Đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định nitơ trong đất vùng rễ lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và tuyển chọn một số dòng có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ







NGUYỄN THỊ PHA


ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN VI KHUẨN
CỐ ĐỊNH NITƠ TRONG ĐẤT VÙNG RỄ LÚA Ở
ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ TUYỂN
CHỌN MỘT SỐ DÒNG CÓ KHẢ NĂNG CỐ
ĐỊNH ĐẠM CAO CHO CANH TÁC LÚA



Chuyên ngành: Vi sinh vật học
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ





2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ PHA

ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN VI KHUẨN
CỐ ĐỊNH NITƠ TRONG ĐẤT VÙNG RỄ LÚA Ở
ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ TUYỂN
CHỌN MỘT SỐ DÒNG CÓ KHẢ NĂNG CỐ
ĐỊNH ĐẠM CAO CHO CANH TÁC LÚA



Chuyên ngành: Vi sinh vật học
M ngnh: 62 42 01 07

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ


Người hướng dẫn khoa học
PGS. TS. NGUYỄN HỮU HIỆP





2014

Công trình được hoàn thành tại: Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ
Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ

Người hướng dẫn:
PGs. Ts. Nguyễn Hữu Hiệp


Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:




Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường
tại:
Vào lúc: … giờ …. ngày …. tháng … năm 20…






Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Trung tâm học liệu – Đại học Cần Thơ
2. Thư viện Quốc gia Việt Nam
1

CHƯƠNG 1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ LUẬN ÁN
1.1 Tính cấp thiết của đề ti
Sản xuất lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chủ yếu sử
dụng phân bón hóa học làm tăng giá thành sản phẩm, phá vỡ kết cấu
của đất làm giảm hiệu quả sử dụng phân bón và gây ô nhiễm môi
trường. Phân bón vi sinh là một giải pháp hiệu quả giải quyết những
vấn đề nêu trên. Vi sinh vật cố định đạm cộng sinh với rễ cây họ đậu
đã được nghiên cứu, ứng dụng từ hơn 30 năm nay (Keyser et al., 1982)
và đã trở nên phổ biến trong sản xuất. Vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn
vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm cũng đã được khá nhiều tác giả
công bố (Gillis et al., 1995; Tran Van et al., 2000; Menard et al.,
2007…). Tuy nhiên, ứng dụng vi sinh vật cố định đạm trong canh tác
lúa thì còn nhiều hạn chế. Khảo sát sự đa dạng di truyền các loài vi
khuẩn này có vai trò rất quan trọng trong việc khai thác, tuyển chọn và
tìm ra những dòng thích hợp với sản xuất lúa ở các tỉnh ĐBSCL. Với
những lý do nêu trên, Đề tài “Đa dạng di truyền tập đon vi khuẩn
cố định nitơ trong đất vùng rễ lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long
và tuyển chọn một số dòng có khả năng cố định đạm cao cho canh
tác lúa” đã được thực hiện.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập được tập đoàn vi khuẩn cố định đạm ở vng đất quanh
rễ la trồng trên 3 loại đất chính ở các tỉnh ĐBSCL (đất ph sa, đất
phn và đất mn)
- Tìm ra được 2-3 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu
ph hợp với la trồng ở từng vng sinh thái khác nhau (đất ph sa, đất
phn và đất mn) vng ĐBSCL.
- Khảo sát đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định đạm thông
qua vùng gen 16S rDNA
2

1.3 Đối tượng v phạm vi nghiên cứu
Các dòng vi khuẩn vng rễ la thu từ các mẫu đất thuộc 6 tỉnh thành
thuộc khu vực ĐBSCL bao gồm thành phố Cần Thơ, tỉnh Vĩnh Long,
tỉnh Hậu Giang, tỉnh Đồng Tháp, tỉnh Trà Vinh và tỉnh Kiên Giang có
khả năng cố định đạm.
1.4 Ý nghĩa khoa học v ý nghĩa thực tiễn của luận án
Về khoa học, đề tài đã phân lập và đánh giá được sự đa dạng di truyền
nguồn gen vi khuẩn vng rễ la có khả năng cố định đạm, làm cơ sở cho
những nghiên cứu tiếp theo và tài liệu tham khảo cho giảng dạy.
Về thực tiễn, đề tài đã tuyển chọn được 6 dòng vi khuẩn có khả năng
thay thế từ 25-50% phân đạm hóa học, rất có triển vọng có thể phát triển
thành phân bón vi sinh phục vụ sản xuất la các tỉnh ĐBSCL.
1.5 Những đóng góp mới của luận án
- Phân lập được tập đoàn vi khuẩn gồm 380 dòng vi khuẩn từ đất vng
rễ la trên môi trường Burk không đạm và đã xác định cả 380 dòng đều
có khả năng cố định đạm. Hai mươi sáu dòng vi khuẩn đã được khảo sát
khả năng cung cấp đạm cho cây la ở giai đoạn mạ, 12 dòng vi khuẩn
được khảo sát khả năng cung cấp đạm ở điều kiện nhà lưới và 6 dòng
được khảo sát khả năng cung cấp đạm cho cây la ở ngoài đồng. Tất cả
các dòng vi khuẩn khảo sát đều có khả năng cung cấp đạm cho cây la ở
các thí nghiệm, trong đó 6 dòng khảo sát ở ngoài đồng có thể thay thế
được 25-50% phân đạm hóa học mà vẫn cho năng suất tương đương với
đối chứng bón đầy đủ phân đạm hóa học.
- Bước đầu khảo sát sự đa dạng về vng gen 16S rDNA của 120
dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao đại diện cho mỗi tỉnh
thành. Kết quả 120 dòng khảo sát có mức tương đồng đạt 75%.
- Định danh 6 dòng vi khuẩn triển vọng bằng phương pháp giải
trình tự vng gen 16S rDNA kết hợp với các đc điểm sinh lý, sinh
3

hóa, đã xác định được dòng CTB3 và CT1N2 thuộc sinh thái đất ph
sa theo thứ tự tương đồng với các loài Serratia marcescens (99%) và
Ideonella sp. (99%); Dòng TN20 và PH27 thuộc sinh thái đất nhiễm
phèn theo thứ tự tương đồng với các loài Burkhoderia tropica (99%)
và Burkhoderia sp. (100%); Dòng AM3 và TV2B7 thuộc sinh thái đất
mn theo thứ tự tương đồng với các loài Stenotrophomonas
panacihumi (99%) và Bacillus megaterium (98%).
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập vi khuẩn vng rễ la trên ba loại đất chính của vng
ĐBSCL bao gồm đất ph sa, đất phn và đất nhiễm mn, trên môi
trường phân lập chuyên biệt dành cho vi khuẩn cố định đạm.
- Khảo sát đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn dựa vào vng gen
16S rDNA thông qua kỹ thuật PCR-RFLP.
- Các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao được tuyển chọn
trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới với các điều kiện khác
nhau ty vào từng vng sinh thái và được kiểm tra hiệu quả cố định
đạm ở điều kiện đồng ruộng trên cả ba vng sinh thái khác nhau.
- Các dòng vi khuẩn triển vọng được định danh bằng phương pháp
giải trình tự vng gen 16S rDNA kết hợp khảo sát các đc tính sinh lý,
sinh hóa.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phân lập và kiểm tra khả năng cố định đạm của vi khuẩn
vùng rễ lúa
Mẫu đất v môi trường nuôi cấy
- Mẫu đất vng rễ la được thu từ 6 tỉnh, thành thuộc ĐBSCL đại
diện cho ba vng sinh thái khác nhau bao gồm: Vĩnh Long và Cần Thơ
4

(đất ph sa), Đồng Tháp và Hậu Giang (đất phn), Trà Vinh và Kiên Giang

(đất nhiễm mn). Mỗi tỉnh/thành phố chọn ngẫu nhiên 3-5 huyện (quận)
mỗi huyện (quận) chọn 1-3 xã, mỗi xã chọn 1-5 ruộng đang trồng lúa.
Nhổ 5 cây la (1 đến 2 tháng tuổi) trên mỗi ruộng. Dng tay tách nhẹ
phần đất bám quanh rễ cho vào ti nylon ghi nhãn (khoảng 400g/mẫu)
và mang về phòng thí nghiệm để phân lập.
- Môi trường phân lập vi khuẩn: Tập đoàn vi khuẩn vng rễ la
được phân lập trên môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005) gồm:
Sucrose (10 g/l), KH
2
PO
4
(0,41 g/l), K
2
HPO
4
(0,52 g/l), NaSO
4
(0,05
g/l), CaCl
2
(0,2 g/l), MgSO
4
.7H
2
O (0,1 g/l), FeSO
4
.7H
2
O (0,005 g/l),
NaMoO

4
.2H
2
O (0,0025 g/l), Agar (18g)
Phân lập vi khuẩn
Cân 10 g mẫu đất, thêm 90 ml nước cất vô trùng, cho vào bình tam
giác đã khử trùng, khuấy trộn đều mẫu bằng máy khuấy từ trong 2 giờ,
để yên 1 giờ, sau đó pha loãng mẫu theo dãy số thập phân 10
0
,10
-1
, 10
-2
,
10
-3
… Dng micropipet ht 50 μl mẫu (ở các nồng độ) nhỏ lên đĩa thạch
chứa môi trường Burk không đạm đã chuẩn bị (mỗi nồng độ 3 đĩa). Dng
que thủy tinh vô trùng trải đều mẫu lên mt môi trường, đậy nắp đĩa lại
để trong vài pht sau đó p ngược đĩa, ủ trong tủ ủ ở 30
o
C.
Chọn ra các khuẩn lạc rời và khác nhau về màu sắc, hình dạng và
kích thước, cấy chuyển nhiều lần theo phương pháp cấy ria và quan sát
dưới kính hiển vi để xác định độ ròng của vi khuẩn.
Kiểm tra khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn
Nuôi các dòng vi khuẩn phân lập ròng trong môi trường Burk lỏng
để đo nồng độ amonium trong dịch nuôi bằng phương pháp Indophenol
Blue (Page et al., 1982).
5

2.2.2 Khảo sát đa dạng di truyền vùng gen 16S rDNA của các
dòng vi khuẩn bằng k thuật PCR- RFLP (Polymerase Chain
Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism).
Chọn 20 dòng vi khuẩn ở mỗi tỉnh (thành) có hàm lượng NH
4
+
trung
bình cao nhất, nuôi sinh khối trên môi trường LB, sau đó tiến hành ly
trích DNA theo quy trình nhiệt của Santos et al. (2001).
Phản ứng khuếch đại vng gen 16S rDNA được thực hiện với cp
mồi tổng 27F và 1495R. Các thành phần cho 1 phản ứng gồm: 1X PCR
buffer, 2 mM MgCl
2
, 200 µM dNTP mỗi loại, 30 pm mồi mỗi loại, 2,5
U Taq DNA polymerase và 50 ng DNA mẫu các dòng vi khuẩn trong
thể tích 50µl.
Phản ứng PCR được thực hiện với chương trình gia nhiệt gồm: biến
tính ở 95
o
C trong 5’ (1 chu kỳ) sau đó thực hiện 35 chu kỳ theo chương
trình 95
o
C trong 45’’ (biến tính), 55
o
C trong 30’’ (gắn mồi), 72
o
C trong
1’20’’ (tổng hợp) và cuối cng là hoàn tất tổng hợp trong 10’.
Sản phẩm PCR của các dòng vi khuẩn khi kiểm tra bằng điện di

trên gel agarose 1,5% có băng rõ, đẹp, ph hợp kích thước với cp mồi
sử dụng (khoảng 1460 bp) được chọn để thực hiện phản ứng cắt với
enzyme cắt giới hạn HaeIII.
Phản ứng được cắt thực hiện với những thành phần sau: Nước cất
2 lần (4,3 µl), Buffer 10X (1,5 µl), enzyme cắt giới hạn 10 U/µl (1,2
µl), 8 µl 16S rDNA (sản phẩm PCR). Phản ứng cắt được ủ ở 37
o
C
trong 3 giờ và điện di trên gel agarose 2%, chụp hình sản phẩm cắt hệ
thống chụp gel.
Sự khác biệt vng gen 16S rDNA qua các phản ứng cắt với enzyme
được phân tích, nhận diện băng DNA và chuyển sang hệ nhị phân bằng
phần mềm PyElph 1.4 của từng bảng gel có băng ghi là 1, không có
băng ghi là 0. Số liệu này được sử dụng để xây dựng ma trận tương
6

đồng (Similarity matrix) bằng phần mềm NTSYSpc.2.1 và vẽ sơ đồ
hình cây phản ánh sự tương đồng giữa các dòng vi khuẩn.
Các ma trận này được xây dựng trên công thức của Nei và Li (1979):

Trong đó:
xy: số băng của hai mẫu cùng có
x: số băng của mẫu x
y: số băng của mẫu y
2.2.3 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao
Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao cho
cây lúa trồng trong dung dịch Yoshida ở giai đoạn mạ
Các dòng vi khuẩn phân lập từ mỗi vng sinh thái (ph sa, phn,
mn) có hàm lượng NH
4

+
trong dịch nuôi cao nhất được chọn để khảo
sát khả năng cung cấp đạm cho cây lúa giai đoạn mạ ở điều kiện phòng
thí nghiệm.
Nuôi sinh khối các dòng vi khuẩn được chọn và chuẩn về mật số
10
7
CFU/ml trước khi chủng vào cây mạ.
Chủng vi khuẩn vào cây mạ bằng cách ngâm mạ (5 ngày tuổi) trong
dung dịch vi khuẩn (trong 2 giờ). Mẫu đối chứng chỉ xử lý với nước cất
đã khử trng. Sau đó, chuyển cây mạ sang bình thủy tinh chứa 100 g cát
sạch làm giá thể (rửa sạch và khử trng) có bổ sung 50 ml môi trường
Yoshida không đạm/bình. Nghiệm thức ĐC+ sử dụng môi trường
Yoshida có đạm. Khi cấy xong, đt các bình (không đậy nắp) cho phát
triển bình thường dưới ánh sáng, theo dõi và bổ sung môi trường Yoshida
tương ứng khi cây ht cạn (bổ sung bằng nhau cho các NT).
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lp lại với 10-
12 nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn khảo sát vào cây la OM6976
trồng trong môi trường Yoshida không đạm so sánh với đối chứng
S
xy
= xy/(x+y)

7

dương (ĐC+) có bổ sung đạm, không chủng vi khuẩn và đối chứng âm
(ĐC-), không bổ sung đạm và không chủng vi khuẩn.
Sau 20 mươi ngày trồng la, ghi nhận các chỉ tiêu theo dõi gồm: Chiều
cao cây mạ (cm) và Khối lượng khô: sấy ở 50ºC đến khi khối lượng
không đổi, cân và ghi nhận kết quả (mg).

Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao cho
cây lúa trồng trong chậu
Chọn các dòng vi khuẩn có hiệu quả cao nhất ở giai đoạn mạ để khảo
sát khả năng thay thế phân đạm hóa học cho cây la trồng trong chậu.
Đất trồng la được thu ở các địa điểm đại diện cho các vng sinh thái
khác nhau và có các đc tính cơ bản như sau: Đất ph sa thuộc loại đất cát
pha thịt có hàm lượng N, P, K ngho hơn loại đất ph sa khu vực ĐBSCL
theo mô tả của Trần Minh Tiến v ctv. (2013) (đất thu tại ruộng la 2 bên
quốc lộ 91B đường Nguyễn Văn Linh, TP. Cần Thơ). Đất phn thuộc loại
đất cát pha thịt, có pH nước dao động từ 3,5-4,0, thành phần P và K dễ
tiêu thấp hơn nhiều so với mô tả của Trần Minh Tiến v ctv. (2013) về đc
tính đất phn vng ĐBSCL, các thành phần còn lại như N
ts
, P
ts
tương
đương với mô tả về đất phn (đất thu ở khu ruộng thực nghiệm của Trường
ĐH Cần Thơ tại Hòa An, Hậu Giang). Đất mn thuộc loại đất st pha thịt,
các thành phần dinh dưỡng như P, K thấp, hàm lượng N tương đương với
đc tính của đất mn thuộc vng ĐBSCL theo mô tả của Trần Minh Tiến
v ctv. (2013) (đất thu ở Ấp Lạc Thạnh A, xã Thạnh Hòa Sơn, Huyện Cầu
Ngang, Tỉnh Trà Vinh).
Đất được phơi khô và cho vào chậu, khoảng hơn nửa chậu (diện
tích chậu đất khoảng 0,08 m
2
), cho nước vào ngâm mềm đất. Trước
khi trồng la 1-2 ngày tiến hành bón lót phân lân (dạng đơn) cho đất.
Chủng các dòng vi khuẩn vào cây mạ giống OM6976 tương tự như ở
điều kiện phòng thí nghiệm, sau đó cấy vào các chậu theo các nghiệm
thức tương ứng, mỗi chậu 2 cây.

8

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lp lại với 18
nghiệm thức gồm 4 dòng vi khuẩn cho mỗi vùng sinh thái kết hợp với
các mức phân bón 0%, 25%, 50% và 75% phân đạm hóa học trên nền
phân bón theo công thức 100-40-30 kg/ha (N-P
2
O
5
-K
2
O) cho vụ Đông
xuân và 80-40-30 kg/ha (N-P
2
O
5
-K
2
O) cho vụ Hè Thu, so sánh với
ĐC+ bón đầy đủ phân đạm, không chủng vi khuẩn và ĐC- không bón
phân đạm, không chủng vi khuẩn.
Các chỉ tiêu theo dõi (khoảng 3 ngày trước khi thu hoạch) gồm:
chiều cao cây (cm); Khối lượng khô rơm (gram/bụi); Số bông/bụi; Số
hạt chắc/bông; Tỷ lệ lép; Khối lượng khô 1000 hạt (gram, quy về ẩm
độ 14%). Khối lượng khô hạt/bụi (g/bụi, quy về ẩm độ 14%).
2.2.4 Định danh các dòng vi khuẩn có hiệu quả cung cấp đạm
cao cho cây lúa
Sáu dòng vi khuẩn cho hiệu quả tốt nhất với cây la trồng trong chậu
(mỗi vùng sinh thái 2 dòng) được định danh bằng giải trình tự vng gen
16S rDNA kết hợp khảo sát một số đc tính sinh lý, sinh hóa.

Đặc tính sinh lý, sinh hóa
a. Phản ứng catalase: sử dụng H
2
O
2
khảo sát phản ứng catalase.
b. Khả năng làm đổi màu môi trường NFB (Kirchhorf et al., 1997).
c. Khả năng sinh trưởng trên các nguồn carbon khác nhau, môi trường
Burk không đạm được thay thế các nguồn carbon khác nhau bao gồm
(sucrose, D- glucose, D- fuctose, maltose, mannose, manitol, chitin).
d. Khảo sát khả năng đối kháng nấm Pyricularia oryzae.
e. Thử hoạt tính nitrogenase bằng phương pháp khử acetylene (ARA).
Giải trình tự vùng gen 16S rDNA
Giải trình tự sản phẩm PCR vùng gen 16S rDNA bằng cp mồi tổng
27F và 1495R tại Phòng Sinh học Phân tử, Viện NCPTCNSH, Trường
ĐH Cần Thơ và Công ty Macrogen (Hàn Quốc) rồi so sánh với ngân
hàng gen NCBI sử dụng chương trình BLASTN để xác định quan hệ
9

di truyền các dòng vi khuẩn tuyển chọn với các loài vi khuẩn tương
ứng trên ngân hàng gen.
2.2.5. Đánh giá hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn
triển vọng với cây lúa trồng ở điều kiện ngoi đồng trên các vùng
sinh thái khác nhau.
Các dòng vi khuẩn có khả năng thay thế 25-50% phân đạm hóa học
cho cây la trong nhà lưới tuyển chọn được ở các vng sinh thái khác
nhau sau khi định danh, được sử dụng làm vật liệu khảo sát hiệu quả
cố định đạm ở điều kiện ngoài đồng.
Các thí nghiệm sử dụng các giống la thích hợp cho từng vng sinh
thái, được thực hiện ở các ma vụ khác nhau và tại các vng đất tương

ứng, có các đc tính cơ bản như sau: Vùng phù sa sử dụng giống la
OM6976 trên địa bàn Ấp Thới Hòa B, Xã Tân Thạnh, Huyện Thới Lai,
Thành Phố Cần Thơ vụ H thu 2013. Đất thí nghiệm thuộc nhóm đất thịt
pha st ngoài trừ N
ts
cao hơn so với đc tính đất ph sa, các thành phần
còn lại là P và K đều thấp hơn rất nhiều so với mô tả về đc tính đất ph
sa của Trần Minh Tiến v ctv. (2013). Vùng phèn sử dụng giống la
OM10424 trên địa bàn Ấp Vĩnh Thuận xã Vĩnh Tường, Huyện Vị Thủy,
Tỉnh Hậu Giang vụ Thu đông 2013. Đất thí nghiệm thuộc loại đất st
pha thịt, có thành phần dinh dưỡng giàu N, P và ngho K, so với mô tả
của Trần Minh Tiến v ctv. (2013). Vng nhiễm mn sử dụng giống la
OM9921 trên địa bàn Ấp Đôn Chụm, xã Tân Sơn, Huyện Trà C, Tỉnh
Trà Vinh vụ Đông xuân 2013-2014. Đất thí nghiệm có thành phần st
pha thịt, giàu đạm đc biệt là đạm dễ tiêu NH
4
+
, ngho K
dt
và P
ts
và có
hàm lượng P
dt
ở mức trung bình, so với tính chất đất mn của Trần Minh
Tiến và ctv. (2013).
Ruộng thí nghiệm được đắp bờ phân lô theo bố trí thí nghiệm, đất
được làm sạch cỏ dại, xới, trục đều và san phẳng mt ruộng. Các dòng
vi khuẩn được nuôi sinh khối và chuẩn về mật số 10
7

CFU/ml để có đủ
thể tích chủng cho 3 kg la đã ngâm ủ cho mỗi dòng (khoảng 5 lít/dòng).
10

La giống được ngâm 36 giờ, vớt ra rửa sạch, ủ trong 36 giờ sao cho hạt
nảy mầm, ra rễ khoảng 0,5 cm thì chia làm 3 phần, một phần không
chủng vi khuẩn, 2 phần còn lại chủng bởi 2 dòng vi khuẩn tương ứng
của từng vng sinh thái và ngâm ít nhất 2 giờ. Hạt giống sau khi đã
chủng vi khuẩn được gieo thành hàng theo hốc với khoảng cách 15 x
20 cm (mỗi hốc 3-5 hạt la).
Bón phân, chăm sóc thí nghiệm: Các loại phân khác như lân và kali
bón bình thường (bón lót toàn bộ phân lân và ½ lượng kali trước khi cấy,
½ lượng kali còn lại bón đón đòng cng với lần bón phân đạm cuối cng).
Phân đạm được chia ra 3 lần bón với lượng phân được tính toán cho từng
ô thí nghiệm và chia ra lần 1 bón ¼ lượng phân sau khi gieo 7-10 ngày,
lần 2 bón ½ lượng phân sau khi gieo 18-20 ngày và ¼ lượng phân còn
lại bón cùng kali lúc la được 40-42 ngày tuổi.
Thí nghiệm được thực hiện theo thể thức khối đầy đủ hoàn toàn
ngẫu nhiên, 4 lần lp lại gồm 10 nghiệm thức kết hợp của 2 dòng vi
khuẩn cho mỗi vùng sinh thái với 5 mức phân bón 0%, 25%, 50%, 75%
và 100% phân đạm hóa học trên nền phân bón 100:40:30 kg/ha
(N:P
2
O
5
:K
2
O) cho vụ ĐX và 80:40:30 kg/ha (N:P
2
O

5
:K
2
O) cho vụ HT
và TĐ, so sánh với 2 đối chứng không chủng vi khuẩn, không bón đạm
và bón đầy đủ phân đạm. Diện tích mỗi ô TN là 20 m
2
, diện tích toàn
thí nghiệm là 1.300 m
2
.
Các chỉ tiêu thí nghiệm giống như các thí nghiệm trồng lúa trong
chậu nhưng không lấy số liệu khối lượng hạt chắc/bụi mà thay bằng
năng suất thực tế: gt 5m
2
(cắt trong ô 2 m x 2,5 m hoc cắt 165 bụi),
phơi khô, làm sạch, cân và quy về ẩm độ 14% tính ra đơn vị T/ha.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và kiểm tra khả năng cố định đạm của vi khuẩn
vùng rễ lúa
11

3.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn vùng rễ cố định đạm
Từ 168 mẫu đất vng rễ la của 6 tỉnh thành, đề tài đã phân lập
được tổng cộng là 380 dòng vi khuẩn. (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Tổng hợp các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vng rễ la
Stt
Tỉnh/Thành
phố
Số lượng mẫu

đất
Số chủng vi
khuẩn
Ký hiệu nhóm
mẫu
1
Cần Thơ
27
65
CT
2
Vĩnh Long
27
47
VL
3
Trà Vinh
30
116
TV
4
Kiên Giang
30
62
KG, AM
5
Hậu Giang
27
49
HG, PH

6
Đồng Tháp
27
41
ĐT, TN
Tổng cộng 168 380
3.1.2 Kiểm tra khả năng tổng hợp NH
4
+
của các dòng vi khuẩn
phân lập
Tất cả 380 dòng vi khuẩn được khảo sát hàm lượng NH
4
+
trong dịch
nuôi bằng phương pháp so màu Indophenol Blue sau khi tiến hành nuôi
trong môi trường Burk lỏng không đạm sau 2, 4, và 6 ngày. Nồng độ
NH
4
+
trong dịch nuôi trung bình qua 3 thời điểm khảo sát từ 0,02 –
5,34 mg/l, trong đó 20 dòng có nồng độ NH
4
+
trong dịch nuôi cao nhất
phân lập từ mỗi tỉnh/thành được chọn để phân tích đa dạng di truyền
vùng gen 16S rDNA.
3.3. Khảo sát đa dạng di truyền tập đon vi khuẩn cố định đạm
thông qua vùng gen 16S rDNA bằng k thuật PCR kết hợp enzyme
cắt giới hạn.

Kết quả khảo sát sự phân nhóm di truyền vng gen 16S rDNA
của 120 dòng vi khuẩn thuộc ba vùng sinh thái đất ph sa, đất
12

phn và đất mn các tỉnh ĐBSCL cho thấy, mức tương đồng của
các dòng vi khuẩn về vng gen 16S rDNA là 75%.
Xt về địa điểm thu mẫu, sự phân bố của các dòng vi khuẩn ở mỗi
tỉnh thành có sự tách nhóm khá riêng biệt (trừ hai tỉnh Trà Vinh và Hậu
Giang). Sự phân bố của 20 dòng phân lập từ thành phố Cần Thơ có
mức tương đồng là cao nhất đạt 81%, kế đến là 20 dòng phân lập từ
Vĩnh Long với mức tương đồng là 80%, các dòng vi khuẩn của hai tỉnh
Trà Vinh và Hậu Giang có mức tương đồng khoảng 78%, sự phân bố
của 20 dòng vi khuẩn phân lập từ tỉnh Đồng Tháp đạt mức tương đồng
khoảng 77%; sự phân bố các dòng vi khuẩn thuộc tỉnh Kiên Giang có
mức tương đồng thấp nhất đạt 75%.
Xt về từng vng sinh thái đất thu mẫu cho thấy, 40 dòng vi khuẩn
của sinh thái đất ph sa có mức tương đồng cao nhất đạt 80%, sinh thái
đất nhiễm phn có độ tương đồng đạt 77%, sự tương đồng của vng
gen 16S rDNA thấp nhất thuộc về các dòng vi khuẩn của sinh thái đất
nhiễm mn (75%).
3.4. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm
cao cho canh tác lúa
Để có cơ sở tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm
cao cho thực hiện các thí nghiệm kế tiếp, 20 dòng vi khuẩn có hàm lượng
NH
4
+
trung bình trong dịch nuôi cao nhất qua ba thời điểm khảo sát được
chọn để phân tích thống kê. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.2
Từ kết quả phân tích thống kê ở Bảng 3.2 chọn được 08 dòng vi

khuẩn từ vng ph sa gồm CT1.21c, CT1.N2, CT1.N3, CT1.73, CTB3,
CT.N1, VL2.27, VL1.17b; 10 dòng vi khuẩn từ vng đất phn gồm
ĐT5, ĐT22, TN20, PH27, ĐT10, ĐT12, ĐT14, ĐT39, ĐT18, ĐT7 và
08 dòng vi khuẩn từ vng đất mn là TV2B7, AM3, TV1, TV58,
TV112, TV92, TV107, TV109, có hàm lượng NH
4
+
trung bình cao hơn,
khác biệt có ý nghĩa thống kê với các dòng vi khuẩn còn lại.
13

Bảng 3.2: Hàm lượng NH
4
+
của các dòng vi khuẩn tổng hợp
được ở ba vng sinh thái
Stt
Vi khuẩn
vùng phù
sa
Hàm lượng
NH
4
+
TB
(mg/l)
Vi khuẩn
vùng
phèn
Hàm lượng

NH
4
+
TB
(mg/l)
Vi khuẩn
vùng
mn
Hàm lượng
NH
4
+
TB
(mg/l)
1
CT1.21c
4,32
a

ĐT5
5,34
a

TV2B7
2,21
a

2
CT1.N2
3,52

b

ĐT22
4,98
b

AM3
1,76
b

3
CT1.N3
2,67
c

TN20
4,33
c

TV1
1,72b
c

4
CT1.73
2,66
d

PH1 27
3,80

d

TV58
1,72b
c

5
CTB3
2,47
e

ĐT10
3,51
e

TV112
1,70b
c

6
CT1.N1
2,26
f

ĐT12
3,27
f

TV92
1,56c

d

7
VL2.27
2,11
g

ĐT14
2,78
g

TV107
1,48
d

8
VL1.17b
2,01
h

ĐT39
2,71
gh

TV109
1,38
de

9
CT3

1,87
i

ĐT18
2,66
gh

TV53
1,2
ef

10
VL20
1,86
ij

ĐT7
2,54
gh

TV63
1,16
fg

11
CT24
1,81
ijk

ĐT9

2,50
h

TV57
1,11
fgh

12
CT36
1,80
jkl

ĐT38
2,17
i

TV90
1,09
fgh

13
CT13
1,78
kl

ĐT13
2,16
j

TV72

1,08
fgh

14
VL29
1,74
klm

ĐT17
2,15
k

TV62
1,06
fgh

15
VL21
1,73
lm

ĐT21
1,94
kl

TV103
1,01
fghi

16

CT19
1,68
mn

ĐT4
1,90
lm

TV68
0,99
ghi

17
VL25
1,62
no

ĐT2
1,84
lm

TV83
0,95
hi

18
VL2
1,55
op

ĐT36
1,83
lm

TV81
0,94
hi

19
VL8
1,51
p

ĐT29
1,82
lm

TV96
0,85
i

20
VL18
1,48
p

ĐT1
1,69
m

TV2
0,84
i


F
820,36
**


160,1
**


31,3
**


CV (%)
2,05

5,3

9,06
Ghi chú: ** là có sự khác biệt có ý nghĩa khi phân tích phương sai sự biến động
của các chỉ tiêu theo dõi ở mức 1%. Các giá trị trong cùng một cột đi theo cùng một
ký tự là khác biệt không có ý nghĩa thống kê
3.4.1 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao
cho cây lúa trồng trong dung dich Yoshida v trong chậu
a) Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao cho

cây lúa trồng trong dung dịch Yoshda ở giai đoạn mạ
Các dòng vi khuẩn chọn được dựa vào nồng độ NH
4
+
trong dịch
nuôi ở Bảng 3.2 được tiếp tục khảo sát khả năng cung cấp đạm cho cây
la OM6976 trồng trong dung dịch Yoshida ở giai đoạn mạ. Kết quả
14

được tổng hợp trong Bảng 3.3
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn đến chiều cao cây và khối
lượng chất khô của cây la OM 6976 giai đoạn 20 ngày tuổi.
Stt
Vng đất phù sa
Vng đất mn
Vng đất phèn
Dòng
VK
Cao cây
(cm)
KLCK
(mg)
Dòng
VK
Cao
cây
(cm)
KLCK
(mg)
Dòng

VK
Cao cây
(cm)
KLCK
(mg)
1
CT1N1
20,6
bc

25,97
de

TV58
22,2
a

38,23
a

ĐT10
17,9
cd

21,39
def

2
CT1N2
21,0

bc

33,61
a

AM3
20,2
ab

36,50
a

ĐT12
16,7
d

19,24
fg

3
CT1N3
20,6
bc

33,60
a

TV112
19,2
b

33,43
b

ĐT14
16,7
d

20,00
ef

4
CTB3
21,8
b

30,31
b

TV2B7
18,4
b

25,73
c

ĐT18
20,1
abc

27,66
a

5
CT1.73
18,0
d

26,59
cd

TV109
20,2
ab

22,23
d

ĐT22
19,0
bcd

26,70
ab

6
CT1.21c
24,2
a

26,01
de

TV107
18,9
b

21,73
de

ĐT39
21,0
ab

22,54
de

7
VL1.17b
20,8
bc

24,33
e

TV1
18,0
b

20,27

ef

ĐT5
13,7
e

15,73
h

8
VL2.27
21,1
bc

28,13
c

TV92
18,2
b

20,13
ef

ĐT7
14,1
e

16,41
gh

9
ĐC+
19,7
cd

25,96
de

ĐC+
21,5
a

26,53
c

PH27
17,9
cd

23,61
cd

10
ĐC-
15,8
e

17,12
f

ĐC-
14,8
c

19,37
f

TN20
19,6
bc

25,68
abc

11






ĐC+
22,3
a

24,03
bcd

12

ĐC-
16,8
d

18,63
fg


F
11,32
**

70,51
**


7,55
**

139,77
**


9,48

**

16,19
**


CV(%)
5,64
3,64

6,82
3,95

8,11
7,72
Ghi chú: ** là có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1%. Các các giá trị trong
một cột có ít nhất 1 trong các chữ a, b, c giống nhau là khác biệt không có ý nghĩa
thống kê. VK: vi khuẩn, KLCK: khối lượng chất khô.
Kết quả phân tích thống kê các chỉ tiêu sinh trưởng của cây lúa
OM6976 ở giai đoạn mạ 20 ngày tuổi (Bảng 3.3) cho thấy, chiều cao
cây và khối lượng chất khô của các nghiệm thức ở cả 3 vng sinh thái
đều có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 1%.
15

Chiều cao cây: NT ĐC- cho chiều cao cây thấp nhất ở vng đất
ph sa (15,8 cm), vng đất mn (14,8 cm) và gần thấp nhất ở vng đất
phèn (16,8 cm), khác biệt với các NT ĐC+ tương ứng (19,7 cm, 21,5
cm và 22,3 cm) và tất cả các NT còn lại. Các NT có chủng các dòng vi
khuẩn cho chiều cao cây cao hơn hoc tương đương với ĐC+ là tất cả
các dòng vi khuẩn ở vng đất ph sa, dòng TV58, AM3, TV109 ở vng

đất mn và dòng ĐT18, ĐT39 ở vng đất phn.
Khối lượng chất khô: NT ĐC- cũng cho KLCK thấp nhất ở vng
đất ph sa (17,12 mg), đất mn (19,37 mg) và gần thấp nhất ở vng đất
phèn (18,63 mg), khác biệt có ý nghĩa với tất cả các NT còn lại ở vng
đất ph sa, đất mn và chỉ cao hơn NT chủng dòng vi khuẩn ĐT5
(15,73 mg) ở vng đất phn. Các NT có KLCK cây mạ cao hơn hoc
tương đương ĐC+ ở vng đất ph sa là CT1N2, CT1N3, CTB3 và
VL2.27; ở vng đất mn là TV58, AM3, TV112 và TV2B7; và ở vng
đất phn là ĐT10, ĐT18, ĐT22, ĐT39, PH27 và TN20. Các dòng vi
khuẩn phân lập từ vng đất mn và đất phn tiếp tục được thử nghiệm
ở các môi trường có bổ sung muối NaCl 4‰ hoc pH 3,5 để xác định
khả năng thích hợp trong các môi trường tương ứng và xác định được
các dòng vi khuẩn cho kết quả ổn định tiếp tục khảo sát ở các thí
nghiệm tiếp theo là TV58, AM3, TV112 và TV2B7 ở vng đất mn và
ĐT10, ĐT39, PH27 và TN20 ở vng đất phn.
b) Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao cho
cây lúa trồng trong chậu
Bốn dòng vi khuẩn tuyển chọn ở mỗi vng sinh thái bao gồm
CT1N2, CT1N3, CTB3 và VL2.27 (đất ph sa); TV58, AM3, TV112
và TV2B7 (đất mn); và ĐT10, ĐT39, PH27 và TN20 (đất phn), được
sử dụng để khảo sát khả năng thay thế phân đạm hóa học đối với giống
la OM6976 trồng trong chậu. Kết quả các chỉ tiêu khảo sát thể hiện ở
Bảng 3.4
16

Bảng 3.4: Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn tuyển chọn từ
các vùng sinh thái đến khối lượng khô rơm và năng suất của giống la
OM6976 trồng trong chậu
Nghiệm
thức

(N-VK)
Vng đất ph sa
Vng đất mn
Vng đất phn
KL rơm/
bụi (g)
Năng suất
(g/bui)
KL rơm
(g/bụi)
Năng suất
bụi (g)
KL rơm/
bụi (g)
Năng suất
(g/bụi)
0-VK1
18,1
gh

13,30
gh

13,0
e-h

10,62
efg

3,9

h

8,21
h

25-VK1
29,8
ef

24,53
d

16,0
c-f

12,03
cde

15,9
ef

9,62
h

50-VK1
35,5
de

29,45
ab

21,7
ab

13,77
abc

18,7
de

12,92
ef

75-VK1
46,8
ab

31,29
a

21,9
ab

13,85
abc

18,8
cde

16,42

d

0-VK2
14,3
h

5,62
i

6,8
ij

6,56
j

4,6
h

9,32
h

25-VK2
23,3
fg

11,55
h

13,2
e-h

8,24
hij

17,8
de

9,07
h

50-VK2
34,3
de

19,08
f

17,4
b-e

12,86
bcd

20,0
bcd

10,51
e-h

75-VK2

44,8
bc

21,94
e

18,5
bcd

14,76
ab

22,7
abc

10,41
fgh

0-VK3
24,7
fg

15,17
g

9,2
hij

7,07
ij

7,6
gh

10,75
e-h

25-VK3
28,4
ef

11,34
h

11,1
f-i

7,47
hij

9,1
g

12,60
efg

50-VK3
45,8
b

25,00
cd

15,2
d-g

10,98
def

15,6
ef

17,11
cd

75-VK3
53,7
a

28,48
b

23,9
a

11,81
cde

16,4
def

21,13
a

0-VK4
18,8
gh

5,97
i

10,9
ghi

8,73
ghi

5,7
gh

10,0
gh

25-VK4
29,8
ef

17,71
f

13,2
e-h

9,28
fgh

13,4
f

13,10
e

50-VK4
38,0
cd

18,16
f

17,5
b-e

13,62
abc

20,2
a-d

18,20
bcd

75-VK4
43,7
bc

24,37
d

20,4
abc

14,60
ab

23,7
ab

20,16
ab

ĐC-
11,7
h

4,67
i

5,8
j

2,69
k

6,2
gh

8,34
h

ĐC+
48,6
ab

27,38
bc

24,1
a

14,96
a

23,9
a

19,48
abc

F
25,12

**

104,74
**

10,01
**

23,28
**

24,76
**

22,10
**

CV (%)
13,40
7,51
19,73
11,49
16.17
12.25
Ghi chú: ** là có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1%. Các các giá trị trong
một cột có ít nhất 1 trong các chữ a, b, c giống nhau là khác biệt không có ý nghĩa
thống kê.; Các dòng vi khuẩn vùng phu sa: VK1: CT1N2, VK2:CT1N3, VK3: CTB3 và
VK4: VL2.27; Vùng mặn: VK1: AM3, VK2: TV112, VK3: TV58 và VK4: TV2B7; Vùng
phèn:VK1: ĐT10, VK2: ĐT39, VK3: PH27 v VK4: TN20
Khối lượng khô rơm/bụi (g): Ở vng sinh thái đất ph sa, khối

lượng khô rơm (KLKR) cao nhất là ở NT bón 75%N chủng dòng CTB3
17

(53,7 g/bụi) và thấp nhất là ĐC- (11,7 g/bụi). Có 5 NT cho KLKR khác
biệt không có ý nghĩa so với ĐC+ (48,6 g/bụi) bao gồm: 75-CTB3
(53,7 g/bụi), 75-CT1N2 (46,8 g), 50-CTB3 (45,8 g/bụi), 75-CT1N3
(44,8 g) và 75-VL2.27 (43,7 g). Ở các NT chủng vi khuẩn và không
bón đạm chỉ có dòng vi khuẩn CTB3 là cho KLKR cao hơn (24,7 g)
khác biệt có ý nghĩa về mt thống kê so với ĐC
Bốn NT ở vng đất mn bao gồm: 50-AM3, 75-AM3, 75-TV2B7,
75-TV58 có KLKR dao động từ 20,4-23,9 g/bụi khác biệt không có ý
nghĩa so với ĐC+ (24,1 g). Ở các NT không bón đạm có chủng vi
khuẩn, chỉ có 2 NT chủng 2 dòng vi khuẩn là AM3 và TV2B7 là có
KLKR cao (12,9 g và 10,9 g), khác biệt có ý nghĩa so với ĐC- (5,8 g).
Ở vng đất phn, có 3 NT cho KLKR khác biệt không có ý nghĩa
so với ĐC+ (23,9 g/bụi) bao gồm: TN20-50%N (20,2 g/bụi), TN20-
75%N (23,7 g/bụi), ĐT39-75%N (22,7 g/bụi). Ở các NT chủng vi
khuẩn và không bón đạm, cả bốn dòng vi khuẩn đều không tạo được
sự khác biệt có ý nghĩa về mt thống kê so với ĐC
Năng suất hạt/bụi (g/bụi): Đây là chỉ tiêu chính đánh giá hiệu quả
cung cấp đạm của các dòng vi khuẩn. Ở vng đất ph sa, có 4 NT đạt
năng suất hạt/bụi (NS bụi) cao hơn hoc tương đương với ĐC+ (27,38
g/bụi), gồm CT1N2-75%N (31,29 g/bụi) CT1N2-50%N (29,45 g/bụi),
CTB3-75%N (28,48 g/bụi) và CTB3-50%N (25,00 g/bụi). Ở vng đất
mn có 5/16 NT là 50-AM3, 75-AM3, 50-TV2B7, 75-TV2B7 và 75-
TV112 có NS bụi dao động từ 13,62-14,76 g/bụi, khác biệt không có
ý nghĩa so với ĐC+ (14,9 g/bụi). Ở vng đất phn, có 4 NT đạt NS bụi
khác biệt không ý nghĩa với ĐC+ (19,48 g/bụi), gồm 50-PH27 (17,11
g/bụi), 75-PH27 (23,13 g/bụi), 50-TN20 (18,20 g/bụi) và 75-TN20
(20,16 g/bụi). Xt ở từng mức phân bón, khả năng thay thế phân đạm

hóa học của các dòng vi khuẩn như sau:
- Ở các NT không bón đạm (0%N) và chủng các dòng vi khuẩn,
có 2 dòng vi khuẩn phân lập từ vng đất phù sa cho NS bụi cao
18

hơn khác biệt có ý nghĩa thống kê với ĐC- (4,67 g/bụi) gồm
CT1N2 (13,30 g/bụi) và CTB3 (15,17 g/bụi), trong khi không
có dòng nào cho NS bụi cao hơn ĐC- ở vng đất phèn. Các dòng
vi khuẩn của vng đất mn lại cho hiệu quả rất tốt khi cả 4 dòng
đều cho NS bụi cao hơn (6,56 10,62 g/bụi), khác biệt có ý nghĩa
so với ĐC- (2,69 g).
- Ở mức phân bón 25%N, tất cả các NT chủng các dòng vi khuẩn
ở cả 3 vng sinh thái đều cho NS bụi cao hơn ĐC- nhưng không
có dòng nào cho năng suất cao hơn hoc tương đương với ĐC+.
- Ở mức phân bón 50%N, mỗi vng sinh thái đều có 2 dòng vi
khuẩn cho NS bụi tương đương với ĐC+ gồm: CT1N2 (29,45
g/bụi) và CTB3 (25,00 g/bụi) ở vng đất phù sa, so với ĐC+
(27,38 g); dòng vi khuẩn AM3 (13,77 g/bụi) và TV2B7 (13,62
g/bụi) ở vng đất mn, so với ĐC+ (14,96 g/bụi); và ở vng đất
phèn là dòng vi khuẩn PH27 (17,11 g/bụi) và TN20 (18,2 g/bụi),
so với ĐC+ (19,48 g/bụi).
- Ở mức phân bón 75%N, mỗi vng sinh thái đều có 2-3 dòng vi
khuẩn cho NS bụi cao hơn hoc tương đương với ĐC+ tương
ứng bao gồm: ở vng đất phù sa, dòng vi khuẩn CT1N2 cho
năng suất 31,29 g/bụi, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê
so với ĐC+ (27,38 g/bụi), dòng CTB3 cho năng suất 28,48 g/bụi,
khác biệt không có ý nghĩa với ĐC+. Ở vng đất mn, 3 dòng
vi khuẩn cho NS bụi khác biệt không có ý nghĩa với ĐC+ (14,96
g/bụi) là TV112 (14,76 g/bụi), TV2B7 (14,60 g/bụi) và AM3
(13,85 g/bụi). Ở vng đất phèn, 2 dòng vi khuẩn cho NS bụi

khác biệt không có ý nghĩa với ĐC+ (19,48 g/bụi) là PH27
(21,13 g/bụi) và TN20 (20,16 g/bụi).
Từ kết quả phân tích về các chỉ tiêu nông học và năng suất của các
dòng vi khuẩn phân lập từ 3 vng sinh thái cho thấy: các dòng vi khuẩn
CT1N2, CTB3 (đất ph sa), AM3, TV2B7 (đất mn), PH27 và TN20
19

(đất phn) vừa cho KLKR cao vừa cho năng suất cao, có khả năng thay
thế từ 25-50% phân đạm hóa học trong điều kiện nhà lưới. Các dòng
này được tiếp tục định danh và đánh giá khả năng cố định đạm ở đều
kiện ngoài đồng ruộng.
3.4.2 Định danh các dòng vi khuẩn cho hiệu quả cố định đạm cao
a) Đặc tính sinh lý sinh hóa
Trong 8 nguồn carbon khảo sát (D-Glucose, Maltose, D-Fructose,
Mannitol, D-Mannose, Acid malic, Sucrose và Chitin), Chitin là nguồn
carbon chỉ có một dòng vi khuẩn là AM3 sử dụng được và dòng vi
khuẩn này cũng có khả năng đối kháng với nấm Pyricularia oryzae.
Các nguồn carbon còn lại, các dòng vi khuẩn đều có khả năng sử dụng,
ngoại trừ dòng vi khuẩn CT1N2 không sử dụng được nguồn carbon là
mannitol. Sucrose là nguồn carbon mà 6 dòng vi khuẩn phát triển tốt
nhất, có thể do đây là nguồn carbon ban đầu sử dụng trong môi trường
Burk để phân lập vi khuẩn.
Tất cả các dòng vi khuẩn khảo sát đều cho phản ứng catalase dương
tính nhưng ở mức độ nhẹ. Điều này cho thấy cả 6 dòng vi khuẩn thuộc
nhóm vi hiếu khí. Kết quả này ph hợp với vi khuẩn vng rễ la của
đề tài.
Kết quả thử nghiệm hoạt tính enzyme nitrogenase qua phương pháp
ARA bằng kỹ thuật sắc ký khí GC (Gas Chromatography) cho thấy cả
6 dòng vi khuẩn đều có hoạt tính nitrogenase khá cao thể hiện qua hàm
lượng C

2
H
2
bị khử dao động từ 2837,76 nM (dòng PH27) đến 3938,57
nM (dòng AM3).
Khả năng làm đổi màu môi trường NFB: NFB là môi trường có bổ
sung chất chỉ thị là Bromophenol Blue. Hợp chất này bị đổi màu khi
pH thay đổi. Các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp đạm cao làm
tăng pH môi trường và làm môi trường chuyển màu xanh dương. Kết
quả khảo sát khả năng đổi màu môi trường cho thấy cả 6 dòng vi khuẩn
20

đều có khả năng làm thay đổi màu môi trường sang xanh dương. Màu
xanh nhạt nhất thuộc về dòng vi khuẩn TN20. Điều này cho thấy các
dòng vi khuẩn đều có khả năng cố định đạm và làm tăng pH của môi
trường. Kết quả nhuộm Gram cho thấy có 5/6 dòng thuộc Gram âm,
duy nhất dòng TV2B7 cho kết quả Gram dương.
b) Trình tự vùng gen 16S rDNA
Trình tự vng gen 16S rDNA của 6 dòng vi khuẩn được trình bày
ở Bảng 3.5
Bảng 3.5: Kết quả giải trình tự 6 dòng vi khuẩn tuyển chọn
Dòng
VK
Số nucleotide
giải trình tự
Kết quả blast so sánh
trên NCBI
% trình tự
so sánh
Độ tương

đồng
Giá
trị E
CTB3
836
1/Serratia marcescens
99%
99%
0,0
CT1N2
800
1/Ideonella sp.
98%
99%
0,0
TN20
1040
1/Burkholderia tropica
97%
99%

0,0

PH27
799
1/Burkholderia sp.
94%
100%
0,0
TV2B7

933
1/Bacillus megaterium
97%
98%
0,0
AM3
1132
1/ Stenotrophomonas.
maltophillia
94%

99%
0,0
Định danh 6 dòng vi khuẩn kết hợp khảo sát các đc tính sinh lý, sinh
hóa, hình dạng khuẩn lạc, tế bào với trình tự vng gen 16S rDNA đã xác
định được dòng vi khuẩn AM3, TV2B7, TN20, PH27, CT1N2, CTB3 có
quan hệ di truyền gần nhất lần lượt với loài Stenotrophomonas maltophilia,
Bacillus megaterium, Burkholderia tropica, Burkholderia sp., Ideonella
sp. Serratia marcescens. Các loài này đều thuộc các loài vi khuẩn có khả
năng cố định đạm đã được nhiều tác giả công bố có khả năng cố định
đạm (Gyaneshwar et al., 2001; Adel et al., 2001; Gillis et al., 1995; Tran
Van et al., 1996; Taghavi et al, 2009; Xie et al. 2006…)
21

3.4.3 Đánh giá hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn
tuyển chọn đối với lúa trồng ở điều kiện ngoi đồng
Sáu dòng vi khuẩn có khả năng thay thế từ 25-50% đạm hóa học
trong điều kiện nhà lưới sau khi định danh, được sử dụng để khảo sát
khả năng thay thế đạm hóa học trong điều kiện ngoài đồng ở các vùng
sinh thái đất ph sa, đất mn và đất phn.

Các chỉ tiêu như chiều cao cây, chiều dài bông, khối lượng khô rơm
(KLKR), các thành phần năng suất và năng suất ở cả 3 vng sinh thái
đều được khảo sát. Kết quả các chỉ tiêu KLKR, số bông/m
2
, số hạt
chắc/bông và năng suất thực tế ở cả 3 vng sinh thái đều có sự khác
biệt có ý nghĩa giữa các NT và xác định được những dòng vi khuẩn có
hiệu quả cung cấp đạm cao cho cây la ở điều kiện ngoài đồng. Số liệu
về 2 chỉ tiêu quan trọng là KLKR và năng suất được tổng hợp trong
Bảng 3.6.
Khối lượng khô rơm: Khối lượng khô rơm của tất cả các NT
chủng các dòng vi khuẩn ở cả 3 vng sinh thái đều tương đương hoc
cao hơn ĐC+ tương ứng từ mức phân bón 50-100%N. Riêng vùng phù
sa, NT 75-CT1N2 còn cho KLKR cao hơn (17,6 g/bụi), khác biệt có ý
nghĩa với ĐC+ (16,2 g/bụi). Ở vng đất mn, tất cả các NT chủng các
dòng vi khuẩn đều cho KLKR cao hơn hoc tương đương với ĐC+
ngay cả khi không bón phân đạm, trong đó có 3 NT cho KLKR cao
hơn, khác biệt có ý nghĩa với ĐC+ (19,2 g/bụi) là 75%N-AM3 (24,5
g/bụi), 100%N-TV2B7 (23,0 g) và 75%N-TV2B7 (22,2 g/bụi). Ở vùng
đất phn, các NT bón phân đạm từ 50-100% có chủng vi khuẩn đều
cho khối lượng rơm khô (10,5-12,3 g/bụi), khác biệt không có ý nghĩa
so với ĐC+ (11,5 g/bụi).


22

Bảng 3.6: Hiệu quả của 6 dòng vi khuẩn và các mức phân đạm hóa học
đến khối lượng khô rơm (g/bụi) của cây lúa ở điều kiện ngoài đồng.
Stt
NT (N-VK)

Đất phù sa
Đất mn
Đất phèn
1
0-0VK
10,2
e

14,9
e

8,6
e

2
100-0VK
16,2
bc

19,2
d

11,5
ab

3
0-VK1
10,4
e

20,0
cd

9,2
de

4
25-VK1
12,2
d

19,1
d

10,0
cde

5
50-VK1
16,3
bc

20,5
bcd

10,6
bcd

6
75-VK1

17,6
a

24,5
a

10,8
bc

7
100-VK1
17,1
ab

21,8
a-d

11,2
abc

8
0-VK2
11,8
d

19,4
d

9,9
cde

9
25-VK2
12,8
d

21,6
bcd

10,1
bcd

10
50-VK2
15,9
c

21,8
a-d

10,5
bcd

11
75-VK2
16,2
bc

22,2
abc

11,2
abc

12
100-VK2
15,7
c

23,0
ab

12,3
a


F
55,80
**

6,51
**

3,94
**


CV (%)
4,99
9,27

9,69
Ghi chú: Trong cùng một cột, những giá trị đi theo cùng một chữ thì khác biệt không ý
nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử LSD. *: khác biệt mức ý nghĩa 5%, ** :
khác biệt mức ý nghĩa 1%, vùng phù sa VK1: CT1N2, VK2: CTB3 vụ HT2013; ở vùng
đất mặn: VK1: AM3, VK2: TV2B7, vụ ĐX 2013-2014; ở vùng đất phèn: VK1: TN20,
VK2: PH27, vụ TĐ 2013
Năng suất thực tế: Kết quả phân tích ở Hình 3.1 cho thấy, hầu hết
các NT chủng cả 6 dòng vi khuẩn đều cho năng suất thực tế cao hơn
hoc tương đương với các ĐC+ tương ứng khi được bón từ 50%N trở
lên ở cả 3 vng sinh thái. Riêng ở vng đất nhiễm mn thì chỉ có 1
trong các NT bón từ 50%N trở lên cho năng suất thấp hơn ĐC+ (5,72
tấn/ha), khác biệt có ý nghĩa thống kê là 50-AM3 (5,07 tấn/ha). Đc
biệt, ở vùng phù sa, khi được bón 75-100%N, dòng vi khuẩn CTB3
còn cho năng suất cao hơn (5,00-5,10 tấn/ha), khác biệt có ý nghĩa
thống kê với ĐC+ (4,43 T/ha).
Như vậy cả 6 dòng vi khuẩn đều có thể thay thế được 25-50%
phân đạm cho cây la mà vẫn đảm bảo năng suất tương đương, thậm
chí dòng vi khuẩn CTB3 không chỉ thay thế tới 50% phân đạm mà còn
cho năng suất cao hơn đối chứng khi bón 75-100% phân đạm.