Khảo sát khả năng biến nạp gen GmCHS7 vào đậu tương (glycine max (l ) merrill) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------------

TRẦN QUỐC BẢO
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG BIẾN NẠP GEN GmCHS7
VÀO ĐẬU TƢƠNG (Glycine max (L.) Merrill)
THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng
2. TS. Trần Đức Long

Hà Nội – 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nghiên cứu trong luận văn này hoàn toàn trung thực và chưa từng được sử dụng
hoặc công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các
thông tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn

Trần Quốc Bảo

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Văn
Đồng – Giám đốc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện
Di truyền Nông nghiệp đã hướng dẫn tận tình và giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện và hoàn thành luận văn thạc sỹ.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Đức Long – Giảng viên Bộ
môn Di truyền học – Khoa Sinh học – Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc
Gia Hà Nội, đã giúp đỡ và đóng góp ý kiến hết sức tận tình để tôi hoàn thành luận
văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ , những ý kiến
đóng góp , sự hướng dẫn tận tình của TS. Nguyễn Anh Vũ – Cán bộ Phòng thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp
trong quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng Thí nghiệm Trọng điểm
Công nghệ tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình
trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học - Khoa
Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giúp đỡ nhiệt tình và đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi trong thời gian học tập cũng như khi hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè, những
người mà đã luôn quan tâm, ủng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi
làm luận văn này, cũng như trong cuộc sống.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó.
Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2015
Học viên
Trần Quốc Bảo

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
1.1. Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây đậu tương trong hệ thống cây trồng ...... 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ............................................................................................. 3
1.1.2. Tầm quan trọng của cây đậu tương ........................................................................... 4
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam ........................................ 5
1.1.4. Đặc tính chống chịu hạn của cây đậu tương............................................................. 8
1.2. Vi khuẩn A. tumefaciens và phương pháp biến nạp gen ở thực vật ............. ..9
1.2.1. Cấu trúc và chức năng của Ti – plasmid................................................................. 10
1.2.2. Cấu trúc và chức năng của đoạn T – DNA............................................................. 11
1.2.3. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens ........................... 12
1.2.4. Tương tác giữa T - DNA và genome tế bào thực vật ............................................ 13
1.2.5. Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens....................................................................................................... 15
1.2.6. Gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc.............................................................................. 17
1.3. Gen liên quan đến khả năng chịu hạn và gen GmCHS7 .............................. 19
1.3.1. Khái quát về các gen liên quan đến khả năng chịu hạn ......................................... 19
1.3.2. Gen GmCHS7 ........................................................................................................... 21
1.4. Phương pháp chuyển gen ở đậu tương ....................................................... 22
1.4.1. Sử dụng súng bắn gen .............................................................................................. 22
1.4.2. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .................................................... 23
1.5. Tình hình sản xuất cây đậu tương biến đổi gen .......................................... 27
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 29
2.1. Vật liệu ...................................................................................................... 29
2.1.1. Vật liệu thực vật ....................................................................................................... 29
2.1.2. Vật liệu di truyền ...................................................................................................... 31
2.1.3. Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.......................................................................... 31

2.1.4. Hóa chất .................................................................................................................... 32
2.1.5. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................................ 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 32
2.2.1. Quy trình biến nạp gen vào các giống đậu tương .................................................. 32
2.2.2. Sàng lọc, phân tích cây chuyển gen ........................................................................ 35
2.3. Xử lý số liệu .............................................................................................. 42
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 44
3.1. Đánh giá khả năng cảm ứng tạo chồi và đặc tính đa chồi của các giống đậu
tương nghiên cứu .............................................................................................. 44
3.2. Đánh giá khả năng sống sót và kéo dài chồi trong môi trường chọn lọc của
các giống đậu tương ......................................................................................... 45
3.3. Đánh giá hiệu quả biến nạp gen GmCHS7 vào giống đậu tương chọn lọc .. 48
3.3.1. Đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua biểu hiện của gen bar.......................... 48
3.3.2. Kết quả PCR với cặp mồi đặc hiệu gen GmCHS7 ................................................. 51
3.4. Kết quả phân tích Southern blot và hiệu quả chuyển gen GmCHS7............ 53
3.5. Phân tích khả năng phân ly của gen GmCHS7 ở thế hệ T1 ......................... 56
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 61
1. Kết luận ........................................................................................................ 61
2. Đề nghị ......................................................................................................... 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 62


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều nhất thế giới năm 2013 ................ 5
Bảng 1.2. Sản lượng và diện tích đậu tương của Việt Nam từ 2011 – 2015 .............. 6
Bảng 1.3. Một số các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) ...................... 18
Bảng 1.4. Một số các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes) ..................... 19
Bảng 2.1.Hóa chất sử dụng trong phân tích Southern blot ....................................... 37
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl ................................. 38
Bảng 3.2. Kết quả theo dõi khả năng sống sót trên môi trường có chất chọn lọc của

các giống đậu tương .................................................................................................. 46
Bảng 3.3. Biểu hiện của các cây đậu tương sau 2 lần phun Basta ........................... 49
Bảng 3.4. Kết quả phân tích PCR các cây có biểu hiện kháng với Basta ................. 52
Bảng 3.5. Hiệu quả chuyển GmCHS7 vào giống đậu tương ĐT22 ở thế hệ T0 ....... 55
Bảng 3.6. Kết quả phun Basta và phân tích PCR các dòng đậu tương ở thế hệ T1 .. 56
Bảng 3.7. Tỷ lệ phân ly của các dòng đậu tương giống ĐT22 ở thế hệ T1 .............. 59


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011 - 2015) .. 7
Hình 1.2 . Bản đồ Ti - plasmid .................................................................................. 11
Hình 1.3. Cấu trúc T – DNA ..................................................................................... 12
Hình 1.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens ............... 13
Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể ..................................................................... 16
Hình 1.6. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp .................................................................. 17
Hình 2.1. Sơ đồ vector pZY101 - 35S ...................................................................... 31
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình biến nạp và tái sinh cây đậu tương từ nốt lá mầm........... 33
Hình 3.1. Chồi tái sinh và kéo dài trong môi trường SEM của giống ĐT22 ............ 47
Hình 3.2. Chồi đậu tương trong môi trường ra rễ ..................................................... 48
Hình 3.3. Biểu hiện của các cây đậu tương sau khi phun Basta ............................... 49
Hình 3.4. Biểu hiện của các cây đậu tương sau khi phun Basta ............................... 50
Hình 3.5. Kết quả điện di DNA tổng số các cây T0 của giống ĐT22 ...................... 51
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen GmCSH7 ở các dòng của giống đậu
tương ĐT22 thế hệ T0 ............................................................................................... 52
Hình 3.7. Kết quả điện di DNA tổng số và kết quả lai Southern blot của các dòng
đậu tương ĐT22 ở thế hệ T0 ..................................................................................... 54
Hình 3.8. Các dòng đậu tương của giống ĐT22 mang gen GmCHS7 ở thế hệ T1 ... 57
Hình 3.9 .Biểu hiện của các dòng đậu tương giống ĐT22 mang gen GmCHS7 ở thế
hệ T1 sau khi phun Basta .......................................................................................... 57
Hình 3.10. Biểu hiện của các dòng đậu tương giống ĐT22 mang gen GmCHS7 ở thế

hệ T1 sau khi phun Basta .......................................................................................... 58
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen GmCHS7 một số dòng của ............ 58
giống đậu tương ĐT22 ở thế hệ T1 ........................................................................... 58
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen GmCHS7 một số dòng của giống .. 59
đậu tương ĐT22 ở thế hệ T1 ..................................................................................... 59


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
A. tumefacien: Agrobacterium tumefaciens
AS

: Acetosyringone

BAP

: 6 - Benzylaminopurine

bp

: base pair (cặp bazơ)

Bar

: gen kháng thuốc diệt cỏ Phosphinothricin (PPT)

CCM

: Co – cultivation medium (môi trường đồng nuôi cấy)

DNA

: Deoxyribo Nucleic Acid

EDTA

: Ethylene Diamine Tetraacetace Acid

Et - Br

: Ethidium Bromide

GM

: Germination medium (môi trường nảy mầm)

NAA

: α - Napthalene acetic acid

MS

: Murashige and Skoog, 1962

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RM

: Root medium (môi trường ra rễ)

OD

: Optical Density (mật độ quang học)

SIM

: Shoot induction medium (môi trường tạo chồi)

SEM

: Shoot elongation medium (môi trường kéo dài chồi)

TAE

: Tris - Acetate- EDTA

TE

: Tris - EDTA

T - DNA

: Transfer DNA (ADN chuyển)

Ti - Plasmid : Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật)
VIR

: Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u)

2,4 - D

: Dichlorophenoxy acetic acid

& cs

: và cộng sự.


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng có vị trí quan trọng ở Việt
Nam, cũng như nhiều nước trên thế giới. Với giá trị dinh dưỡng cao, hạt đậu tương
được sử dụng làm thực phẩm giàu đạm và chất béo cho người, chế biến thức ăn
chăn nuôi, cung cấp nguyên liệu cho ngành chế biến dầu thực vật và một số ngành
công nghiệp khác [2]. Ngoài ra đậu tương còn là cây trồng lý tưởng trong hệ thống
luân canh do có khả năng cố định Nitơ khí quyển thông qua nốt sần ở rễ và khả
năng cải tạo đất tơi xốp.
Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam 2014, diện tích đậu tương ở
nước ta hiện đạt khoảng 117.000 ha với năng suất bình quân 1,43 tấn/ha và tổng sản
lượng đạt trên 176,4 ngàn tấn. Sản lượng sản xuất ra chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu
thụ trong nước, vì vậy hàng năm nước ta phải nhập khẩu khối lượng đậu tương rất lớn
[12]. Những năm gần đây con người đang phải đối mặt với sự biến đổi của khí hậu
toàn cầu. Sự thiếu hụt nước ngọt trầm trọng, cũng như diễn biến phức tạp của khí
hậu như hạn hán, mưa lũ,… cùng với sự gia tăng của dịch hại đã tác động không
nhỏ đến sự sinh trưởng, phát triển và làm giảm năng suất của cây trồng nói chung
và của đậu tương nói riêng. Để tăng sản lượng đậu tương, ngoài mở rộng thêm diện
tích trong cơ cấu luân canh, tăng năng suất là giải pháp chính.
Sử dụng giống đậu tương biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng nhất trong
ngành trồng đậu tương của thế giới hiện nay, với diện tích đậu tương biến đổi gen

trên thế giới năm 2014 lên đến khoảng 94 triệu ha [40]. Gần đây chính phủ Việt
Nam đã quan tâm đầu tư phát triển các ngành công nghệ cao trong đó công nghệ
sinh học được xem là ngành công nghệ mũi nhọn trong tương lai. Ở nước ta đang
dần tiếp cận và ứng dụng công nghệ này để tăng năng suất đậu tương và tạo ra một
số các đặc tính hữu ích khác.
Sử dụng phương pháp chuyển gen vào đậu tương thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens để chọn tạo ra các giống đậu tương cho năng suất, chất lượng cao, có
khả năng chống chịu tốt với điều kiện bất thuận của môi trường là mục tiêu rất được

1


quan tâm của nhiều nhà khoa học. Việc tạo giống đậu tương biến đổi gen từ các
giống đậu tương trồng ở Việt Nam đòi hỏi các nghiên cứu tiến hành có hệ thống,
trong đó việc đánh giá khả năng đáp ứng của giống đối với chuyển nạp gen là rất
cần thiết.
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện nghiên cứu
đề tài “Khảo sát khả năng biến nạp gen GmCHS7 vào đậu tương (Glycine max
(L.) Merrill) thông qua vi khuẩn A. tumefaciens”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu chuyển gen GmCHS7 vào một số giống đậu tương Việt Nam
(ĐT22, DT84, DT2001, DT99, MTĐ176) và xác định hiệu quả chuyển gen của các
giống đậu tương đưa vào nghiên cứu.
- Tạo được các dòng đậu tương có mang gen GmCHS7 cho các nghiên cứu
tiếp theo.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tiến hành nghiên cứu biến nạp gen GmCHS7 vào các giống đậu tương Việt
Nam (DT84, DT99, DT2001, MTĐ176 và ĐT22) thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens bằng phương pháp nốt lá mầm.
- Nghiên cứu khả năng tạo chồi và tạo đa chồi của các giống đậu tương Việt

Nam (DT84, DT99, DT2001, MTĐ176 và ĐT22) sau khi biến nạp.
- Đánh giá hiệu quả chuyển gen vào các giống đậu tương (DT84, DT99,
DT2001, MTĐ176 và ĐT22) thông qua vi khuẩn A. tumefaciens mang gen
GmCHS7.
- Đánh giá tỷ lệ phân ly của gen GmCHS7 ở thế hệ T1.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây đậu tƣơng trong hệ thống
cây trồng
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và
trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh.
Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương có
nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây đậu tương được thuần hóa
ở Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến và được đưa vào trồng trọt và khảo
sát có thể trong triều đại Shang năm 1700 - 1100 trước B.C. [2, 47].
Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, là loại cây trồng
thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướ m (Papilionoidea). Cây đậu tương là cây
thân thảo, ít phân cành dạng bôi, lá đậu tương là lá kép với 3 lá chét, nhưng đôi khi
còn có 4 - 5 lá chét. Hoa màu trắng hay tím, quả thẳng hay quả cong có nhiều lông.
Vỏ của hạt đậu tương có màu nâu, đen, vàng, xanh. Khối lượng hạt rất đa dạng từ
20 - 400 mg/hạt. Cây đậu tương có 2 đặc tính sinh trưởng: sinh trưởng hữu hạn và
sinh trưởng vô hạn, thời gian sinh trưởng có 3 loại: chín sớm (75 - 85 ngày), trung
bình (80 - 100 ngày), muộn (110 - 120 ngày). Thời gian sinh trưởng là một yếu tố
rất quan trọng để lựa chọn cây trồng luân canh xen vụ. Một đặc điểm nổi bật là ở rễ
cây đậu tương thường có nốt sần chứa vi khuẩn có khả năng cố định nitơ tự do, cho
nên trồng cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất [2].

Hệ thống phân loại đã căn cứ vào đặc điểm về hình thái, sự phân bố địa lý và
số lượng nhiễm sắc thể. Theo hệ thống này thì ngoài chi Glycine còn có thêm chi
phụ Soja. Chi Glycine được chia thành 7 loài hoang dại lâu năm bao gồm: Glycine
clandestina Wendl; Glycine falcata Benth; Glycine latifolia (Benth) Newell và
Hymowitz; Glycine tatrobeana (Meissn) Benth; Glycine tabacina; Glycine
canescens F. J. Ham; Glycine tomentella Hyayata. Chi phụ Soja được chia ra làm 2
loài: loài đậu tương trồng Glycine max (L.) Merrill và loài hoang dại hàng năm
G. Soja Sieb và Zucc [2, 40].

3


1.1.2. Tầm quan trọng của cây đậu tương
Cây đậu tương là nguồn thực phẩm có giá trị kinh tế cao, giàu đạm, giàu chất
béo, giàu các chất khoáng và các vitamin. Ngoài ra, đậu tương còn là nguyên liệu
tốt cho ngành công nghiệp thực phẩm, công nghệ ép dầu, thức ăn gia súc và cây làm
tốt đất (nhờ hoạt động cố định N2 của loại vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên rễ cây
họ đậu), đồng thời cũng là những loài xuất khẩu có giá trị đối với nhiều thị trường
trên thế giới [2].
- Giá trị về mặt thực phẩm
Trong hạt đậu tương chứa 38 - 40% protein, trong khi đó sắn, gạo, ngô chỉ
chứa từ 2 - 14,9% và hydrat cacbon từ 15 - 16%. Hơn nữa, đậu tương còn chứa
nhiều amino acid cơ bản cần thiết như: Isoleucin, Leucin, Metionin, Lysin,
Phenylamin, Tryptophan, và nhiều loại vitamin A, B1, B2, C,… và chất khoáng [2,
29, 32]. Hạt đậu tương được coi là nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một
lượng đáng kể các amino acid không thay thế. Khi thiếu protein trong thành phần
thức ăn thì sẽ hạn chế sự sinh trưởng và phát triển trí tuệ của trẻ em và giảm mức độ
đề kháng đối với các bệnh truyền nhiễm.
- Giá trị về mặt nông nghiệp
Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1 kg

hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Toàn cây đậu tương
(thân, lá, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân
lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp
của gia súc. Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá
cao: N:6,2%, P2O5: 0,7%, K2O: 2,4%, vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt [32].
Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt, 1 ha trồng đậu tương
nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30 - 60 kg N. Trong hệ thống luân
canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối
với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí
cho việc bón phân N. Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt
bởi lượng N trong thân chiếm 0,05%, trong lá 0,19% [2].

4


- Giá trị về mặt công nghiệp
Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế
biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng,
dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương được dùng để ép
dầu. Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho
ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật [32].
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
- Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới,
đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô. Hàng năm trên thế giới trồng
khoảng hơn 111,26 triệu ha với năng suất bình quân khá cao 22 - 25 tạ/ha đã tạo ra
một sản lượng đậu tương lớn gấp hơn hai lần so với 20 năm về trước. Các nước
trồng đậu tương đứng hàng đầu trên thế giới về diện tích gieo trồng và sản lượng là
Mỹ 30,7 triệu ha, Brazil 27,86 triệu ha, Argentina 19,41 triệu ha và Ấn Độ 12,2
triệu ha (bảng 1.1) [41].

Bảng 1.1. Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều nhất thế giới năm 2013
TT
1
2
3
4
5
6
7
8

Diện tích
Sản lƣợng
(Triệu ha)
(Triệu tấn)
Mỹ
30,7
89,05
Brazil
27,86
81,85
Argentina
19,41
40,01
Trung Quốc
6,6
12,08
Ấn Độ
12,2
11,05

Paraguay
3,8
8,35
Canada
1,8
4,87
Bolivia
1,2
2,4
Tổng số trên toàn thế giới
111,26
276,4
(Nguồn: Food & Agriculture Organization, 2013)
Quốc gia

- Tình hình sản xuất và tiêu thụ đậu tương ở Việt Nam

· Tình hình sản xuất đậu tương
Điều kiện thời tiết không thuận lợi đã khiến sản lượng đậu tương nước ta năm
2013 giảm 3% so với năm 2012, xuống còn 168 nghìn tấn. Mưa bão nặng nề và kéo
dài suốt năm đã khiến năng suất cây trồng và diện tích thu hoạch đậu tương. Quy

5


mô sản xuất nhỏ lẻ so với các loại cây trồng khác chính là nguyên nhân khiến ngành
đậu tương vẫn không đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ trong nước. Tổ chức USDA dự
báo nếu điều kiện thời tiết thuận lợi, diện tích gieo trồng đậu tương năm 2013 và
2014 lần lượt đạt 120 nghìn và 130 nghìn héc - ta, với mức sản lượng tăng nhẹ
khoảng 176 và 192 nghìn tấn (bảng 1.2, hình 1.1). Khả năng cạnh tranh của đậu

tương so với ngô vẫn còn thấp do sản lươ ̣ng tính trên mỗi héc

- ta trồng đậu tương

thấp hơn so với trồng ngô. Khu vực trồng đậu tương chính tập trung ở vùng Đồng
bằng sông Hồng, miền Bắc nước ta [12].
Theo USDA, sản lượng đậu tương trong những năm tới sẽ tăng và đạt được mục
tiêu mà Chính phủ đã đề ra trong Quy hoạch Tổng thể cho ngành hạt có dầu là 350
nghìn ha diện tích trồng trọt và 700 nghìn tấn sản lươ ̣ng vào năm 2020. Tuy nhiên,
năng suất nhìn chung vẫn còn thấp và việc mở rộng diện tích trồng trọt của ngành chưa
cao, trong đó nguyên nhân chính là khả năng cạnh tranh của cây đậu tương .
Từ khi gia nhập Hiê ̣p hô ̣i bảo hộ giống cây trồng quố c tế (UPOV) năm 2006,
Việt Nam đã đăng kí 90 giống/loại cây trồng, bao gồm đậu tương và lạc (chủ yếu là
các giống địa phương ) để bảo vệ giống cây trồng . Đến năm 2016, theo cam kế t với
UPOV, Việt Nam phải hoàn thành bảo hộ cho tất cả các loài cây trồng. Điều này sẽ
thúc đẩy các nhà khoa học Việt Nam tiếp tục nghiên cứu để cho ra các loại giống tốt
hơn, trong đó có đậu tương.
Bảng 1.2. Sản lượng và diện tích đậu tương của Việt Nam từ 2011 – 2015
2011

2012

2013

2014* 2015*

Diện tích gieo trồ ng (nghìn ha)

181,1

119,6

117,8

120

130

Năng suất (tấn/ha)

1,47

1,45

1,43

1,47

1,48

Tổng sản lƣợng (nghìn tấn)

266,9

173,7

168,4

176,4

192,4

Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn, * số liệu dự báo của USDA

6


(Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, * số liệu dự báo)
Hình 1.1. Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011 - 2015)

· Tình hình tiêu thụ đậu tương
Hầu hết đậu tương được sản xuất trong nước cũng như đậu nành nhập khẩu
đều được sử dụng nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu dùng hàng ngày cũng như dùng làm
thức ăn chăn nuôi. Các loại thực phẩm không lên men truyền thống như đậu phụ,
sữa đậu nành, bột đậu nành được dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm; số ít
được sử dụng để làm nước tương, mắm đậu nành, và sản xuất dầu đậu tương tại các
hộ gia đình. Chỉ một lượng nhỏ đậu nành sản xuất trong nước được sử dụng làm
thức ăn chăn nuôi. Khoảng 80% lượng đậu nành nguyên chất béo nhập khẩu được
nghiền để làm dầu nành và bã đậu nành, 5% được dùng làm thức ăn chăn nuôi và
15% được dùng làm thực phẩm cho con người.
Như vậy, sản xuất đậu tương vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu trong nước.
Nguyên nhân chính là do năng suất của giống không cao, tổn thất do các điều kiện
bất lợi như hạn hán, sâu bệnh hại... còn lớn (hàng năm, ước tính thiệt hại về số
lượng sau thu hoạch đối với đậu tương khoảng 6,2% - 14%). Thêm nữa, những năm
gần đây khí hậu toàn cầu đang có dấu hiệu thay đổi phức tạp. Hiện tượng trái đất
nóng lên đã làm cho tình hình hạn hán, lũ lụt ngày càng trở nên nghiêm trọng. Việt
Nam là một trong những nước sẽ chịu nhiều ảnh hưởng của biến đổi khí hậu. Để

7

nâng cao năng suất đậu tương, vấn đề đặt ra là phải nhanh chóng nghiên cứu cải tiến
và tạo ra những giống đậu tương biến đổi gen có khả năng cho năng suất, chất
lượng cao và chống lại các điều kiện bất thuận của môi trường.
1.1.4. Đặc tính chống chịu hạn của cây đậu tương
Khi gặp các điều kiện bất lợi về nước, đậu tương có những phản ứng để có
thể thích ứng, sinh trưởng và phát triển. Các cơ chế này khá đa dạng, nhưng có thể
chia thành 3 cơ chế chính như sau:
- Cơ chế trốn thoát điều kiện hạn (Drought escape)
- Cơ chế tránh hạn (Drought avoidance)
- Cơ chế chống chịu hạn (Drought tolerance)
Cơ chế trốn thoát điều kiện hạn cho phép cây đậu tương có thể hoàn thành
chu kỳ sống của mình trong giai đoạn được cung cấp đủ nước trước khi hạn xảy ra.
Đối với cơ chế tránh hạn thì các giống đậu tương sẽ có các cơ chế để duy trì lượng
nước trong cơ thể trong giai đoạn hạn, thông qua việc tăng khả năng hấp thu nước
từ rễ hoặc giảm quá trình thoát hơi nước từ các bộ phận khác nhau của cây. Ở các
giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn thì cây có thể duy trì sức căng của các
mô tế bào, chính vì thế các quá trình trao đổi chất có thể diễn ra bình thường trong
điều kiện lượng nước bên ngoài môi trường xuống rất thấp. Sức căng của các mô tế
bào của cây đậu tương được duy trì thông qua việc tổng hợp mạnh các chất chống
lại áp suất thẩm thấu, các chất trao đổi [50].
Các nhà khoa học đã có nhiều thành công khi nghiên cứu sâu hơn về tính
chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương. Maitra và Cushman (1994) đã phân lập
được cDNA của dehydrin từ lá đậu tương khi bị mất nước, ngoài ra các tác giả còn
phân lập được cDNA của LEA (late embryogeis abudant protein) nhóm D - 95 từ lá
và rễ cây đậu tương khi bị hạn [51].
Ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn
của cây đậu tương, tiêu biểu là công trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống
đậu tương nhập nội của Nguyễn Huy Hoàng (1992) [6], nghiên cứu phân lập, xác

định trình tự gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103. Phân

8


lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương của Trần Thị
Phương Liên (1999) [7]. Nâng cao tính chịu hạn của cây đậu tương bằng phương
pháp đột biến thực nghiệm của Chu Hoàng Mậu (2001) [9].
Công nghệ sinh học hiện đại và các cây trồng biến đổi di truyền đang được
ứng dụng rộng rãi cũng như có nhiều đóng góp giá trị cho sản xuất nông nghiệp,
đặc biệt trên lĩnh vực tạo giống cây trồng mới. Công nghệ sinh học với những tiến
bộ của kỹ thuật DNA tái tổ hợp và chuyển gen thực vật, các gen được phân lập từ
các sinh vật khác loài, thực vật, vi sinh vật và động vật đã được đưa vào cây trồng.
Với khả năng tuyệt vời này cho phép tạo ra hàng loạt cây trồng mang các gen hữu
ích, có những đặc tính nông học quan trọng như kháng sâu, kháng hạn, chín sớm và
các đặc tính có lợi khác, điều mà các nhà chọn giống truyền thống chưa làm được,
hoặc làm được nhưng tốn rất nhiều thời gian.
1.2. Vi khuẩn A. tumefaciens và phƣơng pháp biến nạp gen ở thực vật
Các phương pháp để đưa gen mới vào tế bào thực vật có thể chia thành 2
loại: Phương pháp trực tiếp và phương pháp gián tiếp. Phương pháp chuyển gen
trực tiếp là bắn gen, xung điện, vi tiêm và phương pháp gián tiếp là sử dụng vi
khuẩn A. tumefaciens làm trung gian. Việc phát hiện ra A. tumefaciens có khả
năng chuyển gen vào thực vật đã biến loài này trở thành 1 trong những công cụ
quan trong nhất của Công nghệ sinh học Thực vật [30, 33].
A. tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh sống trong đất, có khả năng xâm
nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thương của cây chủ. Trong
tự nhiên, A. tumefacines chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt là nhóm thực
vật có hoa. Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối u do
A. tumefaciens sinh ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh
trưởng (Auxin và Cytokinin). Đó là do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn

T - DNA (Transfer DNA) sang tế bào thực vật và T - DNA điều khiển quá trình
sinh tổng hợp các chất đó [33, 37, 38]. Ngoài ra, các khối u cũng sinh tổng hợp
các opin là các amino acid (aa) đặc biệt là các dẫn xuất của đường. Dạng opin
được tổng hợp có thể là nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin và agropin

9


phụ thuộc vào từng chủng A. tumefaciens điều khiển quá trình tổng hợp các chất
đó. Trong đó, octopin và nopalin là hai dạng opin phổ biến. Opin được vi khuẩn
sử dụng thay cho nguồn cácbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hoá opin
trên plasmid gây khối u thực vật [36]. Cơ chế phân tử của sự hình thành khối u
đã được quan tâm nghiên cứu nhằm tìm ra một phương thức phòng bệnh cho cây.
Khi phát hiện ra Ti - plasmid và khả năng tự chuyển T - DNA vào genome thực
vật, người ta đã đặc biệt chú ý và khai thác khả năng sử dụng chúng như một
vector tự nhiên để chuyển các gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo cây trồng
mang những tính trạng mong muốn [1].
1.2.1. Cấu trúc và chức năng của Ti - plasmid
Ti - plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A. tumefaciens gây độc, có
kích thước khoảng 200 - 250 kb. Chúng được duy trì ổn định trong A. tumefaciens ở
nhiệt độ dưới 30oC. Bằng phương pháp lai DNA - DNA và lập bản đồ chuỗi kép dị
hợp (heteroduplex mapping), người ta đã xác định được Ti - plasmid có 4 vùng
tương đồng. Kết quả phân tích di truyền cho thấy vùng T - DNA (Transfer DNA) và
vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u, trong khi hai vùng
khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong A. tumefaciens [1].
Trong khi hình thành khối u, T - DNA được chuyển vào tế bào thực vật và
hợp nhất với genome nhân. T - DNA ổn định trong genome nhân. Lai Ti - plasmid
với DNA của khối u đã cho thấy T - DNA trong tế bào thực vật là tương ứng song
song với T - DNA trong Ti - plasmid của A. tumefaciens. Kết quả này chứng tỏ
không có sự sắp xếp lại vị trí của T - DNA trong lúc khối u được tạo thành. Một

hoặc nhiều bản sao của T - DNA có thể có mặt ở các đoạn lặp nối tiếp. Chúng cũng
có thể tách ra và liên kết với các vùng khác nhau của DNA thực vật. Vị trí hợp nhất
của T - DNA vào DNA thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên.
Trên Ti - plasmid, chỉ có vùng T - DNA được chuyển từ vi khuẩn sang
genome của cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở đó. Tuy nhiên, vùng này lại không
mã hoá những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T - DNA mà cần sự trợ
giúp đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi

10


khuẩn (gen chv). Vùng VIR dài khoảng 40kb đảm nhận chức năng gây nhiễm ở Ti plasmid dạng octopin, vùng VIR chứa tới 24 gen gây độc. Sản phẩm protein do các
gen này mã hoá đã kích thích sự tách biệt T - DNA, bao bọc che chở và giúp chóng
tiếp cận với genome của cây chủ [37]. Ngoài các gen vir, các gen trên nhiễm sắc thể
của A. tumefaciens (như chvA và chvB) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình
xâm nhập của A. tumefaciens vào thành tế bào thực vật [38].
Vùng gây khối u

Vùng phân
giải nopalin

TDN
ATDN

Vùng tái bản

dddd
ADN

B

Vùng
gây độc

D

Ti-Plasmid
(Nopalin)

C

Vùng tiếp hợp

Hình 1.2 . Bản đồ Ti - plasmid [1]
1.2.2. Cấu trúc và chức năng của đoạn T - DNA
Kết quả phân tích trình tự gen trên T - DNA ở các Ti - plasmid khác nhau
cho thấy, T - DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn từ
khoảng 25bp và gọi là đoạn biên. Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển
T - DNA và xâm nhập của T - DNA vào tế bào thực vật [11, 33, 38]. Ở đoạn biên
phải (Righ border - RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T - DNA.
Đoạn biên trái (Left border - LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T -DNA
và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc bình thường [30] ở Ti - plasmid dạng
nopalin, T - DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài
22 kb. Trong khi ở Ti - plasmid dạng octopin, T - DNA là một đoạn gen liên tục
dài 13kb. T - DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá những enzym
cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u như tms1,

11

tms2, tmr mã hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và
cytokinin [30, 37].

LB

Vùng gây khối u (Onc)

Tms1

Tms2

2

1

TGGCGGATATATATGTGGTGTAAAC

Tmr

RB

nos
TGACAGGATATATGGCGGGTAAAC

Hình 1.3. Cấu trúc T – DNA [1]
1.2.3. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn
như: Acetosyringone, Hydroxy - Acetosyringone... Dưới tác dụng của các hợp chất
này, A. tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T - DNA vào
tế bào thực vật [11, 33,38]. Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir

và RB, LB. Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen
vùng VIR hoạt động và tăng cường biểu hiện.
Sự tiếp xúc của A. tumefaciens với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị
tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti - plasmid phiên mã. Trong quá trình này một
chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là AS. Gen vir A và
gen vir C được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù gen vir C chỉ
được phiên mã ở mức độ thấp. Khi A. tumefaciens gặp dịch rỉ của các tế bào thực
vật bị tổn thương, hoặc AS tinh khiết, sản phẩm của gen vir A (có thể liên kết với
màng) sẽ nhận diện và tương tác với AS và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế
bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen vir C. Sau đó protein vir C đã biến đổi hoạt
hóa làm cho các gen vir B, C, D và E không hoạt động và làm tăng cường sự phiên
mã của gen vir C.
Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các
trình tự biên 25bp nằm ở mép của T - DNA và sự xuất hiện phân tử sợi đơn mạch
thẳng tương ứng với T - ADN. Các sản phẩm của operon vir D có hoạt tính

12


endonuclease. Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T - ADN được
chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào ADN nhân.

Hình 1.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens [11]
1.2.4. Tương tác giữa T - DNA và genome tế bào thực vật
Trong tế bào thực vật, phức ss – T – DNA được đưa qua màng nhân vào
nhân. Hai protein đóng vai trò quan trọng trong bước này là vir D2 và vir E2. Tín
hiệu định vị trong nhân của vir D2 và vir E2 đóng vai trò chủ yếu. Protein vir D2 có
chức năng xác định vị trí cho T – DNA trong nhân. Phức ss – T – DNA là phức
nucleoprotein lên đến 20kb chứa một đầu 5’ gắn với protein vir D2. Nhưng phức
được bao bọc bởi số lượng lớn phân tử vir E2 (xấp xỉ 600/20kb T – DNA) và mỗi

phức này có hai tín hiệu định vị trong nhân. Hai tín hiệu này của vir E2 đóng vai trò
quan trọng đối với việc nhận liên tục phức T – DNA của nhân, có khả năng kích
thích mở lỗ màng nhân. Khả năng nhận phức của nhân được điều khiển bởi protein

13


kết hợp tín hiệu định vị đặc trưng trong nhân, protein này được tìm thấy trong tế
bào chất của tế bào thực vật [33].
Bước cuối cùng trong quá trình vận chuyển T – DNA là sự tương tác trong
genome tế bào thực vật. Các phản ứng trong sự tương tác T - DNA không có tính
điển hình. Sự tương tác này tìm thấy bởi sự tái tổ hợp không theo quy luật. Theo
cách nhìn nhận việc cắt bỏ bớt base, như microhomologies, cần thiết đối với bước
lặp lại giữa cặp vận chuyển T – DNA với vir D2 và DNA thực vật. Sự tương đồng
này rất thấp và đặc trưng đối với quá trình tái tổ hợp bởi sự xác định vị trí của vir
D2 để gắn kết [37, 38]. Ở trình tự gần kề hay đầu 3’ của T – DNA tìm thấy một vài
sự tương đồng nhỏ đối với DNA thực vật, kết quả của sự tương tác đầu tiên giữa sợi
T – DNA và DNA thực vật là tạo ra lỗ hổng ở sợi 3’ – 5’ của DNA thực vật. Sau
đó DNA thực vật được cắt ở vị trí đầu 3’ của lỗ hổng bởi endonuclease và nucleotit
của đầu 5’ bắt cặp với vir D2 bởi một nucleotit của đầu 5’ bắt cặp với vir D2 bởi
một nucleotit trong đầu sợi (5’ – 3’) DNA thực vật. Phần 3’ nhô ra của T – DNA
cũng như DNA thực vật thay thế bị phân hủy bởi endonuclease hay 3’ - 5’
enxonuclease. Đầu 5’ của T – DNA gắn với vir D2 còn đầu 3’ kia cặp đôi với DNA
thực vật kéo dài từ bước đầu của quá trình tương tác, nối liền với vết cắt trong sợi
DNA dưới của thực vật. Sự đưa vào của sợi T – DNA trong sợi 3’ – 5’ của DNA
thực vật được bổ sung, tình trạng xoắn sinh ra bởi vết cắt trong sợi đối ngược được
sản sinh [11, 38].
Tình trạng này hoạt hóa phản ứng sửa chữa của tế bào thực vật và sợi bổ
sung được tổng hợp sử dụng để chèn dễ dàng sợi T – DNA như là sợi khuôn [36].
vir D2 có vai trò hoạt hóa trong sự hòa hợp chính xác sợi T – DNA vào nhiễm sắc

thể thực vật. Phóng thích protein vir D2 có thể cung cấp năng lượng chứa đựng
trong các liên kết phosphodieste, như Tyr 29 với nucleotit đầu tiên của sợi T –
DNA, qui định đầu 5’ của sợi T – DNA không còn [70]. Ngoài ra, quá trình chuyển
T – DNA còn có sự tương tác với các protein do gen trên nhiễm sắc thể của
A. tumefaciens qui định và protein trong tế bào thực vật.

14


1.2.5. Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens
- Vector nhị thể
Trên cơ sở phát hiện hai vùng Vir không nằm trên cùng một plasmid với
vùng T – DNA mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xâm nhập của T – DNA vào
hệ gen thực vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector nhị thể,
trong đó vùng T – DNA và vùng Vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong
cùng một chủng A. tumefaciens.
Có hai loại vector được sử dụng trong hệ thống vector nhị thể:
(1) Vector chuyển gen: là Ti - plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có
phổ vật chủ rộng với đoạn T - DNA được cắt bỏ hết các gen không cần thiết ở giữa
hai trình tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới
gồm: i) các đơn vị sao chép để DNA plasmid có thể vừa tự nhân trong cả E.coli và
A. tumefaciens; ii) các gen chọn lọc, gen chỉ thị; iii) vùng có chứa nhiều điểm cắt
của các enzyme giới hạn (vùng tạo ra dòng đa năng) nằm ở giữa hai trình tự biên
trái và biên phải để chèn gen mong muốn.
(2) Vector bổ trợ: nằm trong A. tumefaciens, với toàn bộ vùng vir được giữ
lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T - DNA và RB, LB. Plasmid này được cải tiến
loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng vẫn duy trì khả
năng thâm nhập vào tế bào thực vật.
Hai cấu trúc này cùng được đưa vào A. tumefaciens, khi các gen trên vector

bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T - DNA trên vector
chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T - DNA sang tế bào thực vật.
Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững
trong E. coli khi cả hai vùng này cùng hoạt động. Tuy nhiên, vector nhị thể có một
số ưu điểm như: i) Không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid; ii) Kích
thước vector khá nhỏ. Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyển gen từ E. coli sang
A. tumefaciens đã tăng lên. Hiện nay, vector nhị thể được sử dụng rộng rãi với rất
nhiều loại được thiết kế phù hợp với yêu cầu của quá trình chuyển gen.

15


Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể [1]
- Hệ vector liên hợp
Vector liên hợp được xây dựng trên cơ sở tự tái tổ hợp giữa vùng tương đồng
nằm trên plasmid vi khuẩn (như vector của E. coli) với vùng T - DNA trên Ti plasmid của A. tumefaciens. Trong đó, người ta giữ lại vùng vir, loại bỏ vùng mã
hoá chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti plasmid. Có 3 loại hệ thống vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:
(i) Ti - plasmid: các gen gây khối u đã bị thay bởi gen kháng kanamycin của
vi khuẩn; (ii) Vector trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và
được sử dụng để bổ trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid (kích thước lớn và
thiếu vùng MCS). Chúng được nhân lên trong E. coli và chuyển sang A.
tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp. Do không thể sao chép trong A. tumefaciens nên
chúng mang những đoạn tương đồng với T - DNA. (iii) Vector trợ giúp: tồn tại
trong E. coli, có kích thước nhỏ, chứa gen di động (mob) và gen chuyển (tra) giúp
cho quá trình tiếp hợp và chuyển vào A. tumefaciens.

16


Hình 1.6. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp [1]

1.2.6. Gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc
- Gen chỉ thị chọn lọc
Việc thiết kế các gen chỉ thị có thể hoạt động được trong tế bào thực vật đã
nâng cao hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen. Nhờ quá trình chọn lọc ở tế bào vi
khuẩn và sàng lọc ở mô tái sinh, các tế bào biến nạp được nhận biết dễ dàng. Các
chỉ thị di truyền sử dụng trong biến nạp gen ở thực vật thường có nguồn gốc từ vi
khuẩn hoặc thực vật với hai loại chính.
Các chỉ thị chọn lọc di truyền đã và đang được sử dụng phổ biến hiện nay
trong quá trình biến nạp gen được trình bày trong bảng 1.3. Việc chọn các gen chỉ
thị di truyền cần chú ý một số yêu cầu: Thứ nhất là chất chọn lọc ức chế sinh trưởng
các tế bào không được biến nạp; thứ hai là sự thể hiện của gen chọn lọc không ảnh
hưởng tới trao đổi chất của các tế bào chuyển nạp; thứ ba là gen chọn lọc bảo vệ tế
bào khỏi tác dụng của chất chọn lọc và cho thấy rõ ràng sự khác nhau về sinh
trưởng giữa tế bào được chuyển nạp và tế bào không được chuyển nạp; thứ tư là
không ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây hoàn chỉnh tạo được từ cây chuyển gen.
Gen bar: Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin
acetyl transferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT),
là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos và Basta. Gen bar được tạo dòng
đầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus. Phương pháp đơn giản

17