ZmDEF1 have successfully designed and created two A.tumefaciens
lines containing the recombinant vector pBetaPhaso-ZmCysII and pBetaPhasoZmDEF1. Active of the transgenic vectors have been evaluated in tobacco plants.
(4) Regeneration system from young corn embryo has the size of 0.9 mm to 1.3 mm
is optimal for gene transformants into maize via Agrobacterium-mediated was
proposed and optimized. A. tumefaciens bacterial density appropriate values is OD =
0.8, the time optimal infection is 30 minutes, the acetosyringone concentration is 150
μM, the age of the embryo is 10-12 days old (size 0.9- 1.3 mm) optimized for capable
of receiving gene and rebirth.The threshold for selective transgenic embryo is 50mg /
ml kanamycin antibiotic.
(5) PBetaPhaso-ZmDEF1 structure is transfered successfully into the two maize
cultivars LC1, LVN99 and transgenic maize lines in T1 generation have been created,
the transgenic efficiency is 1.89% and 1.19% respectively.
(6) In T1 generation, the three transgenic lines from LC1 local maize cultivar (T1C1, C3-T1, T1-C5) and two transgenic lines from LVN99 hybrid maize cultivar
(L1-T1, T1-L3) were been created. rZmDEF1 recombinant protein have the ability
to inhibiting α-amylase activity of the maize weevil larvae with inhibit performance
for α-amylase higher from 54.52% to 63.09% compared to protein of nontransgenic plants
5. Products:
5.1. scientific products
Journal papers
1. Thi Xuan Thuy VI, Hoang Duc LE, Vu Thanh Thanh NGUYEN, Van Son LE,
Hoang Mau CHU (2016), “Expression of the ZmDEF1

gene and α-amylase

inhibitory activity of recombinant defensin against maize weevils”, Turk J Biol.
(2016) 40: © TÜBİTAK; Doi:10.3906 biy-1512-64; In Press (SCI-E).
2. Vi Thi Xuan Thuy, Lo Thi Mai Thu, Ho Manh Tuong, Le Van Son, Nguyen Vu


xiv

Thanh Thanh, Chu Hoang Mau (2016), “Study on characteristics of defensin 1 gene
and structural design to create transgenic maize lines against maize weevils”,
Journal of Biotechnology 14(2), pp. 1-8.
3. Nguyen Vu Thanh Thanh, Vi Thi Xuan Thuy, Nguyen Thi Hop, Le Van Son,
Chu Hoang Mau (2015), “Cloning and design of expression vector carriyng cystatin
2 gene related to the maize weevil resistance”, Journal of Biotechnology, Vietnam
13(1), pp. 105- 111.
4. Vi Thi Xuan Thuy, Ho Manh Tuong, Le Van Son, Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu
Hoang Mau (2014), “Cloning of cystatin II gene isolated from some local corn
sample in Vietnam”, Journal of Biology, Vietnam 36(1), pp. 110- 117.
5. Vi Thi Xuan Thuy, Ho Manh Tuong, Le Van Son, Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu
Hoang Mau (2015), “Molecular characteristics of defensin 1 gene isolated from
some corn sample with resistant to different weevils”, Journal of Science and
Technology of Vietnam 2(9), pp. 38-43.
6. Vi Thi Xuan Thuy, Đang Thi Hoa, Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu Hoang Mau
(2014), “The characteristics of nucleotide sequences of cystatin II gene isolated
from mRNA of two local corn samples from Sonla province and Hagiang
province”, Journal of Science and Technology, Thainguyen University, VietNam
119(5), pp. 101- 106.
The gene sequences published on GenBank

1. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014),“Zea mays mRNA

for Cystatin protein (Cystatin gene), cultivar Simacai”, GenBank: LN650978.
2. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014),“Zea mays
mRNA for Cystatin protein (Cystatin gene), cultivar Maison”, GenBank: LN650977.
3. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014),“Zea mays
mRNA for Cystatin protein (Cystatin gene), cultivar Luthan”, GenBank: LN650976.
4. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014),“Zea mays
mRNA for Cystatin protein (Cystatin gene), cultivar Laocai”, GenBank: LN650975.
5. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014), “Zea mays
mRNA for Defensin protein (Defensin gene), cultivar Maison”, GenBank: LN650982.
6. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014), “Zea mays
mRNA for Defensin protein (Defensin gene), cultivar Laocai, GenBank: LN650980.
7. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2015), “Zea mays
defensin gene for mRNA_DEF, cultivar LVN99”, GenBank: LN878139.
8. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014), “Zea mays
mRNA for Defensin protein (Defensin gene), cultivar Luthan”, GenBank: LN650981.


xv

9. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2014), “Zea mays
mRNA for Defensin protein (Defensin gene), cultivar Simacai”, GenBank: LN650983.
10. Vi,T.X.T., Ho,T.M., Le,S.V., Nguyen,T.T.V. and Chu,M.H. (2015), “Zea mays
Defensin gene, cultivar MaiSon”, GenBank: LN809934.
5.2. Education
Master education
- Nguyen Thi Hop (2014), Design transgenic vector containing the cystatin gene
structure related resistance to weevils of maize plants, The Biotechnological master
thesis, Thai Nguyen University of Scienses.

- Le Duc Huan (2015), Research on gene transfer process into maize in Vietnam,
The Biotechnological master thesis, Thai Nguyen University of Scienses.
- Nguyen Van Tuyen (2016), Study on gene transfer and expression of cystatin 10
gene isolated from maize in tobacco plants, The Biotechnological master thesis,
Thai Nguyen University of Scienses.
Doctor education
- Vi Thi Xuan Thuy (2016), Study on characteristics and expression gene related to
resistant to maize weevil isolated from maize plants, The biological doctoral thesis,
Thai Nguyen University of Education.
5.3. In terms of application
- Successful design two transgenic vectors for expression in seeds, pBetaPhasoZmCysII and pBetaPhaso-ZmDEF1.
- Created two recombinant A.tumefaciens strains containing the pBetaPhasoZmCysII structure and pBetaPhaso-ZmDEF1.
- Created five genetically modified maize line in T1 generation (T1-C1, C3-T1, T1C5, L1-T1, T1-L3).
6. Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits of
research results:
- The results of successful transferred of genes related to resistant ability to weevils
into maize cultivars LC1 and LVN99 is the basis for using the transgenic vector
constructs to transferred into other corn cultivars, contribute to creating transgenic
maize cultivars have ability against weevils in our country.
- The research results are the basis of research development on application of
transgenic technology to improve resistance characteristics of the cultivars at the
laboratory, such as genetic Engineering, plant cell Biotechnology of College of
Education and the laboratory of College of Sciences- Thai Nguyen University.


xvi

- Research results and articles published in the scientific and technological journals
are also used as references in teaching and scientific research for students,
undergraduate students, graduate students from College of Education and College of

Sciences- Thai Nguyen University and some other universities.


1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của vấn đề nghiên cứu
Cây ngô (Zea mays L.) là một trong những cây ngũ cốc chính có năng suất cao
và giá trị kinh tế lớn, góp phần nuôi sống hơn 30% dân số thế giới. Ngày nay trên thế
giới cây ngô đứng thứ ba về diện tích, đứng thứ hai về sản lƣợng và đứng đầu về
năng suất. Ngô đã đƣợc dùng để sản xuất ra khoảng 650 mặt hàng khác nhau trong
các ngành công nghiệp lƣơng thực, thực ph m, dƣợc ph m và công nghiệp nhẹ.
Ngô góp phần vào việc ổn định sản lƣợng ngũ cốc trên thế giới và có vai trò quan
trọng trong kinh tế và thƣơng mại quốc tế. Nhu cầu về lƣơng thực, thức ăn chăn
nuôi và nhiên liệu trên thế giới ngày một tăng, theo tính toán, hàng năm phải sản
xuất thêm 200 triệu tấn ngô và lúa mì mới đủ nhu cầu vào năm 2017 và những năm
tiếp theo.
Sản lƣợng và chất lƣợng hạt ngô sau thu hoạch bị ảnh hƣởng nhiều bởi tác
động gây hại của mọt ngô. Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch.) là loại đa thực,
chúng có thể ăn đƣợc hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản
ph m thực vật khác, tuy nhiên, thức ăn thích hợp nhất với mọt ngô là hạt ngô. Khi
bị nhiễm mọt, sản lƣợng sau thu hoạch có thể giảm trung bình đến 20%, có những
trƣờng hợp sự phá hại của chúng lên đến 90% trong vòng sáu tháng. Ngăn chặn sự
tấn công của mọt với ngô hiện nay đang là vấn đề cấp bách để bảo đảm an ninh
lƣơng thực trên toàn thế giới. Biện pháp bảo quản ngô sau thu hoạch hiện nay phổ
biến là sấy ở nhiệt độ cao để tiêu diệt ấu trùng mọt, vần đảo, trộn bụi trơ, thuốc hóa
học hoặc sử dụng thảo mộc,… Tuy vậy, các biện pháp này tốn nhiều công sức, hiệu
quả thấp, giá thành cao. Mặt khác, biện pháp dùng chất hoá học thì gây ra nhiều mối
lo ngại về ô nhiễm môi trƣờng, độc hại tới vật nuôi và con ngƣời.

Cystatin có bản chất protein là chất ức chế cysteine proteinase, có mặt trong vi
sinh vật, động vật và thực vật. Các cystatin kìm hãm hoạt động của cysteine
proteinase bằng cách xâm nhập vào trung tâm hoạt động của enzyme và ngăn chặn
việc đi vào của cơ chất của cysteine proteinase. Defensin thực vật phân bố rộng rãi
trong giới thực vật, có cấu trúc không gian nhỏ, hình cầu với thành phần cơ bản
khoảng 45-54 amino acid giàu cysteine. Defensin là protein đa chức năng, ức chế
quá trình dịch mã, ảnh hƣởng đến chức năng của kênh màng, làm suy yếu vi sinh
vật, tăng cƣờng khả năng chống chịu kẽm, làm thay đổi trạng thái oxy hoá khử
ascorbic acid, ức chế protease và đặc biệt ức chế hoạt động α-amylase của côn


2

trùng. Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy, defensin phân lập từ đậu xanh, đậu đũa có
khả năng ức chế hoạt động α-amylase của ấu trùng mọt đậu xanh và đậu đũa. Từ
những cơ sở trên, hƣớng nghiên cứu nâng cao khả năng kháng mọt ở cây trồng thu
hạt bằng tăng cƣờng biểu hiện protein cystatin, defensin trong hạt nhằm nâng cao
hiệu quả bảo quả hạt sau thu hoạch đƣợc chúng tôi quan tâm nghiên cứu.
Trong những năm gần đây, biến đổi di truyền đã trở thành một công cụ quan
trọng trong nghiên cứu về quá trình cơ bản ở thực vật và trong cải tiến giống cây
trồng. Kỹ thuật tạo cây chuyển gen đang phát triển nhanh chóng kể từ thành công
đầu tiên trong việc đƣa gen ngoại lai vào trong thực vật nhờ A. tumefaciens. Từ đó
số lƣợng cây trồng chuyển gen đƣợc tạo ra đã tăng lên nhanh chóng. Cây chuyển
gen có những đặc điểm đặc biệt, có thể cải tiến về giá trị về dinh dƣỡng, tăng sản
lƣợng, tăng khả năng chống chịu và nhiều đặc tính ƣu việt khác. Việc ứng dụng kỹ
thuật chuyển gen để tạo ra các giống ngô có khả năng kháng mọt cao là vấn đề thực
tiễn đƣợc đặt ra trong bảo quản ngô hạt sau thu hoạch.
Xuất phất từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt
(Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen” đƣợc thực hiện nhằm xây
dựng cơ sở khoa học của việc ứng dụng công nghệ gen để nâng cao hiệu quả bảo

quản ngô hạt sau thu hoạch.
2. Những đóng góp khoa học của đề tài
Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống, từ đánh giá khả năng kháng mọt
của các mẫu giống ngô đến sự phân lập, tách dòng, giải trình tự gen, thiết kế vector
chuyển gen và phân tích biểu hiện gen liên quả đến khả năng kháng mọt ở ngô.
Cụ thể là:
1) Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu đã xác định đƣợc
giống ngô SL có khả năng kháng mọt ngô tốt nhất và hai giống LC1 và LVN99 có
khả năng kháng mọt ngô kém.
2) Gen ZmCysII và ZmDEF1 phân lập từ các giống ngô nghiên cứu đã đƣợc phân
tích đặc điểm phân tử và sử dụng cho thiết kế cấu trúc vector chuyển gen biểu hiện
ở hạt thực vật và đƣợc biểu hiện thành công trên cây thuốc lá, cây ngô chuyển gen.
3) Protein tái tổ hợp rZmDEF1 tách chiết từ cây thuốc lá và cây ngô chuyển gen có
khối lƣợng phân tử khoảng10 kDa đã biểu hiện chức năng ức chế hoạt động của αamylase của ấu trùng mọt ngô.


3

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu đạt đƣợc của đề tài có giá trị khoa học và thực tiễn trong
tiếp cận nghiên cứu tăng cƣờng khả năng kháng mọt ở ngô bằng kỹ thuật chuyển
gen.
Về mặt khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của
hai gen cystatin, ZmDEF1 phân lập từ các giống ngô địa phƣơng và giống ngô lai
LVN99, góp phần xác định đƣợc cấu trúc gen cystatin, ZmDEF1 ở ngô thông qua so
sánh trình tự nucleotide phân lập từ cDNA và DNA.
Phát triển thành công cấu trúc vector mang gen chuyển và sự biểu hiện chức
năng ức chế hoạt động của α-amylase từ ấu trùng mọt ngô của protein rZmDEF1 ở
cây chuyển gen là cơ sở khoa học cho ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để nâng cao

khả năng kháng mọt ngô của cây ngô.
Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học-công nghệ quốc tế và trong
nƣớc cùng với các trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen là những tƣ liệu có giá
trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy.
Về mặt thực tiễn
Các dòng cây thuốc lá, cây ngô chuyển gen có khả năng ức chế hoạt động
của α-amylase ấu trùng mọt ngô đã góp phần giải quyết cơ sở lý luận của vấn đề
nâng cao khả năng kháng mọt bằng tăng cƣờng biểu hiện gen bằng phƣơng pháp
chuyển gen. Kết quả này là cơ sở khoa học vững chắc cho hƣớng nghiên cứu ứng
dụng kỹ thuật chuyển gen trong nâng cao khả năng kháng mọt của ngô, mở ra triển
vọng ứng dụng mới trong thực tiễn tạo giống ngô kháng mọt cao.


4

Chƣơng 1. MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN VÀ

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu tổng quát
Tạo đƣợc các dòng ngô chuyển gen kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.)
làm nguyên liệu cho chọn giống.
Mục tiêu cụ thể
(1) Sƣu tập và đánh giá đƣợc khả năng kháng mọt của các giống ngô địa phƣơng
khu vực trung du miền núi phía bắc Việt Nam;
(2) Phân lập và phân tích đƣợc đặc điểm của gen liên quan đến khả năng kháng mọt
của cây ngô;
(3) Tạo đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc gen liên quan đến khả năng kháng
mọt dƣới sự điều khiển của promoter hoạt động đặc hiệu cho nội nhũ hạt;

(4) Tạo đƣợc dòng cây ngô chuyển gen kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.).
1.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
1.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Nghiên cứu gen mã hóa liên quan đến khả năng kháng mọt ở cây ngô;
- Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khu n Agrobacterium và tạo cây ngô
chuyển gen kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.).
1.2.2. Vật liệu thực vật
Sử dụng 4 giống ngô địa phƣơng và giống ngô lai LVN99 do Trung tâm giống
cây trồng Lào Cai, Sơn La cung cấp (Bảng 1.1 và Hình 1.1)
Bảng 1.1. Các giống ngô sử dụng trong nghiên cứu
STT
1
2
3
4
5

Tên giống
Giống ngô địa phƣơng Mai Sơn
Giống ngô địa phƣơng Lào Cai
Giống ngô địa phƣơng Si Ma Cai
Giống ngô địa phƣơng Lử Th n
Giống ngô lai LVN99

Ký hiệu
SL
LC1
LC2
LC3
LVN99

Khối lƣợng
1000 hạt (g)
220,82±0,63
220,38±0,84
340,38±0,68
350,02±0,78
290,92±1,16

Màu sắc
hạt
Tím
Trắng
Trắng vàng
Vàng đỏ
Đỏ


5

Hình 1.2. Hình thái hạt các giống ngô nghiên cứu
Giống thuốc lá Nicotinana tabacum C9-1 do Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá
Việt Nam cung cấp.
1.2.3. Các chủng vi khuẩn và các loại vector
Các chủng vi khu n và các loại vector sử dụng trong nghiên cứu đƣợc cung
cấp từ Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam
gồm: Escherichia coli DH5α, A. tumefaciens CV58; vector pBT tách dòng gen,
PDON201- SLHEP- HA, pBetaPhaso-dest đƣợc sử dụng trong quá trình nhân dòng,
thiết kế vector chuyển gen và chuyển vào thực vật.
1.2.4. Thiết kế cặp mồi PCR và trình tự nucleotide của các mồi

Dựa trên những thông tin của Abe (1991) [8] về trình tự gen cystatin II
(ZmCysII) của ngô đã công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế có mã số D38130, cặp
mồi đặc hiệu ZmCysF ZmCysR đã đƣợc thiết kế (Bảng 1.2) để khuếch đại gen
ZmCysII. Dựa vào các thông tin về trình tự nucleotide của gen defensin 1
(ZmDEF1) mang mã số JF797205 trên Ngân hàng gen quốc tế, đã thiết kế cặp mồi
ZmDEF1F-SalI /ZmDEF1R-HindIII để khuếch đại gen ZmDEF1 (Bảng 1.2).
1.2.5. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu
Các loại Kít thao tác phân tử từ các hãng Fermentas, Bio-Neer nhƣ: kít Trizol
Reagents - tách chiết RNA tổng số; kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis tổng hợp cDNA; kít GeneJET PCR Purification - tinh sạch sản ph m PCR; kít
Plasmid Extraction - tách chiết plasmid từ vi khu n.


6

Bảng 1.2. Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu
Ký hiệu
ZmCysF /

Trình tự nucleotide (5’ - 3’)

Sản phẩm Sử dụng
(bp)

ZmCysR

5’ CACCATGCCCAACAAACA TCGAATCG 3’ 405 (cDNA) RT-PCR
5’ TTAGGCGCTA GCACCCTCTTCA 3’.

ZmDEF1F-SalI /

ACGC/GTCGACATGGCGCCGTCTCGACGCA

ZmDEF1R-HindIII

CCCA/AGCTTGCAGATCTTCTTGCAGAAGCAC

nptII-F/ nptII-R

5’- GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3’
5’- ATCGGGAGCGGCGATACCGTA -3’

qDEF1-F /

TCCTCGTCCTCCTGCTC

qDEF-R

GAAGTTCTCGGTCTGGCA

qAct-F /qAct-R

GATCTTGCTGGTCGTGATCTT
GTCTCCAACTCTTGCTCATAGTC

243 (cDNA) PCR và
RT345 (DNA)
PCR
600 (DNA) PCR
148
152

Real
time
RT PCR

Các loại enzyme sử dụng của hãng Fermentas: BamHI, NotI, NcoI, HindIII,
T4 ligase,... Các hoá chất: bacto pepton, yeast extract, agarose, sucrose, glucose,
trypton, X-gal, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2; các
loại kháng sinh kanamycin, rifamycine, cefotaxime, carbenicillin,... của các hãng
Fermentas, Invitrogen, Sigma, Amersham và một số hãng khác.
Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300
(Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy Voltex
(Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, máy xung điện Plulser, máy xác định hàm
lƣợng nucleic acid NanoDrop, cùng với các thiết bị hiện đại khác.
1.3. PHẠM VI VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
1.3.1. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập hai gen cystatin và defensin1 liên quan đến khả năng kháng
mọt ở cây ngô;
- Thiết kế vector mang gen kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.);
- Nghiên cứu hệ thống tái sinh và chuyển gen ở cây ngô;
- Phân tích đánh giá cây ngô chuyển gen .
1.3.2. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm phân lập gen đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học,
Khoa Khoa học Sƣ sống, Trƣờng Đại học Khoa học và tại Phòng thí nghiệm Công
nghệ gen, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên.


7

Thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen và phân tích cây chuyển gen đƣợc

tiến hành tại phòng Công nghệ ADN ứng dụng, phòng Công nghệ Tế bào thực vật
và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các thí nghiệm chuyển gen đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực
vật, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên.
1.4. CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.4.1. Cách tiếp cận nghiên cứu
Tạo dòng ngô kháng mọt đƣợc tiến hành theo các cách tiếp cận nghiên cứu
ứng dụng kỹ thuật chuyển gen theo hƣớng tăng cƣờng biểu hiện protein có khả năng
ức chế sự tiêu hóa của ấu trùng mọt, cụ thể là:
- Thông qua thu thập, đánh giá khả năng kháng mọt của một số giống ngô ở Việt
Nam, lƣu giữ mẫu. Nhân gen, tách dòng và xác định trình tự gen liên quan đến khả
năng kháng mọt của một số giống ngô có khả năng kháng mọt cao. Sử dụng các
trình tự gen phân lập từ các giống ngô để thiết kế vector chuyển gen, đánh giá hoạt
động của vector trên cây mô hình và chuyển gen vào cây ngô.
- Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển, phân tích biểu hiện của gen chuyển. Tạo dòng
ngô chuyển gen kháng mọt.
1.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
1.4.2.1. Phương pháp đánh giá khả năng kháng mọt
Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu thep phƣơng
pháp của Gwinner và cs [32]. Hạt các giống ngô nghiên cứu, loại bỏ các hạt sâu,
bệnh, đƣợc sấy khô đến khi đo độ m trên máy đạt 13%. Chia hạt ngô thành lô thí
nghiệm và lô đối chứng. Lô thí nghiệm, cân 50g hạt ngô và thả 15 cặp mọt ngô vào
bình có nắp, còn lô đối chứng thì không thả mọt. Các chỉ tiêu đánh giá tại các thời
điểm 15 ngày, 30 ngày, 45 ngày và 60 ngày gây nhiễm mọt nhân tạo. Thí nghiệm
đƣợc lặp lại 3 lần. Đánh giá khả năng kháng mọt của các mẫu ngô bằng cách xác
định các chỉ tiêu sau:
Khối lƣợng ngô hao hụt ở lô thí nghiệm đƣợc tính theo công thức:
P = X- Pt – P0 (g) trong đó:
P: Khối lƣợng hạt ngô hao hụt ở công thức thí nghiệm (g)
Pt: Khối lƣợng hạt ngô sau thời gian thí nghiệm (g)

P0: Khối lƣợng hạt ngô hao hụt ở công thức đối chứng (g)
X: Khối lƣợng hạt ngô trƣớc khi thí nghiệm (g).