Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào (Jatropha curcas L.) và ứng dụng trong vi nhân giống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỖ ĐĂNG GIÁP

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ NUÔI CẤY
LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.)
VÀ ỨNG DỤNG TRONG VI NHÂN GIỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2016


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Vi c ng d ng c ng ngh sinh học
nhi n li u hó thạch

sản xuất nhi n li u sinh học th y th nguồn

ng ngày càng cạn ki t như hi n n y là một vấn ề áng qu n

tâm. Theo các tài li u nghi n c u và thực t sử d ng ở nhiều nước tr n th giới, nhi n
li u sinh học chủ y u gồm: eth nol sinh học và diesel sinh học. Eth nol sinh học có th
sản xuất từ nhiều nguồn nguy n li u khác nh u như sắn, mí , ng , ậu tương, mỡ cá,

còn diesel sinh học có th sản xuất từ các cây cọc rào, cọ dầu, hoàng li n mộc, văn
quan, bánh dầu, dừa.
Vi t N m, vi c sản xuất eth nol có nh ng hạn ch nhất

nh. Di n tích ất n ng

nghi p hạn hẹp n n khả năng mở rộng di n tích trồng cây nguy n li u có nhiều khó
khăn, các cây nguy n li u cho sản xuất eth nol sinh học ều là nh ng cây lương thực
chủ y u, cây làm th c ăn chăn nu i có li n qu n

n n ninh lương thực cần phải xem

xét c n trọng. Hơn n , sự phát tri n mạnh củ vi c trồng cây sắn tr n ất dốc s gây r
xói mòn ất (bồi lấp cử s ng, lòng hồ ập...). Cho n n, vi c

nh hướng phát tri n

diesel sinh học s có nhiều thuận lợi hơn. Trong số nh ng loài cây có khả năng sản xuất
diesel sinh học thì cây cọc rào ược chú ý hơn cả do dễ trồng, bi n ộ sinh thái rộng,
khả năng chống ch u tốt và hàm lượng dầu trong hạt khá c o.
Chương trình phát tri n nhi n li u sinh học nói chung và cây cọc rào nói ri ng
nhận ược sự ủng hộ mạnh m củ Nhà nước. Ngày 20 tháng 11 năm 2007, Thủ
Tướng Chính Phủ

r quy t

phát tri n nhi n li u sinh học

nh số 177/2007/QĐ ˗ TTg về vi c ph duy t “Đề án
n năm 2015, tầm nhìn

n năm 2025”. Ngày 19 tháng

6 năm 2008, Bộ N ng nghi p và Phát tri n N ng th n

r

quy t

nh số

1842/QĐ˗BNN˗LN về vi c ph duy t ề án “Nghi n c u, phát tri n và sử d ng sản
ph m cây cọc rào (Jatropha curcas L.) ở Vi t N m gi i oạn 2008 ˗ 2015 và tầm nhìn
n 2025”.
Hi n n y, cây giống cọc rào ược dùng

phát tri n vùng nguy n li u chủ y u

ược gieo từ hạt và cành giâm. M i phương th c sản xuất giống ều có ưu và nhược
i m nhất

nh. Cây giống ược gieo từ hạt có giá thành thấp nhưng b phân ly do cọc

rào là cây th phấn chéo nên khó ki m soát ược năng suất. Cây giống ược sản xuất


2

từ cành giâm cũng kh ng ảm bảo tính ồng nhất về mặt di truyền. Vì vậy, xu hướng
gần ây, các nhà kho học nghi n c u nhân giống theo quy trình kỹ thuật cơ bản như

s u: (1) Nhân giống in vitro một số cây ầu dòng tốt

ược tuy n chọn. Nguy n li u

nu i cấy b n ầu có th là ỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi nách; (2) Trồng nh ng
cây cấy m r

ồng ruộng; (3) Chọn lọc lại và nhân giống bằng kỹ thuật nu i cấy ph i

som từ nh ng cây nu i cấy m nói tr n

tăng h số nhân giống và làm hạ giá thành

cây giống.
Phương pháp nu i cấy lớp mỏng t bào là một phương pháp mới, nghi n c u về
khả năng bi t hó củ t bào. H thống t bào lớp mỏng với ặc tính mỏng có nhiều ưu
i m qu n trọng

tái thi t lập chương trình cho vi c tạo ph i som . Sự thuận lợi củ

phương pháp nghi n c u lớp mỏng t bào là: tần số phát sinh cơ qu n c o, th i gi n
cho k t quả ngắn. N u chọn ược m i trư ng dinh dưỡng và nồng ộ chất iều hò
sinh trưởng thích hợp thì hầu như 100% mẫu cấy có phản ng. Phương pháp nu i cấy
lớp mỏng t bào cũng là một phương pháp mới, nghi n c u về khả năng bi t hó củ
t bào.
Chỉ th phân tử ược phát tri n và ng d ng từ ầu thập ni n 90 củ th kỷ XX.
Sự phát tri n và ng d ng củ chỉ th phân tử

xác

nh và sử d ng nh ng bi n ổi

củ DNA là một bước phát tri n qu n trọng nhất trong lĩnh vực di truyền chọn giống
thực vật. Cho

n n y, nhiều loại chỉ th phân tử ược phát tri n và ư vào sử d ng.

M i loại chỉ th

ều có nguy n lý, kỹ thuật, phạm vi ng d ng khác nh u và phù hợp

cho từng m c ích nghi n c u khác nh u. Trong số các chỉ th phân tử, RAPD ược
xem là kỹ thuật tương ối ơn giản và r tiền, ược ng d ng trong nghi n c u về tính
ổn

nh di truyền củ cây giống nu i cấy m . Trong phạm vi nghi n c u củ luận án,

kỹ thuật RAPD ược sử d ng

ánh giá ki m tr tính ổn

nh di truyền củ cây con

cọc rào từ quy trình vi nhân giống.
Từ nh ng vấn ề

n u tr n, luận án: “Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ

nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào (Jatropha curcas L.) và ứng dụng trong vi
nhân giống” ược thực hi n nhằm ư r một phương pháp mới

quả số lượng lớn cây cọc rào chất lượng c o, ổn
dòng.

vi nhân giống hi u

nh về mặt di truyền so với cây ầu


3

2. Mục tiêu
-

Nghi n c u sự phát sinh ph i som từ nu i cấy lớp mỏng t bào lá cây cọc rào.

-

Xây dựng ược quy trình vi nhân giống hi u quả từ nu i cấy ph i som .

-

Đánh giá m c ộ ổn
ph i som

nh di truyền ở cây cọc rào vi nhân giống tạo thành bởi

ược cảm ng từ m sẹo nu i cấy bằng kỹ thuật lớp mỏng t bào lá

làm cơ sở cho vi c sản xuất cây giống in vitro.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Luận án nghi n c u tr n ối tượng cây cọc rào giống Ấn Độ. Giống này

ược

nhập nội và khảo nghi m từ ề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn giống và công nghệ trồng
cây dầu mè Jatropha curcas L. để sản xuất diesel sinh học góp phần giảm thiểu ô
nhiễm môi trường thành phố”

ược thực hi n do B n quản lý Khu N ng nghi p

C ng ngh c o thành phố Hồ Chí Minh chủ trì từ năm 2007 - 2010. Lá củ nh ng cây
cọc rào trưởng thành ược thu nhận và sử d ng làm vật li u trong nghi n c u.
Phạm vi nghi n c u:
+ Sử d ng nh ng phương pháp nu i cấy m t bào thực vật trong xây dựng quy
trình vi nhân giống cây cọc rào từ ph i som ,
+ Sử d ng nh ng c ng c hi n ại trong ánh giá m c ộ ổn

nh di truyền ở cây

giống từ ph i som ,
+ Sử d ng nh ng phương pháp giải phẫu m t bào thực vật và qu n sát hình thái
trong nghi n c u phát sinh hình thái.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
a. Ý nghĩa khoa học:
-

Đây là một hướng nghi n c u mới trong nu i cấy in vitro tại Vi t N m tr n ối
tượng cây cọc rào.

-

Đề tài óng góp một số k t quả nghi n c u về phát sinh hình thái, di truyền chọn
giống cũng như vi nhân giống cây thân g .

b. Ý nghĩa thực tiễn:
-

Từ quy trình vi nhân giống củ luận án có th sản xuất cây giống cọc rào ổn

nh

về mặt di truyền, có năng suất và hàm lượng dầu c o áp ng nhu cầu củ x hội.
-

Một số cá nhân, cơ qu n có nhu cầu nghi n c u có th sử d ng th m khảo quy
trình c ng ngh vi nhân giống cây cọc rào từ k t quả củ luận án.


4

-

Một số cơ qu n nghi n c u, do nh nghi p cần ược chuy n gi o quy trình c ng
ngh vi nhân giống cây cọc rào từ k t quả củ luận án.

5. Những đóng góp mới của luận án
Luận án

xây dựng ược quy trình vi nhân giống từ ph i som cây cọc rào

th ng qu kỹ thuật nu i cấy lớp mỏng t bào lá. Quy trình ảm bảo các m c ti u có
hi u suất nhân giống c o, ổn

nh di truyền, chất lượng tốt. Đây là quy trình ược xây

dựng ầu ti n ở Vi t N m và có một vài i m cải ti n so với nh ng k t quả nghi n c u
tr n th giới.
Trong luận án này, các chất iều hò sinh trưởng thực vật ngoại sinh ược th y
th bằng một số cid mine và poly mine trong một số gi i oạn củ quá trình phát
sinh ph i som tr n cây cọc rào. Đây có th

ược xem là tính mới củ luận án so với

nh ng k t quả nghi n c u trước ây.
K t quả củ luận án là tiền ề trong nh ng nghi n c u chuy n gen m c ti u vào
cây cọc rào.


5

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ
CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
1.1. Tổng quan về cây cọc rào
1.1.1. Vị trí phân loại
Giới (regnum)

:

Plantae

Ngành (divisio)

:

Embryophyt (thực vật có ph i)

Lớp (class)

:

Sperm topsid (thực vật có hạt)

Bộ (ordo)

:

M lpighi les (bộ sơ ri)

Họ (f mili )

:

Euphorbiaceae (thầu dầu)

Chi (genus)

:

Jatropha (dầu mè, cọc rào)

Loài (species)

:

Jatropha curcas Linn

T n ti ng Anh

:

Physic nut

T n ti ng Vi t

:

Dầu mè, cọc rào, dầu l i …[6]

Tên Jatropha có nguồn gốc từ ti ng Hy Lạp, ghép từ hai ch Jatros (bác sĩ) và
Trophe (th c ăn) ám chỉ công d ng làm thuốc củ cây này. Curc s là t n thư ng gọi
của cây cọc rào ở Malabar, Ấn Độ. Tên thông d ng ở các nước hi n nay là Jatropha.
Vi t Nam, tùy theo từng

phương, cây này cũng có nh ng tên gọi khác nh u như:

Cọc giậu, ậu cọc rào, cọc rào, cây li, dầu mè (Võ Văn Chi, 1999; Nguyễn C ng Tạn,
2008) [6], [13].
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Cọc rào (Jatropha curcas L.) có l ch sử hơn 70 tri u năm, nguồn gốc từ Mexico
(nơi duy nhất có hóa thạch của cây này) và Trung Mỹ, ược ngư i Bồ Đào Nh

ư

n ảo Cape Verde, rồi lan truyền s ng Châu Phi, Châu Á, s u ó ược trồng ở nhiều
nước và dần trở thành cây bản

a ở hầu khắp các nước nhi t ới, cận nhi t ới trên

toàn th giới. Hi n nay, cây cọc rào ược trồng ở nhiều nước như: Ấn Độ, Indonesia,
Philippine, Trung Quốc, Vi t Nam, một số ảo ở Thái Bình Dương và Úc nhằm ph c
v nhu cầu năng lượng tại ch và xuất kh u (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008)
[111], [13].


6

Vi t Nam, cây cọc rào
n y

có mặt từ rất sớm (từ trước th kỷ XIV) và cho

ược trồng rải rác ở nhiều

n

phương: Đ c Trọng, Bắc Ninh, Lạng Sơn, Ninh

Thuận, Bình Thuận, Th nh Hó , Lào C i, Đồng Nai và Thành phố Hồ Chí Minh
(Nguyễn C ng Tạn, 2008) [13].
1.1.3. Đặc điểm sinh học

1.1.3.1. Đặc điểm hình thái
Cọc rào là cây b i g mềm, vỏ xám nhẵn. Cây thư ng cao khoảng 3 ˗ 5 m với tán
cây rộng, vòng

i tr n 50 năm. Trong iều ki n chăm sóc tốt, cây có th cao từ 8 ˗ 10

m và có th sống lâu hơn. Cành non mập và mọng nước, nhựa cây có màu trắng s a
hay màu vàng nhạt. Cây rậm lá, lá to bản có màu xanh hoặc xanh nhạt, hình ovan hoặc
hình trái tim, có lá ch 3

n 5 thùy. Lá sắp x p xen k nhau, 3 ˗ 5 lá ối x ng nhau

xoắn ốc quanh tr c (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].
Hoa cọc rào mọc thành c m ở ngọn h y nách lá, cây thư ng ra hoa vào mùa hè
khoảng tháng 4 ˗ 9 hàng năm. Ho có kích thước nhỏ, màu vàng và có mùi thơm. Ho
ực mọc ở ầu các nhánh với cuống ngắn có khuỷu, hoa cái mọc ở gi a nh ng nhánh
với nh ng cuống không khuỷu, ho lưỡng tính
ực thư ng nhiều hơn ho cái. Ho

ực có 10 nh

nh ở vòng trong dính vào phần chân

i khi cũng xuất hi n. Số lượng hoa
ược chia thành 2 vòng riêng bi t: 5

, 5 nh ở vòng ngoài k t lại thành bó. Hoa cái

thư ng r i rạc với bầu nh y hình elip có 3 noãn với ầu núm nh y ch

i (Lele,

2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].
Quả mọc thành chùm và có dạng n ng, kích thước (2,5 ˗ 4,0) cm. Quả chia thành
3 ngăn có ch a hạt. Hạt chín có màu en, thu n dài, kích thước (2 × 1) cm, khối lượng
khoảng 5,8 g (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].
1.1.3.2. Đặc điểm sinh thái
Cọc rào là loài cây có khả năng thích nghi c o. Khi gặp hạn hán, cây thích ng
bằng cách r ng hầu h t lá

làm giảm sự thoát hơi nước. Cây có th trồng trên mọi

loại ất. Cây cũng có khả năng ch u ược sương mù nhẹ nhưng chỉ trong th i gian
ngắn. Cây càng già khả năng ch u ựng càng tốt. Tr i lạnh cũng làm cây r ng lá. Nhi t
ộ thích hợp cho cây là 18,0 ˗ 28,5°C. Điều ki n
Th i gian ra quả trong vòng 6 tháng

hạt nảy mầm là khí hậu nóng m.

n 1 năm và có th kh i thác trong khoảng th i

gian ít nhất 40 năm (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].


7

Nhu cầu nước của cây cọc rào rất thấp. Cây có th tồn tại ược với lượng mư
trung bình năm từ 250

n 350 mm. Vào nh ng tháng mù

ng, cây cọc rào r ng lá

hình thành lớp che phủ b n dưới gốc cây giúp cây hạn ch sự thoát hơi nước (Lele,
2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

Hình 1.1. Hình thái cây cọc rào
a1: Cây cọc rào; b2: lá, c3: hoa, d4: quả, e5: mặt cắt hạt, f6: hạt
Nguồn: 1. />2. />3. />4. />5. />6. />

8

1.1.4. Giá trị sử dụng
1.1.4.1. Trong điều trị bệnh
Trong thành phần cây cọc rào, ngư i t

phân tích ược nh ng hợp chất chủ

y u như terpen, fl von, coum rin, lipid, sterol, lk loid. Nhiều bộ phận củ cây này có
th ch

b nh như lá, vỏ cây, hạt và rễ. Rễ tr ti u vi m, cầm máu, tr ng ; dầu củ

hạt có tác d ng nhuận tràng; d ch nhự trắng ti t r từ v t thương củ cành có th dùng
ch

b nh phong thấp,

cơm; nước chi t từ lá có ch

u răng, làm lành v t thương, ch

tr b nh trĩ và m n

phytotoxin (curcin), chất này cũng có trong hạt cọc rào,

n u ược nghi n c u sâu hơn rất có th cung cấp cho chúng t một loại dược li u mới.
1.1.4.1. Cọc rào và nhiên liệu sinh học
Ngoài các tác d ng tr b nh k tr n, cây cọc rào ược sự chú ý ặc bi t bởi nó là
nguồn nguy n li u

sản xuất nhi n li u sinh học. Hạt củ cây có ộ m (6,62%),

protein (18,2%), chất béo (38%), c rbohydr te (17,3%), sợi (15,5%) và tro (4,5%).
Dầu chi m 35 ˗ 40% hạt và 50 ˗ 60% nhân hạt. Trong dầu ch

21% các cid béo

kh ng b o hò . Hạt ược x y và ép lấy dầu hoặc dầu ược tách bằng các dung môi.
Dầu s u khi lọc ược sử d ng ng y như là nguồn nguy n li u sinh học ở dạng bổ sung,
dầu cọc rào có th trộn với dầu thư ng với tỷ l l n
lượng mới, n toàn, chi phí thấp, tái sinh ược, h

n 20%. Đây là nguồn năng

hẹn s là nguồn năng lượng th y

th cho thủy i n, dầu diesel, dầu lử , khí hó lỏng (LPG), th n, củi. Nguồn năng
lượng này s giúp các nước cắt giảm một khoản tiền cho năng lượng và phần nào xó
i sự mất cân bằng về sử d ng năng lượng gi

các vùng. Ưu i m là khói từ dầu cọc

rào không có mùi và kh ng c y như khói dầu hỏ và kh ng

lại mùi cho th c ăn s u

khi nấu (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].
1.1.4.3. Bảo vệ môi trường
Cọc rào là cây lâu năm, tuổi thọ củ cây là 50 năm phủ ất rất tốt, sinh trưởng
phát tri n ược ở hầu h t các loại ất xấu, nghèo dinh dưỡng, ất dốc, ất trơ sỏi á.
Vì vậy, cọc rào ược trồng tr n các vùng ất dốc s

ược coi là cây “lấp ầy” l hổng

sinh thái ở các vùng sinh thái xung y u miền núi, sớm tạo r thảm thực vật bề mặt dày
ặc chống xói mòn, chống cháy, nâng c o ộ phì nhi u củ

ất. Kh ng nh ng vậy, cây

còn có th trồng ở nh ng vùng ất s mạc hó , b i thải kh i thác khoáng sản, góp phần


9

ph c hồi h sinh thái các vùng này, tạo r hi u ng to lớn về bảo v m i trư ng (Lele,
2006) [111].
Cọc rào hấp th nhiều CO2 trong kh ng khí. Theo tính toán sơ bộ, một cây có
khả năng hấp th 100 g CO2/ngày trong kh ng khí, tính r m i cây có khả năng hấp
th 30 kg CO2/năm, m i h có th hấp th 48 tấn CO2/năm, góp phần giảm thi u khí

thải gây hi u ng nhà kính (Lele, 2006) [111].
1.1.4.4. Phân bón và thức ăn gia súc
S u khi ép dầu, b kh dầu có hàm lượng N 4,14 ˗ 4,78%; P2O5 0,50 ˗ 0,66%;
CaO 0,60 ˗ 0,65%; MgO 0,17 ˗ 0,21% ược sử d ng làm phân h u cơ rất tốt

bón

cho các loại cây trồng, nhất là cho vùng sản xuất n ng nghi p h u cơ, n ng nghi p
sạch, vừ góp phần sản xuất sản ph m sạch, vừ nâng c o ộ phì nhi u củ

ất

(Nguyễn C ng Tạn, 2008) [13].
1.1.5. Nhân giống cây cọc rào
Nh ng nghi n c u về nhân giống cây cọc rào tr n th giới và ở Vi t N m còn rất
hạn ch . Cho

n n y, phương pháp nhân giống cây cọc rào chủ y u vẫn theo phương

pháp chuyền thống là giâm cành và gieo hạt. Các phương pháp nhân giống hi n ại áp
d ng tr n cây cọc rào chỉ mới phát tri n trong khoảng hơn 10 năm trở lại ây.
1.1.5.1. Phương pháp nhân giống truyền thống
N m Phi, ngư i dân trồng cây cọc rào làm rào dậu hoặc trồng cây
xói mòn và bảo v

chống

ất. Họ thư ng sử d ng phương pháp giâm cành vì ưu i m củ

phương pháp này là nh nh chóng tạo ược cây trưởng thành. Cành ược cắt từ các cây

cọc rào
h i

trưởng thành cắm xuống ất, n u ược chăm sóc c n thận thì s u khoảng

n b tháng là có ược cây ủ lớn

em trồng. Cây tạo r từ phương pháp giâm

cành s u khoảng 1 năm s bắt ầu cho quả.
Trồng cây

kh i thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống bằng gieo hạt

ược sử d ng nhiều hơn. Bởi nh ng nghi n c u
giống bằng giâm cành có

chỉ r rằng, cây tạo thành từ nhân

i sống ngắn hơn, khả năng chống hạn và b nh tật kém hơn

cây ược nhân giống bằng hạt. Rễ củ cây giâm cành phát tri n y u, dễ b g y ổ
(Heller, 1996) [85]. Hạt trước khi em gieo ược lự chọn là nh ng hạt to, chắc, m y.
Hạt ược ngâm nước qu

m

làm tăng tỷ l nảy mầm. S u ó, hạt ược gieo vào

trong các bầu ất. Hạt s nảy mầm s u khoảng 1 tuần và cây con có th

em i trồng


10

s u 45 ngày. Rễ củ cây con mọc từ hạt phát tri n, thư ng có 1 rễ cái và 4 rễ b n. Cây
trồng ngoài thực

s r ho s u khoảng 3 ˗ 4 năm (Heller, 1996) [82]. Nhược i m

củ phương pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con kh ng ồng nhất bởi cây
cọc rào là cây th phấn chéo n n gi

các hạt có sự khác nh u về mặt di truyền. Chẳng

hạn như xét tính trạng hàm lượng dầu trong hạt, các cây tạo r bằng gieo hạt có hàm
lượng dầu trong hạt kh ng ổn

nh, gi o ộng từ 4

n 40% (Jh và cộng sự, 2007)

[89]. Do ó nhân giống bằng phương pháp gieo hạt kh ng th

áp ng ủ nhu cầu cây

giống chất lượng tốt cho vi c trồng cây tr n quy m c ng nghi p.
1.1.5.2. Phương pháp nhân giống hiện đại
Các nghiên cứu trên thế giới

Các phương pháp nhân giống hi n ại có ưu i m lớn là có khả năng tạo r cây
giống với số lượng lớn trong khoảng th i gi n ngắn với chất lượng c o và ồng nhất.
Tuy nhi n, nh ng nghi n c u này còn ít hoặc chư
Suj th và Mukt (1996) [181]

ược c ng bố.

phát tri n kỹ thuật tái sinh cây cọc rào từ nhiều

bộ phận khác nh u củ cây như phần tr hạ di p, cuống lá và lá. Sự tạo thành chồi non
bất

nh ược ch ng minh là hi u quả nhất ở m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l BA và

1,0 mg/l IBA. Chồi non hình thành ược nu i và tạo rễ trong m i trư ng MS kh ng bổ
sung chất iều hò sinh trưởng cho

n khi phát tri n thành cây hoàn chỉnh

ư r

vư n ươm.
Sự tái sinh cây con từ các mẫu cấy tr tr n lá mầm củ cây cọc rào cũng

ược

Wei và cộng sự (2004) nghi n c u thành c ng [216]. Các mẫu cấy tr tr n lá mầm in
vitro ược nu i cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung IBA và BA. Các chồi bất

nh

ược hình thành trực ti p tr n bề mặt củ mẫu cấy tr tr n lá mầm trong iều ki n k t
hợp củ 0,1 mg/l IBA và 0,5 mg/l BA với tỷ l tái sinh chồi c o nhất. Trong khi ó, sự
tái sinh chồi gián ti p th ng qu m sẹo cần phải có sự k t hợp 1,0 mg/l IBA và 0,5
mg/l BA. Chồi tái sinh có th hình thành rễ tr n m i trư ng MS kh ng có bổ sung các
chất iều hò sinh trưởng.
Suj th và cộng sự (2005)

thành c ng trong nhân giống in vitro cây cọc rào

bằng phương pháp tạo c m chồi [181]. Nghi n c u

tạo chồi non bằng cách nu i cấy

nách lá cây cọc rào tr n m i trư ng MS bổ sung 0,5 ˗ 1,0 mg/l TDZ, s u ó chuy n
s ng m i trư ng MS bổ sung IBA và BA. Hi u quả tạo chồi c o 10,0 ˗ 12,3 chồi/mẫu


11

cấy. Vi c tạo chồi bất

nh từ lá thu ược bằng cách nu i cấy mẫu lá tr n m i trư ng

bổ sung 2,0 ˗ 10,0 mg/l BA và 1,0 mg/l IBA
các chồi bất

nh s

tạo thành m sẹo có màu trắng x nh,

ược tạo thành s u khoảng 3 tuần, s u ó chuy n s ng m i trư ng

bổ sung 2,0 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA.
Cây cọc rào

ược tạo dòng in vitro từ các mẫy cấy ốt thân (D tt và cộng sự,

2007) [47]. Các chồi ược tái sinh từ ốt thân tr n m i trư ng có bổ sung auxin và
cytokinin riêng l hoặc k t hợp. Các chồi ược cấy chuyền s ng m i trư ng khác
nhân nh nh số lượng chồi (D tt và cộng sự, 2007) hoặc cấy s ng m i trư ng chỉ có
uxin

hình thành rễ. Cây con s u khi chuy n r vư n ươm thì cho tỷ l sống sót c o

(trên 80%) [47].
Nghi n c u tái sinh chồi từ hạt cũng

ược thực hi n bởi W r k god và

Sub singhe (2009) [215]. Hạt củ cây cọc rào (chư trưởng thành, trưởng thành, hoàn
toàn trưởng thành) s u khi ược thu thập và khử trùng bề mặt s

ược cấy vào m i

trư ng MS, WPM và B5, có hoặc kh ng có bổ sung 1,0 g/l th n hoạt tính. Hạt giống
trưởng thành trong m i trư ng B5 cho thấy tỷ l nảy mầm sớm và tăng trưởng tốt nhất
so với các hạt chư trưởng thành và hoàn toàn trưởng thành trong m i trư ng B5, MS
và WPM. Các chồi ược nảy mầm từ hạt s

ược cấy vào m i trư ng B5 có ch

BA,

KIN, NAA ở các nồng ộ k t hợp khác nh u. Chồi ược nhân nh nh và phát tri n tr n
m i trư ng B5 có bổ sung 1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l KIN và 2,0 mg/l NAA ạt số lượng
chồi c o nhất là 6,6 chồi/mẫu cấy. Bổ sung th n hoạt tính vào m i trư ng B5 kh ng có
ảnh hưởng áng k

n sự nảy mầm củ hạt và sự tăng trưởng củ cây con.

Kaewpoo và Te˗ch to (2009)

báo cáo về ảnh hưởng củ các loại mẫu cấy và

chất iều hò sinh trưởng l n sự hình thành chồi cây cọc rào [91]. Các loại mẫu cấy
khác nh u ( oạn thân, chồi b n, chồi ỉnh) ược nu i cấy tr n m i trư ng MS bổ sung
BA và IBA ri ng l h y k t hợp với các nồng ộ khác nh u. K t quả ch ng minh rằng
các chồi b n cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung 0,5 mg/l BA k t hợp với 0,25 mg/l
IBA ạt số chồi c o hơn so với các thí nghi m còn lại. Chồi tái sinh ược tạo rễ (60%)
tr n m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l IBA sau 30 ˗ 40 ngày nu i cấy.
Phương pháp phát sinh ph i từ t bào som (som tic embryogenesis) ˗ một c ng
c mạnh củ ngành c ng ngh sinh học

tạo giống cây trồng -

ược áp d ng

thành c ng lần ầu ti n tr n cây cọc rào bởi Jh và cộng sự (2007) [89]. M sẹo có khả

12

năng phát sinh ph i ược thu nhận bằng cách nu i cấy mẫu lá tr n m i trư ng MS có
bổ sung 2,0 mg/l KIN. Các khối m sẹo này ược chuy n s ng m i trư ng có bổ sung
0,5 mg/l KIN và 0,25 mg/l IBA cho thấy tần suất m sẹo phát sinh ph i hình cầu c o
nhất. Ph i ược kích thích phát tri n bằng cách bổ sung th m denine sulph te trong
m i trư ng nu i cấy. Các ph i trưởng thành s tạo các cây con tr n m i trư ng ½MS.
Toàn bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 ˗ 16 tuần. Quá trình phát sinh ph i som ở
cây cọc rào có th trở thành một h thống lý tưởng cho nghi n c u chuy n gen trong
tương l i.
Ismidi nty và Esy nti (2010)
trong các ph i som

nghi n c u xác

nh thành phần củ các cid béo

ược nu i cấy bằng biore ctor với m c ích là thu nhận sinh khối

ph i som [88]. Điều ki n tối ưu lưu lượng kh ng khí cũng

ược nghi n c u

duy

trì sự tăng trưởng và tạo r thành phần cid béo ở ph i som thích hợp cho vi c tạo
dầu diesel sinh học. Các mẫu tr dưới lá mầm ược nu i cấy tr n m i trư ng MS có
bổ sung vit min B5; 13,5 M 2,4˗D; 4,4 M kinetin và 30 g/l sucrose

cảm ng m

sẹo có khả năng sinh ph i. Các m sẹo bở s u bốn tuần tuổi ược chuy n vào m i
trư ng MS lỏng có bổ sung vit min B5; 6,75 µM 2,4˗D; 0,4 µM kinetin và 20 g/l
sucrose

khởi ầu nu i cấy tạo huyền phù các t bào ph i som .

Năm 2012, Son l và cộng sự

nghi n c u khả năng phát sinh ph i som từ mẫu

lá mầm. M sẹo có khả năng phát sinh ph i ược hình thành tr n m i trư ng MS có bổ
sung 0,2 mg/l IAA s u 3 ˗ 4 tuần nu i cấy. S u ó, ph i som hình thành tr n m i
trư ng MS có bổ sung 0,2 mg/l IAA và 1,5 mg/l BAP. Đầu ti n, ph i hình cầu hình
thành trong khoảng 3 ˗ 4 tuần s u khi cấy và s u ó nh ng ph i này phát tri n thành
ph i dạng hình tim, hình thủy l i, lá mầm s u 6 tuần.Trong cùng m i trư ng tr n, các
ph i bi t hó tạo rễ, chồi và thành cây hoàn chỉnh s u 4 ˗ 5 tuần nu i cấy. Cây ược
chuy n r vư n ươm với tỷ l sống sót ạt 50% [174].
Năm 2014, Annggi Nindit và cộng sự

báo cáo rằng ở cả h i dạng ph i: h i

tr c và lá mầm ược lấy từ hạt cọc rào chỉ có th hình thành ph i som tr n m i
trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l piclor m [24].
Năm 2014, M h l kshmi và cộng sự

báo cáo về khả năng tái sinh thành cây

con từ ộ già củ các cuống lá khác nh u. Các cuống lá ược ánh số từ ỉnh: cuống

th nhất, th 2, th 3, th 4, th 5, th 6, th 7, th 8, th 9, th 10. Cuống lá ược


13

cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l NAA và 0,2 mg/l kinetin cho tỷ l hình
thành m sẹo c o nhất ở cuống lá th nhất (83,24%), tỷ l hình thành ph i soma cao
nhất ở cuống lá th nhất (35,16%) tr n m i trư ng 0,5 mg/l TDZ và 0,4 mg/l GA 3.
M i trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP, 0,5 mg/l IAA và 0,25 mg/l kinetin cho phần
trăm tái sinh ph i som c o nhất (66,85%). M i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l TDZ, 0,1
mg/l BAP, 0,4 mg/l GA3 là m i trư ng tốt nhất

kéo dài chồi. M i trư ng MS có sổ

sung 0,3 mg/l NAA cho tỷ l hình thành rễ c o hơn tr n m i trư ng có bổ sung IAA
h y IBA. Tỷ l sống sót củ cây con

hình thành rễ trong in vitro ph thuộc vào loại

mẫu cấy và nó th y ổi từ 47 ˗ 60% [115].
Các nghiên cứu ở Việt Nam
Năm 2009, Đ Vũ Tuy t Trinh

nghi n c u sự tạo m sẹo có khả năng phát

sinh chồi và rễ từ nu i cấy lớp mỏng t bào mảnh lá cây cọc rào tr n m i trư ng WPM
có bổ sung 0,1 mg/l IBA và 1,0 mg/l BA. M i trư ng WPM có bổ sung 1,0 mg/l BA
thích hợp cho sự tái sinh chồi từ m sẹo trong khi NAA ở nồng ộ 1,0 mg/l có khả
năng kích thích sự tạo rễ từ m sẹo rất tốt [15].
Thái Xuân Du và Đ Đăng Giáp (2010)

hoàn thi n quy trình vi nhân giống

bằng kỹ thuật nu i cấy lớp mỏng lá cây cọc rào. Lớp mỏng t bào cắt ng ng lá in vitro
ược nu i cấy tr n m i trư ng MS bổ sung TDZ với các nồng ộ khác nh u (0,1 ˗ 0,9
mg/l). K t quả thực nghi m cho thấy, tỷ l tạo chồi bất

nh tốt nhất ược ghi nhận ở

m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l TDZ. Sự hình thành rễ ở nh ng chồi bất

nh có k t

quả tốt tr n m i trư ng ½MS và bổ sung 1,0 mg/l IBA [7].
Bùi Văn Th Vinh và cộng sự (2011)

nghi n c u tái sinh chồi trực ti p từ mẫu

cấy lá cây cọc rào tr n m i trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l BA và 1,0 mg/l KIN. Các
chồi này ược cấy chuyền s ng m i trư ng MS có bổ sung 0,5 mg/l GA3 và 20% nước
dừ

kéo dài chồi và ngăn hi n tượng r ng lá. Các chồi phát tri n tốt ược chuy n

s ng m i trư ng MS½ có bổ sung 0,5 mg/l NAA

cảm ng r rễ. Cây tái sinh sau 4

tháng ược chuy n r vư n ươm với tỷ l sống sót ạt tr n 80%. Đây là một quy trình
hi u quả

tái sinh chồi trực ti p từ mẫu cấy lá cây cọc rào, quy trình này có th

ược

áp d ng trong các nghi n c u chuy n gen nhằm nâng c o hàm lượng dầu trong hạt mà
kh ng qu gi i oạn tạo m sẹo [17].


14

1.1.6. Tình hình nghiên cứu và triển khai canh tác cây cọc rào trên thế giới và ở
Việt Nam
Tình hình nghiên cứu sử dụng cây cọc rào trên thế giới
Từ năm 1991, Giáo sư ngư i Đ c, Kl use Becker, củ Trư ng Đại học Stuttg rt
nhận ơn ặt hàng củ Tập oàn D imler Chrysler hợp tác với 1 h ng tư vấn củ
Áo ti n hành nghi n c u cây cọc rào ở Nic r gu ,

làm nguy n li u sản xuất diesel

sinh học.
Năm 1996, Jo chim Heller nghi n c u thúc

y vi c bảo tồn và sử d ng

úng m c giá tr cây cọc rào tại Rome, It ly.
Các nước nhi t ới, á nhi t ới

ng phát tri n mạnh cây cọc rào. Thái L n hi n

có 1600 h , dự ki n s tăng l n 320 nghìn h trong vài năm tới. Indonesi

ặt m c ti u

n năm 2010, nhi n li u sinh học áp ng 20% nhu cầu năng lượng trong ngành i n
và gi o th ng vận tải. Ấn Độ

xác

nh cọc rào là cây cho hạt có dầu thích hợp nhất

sản xuất diesel sinh học. Từ năm 2001, nhiều b ng ở Ấn Độ

có chương trình

khuy n khích trồng tr n quy m lớn ở các vùng ất ho ng hó , ược nhà nước h trợ
giống và các nguồn vật tư ầu vào nhằm tạo vi c làm, xó

ói giảm nghèo, phát tri n

bền v ng x hội n ng th n Ấn Độ. Cơ qu n k hoạch củ Chính phủ Ấn Độ ặt chỉ
ti u trồng 11 tri u h cây cọc rào vào năm 2012

có ủ nguy n li u sản xuất

biodiesel phối trộn theo tỷ l 20%. Trong tương l i, Ấn Độ ti p t c mở rộng trồng tr n
phạm vi cả nước, ư di n tích tr n 33 tri u h , trong số hơn 133 tri u h

ất

ng b

bỏ ho ng.
My nm r là nước phát tri n vi c trồng cây cọc rào với tốc ộ nh nh. Đ n 2006,
di n tích trồng ở My nm r

ạt 800.000 h . Trung Quốc là nước qu n tâm phát tri n

mạnh cây cọc rào trong vài năm gần ây, chủ y u là 7 tỉnh gồm T Xuy n, Quý Châu,
Vân N m, Phúc Ki n, Quảng Tây, Quảng Đ ng và ảo Hải N m; trong ó, ở khu tự tr
Quảng Tây,

n cuối năm 2007

trồng ược 15 nghìn h , dự

vạn h trong vài năm tới. Các tỉnh khác có iều ki n

nh ư l n khoảng 10

có k hoạch trồng tr n quy m

lớn trong mấy năm tới. Theo ước tính củ Giáo sư Kl use Becker, cho
th giới

n 2009, cả

trồng ược khoảng 5 tri u h cọc rào. Hi n n y, có khoảng 1000 nhóm

nghi n c u về diesel sinh học và cọc rào. Cho

n th i i m này, ây vẫn là một cây

dại và mới ược ư vào ối tượng cây trồng ược khoảng tr n 15 năm, cũng có th


15

coi là cây nông ˗ lâm nghi p tr nhất trong l ch sử trồng cây nông ˗ lâm nghi p củ loài
ngư i.
Bahamas: Tháng mư i một năm 2013 vừ qu , c ng ty i n B h m Gr nd
(GBPC)

tổ ch c lễ kh i mạc cho dự án nhi n li u sinh học củ họ. Hợp tác với cảng

Gr nd B h m , c ng ty phát tri n Gr nd B h m và G rden of the Groves, dự án tập
trung vào tính khả thi củ vi c c nh tác cây dầu mè

sản xuất nhi n li u sinh học

chạy các ộng cơ tạo năng lượng i n.
Botswana: Tháng tám năm 2013, Botsw n
chính sách năng lượng quốc gi

ặt m c ti u nhằm ph duy t

n năm 2015, b o gồm một thành phần năng lượng

tái tạo lớn, trong ó có cả nhi n li u sinh học. Chính phủ

làm vi c với ngư i Nhật

phát tri n các giống j troph có khả năng chống ch u với nh ng th y ổi th i ti t
khắc nghi t trong nước. Bộ trưởng năng lượng thừ nhận rằng sự thi u chính sách này
cản trở ầu tư vào nhi n li u sinh học cho

n n y.

Costa Rica: Cuối tháng mư i h i năm 2013, Altern tive Fuels Americ

bắt

ầu sản xuất thử nghi m b ph nhi n li u sinh học dầu mè. Các nguy n li u cho gi i
oạn 1 s

n từ trồng AFAI trong Temp te, Cost Ric .

Ethiopia: Trong tháng bảy năm 2014, chính phủ Ethiopi
, với sự giúp ỡ củ các nguồn tài trợ từ chính phủ N Uy,

ng ầu tư 2,8 tri u
sản xuất 500 tri u lít

dầu diesel sinh học từ cây dầu mè m i năm. Dự án s diễn r tại 18 quận trong năm
ti u b ng và ước tính s giúp hơn 14 tri u n ng dân và ngư i chăn nu i có nguồn năng
lượng tái tạo sử d ng.
Ghana: Vào tháng tám năm 2013, c ng ty TNHH Sm rt Oil

ký k t một thỏ

thuận cấp phép và các thoả thuận d ch v với QUINVITA. Thỏ thuận này cho phép
truy cập n ng học ti n ti n QUINVITA bi t làm th nào

gieo hạt giống Jatropha

curcas tốt nhất củ QUINVITA (QVP). Niqel Ld , một c ng ty có tr sở hoạt ộng ở
Moz mbique trong vi c sản xuất năng lượng tái tạo từ Jatropha curcas, cũng
một thỏ thuận cấp phép và các thoả thuận d ch v với QUINVITA

ký

sản xuất năng

lượng sinh học từ cây dầu mè.
Sudan: Vào cuối năm 2012,

có báo cáo rằng c ng ty củ Ả Rập S udi T l

hợp tác với Nov toàn cầu củ C n d tr n một dự án mí 650.000.000$ rằng s sản


16

xuất ư ng và eth nol tại ti u b ng Sinn r, cũng như một dự án dầu mè s cung cấp
dầu cho các h ng hàng kh ng Trung Đ ng. Dự án b o gồm khoảng 156.000 mẫu Anh.
Hoa Kỳ:

H w ii, vi c thu hoạch cây dầu mè bắt ầu vào tháng 8 năm 2013 tại

n ng trư ng H w ii Pure Pl nt Oil (HIPPO) thành lập năm 2008 bởi ngư i ch và con

tr i ối tác Christi n và J mes Twigg-Smith. HIPPO
dầu mè ở quận Pun củ

trồng tổng cộng 200 mẫu cây

ảo H w ii với m c ích thu hoạch hạt và chi t xuất dầu

sản xuất dầu diesel sinh học. S u 5 năm thành lập các tr ng trại, nhà Twigg-Smiths
thi t lập hợp tác trực ti p với P cific Biodiesel Technologies thuộc dự án cây trồng
H w ii Milit ry Biofuel Crop. Dự án b o gồm vi c phát tri n các m hình sản xuất
cây dầu mè và các cây trồng khác

chi s với ngư i trồng cây nhi n li u sinh học

tiềm năng tr n toàn ti u b ng.
Tình hình nghiên cứu sử dụng cây cọc rào ở Việt Nam
Từ năm 2008, Khi Bộ N ng nghi p và Phát tri n N ng th n

ph duy t ề án

“Nghi n c u, phát tri n và sử d ng sản ph m cây cọc rào ở VN gi i oạn 2008 ˗ 2015
và tầm nhìn

n 2025”. Theo ề án, m c ti u trong gi i oạn 2008 ˗ 2010 Vi t N m

trồng thử nghi m, khảo nghi m và sản xuất ở các vùng sinh thái khác nh u ạt quy m
di n tích khoảng 30.000 h . Gi i oạn 2011 ˗ 2015 và tầm nhìn
mở rộng sản xuất quy m lớn theo nhu cầu th trư ng,
tích gây trồng trong cả nước khoảng 300.000 h và
th

n 2025 từng bước

n năm 2015 có th

nh hướng tiềm năng

ạt di n
n 2025 có

ạt 500.000 h … Tổng nhu cầu vốn thực hi n cho ề án ước tính khoảng 2.320 tỉ

ồng trong ó nguồn vốn ngân sách Nhà nước khoảng 220 tỉ còn lại 2.100 tỉ là ầu tư
củ các do nh nghi p.
Từ năm 2007, Trung tâm C ng ngh sinh học (thuộc Vi n Kho học Lâm nghi p
Vi t N m)
curcas)”;

tri n kh i ề tài “Nghiên cứu gây trồng phát triển cây cọc rào (Jatropha
nn y

thu thập ược 8 xuất x cọc rào (4 xuất x ở trong nước và 4

xuất x nhập từ nước ngoài) ồng th i

tuy n chọn ược 29 cây trội với các ặc tính

vượt trội về sinh trưởng, năng suất hạt từ 2,5 ˗ 5,0 kg/cây và hàm lượng dầu trong hạt
ạt 25 ˗ 39%, nhưng theo k t quả theo dõi củ

ề tài: cây mẹ có năng suất c o lại

kh ng trùng với cây mẹ có hàm lượng dầu c o. Đơn v này cũng phối hợp với c ng ty
GreenEnergy Vi t N m nghi n c u trồng thử nghi m tại nhiều tỉnh với tổng di n tích
là 38 h . Trong các m hình thử nghi m, vi c ti n hành áp d ng các bi n pháp kỹ thuật


17

lâm sinh nhằm nâng c o năng suất 15% so với b n ầu.
Trư ng Đại học Thành Tây cũng

ng thực hi n ề tài “Chọn tạo giống và

nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật phát triển cây cọc rào thành vùng nguyên liệu sản
xuất diesel sinh học”. Nhà trư ng

ng nghi n c u khảo nghi m các xuất x giống có

năng suất c o củ Vi t N m (40 ˗ 50 xuất x ) và một số nước trong khu vực như
Trung Quốc, Thái L n, Ấn Độ, M l ysi , Indonesi (5 xuất x ) nhằm ánh giá năng
suất và trồng thử nghi m ở một số tỉnh (vùng sinh thái khác nh u) củ Vi t N m.
Trư ng

và

ng trồng giống ưu tuy n số 6 củ Quảng Tây và giống nhập từ C n

Minh (Trung Quốc) tr n di n tích khá lớn ở Lạng Sơn. Trư ng cũng nghi n c u kỹ
thuật giâm hom và nhân giống bằng phương pháp nu i cấy m . Trư ng Đại học Thành

Tây

xây dựng vư n giống từ gi i oạn cuối năm 2007 và hi n n y

ng bắt ầu thu

hạt với m c ích nhằm tạo r năng lượng sinh học mới.
C ng ty Cổ phần Đầu tư và phát tri n Lũng L 5:

ng thực hi n dự án “Phát

triển vùng chuyên canh cây Bã đậu nam (cọc rào) và xây dựng nhà máy chế biến
nhiên liệu sinh học, phụ phẩm kèm theo tại địa bàn tỉnh Quảng Trị; Năm 2008, C ng
ty

ti n hành nhập các giống cọc rào từ một số quốc gi trong khu vực, dưới sự hợp

tác giúp ỡ củ chuy n gi Nhật Bản, hi n n y

tạo ược vư n ươm di n tích tr n

1h với số lượng hàng vạn cây giống. Đơn v này hi n

ng chu n b gi i oạn trồng

thử nghi m.
Vi n nghi n c u Dầu và cây có Dầu (Bộ C ng Thương) hi n

và

ng tri n

kh i ề tài “Nghiên cứu khả năng thích nghi của các giống Jatropha sử dụng làm
nguyên liệu để sản xuất dầu biodiesel” từ năm 2007 tới n y;

thu thập và khảo

nghi m tập oàn gồm 41 mẫu giống trong và ngoài nước như: Úc, Pháp, Ấn Độ,
Br zil, Indonesi , Lào, Thái L n, Trung Quốc tại vư n lưu gi tập oàn tại Tây Ninh.
Hàm lượng dầu củ các mẫu giống từ 33 ˗ 39% ( m ộ hạt là 5%). Đ bố trí khảo
nghi m giống tại vùng Đ ng N m Bộ và Duy n hải Miền Trung ồng th i ti n hành
rất nhiều các nghi n c u thử nghi m về trồng trọt và kỹ thuật chăm sóc (kỹ thuật tạo
tán, mật ộ trồng, ch
cành cọc rào). Vi n

ộ bón phân, ch

ộ tưới nước, các bi n pháp kỹ thuật giâm

ng hợp tác với số 1 ơn v củ Ấn Độ và Đ c trong lĩnh vực

nghi n c u chọn tạo giống, kỹ thuật c nh tác và ch bi n các sản ph m từ cọc rào.


18

Ngoài nh ng ơn v k tr n còn một số ơn v khác ở các tỉnh cũng th m gi vào
vi c nghi n c u, thử nghi m trồng cọc rào. Song, vấn ề qu n trọng nhất

ng ược

ặt r là cần phải lự chọn ược giống cho năng suất hạt và hàm lượng dầu c o, thích
nghi ược với các iều ki n sinh thái khác nh u và có th gây trồng tr n di n rộng với
năng suất ổn

nh.

1.2. Giới thiệu về hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào (Thin cell layer – TCL)
1.2.1. Khái niệm hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL)
Khi nghi n c u về h thống c ch , K. Trần Th nh Vân nghĩ

n khái ni m về h

thống lớp mỏng t bào (Trần Th nh Vân, 2003) [198]. Với h thống này K. Trần
Th nh Vân cố gắng phân tách một hoặc một vài lớp trong nh ng t bào

bi t hó từ

một h thống cơ qu n, m , hoặc t bào; và cố gắng chương trình hó lại chúng trong
nu i cấy in vitro, trong ó “bi t hó ” là một ti u chí qu n trọng. Thực vật có nh ng
ặc i m nổi bật là có th tái thi t lại chương trình bi t hó sự phát tri n củ cơ th và
có khả năng xây dựng quá trình phân chi ch c năng mới (m sẹo, rễ, chồi, ph i som
và ho ), mẫu phát sinh hình thái mới. Trong trư ng hợp hình thành cấu trúc mới là
chồi và ph i som , cá th mới có th hình thành mà kh ng cần quá trình giảm phân và
sinh sản h u tính. Sự phát tri n b n trong thực vật ược ki m soát về kh ng gi n và
th i gi n trong một mạng lưới các ơn v khác nh u: cơ qu n, m , t bào. N u như có
sự th y ổi trong mạng lưới này thì sự c ch ở m c cá th có th xảy r .
H thống TCL b o gồm các mẫu m có kích thước nhỏ ược thu nhận từ các cơ
qu n khác nh u củ thực vật (thân, rễ, lá, c m ho , chồi ho , các cơ qu n củ ho , lá,
mầm, m phân sinh, ỉnh sinh trưởng hoặc ph i). Khi mẫu ược thu nhận theo chiều

dọc gọi là lTCL (longitudi l TCL) và thu nhận theo chiều ng ng gọi là tTCL
(tr nsverse TCL). Các mẫu lTCL (1 mm × 0,5 mm h y 1,0 mm) b o gồm chỉ một dạng
m như một lớp ơn các t bào bi u bì (có th

ược bóc khỏi cơ qu n) hoặc là vài lớp

(3 ˗ 6) t bào bi u bì, trong khi các mẫu tTCL (0,2 ˗ 0,5 mm h y dày vài mm) b o gồm
một số lượng nhỏ các t bào thuộc các dạng m khác nh u như: bi u bì, vùng thượng
tầng, bó g , bó mộc và các t bào nhu m (Tr n Th nh V n và Gendy, 1996) [199].
Ngoài r , còn có h thống TCL chỉ dày vài micromete phải dùng máy vi phẫu

cắt

(Lee˗Stedlem mn và cộng sự, 1989), nhưng với kích thước này mẫu dễ b nhiễm
khu n hoặc ch t [110].


19

1.2.2. Đặc trưng của hệ thống TCL
Đặc trưng củ lTCL và tTCL là chúng rất mỏng, nghĩ là một mẫu cấy có càng ít
t bào càng tốt. Đặc i m này là một trong nh ng iều qu n trọng
dấu (m rkers) củ quá trình bi t hó có th
h y trong t bào cảm ng. Quá trình

các phân tử ánh

nh v in situ trong các t bào m c ti u

nh v này cho phép giới hạn các t bào cảm ng

kh ng mong muốn (Tr n Th nh V n, 2003) [198].
Quá trình cắt mẫu làm m thực vật b thương, nhiều enzyme h y polys cch ride
sinh r rất cần cho quá trình cảm ng sự sinh trưởng và phát tri n củ thực vật (Tr n
Th nh V n và Mut ffschiew, 1990) [200]. Lý do cơ bản ng d ng một vài t bào trong
h thống TCL là vì chúng có mối li n h mật thi t với các t bào b thương (nơi xảy r
sinh tổng hợp cấu tạo vách t bào và là nơi phóng thích oligos cch ride) và chất dinh
dưỡng cùng với các y u tố khác củ m i trư ng “ki m soát” sự phát sinh hình thái.
Một h thống

bào như h thống TCL m ng sự tổ ch c kh ng gi n/th i gi n

củ cơ th b n ầu. Khác với khi sử d ng một t bào ơn h y thậm chí t bào trần, s u
khi tách chúng tạo n n vách t bào và hình thành n n c m t bào với tổ ch c kh ng
gi n/th i gi n khác bi t với tổ ch c trước khi ti n hành quá trình tách r từ m h y cơ
quan cho (Tran Thanh Van, 1973) [201].
Vi c giảm số lượng t bào trong phương pháp lớp mỏng t bào có ý nghĩ rất
qu n trọng

n quá trình phát tri n hoặc các chương trình bi t hó m , cơ qu n. Các

chương trình bi t hó có th th y ổi từ vi c bi n ổi mối tương qu n gi

cơ qu n/m

nu i cấy với kích thước khác nh u khi nu i cấy tr n m i trư ng có cùng tính chất. Lớp
cắt dọc 0,5 × 1,0 × 10 mm ược dùng phổ bi n và các dạng phát sinh hình thái mong
muốn có th tạo ược qu vi c iều khi n m c ộ tác ộng củ các nhân tố ngoại sinh.
B n cạnh ó, khoảng th i gi n củ quá trình phát sinh hình thái xuất hi n tương ối
ngắn (trung bình khoảng 14 ngày s u khi cấy), với tần số c o (gần 100% mẫu có phản

ng). Tỷ l gi

số lượng t bào áp ng với tổng số t bào hi n di n tr n mẫu TCL

cao [198].
1.2.3. Sự phát sinh cơ quan
Nh ng cơ qu n như chồi h y rễ có th

ược hình thành từ bất c loại m nào củ

cây, nh ng cơ qu n ược khởi tạo như vậy ược gọi là cơ qu n bất
sinh các cơ qu n bất

nh gọi là sự phát sinh cơ qu n bất

nh.

nh. Quá trình tái
ây, chồi h y rễ có


20

th hình thành từ một t bào ơn, h y một nhóm t bào. Các t bào này ược kích thích
bởi iều ki n m i trư ng
(m phân sinh bất

trở thành trung tâm củ sự phân chi tích cực các t bào

nh). Cơ ch

iều hò phát sinh cơ qu n có th

ược thấy rõ bằng

cách nu i cấy nh ng lớp mỏng chỉ gồm vài lớp t bào bi u bì và dưới bi u bì (Tr n
Thanh Van, 1980) [197].
Sự tái sinh

ược nghi n c u in vitro tr n số lượng lớn cây trồng củ nhiều loài

khác nh u, nhưng kh ng phải khả năng tái sinh củ cây nào cũng như nh u. Thậm chí
trong cùng một giống cây trồng vẫn có sự khác nh u, ó có th là do tính áp ng in
vitro kém h y kh ng có khả năng tái tạo cơ qu n từ mẫu cấy b n ầu. Hơn n , ở một
số loài, khả năng tái sinh có th b mất s u quá trình chuy n gen. Ngư i t vẫn còn
chư bi t rõ tại s o một số cây trải qu quá trình phát sinh cơ qu n còn một số khác lại
kh ng. Một số giả thuy t ược ư r bởi Christi nson và W rnick (1984) giải thích
một chu i các quá trình củ sự phát sinh cơ qu n theo th i gi n [37]. Sugiy m (1999)
xác

nh ược 3 gi i oạn củ sự phát sinh cơ qu n [180].

‒ Gi i oạn ầu: là gi i oạn ạt khả năng phát sinh cơ qu n, hoặc khả năng phản
ng với tín hi u cảm ng cơ qu n, th ng thư ng òi hỏi một bước bi t hó .
‒ Gi i oạn th 2: là gi i oạn các t bào có khả năng hình thành cơ qu n chuy n
bi t dưới ảnh hưởng củ sự cân bằng các hormon thực vật.
‒ Gi i oạn th 3: là gi i oạn sự phát sinh hình thái ược bắt ầu một cách ộc
lập từ tác nhân kích thích ngoại sinh

ược sử d ng b n ầu.

a. Tái sinh trực tiếp
M phân sinh chồi hình thành trực ti p từ mẫu cấy thư ng ược khởi tạo bằng sự
phân bào sơ cấp s u 48 gi nu i cấy. K ti p m i quá trình phân bào sơ cấp là một quá
trình phân bào dài và ph c tạp hơn, k t quả hình thành n n các mầm chồi bất

nh,

m i mầm chồi b o gồm nhiều t bào. Sự hình thành trực ti p này thư ng bắt nguồn từ
một h y một nhóm các t bào sinh dưỡng chư phân hoá. Broertjes và cộng sự (1976),
cho rằng trong suốt quá trình phát sinh cơ qu n trực ti p, các mầm chồi bất

nh kh ng

phải lúc nào cũng ược hình thành từ nhiều t bào củ m . Một t bào bi u bì

i khi

lại khởi i m cho quá trình phát tri n củ vùng phân sinh trung tâm là nguồn gốc củ 1
cho tới 22 chồi giống nh u. Các nghi n c u tr n một số cây trồng khác cũng khẳng
nh giả thuy t vùng m phân sinh có nguồn gốc từ một t bào [34].


21

Sự phát sinh chồi bất

nh trực ti p thư ng bắt ầu từ các t bào nhu m nằm ở

trong bi u bì (Broertjes và V n H rte, 1978) [33]. Từ một nghi n c u tái sinh chồi từ

th khảm củ lá cây Saintpaulia Norris và Smith (1981) k t luận rằng sự khởi tạo vùng
m phân sinh tr n ỉnh li n qu n tới sự k t hợp củ các t bào dưới lớp bi u bì [143].
Chồi tr n m i trư ng nu i cấy lá Nicotiana tabacum phát sinh trực ti p từ các t bào
m giậu th t lá qu nh rì lá (Attfield và Ev ns, 1991) [25]. Th khảm cũng thấy ở
nhiều ối tượng cây trồng tái sinh khác (Broertjes và V n H rte, 1978) càng ch ng tỏ
nguồn gốc

bào củ sự phát sinh chồi [33].

Attfield và Ev ns (1991) cho thấy rằng trong các nghi n c u từ lá cây Nicotiana
tabacum, rễ bất

nh hình thành trực ti p từ b bó mạch và các mạch củ nhu m [25].

Sự hình thành rễ bất

nh này tương tự như sự khởi tạo rễ có nguồn gốc

bào từ các

mẫu cấy chồi cây Pisum sativum, rễ ược phát sinh từ các t bào nhu m và các mô
mạch

có trước ó (G h n và cộng sự, 1984) [67]. B n cạnh ó, nh ng bi u hi n tác

ộng trực ti p từ tr n nh ng t bào xuất phát từ m mạch và có th là IAA h y chất
iều hò sinh trưởng thực vật khác

khu ch tán vào các t bào và khởi ộng cho quá

trình phân bố mạch và tạo rễ.
b. Tái sinh gián tiếp
Sự hình thành các khối m sẹo từ mẫu cấy b n ầu s u khoảng th i gi n nu i cấy
nhất

nh

hình thành các chồi bất

nh. Các chồi này phát tri n từ ngoại vi m sẹo

và kh ng có qu n h b n ầu với các m có mạch dẫn củ mẫu cấy. Sự hình thành cơ
qu n như th
qu n bất

ược gọi là quá trình tái sinh gián ti p. Sự phát sinh gián ti p các cơ

nh cũng tương tự như sự phát sinh trực ti p, bắt ầu bằng sự phân chi

nh nh các t bào

dẫn tới sự hình thành vùng phân sinh. Ti p theo là sự xuất hi n

các mầm chồi và cuối cùng là chồi (Torrey, 1966) [195]. Vì vậy, rất khó phân bi t h i
hình th c phát sinh cơ qu n này. Th ng thư ng,

sự phát sinh cơ qu n gián ti p xảy

r , các m sẹo hình thành từ mẫu cấy phải ược cấy chuyền s ng m i trư ng ch

chất

iều hò sinh trưởng thực vật thích hợp cho quá trình bi t hó m sẹo.
Đối với m c ích nhân giống in vitro, n u cây tái sinh trực ti p từ mẫu cấy b n
ầu thì kh ng nh ng nh nh chóng thu ược cây, mà các cây này cũng khá ồng nhất
về mặt di truyền. T bào m sẹo s u khi cấy chuyền nhiều lần s kh ng ổn

nh về mặt


22

di truyền. Đ tránh tình trạng ó, nhất thi t phải sử d ng loại m sẹo vừ phát sinh, t c
là m sẹo sơ cấp

tái sinh cây thì hy vọng s thu ược cây tái sinh ồng nhất.

1.3. Giới thiệu về phôi soma
1.3.1. Sự hình thành phôi soma
Phôi của thực vật không nh ng chỉ ược phát sinh từ t bào tr ng
mà nó còn có th

th phấn

ược tạo ra một cách tự nhiên hoặc nhân tạo từ nhiều loại t bào

khác nhau, bao gồm cả t bào sinh dưỡng. Tất cả các t bào sinh dưỡng của thực vật
ều có ch a toàn bộ thông tin di truyền cần thi t cho sự hình thành nên một cơ th
thực vật hoàn chỉnh với ầy ủ các ch c năng cần thi t. Nh ng t bào có khả năng
phát sinh ph i có ặc i m là nhân nằm ở v trí trung tâm, có nh ng ống siêu nhỏ nổi

bật ở gần nhân và nh ng sợi nhỏ actin.
Phôi soma có th

ược bi t hó trực ti p từ mẫu cấy kh ng cần i qu trung gi n

gi i oạn m sẹo, hoặc gián ti p th ng qu gi i

oạn tạo m sẹo (Willi ms và

Maheswaran, 1986) [217]. Sh rp và cộng sự (1980) là nh ng ngư i ầu ti n ư r
thuật ng IEDC (induced embryogenic determined cell) nhằm m tả nh ng t bào có
khả năng sinh ph i xuất phát b n ầu là nh ng t bào kh ng sinh ph i [161]. Nh ng t
bào củ ph i hợp tử có sẵn chương trình bi u hi n củ các gen sinh phôi thì ược gọi
là PEDC (pre˗embryogenic determined cell). Cả IEDC và PEDC ều có ch c năng
tương tự nh u là nhằm m c ích tái sinh. N u m cấy có các PEDC thì chỉ cần một sự
kích thích phân chi t bào là ủ

hình thành ph i và quá trình này ược gọi là sự

hình thành ph i som trực ti p. Ngược lại, n u m cấy là nh ng t bào

phân hó

kh ng còn khả năng sinh ph i thì chúng cần trải qu nhiều lần phân chi t bào li n
ti p, dưới sự cảm ng củ

uxin trong suốt quá trình

ược tái lập trình i vào con

ư ng phát sinh ph i. Quá trình này ược gọi là quá trình phát sinh ph i gián ti p vì
phải th ng qu gi i oạn tạo m sẹo. Các m sẹo có khả năng phát sinh ph i b o gồm
các c m tiền ph i (PEM ˗ proembryogenic m ss). PEM là bước khởi ầu cho sự phát
sinh ph i som , s u ó là sự hình thành ph i som , ph i trưởng thành, ph i ở gi i oạn
mi n trạng và cuối cùng là gi i oạn tái sinh cây.
Sự chuy n ti p từ PEM s ng ph i có v i trò rất qu n trọng, là k t nối gi

sự

tăng sinh củ PEM và sự phát tri n có tổ ch c của ph i. Auxin tổng hợp như 2,4˗D ặc
bi t hi u quả trong vi c thúc

y sự thi t lập và tăng sinh nu i cấy ph i hơn các loại


23

uxin khác. Do ó,

kích thích tăng trưởng củ ph i som cần chuy n chúng s ng

m i trư ng kh ng có uxin. Khi m i trư ng nu i cấy thi u uxin các gen ngăn chặn
ph i chuy n s ng gi i oạn hình tim s kh ng bi u hi n ược (Zimmerm n, 1993)
[222].
Sự phát sinh ph i là một gi i oạn ph c tạp trong ó sự sống sót và tăng trưởng
củ thực vật có nguồn gốc từ ph i ph thuộc vào các iều ki n nu i cấy trong các gi i
oạn ầu. Do ó,

phát tri n kỹ thuật nhân giống số lượng lớn bằng ph i som phải

loại trừ các nhân tố có th ảnh hưởng xấu

n bi u hi n ex vitro củ thực vật. Chỉ có

các ph i trưởng thành với hình thái bình thư ng có tích lũy ầy ủ các hợp chất dự tr
và vượt qu gi i oạn làm kh là phát tri n thành cây bình thư ng ược. Các ph i
som thư ng phát tri n thành các cây con nhỏ khi nu i cấy tr n m i trư ng kh ng có
chất iều hò sinh trưởng. Tuy nhi n, có trư ng hợp uxin và cytokinin thúc
nảy mầm. Hơn n , cần có vài bi n ổi trong m i trư ng cơ bản

thúc

y sự

y nảy mầm.

vài loài phải th m vào các hợp chất như glut mine và c sein hydrolys te. Khi các
cây con ạt

n kích thước phù hợp chúng s

ược chuy n s ng nu i cấy ex vitro.

Trong một vài báo cáo cho thấy cây phát sinh từ ph i som tăng trưởng tương tự như
các cây từ hạt bình thư ng. Tuy nhi n, ở vài loài cũng xảy r vấn ề bi n ổi gen trong
quá trình nu i cấy.
 Nhân giống bằng phôi vô tính có các ƣu điểm chính sau:
-

H số nhân giống c o do các m và t bào sinh dưỡng nu i cấy in vitro có th

tạo r ph i v tính một cách trực ti p hoặc th ng qu gi i oạn trung gi n là m sẹo.
T bào m sẹo có th phân chi theo cấp số nhân và khi phân hoá thành ph i v tính s
tạo r số lượng ph i v tính khổng lồ trong th i gi n ngắn. Ví d , ở cà ph ngư i t có
th tạo ược 600.000 ph i v tính từ 1 g sinh khối b n ầu trong vài tháng với tỷ l tái
sinh cây từ ph i v tính ạt 47% (Ducos và cộng sự, 1993) [52].
-

Ph i v tính ch

một lượng chất dinh dưỡng tương tự với nội nhũ củ ph i

h u tính, có mầm chóp rễ và chồi ỉnh, do vậy có th nảy mầm trực ti p thành cây
(Ammirrato, 1983) [21].
-

Phôi vô tính sau khi tạo hạt nhân tạo có th bảo quản và lưu gi dài hạn.

-

Khả năng c ng nghi p hoá và tự ộng hoá quá trình nhân giống quy m lớn,

ặc bi t là nhân giống bằng biore ctor (T k y m và Akit , 1994) [188].


24

1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi soma
1.3.2.1. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
a. Cytokinin

Sử d ng cytokinin ri ng l

tạo ph i som từ hợp tử non cũng

ạt ược

nh ng thành c ng tr n một số loài, b o gồm cả thực vật hạt kín và hạt trần. N u dự
tr n giả thuy t PEDC, sự hình thành ph i som từ ph i hợp tử non ược kích thích bởi
cytokinin. Vì hợp tử có ch

các m quy t

nh sự hình thành ph i, do ó kh ng cần

thi t phải thi t lập một ki u bi u hi n gen nào cả. Th y vào ó, t bào cần phải ược
cho phép phân chi mà kh ng b kìm h m bởi các t bào xung qu nh, trong trư ng hợp
này thì cytokinin óng v i trò áng k .
Halperin (1970) báo cáo rằng khi nu i cấy cà rốt, sự hi n di n củ BAP trong
m i trư ng tăng sinh có th thúc

y sự phân chi t bào, nhưng nó làm c ch tiềm

năng phát sinh ph i [78]. Tuy nhi n, một số nghi n c u khác

ghi nhận các

cytokinin làm tăng hi u quả phát sinh ph i. Cũng trong nu i cấy m Cà rốt, Fujimur
và Kom mine (1975) qu n sát thấy rằng trong khi BAP và kinetin c ch khả năng tạo
ph i, thì ze tin ở nồng ộ là 0,1 M thúc
cà ph có th

y quá trình này [64]. Sự phát sinh ph i cây

ược cảm ng khi có sự hi n di n củ một cytokinin. Các m i trư ng

cảm ng ở cỏ linh lăng có ch

5 M và 2,4˗D (22,6 ˗ 45,2 M). Nồng ộ tương ối

củ chất iều hò sinh trưởng trong m i trư ng cảm ng xác

nh ki u bi t hó phát

sinh hình thái s u khi chuy n s ng m i trư ng kh ng có ch

chất iều hò sinh

trưởng.
Đối với sự phát sinh ph i gián ti p, sự k t hợp cytokinin ở một hàm lượng thấp
với uxin

ạt ược hi u quả sinh ph i, tuy nhi n chư thấy có nh ng nghi n c u

nào về cơ ch tác ộng củ cytokinin trong cảm ng sinh tạo ph i.
b. Auxin
Auxin là y u tố cần thi t cho sự phát tri n củ ph i, nó ảnh hưởng khác nh u
trong từng gi i oạn củ quá trình sinh ph i. Sự hi n di n củ

uxin ri ng l h y uxin

k t hợp với một cytokinin là cần thi t cho sự thành lập các t bào h y nhóm các t bào
có khả năng sinh ph i, tuy nhi n uxin lại cản trở sự sinh ph i ở các ph ti p theo.
Nhu cầu về loại uxin cũng như nồng ộ uxin cho sự cảm ng ph i th y ổi tùy thuộc
vào ki u gen củ thực vật cũng như loại m sử d ng trong nu i cấy. Trong số các loại