KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHÓM VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-PHOSPHATE TRONG CHẤT THẢI CHĂN NUÔI HEO VÀ CÁ TRA Ở VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC AO CÁ TRA
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.28 MB, 211 trang )
Header Page 1 of 89.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LÊ QUANG KHÔI
MSHV: 62031101
KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHÓM
VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-PHOSPHATE TRONG
CHẤT THẢI CHĂN NUÔI HEO VÀ CÁ TRA Ở
VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ
ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC AO CÁ TRA
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07
Năm 2015
Footer Page 1 of 89.
Header Page 2 of 89.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LÊ QUANG KHÔI
MSHV: 62031101
KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHÓM
VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-PHOSPHATE TRONG
CHẤT THẢI CHĂN NUÔI HEO VÀ CÁ TRA Ở
VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ
ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC AO CÁ TRA
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS. TS. TRƯƠNG TRỌNG NGÔN
GS. TS. CAO NGỌC ĐIỆP
Năm 2015
Footer Page 2 of 89.
Header Page 3 ofLuận
89.án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của Nghiên cứu sinh Lê
Quang Khôi với sự hướng dẫn của PGS. TS. Trương Trọng Ngôn và GS.TS.
Cao Ngọc Điệp. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực,
chưa từng được công bố riêng lẻ bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào
trước đây./.
Người hướng dẫn khoa học
Tác giả luận án
PGS. TS. TRƯƠNG TRỌNG NGÔN
LÊ QUANG KHÔI
GS. TS. CAO NGỌC ĐIỆP
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 3 of 89.
i
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 4 ofLuận
89.án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
LỜI CÁM ƠN
Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cám ơn PGS. TS Trương
Trọng Ngôn và GS. TS. Cao Ngọc Điệp đã tận tình hướng dẫn và giúp tôi hoàn
thành luận án này. Thầy là người truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên
ngọn lửa đam mê khoa học, khơi dậy trong tôi sự nỗ lực, tự tin, cố gắng không
ngừng và không nản lòng trước những khó khăn trong suốt tiến trình thực hiện
luận án tiến sĩ. Xin cám ơn Thầy đã dành nhiều thời gian, công sức và luôn giúp
tôi có được định hướng đúng đắn trong học tập và nghiên cứu.
Tiến trình hơn 3 năm thực hiện các thí nghiệm trong luận án, tôi đã luôn
được sự quan tâm, hỗ trợ của Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học-trường Đại học Cần Thơ, quý Thầy Cô đã giúp tôi có
thêm nhiều nghị lực để hoàn thành nội dung nghiên cứu.
Xin cám ơn:
Cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường-Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học; phòng Thí nghiệm chuyên sâu-Trường Đại
học Cần Thơ; phòng thí nghiệm Sinh học phân tử-Viện Công nghệ Sinh họcViện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, phòng thí nghiệm Sinh học
phân tử-Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học-Trường Đại học
Cần Thơ; phòng Thí nghiệm trọng điểm-trường Đại học Bách Khoa Thành
Phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ tôi thực hiện nội dung nghiên cứu.
Anh chị Nghiên cứu sinh, học viên Cao học và các em Sinh viên đã đồng
hành cùng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu; đã chia sẽ những khó
khăn và khuyến khích, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, xin được gởi lời biết ơn đến Sở Khoa học và Công nghệ,
Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng và Dịch vụ Khoa học Công nghệ Tiền Giang
đã sắp xếp công việc và tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi hoàn thành
kế hoạch học tập toàn khóa trong chương trình đào tạo tiến sĩ. Đặc biệt là đối
với gia đình đã dành cho tôi tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ tôi
trong chặng đường cam go để hoàn thành được luận án nghiên cứu này.
Chân thành cám ơn./.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 4 of 89.
ii
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 5 ofLuận
89.án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
TÓM TẮT
Vi khuẩn tích lũy poly-phosphate (poly-phosphate accumulating bacteria
-PAB) là nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trong xử lý nước thải bằng con
đường sinh học. Chúng tích lũy lượng lớn poly-phosphate nội bào, góp phần
vào quá trình loại bỏ phốt-pho hòa tan trong nước.
Đề tài được thực hiện với mục tiêu khảo sát tính đa dạng di truyền nhóm
vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-phosphate (poly-P) trong chất thải chăn
nuôi heo đã qua xử lý biogas và ao nuôi thâm canh cá tra ở các tỉnh ĐBSCL
bao gồm các khâu phân lập và tuyển chọn, phân tích tính đa dạng di truyền và
ứng dụng vào trong xử lý phốt-pho hoà tan.
Áp dụng phương pháp truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử hiện
đại để phân lập PAB. Kết quả có 439 dòng vi khuẩn phân lập từ 196 mẫu chất
thải, trong đó có 191 dòng phân lập từ 70 mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá
tra và 248 dòng phân lập từ 126 mẫu chất thải chăn nuôi heo. Qua tiến trình
tuyển chọn và mô tả các đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn có tiềm năng
tích lũy poly-phosphate, kết quả nghiên cứu đã tìm ra được 48 dòng vi khuẩn
có khả năng tích lũy hàm lượng poly-P nội bào cao với các đặc tính chủ yếu
như: chúng có dạng hình que hoặc que ngắn; chuyển động, dao động tại chỗ
hoặc không chuyển động; có sự hiện diện các hạt poly-P bắt màu đen khi quan
sát tế bào dưới kính hiển vi điện tử truyền quét; gen tích lũy poly-phosphate
hiện diện chủ yếu dưới dạng IIA và IIC; tiềm năng tích lũy poly-phosphate nội
bào từ 10-9 đến 10-12 mg poly-phosphate/tế bào.
Dựa trên trình tự gen 16S rRNA cho thấy PAB có sự đa dạng về thành
phần loài; 22/191 dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải ao nuôi thâm canh cá tra
nằm trong bốn lớp Bacilli, Actinobacteria, Beta-proteobacteria, Gammaproteobacteria; 26/248 dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo
nằm trong 4 lớp Bacilli, Actinobacteria, Gramma-proteobacteria, Alphaproteobacteria. Các dòng vi khuẩn có quan hệ gần gũi với giống Bacillus
chiếm tỉ lệ cao (54%), nhưng dòng vi khuẩn có tiềm năng tích lũy poly-P cao
là Acinetobacter sp. trong lớp Gamma-proteobacteria; Rhodococcus sp. trong
lớp Actinobacteria và Ochrobactrum sp. trong lớp Alpha-proteobacteria.
Qua phân tích và so sánh tính đa dạng di truyền của 48 dòng vi khuẩn
cho thấy trình tự gen 16S rRNA có các vùng nucleotide biến thiên mạnh xen
kẽ với các vùng ít biến thiên, các vùng này tạo ra các đặc trưng về sự đa hình
và đa dạng trình tự nucleotide cho quần xã vi khuẩn tích lũy poly-P cao. Số vị
trí đa hình khác biệt trong quần xã là 82,02 với chỉ số đa hình trung bình
θ=0,11 và có sự biến thiên từ 0,06 đến 0,17. Trung bình sự khác biệt
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 5 of 89.
iii
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 6 ofLuận
89.án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
nucleotide k=116,6 với chỉ số đa dạng nucleotide trung bình Pi=0,16 và có sự
biến thiên từ 0,07 đến 0,3. Sự biến thiên các chỉ số θ và Pi tạo nên các dạng
haplotype khác nhau trong quần xã vi khuẩn tích lũy poly-P, có 25 haplotype
(kiểu gen) được tạo ra từ 48 trình tự nucleotide. Sự khác nhau về cấu trúc của
các haplotype tạo nên sự đa dạng cao giữa chúng (Hd=0,91). Điều này làm
xuất hiện nhiều kiểu gen có tính biến dị di truyền và khả năng thích nghi với
môi trường sống trong quá trình tiến hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng
tích lũy hàm lượng poly-P cao. So sánh sự đa dạng di truyền giữa hai quần xã
vi khuẩn phân lập ở hai địa điểm lấy mẫu, kết quả cho thấy tính đa dạng
nucleotide, đa dạng haplotype của các dòng vi khuẩn phân lập trong chất thải
chăn nuôi heo (Pi=0,16, h=14) thấp hơn và tính bảo tồn gen cao hơn các dòng
vi khuẩn phân lập trong chất thải ao nuôi cá tra (Pi=0,18, h=16). Đây là cơ sở
khoa học trong việc lựa chọn nguồn mẫu để phân lập và tuyển chọn các dòng
vi khuẩn tích lũy poly-P.
Thông qua quá trình tuyển chọn ban đầu từ tập hợp 20 dòng vi khuẩn
phân lập được, 2 dòng TGT013L và TGT025L có khả năng làm giảm hàm
lượng phosphate cao nhất trong nước thải tổng hợp từ 17,7 mg/L xuống còn
4,1 và 2,6 mg/L sau 25 giờ thí nghiệm, với hiệu suất loại bỏ phosphat tương
ứng là 76,5% và 85,3% (ở pH khoảng 8,1; chỉ số OD.600 nm khoảng 0,6). Tổ
hợp 2 dòng TGT013L+TGT025L cho hiệu quả loại bỏ phosphate hoà tan
trong nước ao nuôi cá tra xuống còn 0,5 mg/L với hiệu suất xử lý đạt 85,1%
sau 36 giờ cấy bổ sung vi khuẩn. Kết quả chụp TEM và PCR cho thấy 2 dòng
vi khuẩn này có gen đồng hóa phosphate thành dạng hạt poly-phosphate nội
bào. Chúng được xác định có mối quan hệ gần gũi với Acinetobacter
radioresistens (GU145275) và Kurthia sp. (JQ398850), cùng tỉ lệ tương đồng
với trình tự gen 16S rRNA trên Genbank, 99%. Hai dòng vi khuẩn này có
nhiều tiềm năng để xử lý phốt-pho hòa tan trong mô hình nuôi cá tra công
nghiệp có ứng dụng công nghệ vi sinh.
Từ khóa: Acinetobacter, Kurthia, chỉ số θ, chỉ số Pi, poly-phosphate, vi
khuẩn tích lũy poly-phosphate.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 6 of 89.
iv
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 7 ofLuận
89.án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
SUMMARY
Poly-phosphate accumulating bacteria (PAB) is an important bacterial
group that can take up large amounts of phosphate and accumulate as
intracellular poly-phosphate, contributing to biological phosphorus removal in
waste-water treatment.
The thesis was conducted to survey a genetic diversity of PAB
community isolated from samples of water and sludge of intensive catfish
ponds and effluent water and sludge obtained from piggery waste-water
treated bio-digesters in the Mekong Delta, Vietnam included isolation and
selection, analysis of genetic diversity and application of PAB isolated to treat
soluble phosphorus.
PAB were isolated by using plating techniques and molecular biology
techniques. In a total of 439 isolates, there are 191 strains isolated from 70
water and sludge samples of intensive catfish ponds and 284 strains isolated
from 126 samples obtained from piggery waste-water treated bio-digesters.
Throughout the process of selection and description of biological
characteristics of 48 isolates that have the potential of accumulating
intracellular poly-phosphate shown main characters included shaped like a
rods or short rod-shaped; motile, twitching movements or non-motile;
expression of poly-phosphate electron dense granules within the cells under
TEM examination; accumulated poly-phosphate from poly-phosphate kinase
gene 1 type-IIA and IIC that synthesizes intracellular poly-phosphate granules;
the content of intracellular poly-phosphate varied from 10-9 to 10-12 mg/cell.
Based on the partial 16S rRNA genes of these isolates were sequenced
and compared with bacterial 16S rRNA genes in Genbank show that PAB
have a diversity of the composition of species, 22 strains isolated from
intensive catfish ponds included in four classes: Bacilli, Actinobacteria, Betaproteobacteria, Gamma-proteobacteria; and 26 strains isolated from piggery
waste-water treated bio-digesters included in four classes: Bacilli,
Actinobacteria, Alpha-proteobacteria, Gamma-proteobacteria. The strains
which related to Bacillus were dominant bacteria group constituted up to 54%
of all identified isolates, but high potential strains of accumulating polyphosphate are Acinetobacter sp. within class Gamma-proteobacteria;
Rhodococcus sp. within class Actinobacteria; Ochrobactrum sp. within class
Alpha-proteobacteria.
The process of analysis and comparison of genetic diversity of 48 isolates
showed 16S rRNA sequences have nucleotide regions of high variability
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 7 of 89.
v
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 8 ofLuận
89.án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
interspersed with nucleotide regions of low variability. These areas generate
characteristics included nucleotide polymorphisms and diversity among 16S
rRNA sequences of high poly-phosphate accumulating bacteria. Measurement
of the amount of DNA polymorphisms revealed the number of polymorphic
sites among DNA sequences was 82.02 with the mean of the number of
polymorphic sites was θ=0.11 and the variance of θ ranged from 0.06 to 0.17.
Average number of nucleotide differences was k=116.6 with the mean of
nucleotide diversity was Pi=0.16 and the variance of Pi ranged from 0.07 to 0.3.
The variation of θ and Pi index formed the different types of haplotype in
population of PAB. There were 25 haplotypes (genotypes) from 48 sequences.
The difference of the structure of haplotypes formed a high diversity between
them (Hd=0.91). The levels of haplotype diversity created many genotypes for
the genetic variation and the ability to adapt to the environment in the
evolutionary process of bacterial strains capable of high accumulating poly-P.
Comparison of genetic diversity between populations of bacteria isolated from
two sampling places, the results showed that the nucleotide and haplotype
diversity of the strains isolated in piggery waste-water treated biodigesters
(Pi=0.16, h=14) were lower and the genetic conservation was higher than
isolated strains in intensive catfish ponds (Pi=0.18, h=16). This is scientific
basis for the selection of the sample sources for the isolation and selection of
poly-phosphate accumulating strains.
Of the total 20 strains that were initial screen-test, 2 strains as TGT013L
and TGT025L were capable of reducing phosphate in the synthesis medium
from 17.7 to 4.1 and 2.6 mg PO43-/L respectively after 25 hours of experiment
with the efficiency phosphate removal of 76.6 and 85.3% respectively at pH
8.1 and OD.600 nm 0.6 approximately. The Acinetobacter radioresistens
TGT013L and Kurthia sp. TGT025L consortium have the removal efficiecy of
soluble phosphorous in catfish ponds reached 85.1% after 36 hours cultured.
Association of TEM and PCR confirmed that two isolates have polyphosphate kinase gene 1 type-IIA that synthesizes intracellular poly-phosphate
granules. These strains were related to sequences of Acinetobacter
radioresistens (99% identity) and Kurthia sp. (99% identity). Two isolates,
from this study, have application potential to reduce soluble phosphorus from
intensive catfish ponds that applied microbial biotechnology.
Keyword: Acinetobacter, Kurthia, θ index, Pi index, poly-phosphate, polyphosphate accumulating bacteria.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 8 of 89.
vi
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 9 ofLuận
89.án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...............................................................................................................i
LỜI CÁM ƠN.....................................................................................................................ii
TÓM TẮT..........................................................................................................................iii
SUMMARY .......................................................................................................................v
MỤC LỤC ........................................................................................................................vii
DANH SÁCH BẢNG ......................................................................................................xi
DANH SÁCH HÌNH.......................................................................................................xii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................................xv
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU...............................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ................................................................ 2
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................2
1.2.2 Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2
1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án .............. 3
1.4 Cách tiếp cận và giả thuyết khoa học .......................................................... 3
1.5 Kết cấu của luận án...................................................................................... 5
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................6
2.1 Các dạng phốt-pho tồn tại trong tự nhiên .................................................... 6
2.2 Sự tích tụ P sinh học trong các lớp bùn trầm tích ở ao-hồ........................... 7
2.3 Tình hình chăn nuôi heo, cá tra ở ĐBSCL .................................................. 8
2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về phân lập, tuyển chọn PAB 11
2.4.1 Ngoài nước..............................................................................................11
2.4.2 Trong nước..............................................................................................13
2.5 Thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy poly-phosphate ............................. 14
2.5.1 Tình hình nghiên cứu thành phần quần xã PAB trong nước thải ..................14
2.5.2 Tình hình nghiên cứu thành phần quần xã PAB trong các ao hồ tự nhiên ..15
2.6 Phương pháp định tính và định lượng hàm lượng poly-P nội bào ............ 16
2.6.1 Định tính hạt poly-P nội bào...................................................................16
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 9 of 89.
vii
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 10 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
2.6.1.1 Kính hiển vi quang học huỳnh quang ..................................................16
2.6.1.2 Kính hiển vi điện tử kết hợp với phân tích năng lượng phân tán ........17
2.6.2 Xác định hàm lượng poly-P nội bào.......................................................18
2.7 Cơ chế quá trình trao đổi chất của nhóm vi khuẩn PAB và sự điều hòa ... 21
2.7.1 Cơ chế quá trình trao đổi chất của vi khuẩn tích lũy poly-P ..................21
2.7.2 Quá trình tổng hợp và điều hòa sự tổng hợp poly-phosphate ........................23
2.7.2.1 Các enzyme tham gia tổng hợp poly-P................................................24
2.7.2.2 Các enzyme tham gia phân giải poly-P ...............................................24
2.7.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa hàm lượng carbon và phosphate .................25
2.7.2.4 Ảnh hưởng pH và Mg2+ trên quá trình đồng hóa và dị hóa .................27
2.8 Cơ sở khoa học phân tích sự đa dạng di truyền ở vi khuẩn....................... 28
2.8.1 Phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự gen 16S rRNA .........28
2.8.1.1 Gen rRNA trong phân tích mối quan hệ di truyền của vi khuẩn .........28
2.8.1.2 16S Ribosomal RNAs..........................................................................30
2.8.1.3 Phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên gen 16S rRNA ...................30
2.8.2 Gen ppk1 trong phân tích mối quan hệ di truyền của PAB ....................32
2.8.3 Phân tích đa dạng di truyền ....................................................................33
2.8.3.1 Đa dạng trình tự Nucleotide.................................................................33
2.8.3.2 Đa dạng loài .........................................................................................34
2.9 Các biện pháp loại bỏ phosphate hòa tan trong nước ................................ 35
2.9.1 Loại bỏ phốt-pho hòa tan bằng con đường hóa học.........................................35
2.9.2 Loại bỏ phốt-pho hòa tan bằng con đường sinh học........................................37
2.9.2.1 Quá trình loại bỏ phosphate trong hệ thống xử lý nước thải ...............38
2.9.2.2 Sự kết hợp loại bỏ phosphate bằng hóa học và sinh học .....................41
2.9.2.3 Sự giống nhau giữa poly-P trong bùn hoạt tính và bùn lắng tụ...........42
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................44
3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................. 44
3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu ..............................................................44
3.1.2.1 Thời gian nghiên cứu ...........................................................................44
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 10 of 89.
viii
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 11 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
3.1.2.2 Địa điểm nghiên cứu............................................................................44
3.1.3 Thiết bị, hóa chất ....................................................................................44
3.1.3.1 Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................44
3.1.3.2 Hóa chất ...............................................................................................45
3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 47
3.2.1 Chuẩn bị mẫu ..........................................................................................47
3.2.1.1 Đối với mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá tra ..................................47
3.2.1.2 Đối với mẫu chất thải trại heo [sau hầm ủ biogas] ..............................48
3.2.2 Phân lập vi khuẩn....................................................................................49
3.2.3 Định tính hạt poly-P nội bào...................................................................50
2.2.4 Xác định hàm lượng poly-P nội bào.......................................................50
3.2.5 Nhận diện gen ppk1 ................................................................................51
3.2.6 Định danh PAB.......................................................................................52
3.2.7 Phân tích sự đa dạng vi khuẩn tích lũy poly-P .......................................53
3.2.8 Thí nghiệm kiểm tra sơ bộ khả năng loại bỏ phosphate hòa tan ............54
3.2.9 Thí nghiệm theo dõi sự biến đổi pH, OD.600nm ...................................54
3.2.10 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate qui mô 10 lít ...........56
3.2.11 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate qui mô 500 lít .........57
3.2.12 Đánh giá hiệu quả xử lý của 2 dòng vi khuẩn PAB..............................58
3.2.13 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................60
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................61
4.1 Phân lập và xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn phân lập ............... 61
4.1.1 Kết quả phân lập .....................................................................................61
4.1.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn đã phân lập ...............................................64
4.1.3 Mô tả đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn PAB ............................. 66
4.1.4 Nhận diện gen ppk1 ................................................................................77
4.2 Định danh và phân tích tính đa dạng PAB ................................................ 80
4.2.1 Định danh và phân tích sự phát sinh loài PAB trong ao nuôi cá tra.......80
4.2.2 Định danh và phân tích sự phát sinh loài PAB chất thải chăn nuôi heo.83
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 11 of 89.
ix
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 12 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
4.2.3 Phân tích tính đa dạng di truyền của PAB..............................................92
4.2.3.1 Phân tích tính đa dạng nucleotide........................................................92
4.2.3.2 Phân tích tính đa dạng loài.................................................................103
4.3 Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P ........................... 104
4.3.1 Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate của 20 dòng vi khuẩn ...104
4.3.2 Sự biến đổi chỉ số pH và hàm lượng PO43- theo thời gian....................105
4.3.3 Sự biến đổi chỉ số OD.600 nm và hàm lượng PO43- theo thời gian......106
4.3.4 Kết quả loại bỏ phosphate trong nước ao nuôi cá tra ...........................110
4.3.4.1 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian qui mô 10 lít ................110
4.3.4.2 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian qui mô 500 lít ..............112
4.3.4.3 Đánh giá hiệu quả xử lý PO43- vi khuẩn mô hình nuôi cá tra ............113
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT................................................................ 120
5.1 Kết luận.................................................................................................... 120
5.2 Đề nghị..................................................................................................... 121
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 122
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................... 136
PHỤ LỤC 1: ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ......... 137
Bảng PL1.1: Chỉ số pH và mật số vi khuẩn dị dưỡng của 196 mẫu.............. 137
Bảng PL1.2: Hình dạng 439 dòng vi khuẩn và hàm lượng poly-P nội bào... 147
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RNA .................................. 156
PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ CHỈ SỐ ĐA DẠNG ......... 159
PL3.1: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 48 dòng .................................. 159
PL3.2: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 22 dòng ................................. 159
PL3.3: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 26 dòng .................................. 160
PHỤ LỤC 4: BẢNG THỐNG KÊ SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM ................................. 161
PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ANOVA ..................................................... 163
PL5.1: Kết quả phân tích AGH006L, BTT006L, TGT013L, TGT025L ............ 163
PL5.2: Kết quả phân tích TGT025, DC, TGT013, TGT013L+TGT025L .... 167
PL5.3: Kết quả phân tích TGT025, DC, TGT013, TGT013L+TGT025L .... 168
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 12 of 89.
x
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 13 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
2.1:
Các chất sử dụng và điều kiện ly trích poly-P (Eixler et al., 2005) .. 20
2.2:
Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk1 (He et al., 2007)....................... 25
2.3:
Thành phần của ribosome của tế bào nhân sơ và nhân thật............... 29
2.4:
Hóa chất thường dùng để trầm hiện ortho-phosphate. ...................... 36
2.5:
Acid béo hòa tan được hình thành trong bể kỵ khí............................ 40
2.6:
Cấu trúc phân tử các đơn vị cấu tạo nên PHAs ................................. 40
3.1:
Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk1 (He et al., 2007) 47
3.2:
Trình tự primer nhận diện 16S rDNA vi khuẩn PAB........................ 47
4.1:
Mật số vi khuẩn dị dưỡng (CFU/mL).................................................61
4.2:
Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn.................................................. 63
4.3:
Tỷ lệ phần trăm về đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn.......... 65
4.4:
Tổng hợp kết quả kiểm tra hàm lượng poly-P nội bào ...................... 66
4.5:
Đặc điểm sinh học PAB phân lập từ chất thải ao nuôi cá tra .............. 67
4.6:
Đặc điểm sinh học PAB phân lập trong chất thải chăn nuôi heo ...... 70
4.7:
Hàm lượng poly-P nội bào vi khuẩn phân lập từ ao nuôi cá tra............ 75
4.8:
Hàm lượng poly-P nội bào vi khuẩn từ chất thải chăn nuôi heo ....... 76
4.9:
Kết quả định tên vi khuẩn phân lập trong nước ao nuôi cá tra .......... 82
4.10:
Kết quả định tên vi khuẩn phân lập trong chất thải chăn nuôi heo ....... 85
4.11:
Đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA 48 dòng vi khuẩn ............. 94
4.12:
Đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA ........................................ 101
4.13:
Chỉ số H′ và J′ của 2 quần xã vi khuẩn tích lũy poly-P.................... 103
4.14:
Hiệu suất loại bỏ phosphate của 20 dòng vi khuẩn ......................... 105
4.15:
Tỉ lệ (%) giữa PO43-/TP và sự chênh lệch giữa hai nghiệm thức..... 118
4.16:
Trọng lượng và tỉ lệ sống cá lúc thu hoạch ở hai nghiệm thức ....... 118
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 13 of 89.
xi
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 14 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
2.1:
Cấu trúc phân tử ortho-phosphate......................................................... 6
2.2:
Cấu trúc chuỗi pyro-phosphate (Ahlgren, 2006) ................................. 6
2.3:
Ảnh chụp TEM hạt poly-P vi khuẩn Pseudomonas putida CA-3 ......... 7
2.4:
Cấu trúc của phân tử ATP (adenosin triphosphate)............................. 7
2.5:
Ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền quét hạt poly-P và hạt PHAs . 12
2.6:
Tổng P được cấu thành từ các thành phần P khác nhau .................... 19
2.7:
Sự hiện diện các hạt poly-P................................................................. 21
2.8:
Hiệu quả trích poly-P bằng nước lạnh, nước nóng và NaOH............ 21
2.9:
Các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR ............................... 22
2.10:
Chuyển hoá acetate và glycogen thành PHB bởi PAB ....................... 22
2.11:
Mối tương quan giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm lượng COD ..... 26
2.12:
Sơ đồ mô tả sự đồng vận chuyển MgHPO4/H+. ................................... 27
2.13:
Ribosome của prokaryote và eukaryote............................................. 29
2.14:
Ribosomal RNA operon của E.coli ................................................... 29
2.15:
Các ribosomal RNAs genes của eukaryotes ...................................... 30
2.16:
Giản đồ cho 16S rRNA nằm trên tiểu đơn vị nhỏ của ribosome....... 31
2.17:
Biểu đồ các bước phân tích mối quan hệ di truyền ........................... 32
2.18:
Chỉ số đa dạng Shannon (H′) và chỉ số độ đồng đều (J′)....................... 34
2.19:
Sơ đồ mô tả loại bỏ phốt-pho............................................................. 35
2.20:
Hệ thống tăng cường loại bỏ phốt-pho sinh học ..................................... 39
2.21:
Mô hình tóm tắt quá trình tích lũy poly-P sinh.................................. 42
3.1:
Thu mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá tra (nước và bùn)………...48
3.2:
Mẫu bùn và nước ao cá tra................................................................. 48
3.3:
Thu mẫu chất thải chăn nuôi trại heo (sau biogas) ............................ 48
3.4:
Mẫu chất thải trại heo sau biogas ...................................................... 49
3.5:
Sơ đồ tóm tắt các bước phân lập vi khuẩn ........................................... 49
3.6:
Sơ đồ tóm tắt các bước trong quá trình ly trích poly-P ..................... 51
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 14 of 89.
xii
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 15 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
3.7:
Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA............................ 52
3.8:
Bố trí các nghiệm thức....................................................................... 55
4.1:
Mối tương quan pH chất thải chăn nuôi heo và mật số dưỡng …….62
4.2:
Mối tương quan pH chất thải ao nuôi nuôi cá tra và mật số.............. 62
4.3:
Hình dạng và kích thước các dòng vi khuẩn phân lập....................... 68
4.4:
Khuẩn lạc PAB phân lập trong chất thải ao nuôi cá tra..................... 69
4.5:
Khuẩn lạc PAB phân lập trong chất thải chăn nuôi heo.................... 71
4.6:
Hình dạng và cấu trúc bên trong PAB trong nước ao nuôi cá tra...... 73
4.7:
Hình dạng và cấu trúc bên trong PAB trong chất thải nuôi heo........ 74
4.8:
Phổ điện di (1) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA ........................... 77
4.9:
Phổ điện di (2) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA ........................... 78
4.10:
Phổ điện di (3) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA ........................... 78
4.11:
Phổ điện di (4) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA ........................... 78
4.12:
Phổ điện di (5) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA, gen ppk1........... 79
4.13:
Phổ điện di sản phẩm PCR của gen ppk1 trên gel agarose 1,2 % ..... 79
4.14:
Phổ điện di sản phẩm PCR của gen ppk1 trên gel agarose 1,2 %. .... 80
4.15:
Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rRNA của 22 dòng vi khuẩn......... 81
4.16:
Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rRNA của 26 dòng vi khuẩn......... 84
4.17:
Tỉ lệ các lớp vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra...................... 87
4.18:
Tỉ lệ các lớp vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo......... 87
4.19:
Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rRNA của 48 dòng vi khuẩn ............ 93
4.20:
Sự biến thiên chỉ số Theta vùng nucleotide từ 100 đến 816.............. 95
4.21:
Đa hình đoạn trình tự gen từ vị trí 112 đến 236 ................................ 96
4.22:
Đa hình đoạn trình tự gen từ vị trí 277 đến 377 ................................ 97
4.23:
Sự biến thiên chỉ số Pi vùng nucleotide vị trí từ 100 đến 816........... 98
4.24:
Sự phân bố các dạng haplotype ........................................................... 98
4.25:
Sự đa hình nucleotide trên 25 haplotype của 48 dòng vi khuẩn.......... 99
4.26:
Dạng haplotype dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P cao .... 100
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 15 of 89.
xiii
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 16 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
4.27:
Sự biến thiên chỉ số Theta trong vùng có vị trí từ 100 đến 866 ...... 101
4.28:
Sự biến thiên chỉ số Theta trong vùng có vị trí từ 100 đến 829 ...... 101
4.29:
Sự biến thiên chỉ số Pi trong vùng có vị trí từ 100 đế 866 .............. 102
4.30:
Sự biến thiên chỉ số Pi trong vùng có vị trí từ 100 đến 866 ............ 102
4.31:
Biến đổi pH theo thời gian của 5 dòng vi khuẩn ............................. 106
4.32:
Phương trình tuyến tính giữa OD.600 nm và mật số vi khuẩn........ 107
4.33:
Sự biến đổi hàm lượng PO43- và chỉ số OD.600 nm........................ 108
4.34:
Hiệu suất loại bỏ phosphate của 5 dòng vi khuẩn sau 25 giờ.......... 109
4.35:
Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian......................................... 111
4.36:
Hiệu suất loại bỏ phosphate của 2 dòng vi khuẩn ........................... 111
4.37:
Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian giữa 2 nghiệm thức ........ 112
4.38:
Sự biến đổi chỉ tiêu pH trong nước bể ao nuôi cá tra ...................... 114
4.39:
Sự biến đổi hàm lượng PO43- trong nước bể ao nuôi cá tra ............. 115
4.40:
Sự biến đổi hàm lượng TP trong nước bể ao nuôi cá tra ................. 117
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 16 of 89.
xiv
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 17 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
31
P-NMR: Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance-cộng hưởng từ electron 31P
ACCT: American Type Culture Collection – mã dòng vi khuẩn được phân lập
và tuyển chọn ở Hoa Kỳ
ACS: acetyl-CoA synthase
AGH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở An Giang
AGT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở An Giang
BLH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Bạc Liêu
BTT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Bến Tre
BTH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Bến Tre
CMH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Cà Mau
CTT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Cần Thơ
CTH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Cần Thơ
DAP: 4‘, 6-Diamidino-2-phenylindole dehydrochloride
DPAB: Denitrifying poly-phosphate accumulating organisms-vi khuẩn tích
lũy poly-P khử nitơ
DTT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Đồng Tháp
DTH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Đồng Tháp
ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long
EBPR: Enhanced biological phosphorus removal-Tăng cường sự loại bỏ phốtpho bằng sinh học
EDX: Phân tích sự phân tán năng lượng tia X
EELS: Electron energy loss spectroscopy-quang phổ phân tán năng lượng điện tử
GAOs: Glycogen accumulating organisms-vi khuẩn tích lũy glycogen
HAc: Hydroxy-Acetate
HGH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Hậu Giang
HGT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Hậu Giang
KGH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Kiên Giang
KGT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Kiên Giang
LAH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Long An
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 17 of 89.
xv
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 18 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
N: Nitơ
P: Phốt-pho
PAB: Poly-phosphate accumulating bacteria-vi khuẩn tích lũy poly-P
Poly-P: Poly-phosphate
ppk1: Gen poly-phosphate kinase 1
PHAs: Poly-hydroxyalkanoates
PHB: Poly-hydroxybutyrate
SCFAs: Short chain fatty acids-axid béo mạch ngắn
SEM: Scanning electron microscopy-Kính hiển vi điện tử quét
STT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Sóc Trăng
STH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Sóc Trăng
TEM: Transmission electron microscopy-kính hiển vi điện tử truyền quét
TGH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở tTiền Giang
TGT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Tiền Giang
TP: Total phosphorous - tổng P
TVH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Trà Vinh
TVT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Trà Vinh
VFAs: Volatile fatty acids-acid béo dễ bay hơi
VLH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Vĩnh Long
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 18 of 89.
xvi
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 19 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Ngành nuôi trồng thủy sản, chăn nuôi gia súc ở ĐBSCL đã và đang phát
triển theo hướng chăn nuôi tập trung và kết quả của xu thế đổi mới là làm tăng
cường hiệu quả sản xuất trên một đơn vị lao động và đất đai. Bên cạnh sự phát
triển đó là những nguy cơ ảnh hưởng mạnh mẽ đến môi trường sống. Các
nguồn gây ô nhiễm nước chủ yếu là thức ăn tồn đọng, chất thải bài tiết của cá
và heo… Thành phần các chất gây ô nhiễm chủ yếu là protein, lipid, acid béo,
phospholipid, carbohydrate, hàm lượng nitơ, chất khoáng… (Lê Văn Cát,
2007). Thông qua quá trình phân hủy của vi sinh vật và các tiến trình phân hủy
tự nhiên, lượng thức ăn dư thừa và chất thải sẽ chuyển thành các dạng nitơ
(N) và phốt-pho (P) vô cơ. Hàm lượng N và P vô cơ cao trong môi trường
nước sẽ kích thích mạnh mẽ khả năng tăng sinh khối của thủy sinh vật như tảo
và vi khuẩn lam là nhân tố chủ yếu gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa và tiến
trình phân hủy tảo sẽ làm cho môi trường nước ao bị ô nhiễm, thiếu oxy cung
cấp cho hoạt động hô hấp của cá, cá sẽ suy yếu và dễ nhiễm bệnh.
Để xử lý phốt-pho hòa tan, một số biện pháp được sử dụng là xử lý bằng
hóa học và sinh học. Trong biện pháp xử lý bằng sinh học, nhóm vi khuẩn có
khả năng hấp thu và tồn trữ P như nguồn phốt-pho nội bào giữ vai trò quan
trọng và chúng được xem như là vi khuẩn tích lũy poly-phosphate. Loại bỏ
phốt-pho hoà tan dạng PO43- thông qua hoạt động vi khuẩn ngày càng được
ứng dụng bởi vì các đặc tính hữu dụng của chúng là dễ ứng dụng, hiệu quả về
mặt kinh tế và thân thiện với môi trường sống (Mino et al., 1998).
Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy
poly-phosphate bằng cách sử dụng các phương pháp mô tả truyền thống và kỹ
thuật sinh học phân tử hiện đại cho thấy quần xã vi khuẩn tích lũy polyphosphate có sự đa dạng về thành phần loài kể cả trong các hệ thống xử lý
nước thải và trong các ao-hồ tự nhiên. Sự hiện diện của các loài và thành phần
phần trăm của chúng trong môi trường cũng có sự khác nhau giữa 2 hệ sinh
thái: nhân tạo (hệ thống xử lý nước thải) và tự nhiên (ao-hồ). Tuy nhiên, chúng
chủ yếu thuộc các lớp Bacilli, Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria,
Gamma-proteobacteria và Actinobacteria (Crocetti et al., 2000; Ahn et al.,
2007; Bond et al., 1995, Beer et al., 2006; Szabó et al., 2011). Việc phân lập,
định danh vi khuẩn tích lũy poly-P bằng kỹ thuật sinh học phân tử có vai trò
quan trọng không chỉ để ứng dụng chúng trong quá trình xử lý phốt-pho hòa
tan mà còn hỗ trợ trong việc đánh giá sự phân bố và tính di truyền quần thể
của chúng.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 19 of 89.
1
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 20 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
Hiện nay chưa có nghiên cứu về thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy
poly-phosphate trong nước và bùn của ao nuôi thâm canh cá tra (sau đây gọi là
chất thải ao nuôi cá tra) và chất thải chăn nuôi heo đã qua xử lý biogas (sau
đây gọi là chất thải chăn nuôi heo) ở ĐBSCL. Tuy nhiên, Phan et al., (2009)
nghiên cứu sự tích lũy các thành phần dinh dưỡng trong ao nuôi cá tra ở
ĐBSCL cho thấy khoảng 51% P được tích lũy trong bùn đáy. Điều này cho
thấy có sự đóng góp của vi sinh vật trong quá trình tích tụ P hòa tan. Chúng
hấp thu PO43- hòa tan trong nước và tích lũy chúng trong sinh khối trước khi
lắng tụ xuống đáy ao. Chính vì vậy việc phân lập, tuyển chọn vi khuẩn tích lũy
poly-P có hiệu suất loại bỏ phosphate cao sẽ tạo nên cơ sở dữ liệu cho đánh
giá tính đa dạng sinh học của PAB (Poly-phosphate accumulating bacteria-vi
khuẩn tích lũy poly-P); là một nghiên cứu cần thiết nhằm đưa các giải pháp
khai thác và sử dụng bền vững nguồn vi khuẩn tích lũy poly-phosphate bản
địa, có lợi trong tự nhiên để ứng dụng vào trong xử lý P hòa tan dư thừa trong
nước.
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá sự đa dạng sinh học của nhóm vi khuẩn có khả năng tích lũy
poly-P với hàm lượng cao được phân lập từ chất thải chăn nuôi heo và cá tra ở
các tỉnh ĐBSCL để tìm hiểu sự phân bố và tính di truyền quần thể của chúng.
Tìm ra nguồn vi khuẩn có khả năng loại bỏ phosphate cao làm cơ sở cho
việc sản xuất chế phẩm sinh học xử lý phốt-pho hòa tan.
Ứng dụng các dòng vi khuẩn phân lập được để xử lý phốt-pho hòa tan
trong nước ao cá tra ở qui mô phòng thí nghiệm.
1.2.2 Nội dung nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P từ các nguồn thải của trại chăn nuôi
heo và ao cá tra của 13 tỉnh ĐBSCL từ đó tuyển chọn các dòng có hiệu quả
tích lũy poly-P cao.
Xây dựng cây phả hệ các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được phân lập
dựa trên trình tự gen 16S rRNA từ đó phân tích sự đa dạng di truyền dựa trên
các chỉ số đa dạng sinh học.
Đánh giá khả năng xử lý phốt-pho hòa tan trong nước ao cá tra của các
dòng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập được thông qua qui mô thử nghiệm chế
phẩm này (ở phòng thí nghiệm với qui mô là 500 lít).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 20 of 89.
2
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 21 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Luận án nghiên cứu có tính hệ thống về vi khuẩn tích lũy poly-P hiện
diện trong chất thải chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra, bao gồm các khâu phân
lập, tuyển chọn, đánh giá tính đa dạng sinh học và ứng dụng vào trong xử lý
phốt-pho hòa tan trong nước ao cá tra. Trên cơ sở kết quả nghiên cứu, các
dòng vi khuẩn phân lập được xem như là các đại diện của PAB trong chất thải
chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra ở các tỉnh ĐBSCL.
Quá trình phân lập dựa vào cơ chế trao đổi chất đặc biệt trong quá trình
tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn tích lũy poly-P, cho phép điều chỉnh
thành phần carbon giữa hai môi trường phân lập và cấy chuyền để sàng lọc và
tuyển chọn ban đầu nguồn vi khuẩn mong muốn, là phương pháp mới để phân
lập vi khuẩn tích lũy poly-P. Sự kết hợp các phương pháp khác nhau như vừa
định tính vừa định lượng poly-P nội bào và nhận diện gen poly-phosphate
kinase bằng các cặp mồi đặc hiệu, là phương pháp tin cậy để tuyển chọn
nguồn vi khuẩn tích lũy poly-P. Thông qua phương pháp này, đã phân lập và
tuyển chọn được 48/439 dòng vi khuẩn phân lập có khả năng tích lũy poly-P
cao làm cơ sở cho việc đánh giá tính đa dạng di truyền và chọn lọc các dòng vi
khuẩn có hiệu suất loại bỏ phốt-pho hoà tan cao để ứng dụng xử lý phosphate
trong nước ao cá tra.
Ứng dụng các kỹ thuật sinh học sinh tử hiện đại (thực hiện trên trình tự
gen 16S rRNA và gen ppk1), kết hợp phương pháp truyền thống trong định
danh vi khuẩn cho thấy 48 loài vi khuẩn tích lũy poly-P được phân lập thể
hiện sự phong phú và sự đa dạng tương đối cao thuộc 5 lớp Bacilli,
Actinobacteria, Alpha-protepbacteria, Beta-proteobacteria và Gammaproteobacteria. Kết quả chụp TEM và PCR cho thấy rằng các dòng vi khuẩn
này có gen đồng hóa phosphate thành dạng hạt poly-phosphate nội bào.
Đề tài đã tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có hiệu suất loại bỏ phốtpho hòa tan cao. Đặc biệt là hai 2 dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens
TGT013L và Kurthia sp. TGT025L cho hiệu suất loại bỏ PO43- đạt 85,1%
trong nước ao nuôi cá tra sau 36 giờ thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu mang lại
nhiều triển vọng trong thực tiễn ứng dụng 2 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P này
để xử lý phốt-pho hòa tan trong mô hình nuôi cá tra công nghiệp có ứng dụng
công nghệ vi sinh.
1.4 Cách tiếp cận và giả thuyết khoa học
Quá trình phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P được dựa trên các quy trình
phân lập của Fuhs và Chen (1975); Sidat et al., (1999); Nakamura et al.,
(1991) và đặc tính sinh học đặc biệt là vi khuẩn tích lũy poly-P có khả năng
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 21 of 89.
3
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 22 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
hấp thu các acid béo mạch ngắn (short chain fatty acids-SCFAs) như acetate
và đồng hóa chúng thành poly-hydroxyalkanoates (PHAs). PHAs được xem
như là nguồn carbon nội bào cần thiết cho tế bào vi sinh vật sống sót trong
điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng (Mino et al., 1998). Chính vì vậy, các
khuẩn lạc có hình thái khác nhau trên môi trường phân lập (có nguồn carbon)
sẽ được chọn và cấy chuyển sang môi trường thiếu nguồn carbon (môi trường
cấy chuyền), chỉ có những vi khuẩn có đặc tính trên mới có thể tăng trưởng và
phát triển được. Thao tác trên được lặp đi lặp lại và luân phiên giữa hai môi
trường phân lập và cấy chuyền cho đến khi chọn được dòng vi khuẩn thuần.
Vi khuẩn tích lũy poly-P là vi khuẩn có khả năng hấp thu lượng lớn
phosphate ngoại bào và đồng hóa thành poly-P nội bào. Do đó, để chứng minh
nguồn vi khuẩn phân lập thuộc nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P và đồng thời
xác định được khả năng hoạt động của chúng, cần phải kiểm tra hàm lượng
poly-P nội bào. Hiện nay chưa tìm thấy phương pháp xác định trực tiếp hàm
lượng poly-P nội bào. Trong Luận án, việc kiểm tra các đặc tính sinh hoá của
các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập thông qua việc áp dụng các
phương pháp có sự kết hợp giữa định tính và định lượng như: định tính hạt
poly-P bằng phương pháp chụp tế bào dưới kính hiển vi điện tử truyền quét
thông qua xử lý sinh khối theo Boswell et al., (2001). Định hàm lượng poly-P
nội bào thông qua phương pháp ly tích của Eixler et al., (2005).
Các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng trong luận án là
phù hợp với các tài liệu nghiên cứu về vi khuẩn tích lũy poly-P như ly trích
DNA thực hiện theo Carr et al., (2001). Cặp mồi 27F và 1492R (Lane et al.,
1991) được sử dụng khuếch đại gen 16S rRNA. Phản ứng PCR thực hiện theo
Ivanov et al., (2005). Nhận diện gen ppk1 theo He et al., (2007).
Định danh PAB phân lập dựa trên mức độ tương đồng của gen 16S
rRNA trên cây phả hệ. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên sự khoảng cách
tiến hóa bằng phần mềm phân tích MEGA.5 (Tamura et al., 2011). Phân loại
và xếp lớp vi khuẩn dựa trên Bergey’s Manual of determinative Bacteriology,
2nd edition (New York: Springer) (Garrity, 2005).
Phân tích tính đa hình nucleotide bằng chương trình DNASP 5.10 (Rozas
et al., 2003) kết hợp với phần mềm BioEdit (Hall, 1999) để định lượng các chỉ
số đa hình và đa dạng nucleotide như chỉ số Theta (θ) (Hall, 1999), chỉ số Pi
(Tajima, 1993), haplotype và sự đa dạng gen. Đánh giá mức độ đa dạng loài
của các dòng vi khuẩn phân lập và tuyển chọn dựa trên phân tích định lượng
các chỉ số đa dạng sinh học [biodiversity measurement: chỉ số đa dạng loài H′Shannon-Weiner’s index; chỉ số đồng đều J′-Shannon Evenness index
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 22 of 89.
4
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 23 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
(Richard, 2005)]. Phân tích các chỉ số đa dạng di truyền để thấy tính đa hình
nucleotide (θ) và sự đa dạng nucleotide (Pi) vùng gen 16S rRNA của nhóm vi
khuẩn tích lũy poly-P và tìm sự khác nhau giữa hai quần xã vi khuẩn tích lũy
poly-phosphate phân lập được trong chất thải ao nuôi cá tra và chăn nuôi heo.
Sự biến thiên các chỉ số θ và Pi tạo nên các dạng haplotype khác nhau. Sự
khác nhau về cấu trúc của các haplotype tạo nên sự đa dạng gen giữa chúng.
Điều này làm xuất hiện nhiều kiểu gen có tính biến dị di truyền và khả năng
thích nghi với môi trường sống trong quá trình tiến hóa của các dòng vi khuẩn
có khả năng tích lũy poly-P. Đây là cơ sở khoa học trong việc lựa chọn nguồn
mẫu để phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P có khả năng
thích nghi cao với môi trường.
Quá trình tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P có khả năng loại bỏ phốtpho hòa tan cao trong nước ao cá tra được thực hiện qua nhiều công đoạn với
cách bố trí thí nghiệm phù hợp, mang tính khoa học cao. Số liệu được thu
thập, xử lý và so sánh bằng các phương pháp phân tích và phần mềm thống kê
đáng tin cậy (phân tích ANOVA với phép thử Turkey để tìm ra sự khác biệt trị
số trung bình giữa các nghiệm thức bằng phần mềm phân tích thống kê
Minitab 16).
1.5 Kết cấu của luận án
Luận án có 3 phần: Phần đầu (16 trang được đánh số từ i đến xvi). Phần
chính luận án gồm 5 chương: Chương 1: Giới thiệu (5 trang với 5 tiểu mục,
được đánh số từ 1 đến 5); Chương 2: Tổng quan tài liệu (38 trang với 9 tiểu
mục được đánh số từ 6 đến 43); Chương 3: Phương tiện và phương pháp
nghiên cứu (17 trang với gồm 2 tiểu mục và 6 thí nghiệm ứng dụng, được
đánh số từ 44 đến 60); Chương 4: Kết quả và thảo luận (59 trang với 3 tiểu
mục được đánh giá số từ 61 đến 119); Chương 5: Kết luận và đề nghị (2 trang
với 2 tiểu mục được đánh số từ 120 đến 121). Phần cuối [72 trang bao gồm
các phần, tài liệu tham khảo (14 trang), danh mục các công trình đã công bố
(01 trang), phụ lục (57 trang)]. Số bảng và hình trong luận án gồm 24 bảng và
69 hình. Bài viết sử dụng 158 tài liệu tham khảo, bao gồm 141 tài liệu tiếng
Anh, 17 tài liệu tiếng Việt.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 23 of 89.
5
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 24 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Các dạng phốt-pho tồn tại trong tự nhiên
Phốt-pho tồn tại trong môi trường ở 3 dạng chính: P dạng hữu cơ (P liên
kết trong các hợp chất hữu cơ), ortho-phosphate (PO43-) và poly-phosphate.
Hầu hết P hữu cơ và poly-phosphate có thể chuyển hóa thành PO43- thông qua
quá trình phân hủy bởi các vi sinh vật (Ahlgren, 2006).
Thể vô cơ bao gồm 2 dạng: ortho-phosphate (Hình 2.1a) và polyphosphate (Hình 2.1b). Ortho-phosphate là thể hòa tan thích hợp cho sinh vật
hấp thu dễ dàng, gồm có các dạng PO43-, HPO42-, H2PO4- và H3PO4.
(a)
(b)
Hình 2.1: Cấu trúc phân tử: (a) ortho-phosphate, (b) poly-phosphate (Ahlgren, 2006)
Thể ortho-phosphate thường gặp nhất trong nước là HPO42- và H2PO4-,
số lượng của mỗi loại tùy vào pH của môi trường. Trong hầu hết các hệ thống
xử lý nước thải, HPO42-, H2PO4- là dạng nổi trội ở giá trị pH lớn hơn 7
(Ahlgren, 2006). Ortho-phosphate dễ dàng loại bỏ khỏi môi trường thông qua
quá trình kết tủa bằng các muối kim loại AlPO4.2H2O, FePO4.H2O,
Ca5(PO4)3.OH.
Poly-phosphate là thể phức tạp hơn, nó gồm 2 dạng poly-P hữu cơ và
poly-P vô cơ. Pyro-phosphate là chuỗi đầu tiên của poly-phosphate không
phân nhánh [P2O73- (Hình 2.2)].
Hình 2.2: Cấu trúc chuỗi pyro-phosphate (Ahlgren, 2006)
Poly-phosphate dạng vô cơ là polymer đầu tiên được xác định bởi Wiame
(1947) như là một trong những thành phần hạt quan trọng được tích lũy trong
nội bào (Hình 2.3).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 24 of 89.
6
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Header Page 25 Luận
of 89.
án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015
Trường Đại học Cần Thơ
Hình 2.3: Ảnh chụp TEM hạt poly-P màu đen trong vi khuẩn Pseudomonas putida
CA-3 (Tobin et al., 2007)
Poly-P là những phân tử mang điện âm mạnh và tạo phức với nhiều ion
kim loại. Phức hợp của poly-P với những kim loại như Ba2+, Pb2+, Mg2+ là
những hợp chất kém hòa tan. Điều này có thể gây kết tủa phức hợp polyphosphate-kim loại trong tế bào như là những hạt nhỏ poly-P và bắt màu khi
nhuộm (Bonting et al., 1993). Ngày nay, poly-P được nhận biết như là biopolymer hiện diện hầu hết trong các sinh vật: vi khuẩn, nấm, thực vật và động
vật (Dawes và Senior, 1973). Poly-P là chuỗi thẳng bao gồm gốc phosphate
nối với nhau bằng cầu nối giàu năng lượng phospho-alhydride (Hình 2.4) và
chiều dài từ 3 tới 1000 gốc phosphate (Kulaev, 1979).
Hình 2.4: Cấu trúc của phân tử ATP (adenosin triphosphate)
(ngày 25/12/2013)
Phốt-pho dạng hữu cơ là phần tử quan trọng cần thiết cho tất cả các tế
bào sống. Phốt-pho là thành cấu tạo nên các hợp chất quan trọng của sự sống
như các phân tử di truyền DNA, RNA; các phân tử cấu trúc như protein,
phospho-lipid; các phân tử dự trữ năng lượng cho tế bào như ATP (Hình 2.4),
poly-phosphate… ATP là phân tử giàu năng lượng, được dùng để vận chuyển
năng lượng trong tế bào. Phospho-lipid là thành phần quan trọng trong cấu
trúc của màng tế bào. Acid teichoic, acid teichuronic là thành phần quan trọng
trong cấu trúc vách tế bào vi khuẩn gram dương.
2.2 Sự tích tụ P sinh học trong các lớp bùn trầm tích ở ao-hồ
Trương Quốc Phú và Trần Kim Tính (2012) xác định thành phần hóa học
của bùn đáy ao nuôi cá tra, cho thấy tổng lượng P trung bình trong các ao nuôi
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Footer Page 25 of 89.
7
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
