Nghiên cứu phân loại một số loài cá thuộc giống cá bỗng (spinibarbus) ở việt nam dựa trên gen ty thể (COI, 16s rRNA)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-----------------------------------

NGU

N TH TH

NGHI N C U PH N OẠI
GI NG C

INH

TS

O I C THU C

NG SPINIBARBUS

VI T NA

A TR N G N T TH (COI, 16S rRNA)

UẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGH SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-----------------------------------

NGU

N TH TH

INH

NGHI N C U PH N OẠI
TS
O I C THU C
GI NG C
NG SPINIBARBUS
VI T NA
A TR N G N T TH COI, 16S rRNA)

Chuyên ngành: CÔNG NGH SINH HỌC
ã số: 60 42 02 01

UẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGH SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG ẪN KHOA HỌC
TS KI TH PHƯ NG OANH

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

i

ỜI CẢ

N

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, ban chủ nhiệm
Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã
tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến TS. Kim Th Phương
Oanh, trư ng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên c u hệ Gen - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người cô đã dành nhiều thời gian,
tâm huyết, tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và
hoàn thiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, chỉ bảo và giúp đỡ nhiệt tình của
tập th cán bộ Phòng Hệ gen học môi trường - Viện Nghiên c u hệ Gen - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, c ng các cán bộ của các phòng ban
khác, thuộc Viện Nghiên c u hệ Gen đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi c ng xin chân thành cảm ơn nhà ngư loại học TS. Nguy n Văn Hảo
và TS. Nguy n Th iệu Phương thuộc Viện Nghiên c u Nuôi tr ng Thủy sản I
c ng anh H nốt - người dân tộc Vân Kiều đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong việc
thu thập và phân loại hình thái các mẫu cá nghiên c u.
Cuối c ng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và tập th lớp Cao học Công
nghệ sinh học K6B đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
và thực hiện luận văn.

Th i Ngu n ng

17 tháng 11 năm 2015

H

viên

Nguy n Th Th y inh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ii

ỜI CA

ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này hoàn toàn được trình bày dựa trên kết quả
nghiên c u khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn của chuyên môn của TS.
Kim Th Phương Oanh, trư ng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên c u
hệ Gen, c ng với sự hướng dẫn k thuật của các cán bộ trong phòng Hệ gen học
môi trường. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này là
trung thực, không sao chép t bất c tài liệu, công trình nghiên c u của người
khác mà không chỉ rõ ngu n tham khảo. Tôi xin ch u trách nhiệm về lời cam
đoan của mình trước hội đ ng nhà trường.
Thái Nguyên, ngày 17 tháng 11 năm 2015

H

viên

Nguy n Th Th y inh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iii

C

C

ỜI CẢ

N ........................................................................................................................ i

ỜI CA

ĐOAN ................................................................................................................ ii

C

C ............................................................................................................................. iii

ANH

C C C K HI U C C CH

VI T TẮT .......................................... v

ANH

C C C ẢNG ............................................................................................... vi

ANH

C C C H NH ............................................................................................... vii

Đ U ................................................................................................................................. 1
Chương 1: T NG QUAN T I I U ........................................................................... 3
1.1. T ng quan về giống cá

ng ...................................................................................... 3

1.1.1. V tr phân loại và phân bố.............................................................................. 3
1.1.2. Đ c đi m sinh học ............................................................................................. 4
1.1.3. Giá tr kinh tế...................................................................................................... 5
1.2. Nghiên c u phân loại cá .............................................................................................. 5
1.2.1. Khái niệm về hệ thống phân loại cá ............................................................. 5
1.2.2. Đ c đi m hình thái thường d ng trong phân loại cá................................ 6
1.2.3. Phân loại học phân t trong phân loại cá.................................................... 6
1.2.4. Tình hình nghiên c u phân loại cá

Việt Nam ........................................ 9

1.3. Đ c đi m hệ gen ty th và vai trò của gen ty th trong phân loại phân t .... 11
1.3.1. Đ c đi m hệ gen ty th .................................................................................. 11
1.3.2. S d ng gen ty th trong phân loại phân t ............................................. 12
1.3.3. Hệ gen ty th của một số loài thuộc giống cá

ng Spinibarbus).... 12

Chương 2: VẬT I U V PHƯ NG PH P NGHI N C U .......................... 14
2.1. Vật liệu ........................................................................................................................... 14
2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................................... 14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iv

2.1.2. Hóa chất ............................................................................................................. 15
2.1.3. Thiết b , d ng c nghiên c u ....................................................................... 16
2.2. Phương pháp nghiên c u ........................................................................................... 17
2.2.1. Phương pháp nghiên c u hình thái ............................................................. 17
2.2.2. Phương pháp nghiên c u sinh học phân t ............................................... 17
Chương 3: K T QUẢ NGHI N C U V THẢO UẬN.................................. 27
3.1. Kết quả phân loại về m t hình thái.......................................................................... 27
3.2. Kết quả tách chiết N t ng số .............................................................................. 28
3.3. Kết quả khuếch đại gen 16S rRN và COI b ng k thuật PCR...................... 29
3.4. Kết quả tinh sạch sản ph m PCR............................................................................. 30
3.5. Kết quả giải trình tự gen ............................................................................................ 31
3.5.1. Kết quả giải mã đoạn gen 16S rRN của ba mẫu cá nghiên c u ..... 31
3.5.2. Kết quả giải mã đoạn gen COI của ba mẫu cá nghiên c u ................. 34

3.6. Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa trên
đoạn gen 16S rRN và COI .................................................................................... 38
3.6.1. Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa
trên đoạn gen 16S rRN ......................................................................... 38
3.6.2. Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa
trên đoạn gen COI ...................................................................................... 43
3.7. Đánh giá t nh hiệu quả của N barcoding s d ng đ phân loại giống
cá ng Spinibarbus) ............................................................................................... 48
K T UẬN V KI N NGH ....................................................................................... 49
T I I U THA
PH

KHẢO .............................................................................................. 50

C ............................................................................................................................. 56

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




v

ANH

C C C K HI U C C CH

VI T TẮT

COI

Cytochrome c Oxidase subunit I

DNA

Deoxyribonucleic Acid

bp

basepair

dNTP

deoxynucleotide triphosphate

ddNTP

dideoxynucleotide triphosphate

EDTA

Ethylene-Diamine-Tetra-Acetic acid

epp

eppendorf

EtBr

Ethidium Bromide

Kb

Kilobase

K2P

Kimura 2-Parameter

mM

milliMol

ML

Maximum Likelihood

MP

Maximum Parsimony

mtDNA

mitochondrial DNA

ng

nanogram

NJ

Neighbour Joining

OD

Opitical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

pmol

picomol

Primer F

Primer Forward

Primer R

Primer Reverse

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

TAE

Tris base-Acetic acid-EDTA

µl

microliter

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vi

ANH

C C C ẢNG

ảng 2.1: Các hóa chất được s d ng ................................................................. 15
ảng 2.2: Các thiết b , d ng c được s d ng .................................................... 16
ảng 2.3: Các c p m i s d ng trong nghiên c u .............................................. 19
ảng 2.4: Thành phần phản ng PCR ................................................................. 22
ảng 3.1: ảng kết quả xác đ nh n ng độ và O 260/280 N t ng số của các
mẫu cá nghiên c u ............................................................................... 28
ảng 3.2: ảng kết quả xác đ nh n ng độ và O 260/280 sản ph m PCR của
các mẫu cá nghiên c u sau khi đã được tinh sạch ............................... 30
ảng 3.3: ảng thống kê một phần kết quả L ST đối với đoạn gen 16S
rRN của ba mẫu nghiên c u.............................................................. 32
ảng 3.4: ảng thống kê một phần kết quả L ST đối với đoạn gen COI
của ba mẫu nghiên c u ........................................................................ 35
ảng 3.5: ảng thống kê khoảng biến thiên khoảng cách di truyền một số
node trên cây phát sinh chủng loại Hình 3.4 cho sự phân tách rõ

các loài trong c ng một giống ............................................................. 41
ảng 3.6: Khoảng cách di truyền K2P gi a các loài cá nghiên c u và 4 loài
thuộc giống cá
ng đã được đ nh danh trên Gen ank t bộ d
liệu trình tự đoạn gen 16S rRNA ......................................................... 42
ảng 3.7: ảng thống kê khoảng biến thiên khoảng cách di truyền một số
node trên cây phát sinh chủng loại Hình 3.5 cho sự phân tách rõ
các loài trong c ng một giống ............................................................. 46
ảng 3.8: Khoảng cách di truyền K2P gi a các loài cá nghiên c u và 4 loài
thuộc giống cá
ng đã được đ nh danh trên Gen ank t bộ d
liệu trình tự đoạn gen COI ................................................................... 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vii

ANH

Hình 1.1: Sự phân bố của giống cá

C C C H NH

ng Spinibarbus) [26]. .............................. 4

Hình 1.2: Đ c đi m hình thái đ c trưng của giống cá

ng ................................. 4

Hình 2.1: Các mẫu cá s d ng trong nghiên c u ................................................ 14
Hình 2.2: Sơ đ thiết kế m i khuếch đại hai đoạn gen 16S rRN và COI ........ 20
Hình 2.3: Sơ đ chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen 16S rRN b ng
phản ng PCR ..................................................................................... 22
Hình 2.4: Sơ đ chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen COI b ng phản ng PCR...... 23
Hình 3.1: Kết quả điện di ki m tra sản ph m tách N t ng số trên gel
agarose 0,8% ........................................................................................ 28
Hình 3.2: Kết quả điện di ki m tra sản ph m PCR trên gel agarose ,8 ......... 29
Hình 3.3: Kết quả điện di ki m tra sản ph m PCR sau khi đã tinh sạch ............ 31
Hình 3.4: Cây phát sinh chủng loại NJ xây dựng dựa trên trình tự đoạn
gen 16S rRN của 3 mẫu cá nghiên c u và 4 loài cá khác
thuộc họ cá Chép ................................................................................. 39
Hình 3.5: Cây phát sinh chủng loại NJ xây dựng dựa trên trình tự đoạn gen
COI của 3 mẫu cá nghiên c u và 4 loài cá khác thuộc họ cá Chép ....... 44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1

Đ U
1.

h n

tài

Giống cá
ng (Spinibarbus là một trong nh ng giống cá thuộc họ cá
Chép Cyprinidae). Các loài cá thuộc giống cá
ng phân bố chủ yếu các
sông lớn ph a nam Trung Quốc, ph a bắc Việt Nam và Lào. Theo kết quả
nghiên c u gần đây, Việt Nam giống cá ng hiện có 13 loài, trong đó có 3
loài mới phát hiện có khả năng là loài mới. Việt Nam, cá ng được mệnh
danh là một trong 5 loại cá vua của sông suối Tây ắc rất được ưa chuộng,
cho thấy giá tr kinh tế cao của cá
ng nói riêng c ng như các loài thuộc
giống cá
ng nói chung. Giống cá
ng là một trong nh ng giống cá qu
hiếm, một số loài thuộc giống cá
ng hiện nay được ghi trong sách Đỏ Việt
Nam, có nguy cơ tuyệt chủng m c độ V và đ ng thời n m trong danh sách
đỏ có nguy cơ tuyệt chủng của IUCN International Union for Conservation
of Nature). Trước thực tế một số loài thuộc giống cá
ng có hình thái bên
ngoài tương đối giống nhau, nếu chỉ dựa vào đ c đi m hình thái s g p khó
khăn khi phân loại cấp độ loài ho c mẫu phân loại có k ch thước nhỏ. Hơn
n a, một số loài thuộc giống cá
ng mới được phát hiện, xét về m t hình
thái có khả năng là loài mới cần được kh ng đ nh lại m c độ phân t . Nh m
cung cấp ngu n d liệu về m t di truyền, h trợ việc nhận dạng một số loài cá
thuộc giống cá ng và kh ng đ nh lại một số loài được cho là loài mới thuộc
giống cá
ng được phát hiện Việt Nam. Chúng tôi đã tiến hành thực hiện
đề tài: Nghiên

u h n
i
t số ài
thu
giống
ng
(Spinibarbus ở Việt Na
ựa trên gen ty thể COI 16S rRNA .
2.

tiêu

a

tài

Xác đ nh chỉ th mã vạch phân t
N barcoding marker) cho một số
loài thuộc giống cá
ng Spinibarbus dựa trên phân t ch hai gen ty th :
cytochrome c oxidase subunit I (COI) và 16S rRN .
3. Đối tư ng và h
vi nghiên u
Một số loài được phân loại sơ bộ về m t hình thái thuộc giống cá
ng
(Spinibarbus) ho c được đánh giá có mối quan hệ di truyền rất gần g i với giống cá
ng được thu thập tại sông Đakrông, huyện Đakrông, tỉnh Quảng Tr , bao g m:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

2

 Cá ng nguy n Spinibarbus nguyenhuuduci sp.n)
 Cá Chầy đất Spinibarbus hollandi Oshima, 1919)
 Cá Cầy (Paraspinibarbus macracanthus)
Loài cá Cầy (Paraspinibarbus macracanthus về m t hình thái được phân
loại thuộc giống cá ng Spinibarbus b i Pellegrin và Chevey vào năm 1936
với tên khoa học là Spinibarbus macracanthus. Đến năm 1989, dựa trên sự khác
biệt về đ c đi m hình thái của loài cá Cầy với các loài cá thuộc giống
Spinibarbus nên loài cá Cầy đã được phân loại lại và được tách thuộc một giống
riêng với tên gọi Paraspinibarbus trong họ cá Chép Cyprinidae) [21].
4. N i ung nghiên u
 Phân lập và xác đ nh một phần trình tự của hai gen ty th COI, 16S
rRN
3 loài cá : cá ng nguy n (Spinibarbus nguyenhuuduci sp.n), cá Chầy
đất Spinibarbus hollandi Oshima, 1919 , cá Cầy Parapinibarbus
macracanthus).
 Phân t ch gen ty th COI và 16S rRNA nh m xác đ nh chỉ th mã vạch
phân t
N barcoding marker d ng đ phân biệt loài trong giống
Spinibarbus.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




3

Chương 1
T NG QUAN T I I U
1.1. T ng uan v giống
1.1.1. V tr

h n

ng

i và h n ố


Ngành động vật có dây sống Chordata)
Lớp cá Xương (Actinopterygii)
ộ cá Chép Cypriniformes)
Họ cá Chép Cyprinidae)
Phân họ cá

ng Barbinae)

Giống cá
Theo d liệu trên ish ase, giống cá

ng Spinibarbus)
ng hiện có 11 loài [25].

Việt

Nam, trong khuôn kh dự án ảo t n và phát tri n ngu n lợi thủy sản v ng cao

High RCS được thực hiện

Đakrông, tỉnh Quảng Tr b i Viện Nghiên c u

Nuôi tr ng Thủy sản I, giống cá

ng được phát hiện có 13 loài, trong đó có 1

loài đã được thống kê trên ish ase và ba loài có khả năng là loài mới đã được
phân loại sơ bộ về m t hình thái bao g m: cá ulu (Spinibarbus hoenoti sp.n),
cá

ng nguy n (Spinibarbus nguyenhuuduci sp.n) và cá

ng vây đen

(Spinibarbus nigripinnis sp.n) [12]. Đối với ba loài cá mới được phát hiện, cần
có nh ng nghiên c u về m t di truyền đ kh ng đ nh đây là cá loài mới.

Nhìn chung, các loài thuộc giống cá

ng sống

trung và thượng lưu các

sông lớn ph a nam Trung Quốc, ph a bắc Việt Nam và Lào. Sự phân bố của
giống cá

ng được th hiện

Hình 1.1.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




4

H nh 1 1: Sự phân bố của giống cá

ng Spinibarbus) [26].

Việt Nam, các loài thuộc giống cá ng thường sống trung và thượng
lưu các con sông lớn các tỉnh ph a bắc Việt Nam như sông H ng Yên ái tr
lên , sông Lam Nghệ n hay sông Trà Khúc Quảng Ngãi ,
1.1.2. Đ

iể

sinh h


Xét về m t hình thái, đ c đi m chung nhất của tất cả các loài thuộc giống cá
ng được s d ng đ phân biệt giống cá ng với các giống cá khác thuộc họ
cá Chép Cyprinidae) là chúng đều có gai ngược ph a trước vây lưng và vây
hậu môn có 5 tia phân nhánh Hình 1.2 .

H nh 1 2: Đ c đi m hình thái đ c trưng của giống cá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

ng




5



: Giống cá ng thường sống v ng nước chảy và trong.
Đây là giống cá ưa nước sạch, do đó ngu n nước trong ao ho c b nuôi cá
phải liên t c được lưu thông [14].



ă : Th c ăn chủ yếu của các loài thuộc giống cá ng là các loài động
vật không xương sống, ấu tr ng, côn tr ng trư ng thành, giun t tơ, giáp xác,
tôm, ốc, hến,



: Nhìn chung, các loài thuộc giống cá ng thành th c muộn, nuôi
khoảng 1 năm mới bắt đầu sinh đ và t lệ sống thấp v d như cá ng
khoảng 3 -4
. Đây là khó khăn lớn nhất trong việc phát tri n nuôi các loài
cá thuộc giống cá ng [9].

1.1.3. Gi tr

inh t

Nhìn chung, các loài thuộc giống cá
ng giàu giá tr dinh dưỡng, chất
lượng th t thơm ngon, do vậy giá tr về m t kinh tế của giống cá ng là rất cao.
Hiện nay, các loài cá thuộc giống cá ng nước ta đang được m rộng nghiên
c u và chuy n giao công nghệ nhân giống và nuôi cá đ tr thành các loài cá
thương ph m. Đi n hình là mô hình nuôi cá ng được phát tri n trong nh ng
năm gần đây một số tỉnh miền núi như: Hà Giang, Yên ái, Hòa ình, Thanh
Hóa. Theo c c Thủy sản Hòa ình, cá
ng hiện nay là một trong nh ng đối
tượng nuôi l ng ch nh của tỉnh, m i năm có th cung cấp ra th trường 5-6 tấn cá
thương ph m [9].
1.2. Nghiên
1.2.1. Kh i niệ

u h n

i

v hệ thống h n

i

Hệ thống phân loại cá là một hệ thống g m các cấp phân loại t thấp đến
cao theo th tự sau: loài, giống, họ, bộ, lớp, ngành, giới. Theo đó, loài được xem
là cấp phân loại cơ bản nhất.
các hệ thống phân loại cá hiện nay, ngoài các cấp phân loại ch nh k trên,
chúng ta có th g p các cấp phân loại ph như: ngành ph , lớp ph , bộ ph , họ
ph , loài ph . T một loài có th chia ra làm hai hay nhiều loài ph . Loài ph là

tập hợp của nhiều cá th có nhiều đ c đi m phân loại giống nhau và c ng phân
bố một v ng đ a l nhất đ nh. Gi a các loài ph trong c ng một loài s có một
vài sai khác phân loại [7].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




6

Trên thế giới có hai hệ thống phân loại cá được s d ng ph biến là: hệ
thống phân loại cá của Lindberg 1971 và hệ thống của schmeyer 1998 . Tuy
nhiên hệ thống phân loại cá của Eschmeyer (1998) được s d ng ph biến, vì
các tác giả này đã dựa trên nh ng nghiên c u mới nhất về giải phẫu, sinh l , sinh
hóa, di truyền, đ sắp xếp các loài cá vào hệ thống phân loại. Ch nh vì thế, hệ
thống phân loại cá này v a mang t nh hiện đại, v a có độ tin cậy cao hơn.
1.2.2. Đ

iể

h nh th i thư ng

ng tr ng h n

i


 Đếm tia vi của các vi như: vi lưng, vi hậu môn, vi ngực, vi b ng
 Đếm v y:
 V y đường bên: Đếm tất cả nh ng v y có ống cảm giác t sau l mang đến

gốc của các tia vi đuôi.
 V y trên đường bên: Đếm nh ng v y thuộc hàng v y n m
đường bên.

bên trên của

 V y quanh cuống đuôi: Đếm nh ng v y quanh phần cuống đuôi.

 Đo các chỉ tiêu thuộc về chiều dài như: Chiều dài toàn thân cá, chiều dài cá
bỏ đuôi, chiều dài đầu, chiều dài mõm, chiều dài cuống đuôi, chiều dài tia
dài nhất của vây đuôi, chiều dài tia gi a vây đuôi.
 Đo các chỉ tiêu thuộc về chiều cao và khoảng cách như: Chiều cao thân,
chiều cao đầu qua gi a mắt, chiều cao đầu qua bờ trước và bờ sau của mắt,
chiều cao cuống đuôi, đường k nh mắt, khoảng cách gi a hai mắt.

 Quan sát hình dạng toàn thân và hình dạng của các cơ quan trên cơ th cá.
 Quan sát màu sắc toàn thân và màu sắc của các cơ quan trên cơ th cá [7].
1.2.3. Ph n

ih

h n t tr ng h n

i

Phân loại học phân t molecular taxonomy là phương pháp phân loại các
loài sinh vật dựa trên các d liệu m c độ phân t
N , protein [37].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

7

ựa trên các kết quả phân t ch, so sánh trình tự N ho c protein của sinh
vật, hệ thống phân loại của nhiều họ sinh vật đã được sắp xếp lại. Năm 2 8,
Cooper và cộng sự đã công bố nghiên c u sự phát sinh loài của họ cá
Pomacentridae thuộc bộ cá Perciformes). N t ng số của tất cả 1 4 loài
thuộc tất cả các giống n m trong họ cá Pomacentridae và 1 loài ngoài nhóm t
các họ cá khác thuộc bộ cá Perciformes bao g m họ cá Cichlidae,
Embiotocidae và Labridae) đã được tách chiết. Sau đó ba đoạn gen nhân g m:
rag1 9 3 bp , rag2 8 2 bp , bmp4 553 bp và ba đoạn gen ty th g m: 12S
rRN 1 27 bp , 16S rRN 598 bp , N 3 4 8 bp được khuếch đại và giải
trình tự. D liệu trình tự các gen thu được được d ng đ xây dựng cây phát sinh
chủng loại theo phương pháp Maximum Likelihood ML và Maximum
Parsimony (MP) b ng cách s d ng phần mềm Mr ayes v3.1.2, Garli v .951 và
PAUP* v4.0b10. Kết quả cây phân loại cho thấy có 5 nhánh ch nh trong họ cá
Pomacentridae được tạo ra trên cây phân loại với 5 họ ph , bao g m:
Stegastinae, Lepidozyginae, Chrominae, Abuderdufinae và Pomacentrinae. Kết
quả phân t ch số liệu ML và ayesian cho thấy các loài trong nhánh lớn chủ yếu
là các loài cá lớn, các loài cá ăn sinh vật đáy thuộc 9 giống [22]. Năm 2 12,
Costa và cộng sự đã s d ng DNA barcoding đ xây dựng một hệ thống cấp bậc
cho các loài cá bi n Portugal, thông qua việc phân t ch v ng trình tự gen COI5P của 1 2 loài cá được nhận dạng về m t hình thái. Các mẫu cá thu thập được
tách N t ng số t mô th t. Sau đó, khuếch đại b ng phản ng PCR v ng gen
COI 652 bp . Tất cả sản ph m PCR được tinh sạch và được đọc trình tự t cả
m i xuôi và m i ngược. Kết quả xác đ nh trình tự được dóng hàng s d ng
MEGA v4.1 và đưa lên GenBank và OL (Barcode of Life Data Systems).
Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên phương pháp Neighbour Joining
(NJ) với giá tr bootstrap 1

lần và khoảng cách di truyền được t nh toán theo
thuật toán Kimura 2-Parameter K2P được s d ng đ phân t ch sự phát sinh
loài. Kết quả phân t ch cây phát sinh chủng loại cho thấy 1 2 loài cá nghiên c u
thuộc 79 giống, 54 họ và 22 bộ; khoảng cách di truyền trung bình trong c ng
loài và khoảng cách di truyền trung bình khác loài được t nh theo thuật toán K2P
tương ng là ,32 và 8,84%. Tất cả các mẫu đã được sắp xếp thành 5 cấp độ
khác nhau -E), theo độ tin cậy và sự ph hợp gi a nhận dạng hình thái loài
c ng chu n đoán tương ng dựa trên N barcoding của chúng, cấp độ
chiếm 73,5 bao g m các loài được nhận dạng rõ ràng về m t hình thái, cấp độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




8

chiếm 7,8% g m các thành phần trong nhóm ph hợp với sự phân loại dựa
trên N barcoding nhưng còn cần sự kh ng đ nh lại của nh ng nghiên c u tiếp
theo, còn lại là các loài nhận dạng với các cấp độ thấp của độ tin cậy cấp độ C
đến chiếm 18,7% [23].
Với nh ng đ c t nh hình thái th hiện một cách không rõ ràng trong mô tả
cấp độ loài sinh vật, thông tin trình tự N có nh ng đóng góp quan trọng trong
việc chu n đoán đ c t nh của loài. một số t các loài chưa được phân loại rõ,
thông tin t
N có th coi như căn c đ mô tả trong phân loại. o đó,
phương pháp phân loại phân t kết hợp với phương pháp phân loại truyền thống
trong việc xác đ nh và mô tả một loài sinh vật, đ c biệt là các loài mới được xem
là rất cần thiết [27].
Năm 2 3, Paul Hebert, nhà nghiên c u tại Đại học Guelph Ontario,
Canada đã đề xuất khái niệm

N barcoding mã vạch N như là một
cách đ xác đ nh loài thông qua việc so sánh các trình tự một đoạn N ngắn
(DNA barcoding t một mẫu chưa biết với một thư viện các trình tự DNA của
các loài đã biết. Điều này cho phép đ nh danh một sinh vật tại bất kỳ giai đoạn
phát tri n nào t một mẫu mô rất nhỏ, dạng tươi ho c dạng bảo t n trong nhiều
năm trước [1]. T khái niệm này có th thấy N barcoding đóng vai trò như
một công c mang t nh ng d ng cao h trợ hiệu quả cho công tác phân loại sinh
vật.
Cá, d liệu di truyền s d ng k thuật N barcoding đã và đang được
b sung và s d ng một cách có hiệu quả trong việc nhận dạng và xác đ nh loài
mới. Năm 2 11, Zhang đã s d ng một đoạn gen COI có k ch thước 652 bp làm
N barcoding đ nhận dạng các loài cá bi n Trung Quốc. Đầu tiên, 329 mẫu
thuộc 1 loài, bảo quản trong c n 7
được tách chiết N t ng số. Sau đó
một đoạn v ng 5 trên gen ty th COI được khuếch đại b ng phản ng PCR,
sản ph m PCR sau đó được s d ng đ xác đ nh trình tự. Trình tự giải mã được
dóng hàng s d ng phần mềm S QSC P v2.5, sự sai khác của trình tự được
t nh theo thuật toán Kimura 2-Parameter (K2P). Cây NJ được tạo ra dựa trên
khoảng cách K2P s d ng phần mềm M G . Việc lựa chọn các nhóm phân
loại, phân t ch sự phát sinh loài được tiến hành b ng P UP* v4.0b10 s d ng
phương pháp MP với bootstrap 1
lần, kết quả đã phân loại 121 loài cá, các
loài khác nhau c ng được nhận dạng cấp độ giống [47]. C ng trong thời gian
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




9

này Gao và cộng sự đã s d ng một đoạn gen COI 6 9 bp đ h trợ cho phân
loại hình thái một loài cá mới thuộc bộ cá Perciformes Trung Quốc. Năm
2 13, Zhu và cộng sự c ng đã s d ng một đoạn gen COI có k ch thước khoảng
650 bp làm N barcoding đ nhận dạng các loài thuộc giống cá Chana [48].
1.2.4. T nh h nh nghiên

u h n

i

ở Việt Na

Thành phần khu hệ cá Việt Nam rất đa dạng và phong phú. o đó, nhiều
nghiên c u liên quan đến phân loại cá, đánh giá sự đa dạng của thành phần các
loài cá trong theo khu vực đ a l
nước ta đã được thực hiện trong suốt thời
gian qua:
Năm 2 8, Mai Viết Văn và cộng sự đã nghiên c u thành phần loài cá phân
bố Sóc Trăng- ạc Liêu. Kết quả đã phát hiện 239 loài cá thuộc 146 giống, 68
họ, 18 bộ. ộ cá Vược Perciformes chiếm số lượng loài lớn nhất với 126 loài
chiếm 52,72 , trong đó họ cá Khế Carangidae là họ có số lượng thành phần
loài phong phú nhất [16].
Năm 2 11-2012, Hoàng nh Tuấn và Nguy n Xuân Huấn đã công bố danh
m c thành phần loài cá của 2 xã a Nam và a Xa, huyện a Tơ, tỉnh Quảng
Ngãi, là đ a phận có nhiều sông lớn chảy qua. Kết quả phân t ch số liệu đã xác
đ nh bộ cá Chép Cypriniformes là bộ đa dạng nhất với 4 họ chiếm 23,5 và
27 loài chiếm 62,8 [15].
Năm 2 11, ương Văn Long đã xác đ nh thành phần loài cá của lưu vực
sông H ng, thuộc đ a phận thành phố Hưng Yên, huyện Kim Động, tỉnh Hưng
Yên. Kết quả bước đầu xác đ nh được 51 loài cá, thuộc 47 giống, 24 họ và 1

bộ. Trong đó, bộ cá Chép có số lượng loài lớn nhất chiếm 29, 2 [8].
Năm 2 13, Nguy n Th iệu Phương và cộng sự nghiên c u khu hệ cá
sông Đakrông, huyện Đakrông, tỉnh Quảng Tr trong khuôn kh dự án ảo t n
và Phát tri n ngu n lợi thủy sản v ng cao, cho thấy có 84 loài cá, thuộc 52
giống, 17 họ và 7 bộ khu vực này. Trong đó, cấu trúc taxon bậc họ thì bộ cá
Vược Perciformes) nhiều nhất với 7 họ chiếm 36,85 , cấu trúc taxon bậc
giống và bậc loài thì nhiều nhất là bộ cá Chép Cypriniformes với 39 giống
chiếm 65 và 78 loài chiếm 73,15 [12].
Các nghiên c u đánh giá sự đa dạng của thành phần các loài cá, không chỉ
d ng lại việc phân loại, thống kê thành phần các loài cá đã được mô tả, so sánh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




10

và đánh giá sự đa dạng của các họ cá, bộ cá đ a đi m nghiên c u. Các nghiên c u
còn phát hiện ra các loài cá mới, b sung ngu n d liệu quan trọng làm phong phú
thêm cho sự đa dạng thành phần các loài cá của khu hệ cá Việt Nam:
Năm 2 7, Nguy n H u ực và cộng sự đã công bố phát hiện một loài cá
mới thuộc phân giống Spinibarbichthys Oshima, 1926 thuộc giống
Spinibarbus và được đ t tên khoa học là Spinibarbus maensis [11].
Năm 2 12 Nguy n Văn Hảo và V Th H ng Nguyên đã mô tả một loài
mới thuộc giống cá
ng Spinibarbus Oshima được phát hiện tỉnh Tuyên
Quang [4].
Năm 2 13, Nguy n H u ực và cộng sự đã phát hiện loài cá mới
Acheilognathus nguyenvanhaoi sp.n, thuộc giống Acheilognathus Bleeker, 1859
n m trong họ cá Chép [2]. C ng trong thời gian này, Nguy n Văn Hảo và cộng

sự đã mô tả 3 loài cá mới thuộc giống cá ng Spinibarbus) được phát hiện
tỉnh Quảng Tr bao g m: cá ulu (S.hoenoti sp.n), cá
ng nguy n
(S.nguyenhuuduci sp.n) và cá ng vây đen (S.nigripinnis sp.n) dựa trên các đ c
đi m về m t hình thái [5].
Năm 2 15, Nguy n Văn Hảo và cộng sự đã dựa vào các đ c đi m hình thái
phát hiện 3 loài cá mới trong giống Silurus bao g m: S.caobangensis sp.n,
S.langsonensis sp.n, S.dakrongensis sp.n. Kết quả thu được đã nâng số loài trong
giống Silurus nước ta lên 5 loài [3].
ên cạnh đó, các nghiên c u phân t ch các đ c đi m hình thái và đ c đi m
di truyền đ c trưng cho t ng loài cá, nh m h trợ cho việc nhận dạng, đ nh danh
các loài cá nước ta c ng được tập trung nghiên c u:
Năm 2 13, Hà Phước H ng và H Kim Lợi đã nghiên c u hình thái đá tai
cơ quan tiếp nhận âm thanh và cân b ng của cá của 26 loài họ cá Chép
(Cyprinidae cho thấy có th dựa vào các đ c đi m riêng biệt của t ng loại đá tai
đ h trợ cho đ nh danh loài [6].
Năm 2 14, Đ ng V Hà Quyên và cộng sự đã phân loại một số loài cá
nước ngọt đ ng b ng sông C u Long dựa vào đ c đi m hình thái và s d ng
trình tự gen 16S rRNA (khoảng 6 bp của hệ gen ty th nh m xây dựng mối
quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cá nghiên c u đ ki m ch ng kết quả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




11

phân loại dựa vào hình thái. Cây phân loại cho thấy sự đ ng dạng của các giống
cá nghiên c u, tuy nhiên, có sự khác biệt trình tự gen 16S rRN gi a các loài
trong nghiên c u và loài tương ng trên GenBank [13].

1.3. Đ
1.3.1. Đ

iể

hệ gen ty thể và vai tr
iể

a gen ty thể tr ng h n

i h nt

hệ gen ty thể

Hệ gen ty th mt N bao g m các N mã hóa cho các protein riêng
chỉ có trong ty th , và chúng c ng được nhân lên trong ch nh ty th . Hệ gen ty
th ch a các nhóm gen mang t nh n đ nh cao, có hệ số đột biến thấp, sản ph m
của chúng có t nh bảo t n ch c năng nghiêm ng t và bảo thủ qua các thế hệ như
các gen sao mã các rRN riboxom .
N ty th mã hóa cho 2 rRN chỉ có duy nhất trong ribosome của ty
th , 2 đến 35 tRN cần cho quá trình vận chuy n trong ty th , và 13 protein
ti u đơn v của ph c hợp trong ty th có liên quan đến chu i hô hấp và sự t ng
hợp TP .
Hệ gen ty th có k ch thước đa dạng, v d : nấm men Saccharomyces
cerevisiae là 78 kb, nấm mốc Neurospora crassa là 6 kb, cá ng Spinibarbus
denticulatus là 16,5 kb,
tất cả các tế bào động vật đều có ch a N ty th , N ty th có tốc độ
thay đ i nhanh, chúng cung cấp nh ng sai khác quan trọng trong trình tự
mt N gi a các loài. Tốc độ tiến hóa của mt N là nhanh hơn t 5 đến 1 lần
genome nhân b i vì ty th không có enzyme s a ch a các sai sót trong quá trình tái

bản, hay nh ng sai hỏng đối với phân t
N . ng cách đó, mt N có cấp độ
thay đ i trình tự nucleotide và cấp độ thay đ i axit amin trong protein mã hóa s
cao.
động vật có vú, mt N tiến hóa rất nhanh chóng trong giới hạn các
nucleotide thay đ i, nhưng sự sắp xếp không gian của các gen và k ch thước của
genome là khá n đ nh gi a các loài [28]. Một số gen ty th được ng d ng nhiều
có th k đến như: gen cytochrome c oxidase subunit I COI và gen 16S rRNA.
COI (hay COX1) là một v ng gen mã hóa cho protein có m t với nhiều bản
sao trong m i tế bào. Hiệu quả s d ng gen COI đ phân biệt nhiều mẫu động
vật có c ng t tiên được ghi nhận tốt, thậm ch hiệu suất s d ng cao ngay cả
với các mẫu đã được lưu gi qua thời gian dài. Nhiều nghiên c u cho thấy COI
giúp phân biệt được khoảng 98 các loài với nhau [10].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




12

16S rRNA là một gen ty th mã hóa cho ti u đơn v nhỏ của riboxom. Gen
16S rRN chiếm 1 1 toàn bộ hệ gen ty th , và được s d ng rộng rãi trong
nghiên c u sự phát sinh loài vì tốc độ biến đ i tương đối nhanh của nó trong quá
trình tiến hóa và có t nh bảo t n cao. Gen 16S rRNA trong ty th đã được s
d ng đ khám phá mối quan hệ phát sinh loài cá với các cấp độ phân loại
khác nhau. V d
cấp bộ [34]; cấp họ [45 ; cấp phân họ [24] [35]; cấp độ giống
[33 ; và cấp loài [19 [24].
1.3.2. S

ng gen ty thể tr ng h n

i h nt

Với nh ng đ c đi m của các gen trong hệ gen ty th , đ c biệt là t nh n
đ nh cao, hệ số đột biến thấp, sản ph m của các gen có t nh bảo t n ch c năng
nghiêm ng t và bảo thủ qua các thế hệ, nhiều gen trong hệ gen của ty th đã
được nghiên c u và ng d ng trong phân loại phân t , đ c biệt là trong việc
xây dựng bộ d liệu N barcoding trong nhận dạng cấp độ loài.
Năm 2 13, Wang và cộng sự đã phân loại hình thái và kết hợp với phân
loại di truyền phân t cho thấy mối quan hệ gần g i của tất cả các loài, loài ph
của giống cá Percocypris dựa trên phân t ch 3 gen ty th 16S rRN , COI và
CYTB và một gen nhân rag2) [43].
Năm 2 1 , Tang và cộng sự đã ki m tra mối quan hệ phát sinh chủng loại
của họ ph Danioninae , thuộc bộ cá Chép (Cypriniformes s d ng d liệu trình
tự của 2 gen ty th : COI, CYTB và 2 gen nhân: rag1 và RH [40].
1.3.3. Hệ gen ty thể

a

t số

ài thu

giống

ng Spinibarbus)

Năm 2 13, genome ty th của S. denticulatus có k ch thước 16549 bp đã
được giải mã, bao g m: 13 gen mã hóa protein, 22 gen tRN và 2 gen rRN

[42]. Genome ty th của S. denticulatus được công bố trên GenBank mang mã
số KC852197.1.
Sau đó, Ai và cộng sự đã tiếp t c giải mã được toàn bộ genome ty th của
S. caldwelli với k ch thước là 16545 bp, được công bố trên GenBank mang mã
số K 134718.1.
Năm 2 14, Ma và cộng sự đã giải mã toàn bộ genome ty th của S. sinensis
với k ch thước 16591 bp và được công bố trên GenBank mang mã số
KC579368.1. Genome ty th của S. sinensis bao g m 13 gen mã hóa protein, 22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




13

gen tRNA, 2 gen rRNA và một v ng điều khi n. Kết quả cho thấy có 8 gen
tRN , gen N 6 và tất cả các gen ty th khác được mã hóa trên chu i n ng. Có
1 v ng gen ch ng chéo lên nhau với k ch thước 3 bp và có 13 v ng đệm gi a
các gen với t ng k ch thước là 69 bp [31].
C ng trong năm 2 14, Chen và cộng sự đã giải mã toàn bộ hệ gen ty th
của S.hollandi Oshima với k ch thước 16521 bp và mã số trên GenBank là
KM401858.1. Hệ gen ty th của S.hollandi g m 13 gen mã hóa protein, 22 gen
tRNA, 2 gen rRNA, và một v ng điều khi n không mã hóa CR . CR có k ch
thước 867 bp n m v tr gi a tRN Pro và tRN Phe. Thành phần trung bình của
các bazơ của S.hollandi là: 31,87
; 26,56 C; 25,89 T và 15,68 G [20].
Các d liệu về hệ gen ty th của các loài thuộc giống cá ng được công bố
trên GenBank đã được đề cập trên cung cấp ngu n tài liệu tham chiếu quan
trọng trong nghiên c u này.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




14

Chương 2
VẬT I U V PHƯ NG PH P NGHI N C U
2.1. Vật iệu
2 1 1 Nguyên iệu
Các mẫu cá được nhận dạng sơ bộ về m t hình thái thuộc ho c có quan hệ
gần g i với giống cá ng s d ng đ nghiên c u được thu thập trực tiếp trên
sông Đakrông, xã Đakrông, huyện Đakrông, tỉnh Quảng Tr , được th hiện
Hình 2.1.

H nh 2 1: Các mẫu cá s d ng trong nghiên c u
ảo quản mẫu : Mẫu cá ngay sau khi thu thập được ngâm và bảo quản trực
tiếp trong dung d ch ethanol 1
, điều kiện nhiệt độ phòng khoảng 25oC).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




15

2 1 2 Hóa hất
Các hóa chất s d ng trong nghiên c u này được cung cấp b i Phòng Hệ

gen học môi trường, Viện Nghiên c u hệ Gen, được trình bày
ảng 2.1.
Bảng 2.1: Các hóa chất được s d ng
STT
1

Th nghiệ

Tên hóa hất

Tách chiết và tinh H n hợp dung d ch Solution1: Tris HCl 10 mM,
sạch N t ng số EDTA 100 mM, SDS 2%
ung d ch Amonium axetat 7,5 M (Solution 2)
Proteinase K (20 mg/ml)
Ethanol 100%
Ethanol 70%

2

Điện di

Agarose
TAE
Bromophenol blue 0,25%
Ethidium bromide 0,1µg/ml.

3

PCR

dNTPs 10 mM
Taq DNA polymerase
Buffer 10X

4

Tinh sạch N

GeneJET PCR Purification Kit (Lithuania-EU)

5

Sequencing

BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
Ethanol
EDTA; Hi-Di Formamide

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




16

2.1.3. Thi t

ng

nghiên

u

Bảng 2.2: Các thiết b , d ng c được s d ng
Dụ

STT
1

àn soi gel với tia UV
Transilluminator, M

2

Máy n nhiệt ThermoMixer C, M

3

ộ ngu n điện di và b điện di ngang
PowerPac 3
io-Rad, M

4

Cân điện t
Th y S

5

Lò vi sóng Sarp, Nhật ản

Lọ thủy tinh Pyrex các cỡ

6

Máy đo pH Mettler, Th y S

Kh u trang

7

Máy ly tâm Eppendorf 5415C
(Biofuge, Sorvall)

Găng tay cao su

Máy lắc (Eppendorf)

Micropipet 1
Pháp

l Gilson,

Máy PCR Veriti 96 well Thermal
Cycler
I, M ,

Micropipet 2
Pháp

l Gilson,

Máy speed Vac (Eppendorf)

Micropipet 1
Pháp

l Gilson,

Máy giải trình tự gen
I PRISM®
3100 Avant Genetic Analyzer)

Micropipet 2
Pháp

l Gilson,

Máy khuấy trộn Vortex OSI Rotolab

Micropipet 1
Pháp

Tủ lạnh nhiệt độ 40C, - 200C Sanyo,
Nhật ản

Đầu côn các cỡ, ph hợp với
t ng loại micropipet

Máy đo O

ng eppendorf các cỡ ,2ml;
0,5ml; 1ml; 2ml

8

9
10
11
12
13
14

enchtop UV

ụ

Mettler Toledo 1

-4

g,

ioSpectrometer, M

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

ình đựng đá
ình tam giác các cỡ
Cốc đong

ng đong

l Gilson,