Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký

Header Page 1 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

M CL C
DANH M C T

VI T T T

DANH M C B NG BI U
DANH M C HÌNH VẼ
M

Đ U …………………………………………………………………..

Ch

ng 1 - T NG QUAN ……………………………………………….

1.1. Giới thi u chung v sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)………
1.1.1. Cấu trúc phân tử …………………………………………………..
1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học c a các Sulfamit, Metronidazole ………….
1.1.3. Tính chất dược lý và phổ tác dụng c a Sulfamit, Metronidazole ...........
1.1.4. Cơ chế tác dụng kháng khuẩn c a Sulfamit, Metronidazole ..........
1.1.5. Một số chế phẩm c a Sulfamit tiêu biểu ………..………………...
1.2. Ph

ng pháp xác định……………………………………………….

1.2.1. Một số công trình nghiên c u xác định Sas bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ……………………………………………..
1.2.2. Một số công trình nghiên c u xác định Metronidazole bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) …………………………………….
1.2.3. Một số công trình nghiên c u xác định đồng th i các sulfamit và
metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ……….
Ch

ng 2 - Đ I T

2.1.

Đ it

NG VÀ PH

NG PHÁP NGHIểN C U ……..

ng, m c tiêu vƠ nhi m v nghiên c u…………………

2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên c u …………………………………

2.1.2. Nhiệm vụ nghiên c u ……………………………………………..
2.2.

Ph

ng pháp nghiên c u…………………………………………

2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị c a phương pháp HPLC …….

Footer Page 1 of 148.

1


Header Page 2 of 148.

Luận văn Thạc sĩ
2.2.2.

Bùi Minh Thái

Phân tích định lượng bằng HPLC …………………………

2.3.

Giới thi u chung v ph

ng pháp chi t pha r n ….………….

2.4.

Hóa ch t và d ng c ……………………………………………..

2.4.1.

Hoá chất …………………………………………………

2.4.2.

Dụng cụ ………………………………………………………

Ch

ng 3 - K T QU VÀ TH O LU N ……………………………….

3.1. Kh o sát các đi u ki n s c ký ……………………………………….
3.1.1. Chọn bước sóng c a detector ……………………………………..
3.1.2. Thăm dò kh năng tách c a các Sulfamit trên cột RP-C18 ……….
3.2. Chọn pha tĩnh ……………………………………………………......
3.3. T i u hóa pha động …………………………………………………
3.3.1. Nồng độ đệm axetat c a pha động ………………………………...
3.3.2. Độ pH cho dung dịch đệm axetat ………………………………….
3.3.3. Tỉ lệ thành phần pha động ………………………………………...
3.3.4. Tốc độ pha động ..............................................................................
3.4. Đánh giá ph

ng pháp phân tích …………………………………..

3.4.1. Kh o sát lập đư ng chuẩn trong kho ng nồng độ 0,05 – 1,000ppm
3.4.2. Giới h n phát hiện (LOD); Giới h n định lượng (LOQ) ................
3.4.3. Độ đúng, độ lặp l i c a phép đo ………………………………….
3.5. M u thực, quy trình xử lý vƠ k t qu phơn tích …………………...
3.5.1. Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi …………………..
3.5.2. Phân tích mẫu thực ………………………………………………………

K T LU N ……………………………………………………………….
TÀI LI U THAM KH O

Footer Page 2 of 148.

2


Header Page 3 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

DANH M C T

STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Footer Page 3 of 148.

VI T T T

Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrin

Axetonitrin
Bộ Nông nghiệp phát
triển nông thôn

BNNPTNT
CV

Coeficient Variation

Hệ số biến thiên

HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng
cao

RP

Reversed phase

Hấp phụ pha đ o

LOD

Limit of Detection

Giới h n phát hiện

LOQ

Limit of Quantity

Giới h n định lượng
Thông tư

TT
UV - Vis

Untraviolet - Visibet

3

Tử ngo i – Kh kiến


Header Page 4 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

DANH M C B NG BI U
B ng 3.1:

Diện tích c a pic phụ thuộc vào bước sóng detector…………………

25

B ng 3.2:

Th i gian lưu và th tự ra pic c a các chất phân tích………………..

27

B ng 3.3:

Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat c a pha động……………..

29

B ng 3.4:

Hệ số dung tích các giá trị pH khác nhau………………………….

31

B ng 3.5:

Hệ số dung tích phụ thuộc vào %ACN trong pha động……………..

33-34

B ng 3.6:

Diện tích pic c a các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động....

36

B ng 3.7:

Diện tích pic sắc ký phụ thuộc vào nồng độ các chất phân tích………

38-39

B ng 3.8:

B ng giá trị các Ftính c a các chất phân tích............................................

42

B ng 3.9:

LOD, LOQ tính theo phương trình hồi quy ..........................................

43

B ng 3.10: Kh o sát độ đúng, độ lặp l i c a phương pháp phân tích (nồng độ 0,08ppm)

45

B ng 3.11: Kh o sát độ đúng, độ lặp l i c a phương pháp phân tích (nồng độ 0,4ppm)

46

B ng 3.12: Kh o sát độ đúng, độ lặp l i c a phương pháp phân tích (nồng độ 0,8ppm)

47-48

B ng 3.13: Chiều cao píc sắc ký mẫu tôm các nồng độ thêm chuẩn khác nhau

50

B ng 3.14: Kết qu xác định hiệu suất thu hồi các chất phân tích………………..

51

B ng 3.15: Kết qu phân tích các chất đối với mẫu tôm r o…………………….

52

B ng 3.16: Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tôm r o…………………..

53

B ng 3.17: Kết qu phân tích các chất đối với mẫu tôm chân trắng…………….

54

B ng 3.18: Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tôm chân trắng……………….

54

B ng 3.19: Kết qu phân tích các chất đối với mẫu tôm sú……………………...

55

B ng 3.20: Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tôm sú……………………

55

Footer Page 4 of 148.

4


Header Page 5 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

B ng 3.21: Kết qu phân tích các chất đối với mẫu tôm lớt…………………….

56

B ng 3.22: Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tôm lớt……………………….

57

Footer Page 5 of 148.

5


Header Page 6 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

DANH M C HÌNH VẼ
Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein…………………...

5

Hình 2.1: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đ ………………………………..

19

Hình 3.1: Phổ hấp thụ trong vùng tử ngo i kh kiến c a các Sas……………

23-24

Hình 3.2: Diện tích c a pic phụ thuộc vào bước sóng detector………………

25

Hình 3.3: Th i gian lưu c a các sulfamit……………………………………

26-27

Hình 3.4: Sự phụ thuộc c a k’ vào nồng độ đệm axetat trong pha động……

29

Hình 3.5: Píc sắc ký các giá trị nồng độ đệm khác nhau...................................

29-30

Hình 3.6: Sự phụ thuộc c a K’ vào pH c a pha động..........................................

31

Hình 3.7: Sắc đồ sắc ký pH khác nhau...............................................................

32

Hình 3.8: Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ % ACN trong pha động...............................

34

Hình 3.9: Sắc đồ píc sắc ký t i các tỉ lệ thành phần pha động khác nhau...........

34-35

Hình 3.10: Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động.......................

36

Hình 3.11: Sắc đồ tốc độ khác nhau c a pha động.................................................

37

Hình 3.12: Đư ng chuẩn c a chất phân tích trong kho ng nồng độ 0,05-1,00ppm….

39-40

Hình 3.13: Sắc đồ c a các chất phân tích nồng độ khác nhau t i bước sóng 270nm…

40

Hình 3.14: Sắc đồ c a các chất phân tích nồng độ khác nhau t i bước sóng 320nm…

41

Hình 3.15: Sắc đồ c a 5 chất phân tích với nồng độ 0,01ppm…………………

43

Hình 3.16: Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,08ppm ….

45

Hình 3.17: Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,4ppm ……

47

Hình 3.18: Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,8ppm ……

48

Hình 3.19: Sơ đồ xử lý mẫu Tôm.............................................................................

49

Hình 3.20: Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tôm........................

50

Footer Page 6 of 148.

6


Header Page 7 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Hình 3.21: Đư ng chuẩn SGU trong mẫu tôm r o khi phân tích thêm chuẩn….

53

Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong mẫu tôm r o………

53

Hình 3.23: Đư ng chuẩn SGU trong mẫu tôm chân trắng khi phân tích thêm chuẩn..

54

Hình 3.24: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong mẫu tôm chân trắng...

54

Hình 3.25: Đư ng chuẩn c a SGU, SMP trong mẫu tôm sú khi phân tích thêm chuẩn

55

Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU, SMP trong tôm sú……….

56

Hình 3.27: Đư ng chuẩn SGU trong mẫu tôm lớt khi phân tích thêm chuẩn…..

57

Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong tôm lớt…………….

57

Footer Page 7 of 148.

7


Header Page 8 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

M

Đ U

Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ng i c a hầu hết
các cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Một số lo i kháng sinh thông thư ng
(chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) b n thân nó có thể gây ra tác
động có h i cho s c khoẻ ngư i tiêu dùng, một số lo i khác như các kháng sinh
nhóm nitrofurans qua quá trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ra
những hợp chất có độc tính cao đối với cơ thể sống. Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit
(SAs) là nhóm kháng khuẩn có ho t phổ rộng, được sử dụng nhiều trong trong nuôi
trồng, chế biến nông th y s n, v.v..
Việc sử dụng chất này một cách tùy tiện có thể dẫn đến tồn dư một lượng lớn
quá giới h n cho phép trong cơ thể động vật. Khi ngư i tiêu dùng sử dụng thực
phẩm có dư lượng lớn sulfamit hay các chất kháng sinh trong th i gian dài gây ra
một lo t các ph n ng như rối lo n đư ng tiết niệu, rối lo n t o máu, rối lo n
chuyển hóa porphyrin. Cho nên việc xác định chính xác lượng các sulfamit, các chất
kháng sinh trong th c ăn chăn nuôi và lượng tồn dư trong s n phẩm từ động vật là rất
quan trọng.
Dựa trên thực tế đó, trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên c u các
điều kiện tách và xác định đồng th i chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit
như sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis,
phương pháp này có độ chọn lọc, độ nh y tốt và được trang bị
nghiệm c a nước ta, có tính kh thi và ng dụng vào thực tế cao.

Footer Page 8 of 148.

8

nhiều cơ s kiểm


Header Page 9 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái
Ch

ng 1 - T NG QUAN

1.2. Giới thi u chung v sulfamit (SAs), metronidazole(MTD)
1.1.1. C u trúc phân tử [3,6]
Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát:
R2 N

SO 2 NH R1

Khi thay thế các nhóm R1, R2 bằng các gốc khác nhau, chúng ta có các SAs
khác nhau.Vì thế có c một họ SAs.
Khi R2 = H thì sulfamit mới có ho t tính kháng khuẩn. Khi R2 # H, thì chất đó
là tiền thuốc. R1 có thể là m ch thẳng, dị vòng. Tuy nhiên nếu R1 là dị vòng thì hiệu
lực kháng khuẩn m nh hơn, thông thư ng các dị vòng 2-3 dị tố.
Cấu trúc Metronidazole(MTD):

Là một thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt đối với vi
khuẩn kỵ khí và động vật nguyên sinh. MTD là một trong những thành phần có mặt
trong th c ăn chăn nuôi, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng th y s n (với tên thương
m i là Enro DC).
1.1.3. Tính ch t v t lý và hoá học c a các Sulfamit, Metronidazole [3]
1.1.2.1. Tính chất vật lý
SAs

d ng tinh thể màu trắng hoặc vàng nh t, không mùi, thư ng ít tan trong

nước, tan trong dung dịch axít, tan trong dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin).

Footer Page 9 of 148.

9


Header Page 10 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

MTD là tinh thể hoặc bột kết tinh, hơi vàng, không mùi, bền ngoài không khí,
sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng. Nóng ch y

kho ng 159oC – 163oC.

Metronidazol khó tan trong nước, aceton.
1.1.2.2. Tính chất hoá học

- SAs có tính chất lưỡng tính:
 Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung dịch axít.
Ví dụ: cho kết t a muối picrat trong dung dịch HCl loãng.
N-amit linh động, nên dễ tan trong dung

 Có tính axít do có nguyên tử H

dịch kiềm t o muối natri tan để pha thuốc tiêm (trừ Sulfaguanidin):
R
H2N

SO2

R

N

H2 N

H

H 2N

SO2

SO2

N

N

H

R

Na

- SAs t o muối ph c kết t a với ion Ag+, và t o ph c màu kết t a với ion Cu2+,
Co2+, …
nhóm amin bậc một c a SAs có đôi điện tử tự do, giúp SAs thực hiện ph n

-

ng t o ph c chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho ph c màu tím có bước
sóng hấp thụ cực đ i

270-273 nm.

- Nhóm amin thơm tự do cho ph n

ng diazo hoá, rồi ngưng tụ với

n phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ

bước sóng 460nm.

Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl = [Ar-N+ ≡N]Cl- + NaCl + 2H2O
Muối diazoni
đây, Ar – là thành phần -C6H5-SO2NH-R1 c a phân tử SAs.
Nh thế mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp này diễn ra dễ dàng.

Footer Page 10 of 148.

10


Header Page 11 of 148.

Luận văn Thạc sĩ
1.1.6. Tính ch t d

Bùi Minh Thái
c lý và ph tác d ng c a Sulfamit, Metronidazole [3,6,9]

Với liều điều trị, SAs không diệt vi khuẩn, chỉ làm vi khuẩn yếu đi, không phát
triển và sinh s n được, dễ bị b ch cầu tiêu diệt.
SAs có phổ tác dụng và ho t phổ rộng: tác dụng lên nhiều vi khuẩn than, vi
khuẩn t , Shigella, E.coli, trực khuẩn Hansen... Ít hoặc không tác dụng trên một số
vi khuẩn: liên cầu khuẩn yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia... Không có tác dụng
đối với virut (trừ virut gây đau mắt nh y c m với sulfacylum). Nhưng l i có tác
dụng lên một số ký sinh trùng, đặc biệt ký sinh trùng sốt rét.
Tính hấp thu và đào th i: trừ nhóm SAs điều trị đư ng ruột, các SAs nói chung
đều được hấp thu nhanh

ruột non, đào th i ch yếu qua đư ng thận với tốc độ

khác nhau nên th i gian có tác dụng khác nhau.
Metronidazole cũng có ho t phổ rộng bao gồm động vật nguyên sinh và các vi
khuẩn yếm khí bao gồm: nhóm Bacteroides(gồm c B. fragilis), Fusobacterium
Veillonella, nhóm Clostridium (bao gồm c

C. difficile và C. perfringens),

Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus. Nó là hiệu qu đối với B. fragilis
phân lập kháng với clindamycin..
Metronidazole cũng có những ho t động c chế miễn dịch và kháng viêm, và
nó đã được sử dụng trong các bệnh nhân bị bệnh rosacea. Các ho t động kháng
khuẩn c a metronidazole làm thay đổi trao đổi chất c a vi khuẩn acid mật trong
đư ng ruột, gi m ng a những bệnh nhân bị mật th cấp đến xơ gan mật tiền phát.
1.1.7. C ch tác d ng kháng khuẩn c a Sulfamit, Metronidazole [3]
1.1.4.1. Cơ chế kháng khuẩn của SAs
-

c chế enzym chuyển hóa acid folic

Các sulfamit có hiệu lực điều trị tốt đều có gốc R mang dị vòng, dị vòng 2 dị
tố tốt hơn dị vòng 1 dị tố. Ví dụ: sulfamethoxazol: c chế enzym dihydrofolat
synthetase nên ngăn chặn giai đo n chuyển acid folic thành axit hydrofolic.
- Ngăn c n tổng hợp axít folic c a vi khuẩn

Footer Page 11 of 148.

11


Header Page 12 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Vi khuẩn tổng hợp và chuyển hoá axít folic thành nucleo protein (cần thiết cho
mọi tế bào sống) theo sơ đồ sau:
OH
N

CH2

N
H2N

NH

CO

NH

CH CH2 CH2 COOH
COOH

N

acid glutamic

A.PAB

N

+

(vitamin H )

pterin
pteoryl

Acid folic (acid pteoryl glutamic)
Acid Dihydrofolic

Dihydrofolat syntetase
(enzy m)
Dihydrofolat sreductase
(enzy m)

Acid Tetrahydrofolic
Nucleoprp tein

Acid folinic

Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein
Theo sơ đồ trên sự đối kháng giữa A.PAB và SAs là sự c nh tranh vào vị trí
c a A.PAB trong thành phần phân tử axít folic trong quá trình vi khuẩn tổng hợp
axít này. Khi nồng độ đ cao thì SAs sẽ chen vào vị trí c a A.PAB làm cho việc
tổng hợp axít folic bị gián đo n, ngưng trệ. Sự tranh chấp giữa A.PAB và SAs rõ
ràng tuân theo quy luật khối lượng, nên cần duy trì nồng độ có tác dụng

máu trong

suốt th i gian dùng SAs.
SAs thay được A.PAB vì chúng giống nhau về hình d ng, kích thước và nhóm
ch c hoá học:
o

6.7 A

6.9 Ao
O

O
H2N

o

C

2.3 A

H2N

o

S

2.4 A
O

OH

NH - R

ngoài mặt phẳng
A.PAB

Footer Page 12 of 148.

Sulfamit

12


Header Page 13 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Như vậy những vi khuẩn không cần đến axít folic hoặc lấy được axít foclic có
sẵn trong môi trư ng thì không bị SAs tác dụng. Tế bào c a ngư i và động vật lấy
axít folic từ bên ngoài vào như một vitamin (axít folic là vitamin B9), nên không bị
nh hư ng b i SAs. Khi dùng SAs để chữa bệnh thì nó chỉ có tác dụng chọn lọc
trên vi khuẩn.
H

H

N

(-)
N

S
O

H

H

N

R

O

S

(-)
O

O

anion sulfamit

anion PAB

1.1.4.2. Cơ chế kháng khuẩn của Metronidazole
Metronidazole tác dụng lên vi khuẩn kỵ khí như Helicobacter pylori và
Gardnerella vaginalis, nhưng cơ chế c a hành động này là chưa được hiểu rõ. Tuy
nhiên, ho t động c a nó chống l i vi khuẩn kỵ khí bắt buộc x y ra thông qua một
quy trình bốn bước:
- Tấn công vào vi sinh vật: Metronidazole là một hợp chất có khối lượng phân
tử thấp nên dễ dàng khuếch tán qua màng tế bào c a vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí.
- Làm suy gi m ho t hóa b i sự vận chuyển protein trong tế bào:

Metronidazole làm gi m b i pyruvat : ferredoxin(protein ch a sắt chuyển các điện
tử) oxidoreductaza (enzyme xúc tác ph n ng oxy hóa- khử) trong ty thể c a vi
khuẩn kỵ khí, làm thay đổi cấu trúc hóa học c a nó.
Pyruvate: ferredoxin oxidoreductase thư ng t o ra ATP qua decarboxylation
oxy hóa c a pyruvate. Với metronidazole trong tế bào, nhóm nitro c a nó ho t động
như một chỗ cất giữ điện tử, thu giữ điện tử thư ng được chuyển giao cho các ion
hydro trong chu kỳ này. Tác dụng làm suy gi m c a metronidazole thúc đẩy hình
thành các hợp chất trung gian và các gốc tự do độc h i đối với tế bào.

Footer Page 13 of 148.

13


Header Page 14 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

- Gi m tương tác tiểu phân trung gian với tế bào - các tiểu phân trung gian độc
tương tác với DNA ch , dẫn đến vỡ sợi DNA và phá h y chuỗi AND.
- Sự phá vỡ c a các s n phẩm trung gian gây độc tế bào - các tiểu phân trung
gian độc h i phân h y thành s n phẩm cuối cùng không ho t động.
1.1.8. Một s ch phẩm c a Sulfamit tiêu bi u [3;6; 9]
Như ta đã biết, các SAs có c một họ gồm hàng nghìn chất, với những tính
chất và công dụng khác nhau. Vì vậy, chúng tôi chỉ đi sâu vào bốn SAs sẽ được
nghiên c u trong luận văn này.
1.1.8.1. Sulfaguanidin (SGU)
Công thức:

O

O
S
NH

H2N

NH2

HN

Tính chất: D ng bột tinh thể màu trắng, tan rất ít trong nước, axeton, etanol
96o; không tan trong metylen clorit (CHCl3); không tan trong dung dịch có tính
kiềm; tan tốt trong dung dịch các axít vô cơ loãng... Nhiệt độ nóng ch y 189 –
193oC.
SGU cũng như nhiều SAs khác có cấu trúc rất giống A.PAB - một chất không
thể thiếu cho sự phát triển c a vi khuẩn. Nên dễ dàng thay thế A.PAB để kìm hãm
quá trình trao đổi chất c a vi khuẩn. Vì vậy SGU là một tác nhân kháng khuẩn
m nh, được dùng như một lo i thuốc chống các bệnh dịch t , đái tháo đư ng, ch ng
phù, tăng huyết áp...
1.1.5.2.Sulfamethoxypyridazin (SMP)
Công th c:
N
O

O
S
NH

H 2N

Footer Page 14 of 148.

14

N

OCH 3


Header Page 15 of 148.

Luận văn Thạc sĩ
Tính chất: SMP

Bùi Minh Thái
d ng bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà, dưới tác dụng

c a ánh sáng sẽ bị sẫm màu, nâu dần; có vị đắng; rất ít tan trong nước, tan trong
kiềm và axít vô cơ loãng. Nhiệt độ nóng ch y c a dẫn chất axetyl hoá là 228 –
229oC.
SMP tác dụng lên vi khuẩn tương tự như sulfadiazin nhưng hấp thụ

ruột

nhanh hơn, nhiều hơn và đào th i rất chậm nên đ t được nồng độ cao trong máu,
đồng th i duy trì được nồng độ có tác dụng lâu, nên có tác dụng kéo dài. Vì vậy
dùng liều thấp hơn, ít nguy cơ kết tinh

đư ng tiết niệu song cần đề phòng nguy cơ

tích luỹ gây ngộ độc vì sự đào th i chậm. SMP dùng để điều trị các bệnh nhiễm
khuẩn đư ng hô hấp, sinh m , viêm (hoặc giãn) phế qu n, viêm đư ng niệu đ o (bể
thận, ruột thận), viêm họng, màng não tuỷ, v.v...
1.1.5.3.Sulfadoxin (SDO)
Công thức:
O

N

O

N

S
OCH 3

NH
OCH 3

H2 N

Tính chất: SDO d ng bột kết tinh màu trắng, rất ít tan trong nước, ít tan trong
etanol 96o, không tan trong ete, tan trong các dung dịch axít vô cơ loãng và
hydroxyt kiềm. Nhiệt độ nóng ch y 198oC.
SDO chỉ định các nhiễm khuẩn do tụ cầu, lậu cầu, màng não cầu, E.coli, phế
cầu. Dung dịch muối natri tiêm tĩnh m ch cho các trư ng hợp nhiễm khuẩn nặng, trị
sốt rét. Muối Ag c a SDO có tác dụng tốt lên trực khuẩn m xanh, chữa bỏng. SDO
cũng có tác dụng kéo dài.

1.1.5.4. Sulfamethoxazol (SMX)
Công thức:
O
O

O

CH3

S
NH
H2N

Footer Page 15 of 148.

15

N


Header Page 16 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Tính chất: SMX d ng bột tinh thể trắng hoặc trắng ngà. Thực tế không tan
trong nước, khó tan trong ete, hơi tan trong ethanol 96o, dễ tan trong axeton, tan
trong các dung dịch hydroxyt kim lo i kiềm loãng. Nhiệt độ nóng ch y là 169 172oC.
SMX có tính kháng khuẩn m nh, đã được làm thuốc điều trị sốt rét phối hợp

với pyrimethamin, do c chế men dihydropholat nên ngăn c n sự chuyển hóa axít
dihydrofolic. SMX còn được dùng rộng rãi cho các bệnh nhiễm khuẩn đư ng hô
hấp, tai - mũi - họng, đư ng tiết niệu, thận, máu, bộ phận sinh dục, đư ng tiêu hoá,
v.v...
1.2. Ph

ng pháp xác định

1.2.1. Một s công trình nghiên c u xác định Sas bằng ph

ng pháp s c ký

l ng hi u năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất
là các lĩnh vực c a hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học
hợp chất thiên nhiên, các lo i chất có tác dụng độc h i, phân tích môi trư ng... đặc
biệt là tách và phân tích lượng vết các chất.
Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định các kháng khuẩn SAs
trong các lo i mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác khi xác định
dư lượng các kháng khuẩn trong mẫu thực phẩm vì có độ chính xác, độ nh y và độ
lặp l i cao...
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau
khi rửa gi i. Ngày nay có rất nhiều lo i detector được sử dụng cho mục đích này đã
m rộng kh năng phát hiện được rất nhiều lo i chất bằng phương pháp HPLC. Đối
với phân tích dư lượng thì ngư i ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD) nhất là
tách và phân tích chất trong các đối tượng ph c t p. Còn thông dụng ngư i ta dùng
detector UV-Vis hay detector huỳnh quang. Dùng detector UV-Vis thì xác định
được nhiều lo i chất hơn, nhưng detector huỳnh quang thư ng nh y hơn, chọn lọc
hơn và ít hơn các tương tác do các hợp chất có trong nền mẫu.

Footer Page 16 of 148.

16


Header Page 17 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004 [8], qui định phương pháp xác định
hàm lượng nhóm chất SAs (gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfamethazin,sulfamethoxypiridazine,sulfacloropyridazin,sulfadoxin, sulfamethoxazone
sulfadimethoxin và sulfa-chinoxalin) trong s n phẩm th y s n bằng HPLC- detector
huỳnh quang. Điều kiện ch y sắc ký như sau: Cột sắc ký: cột Nucleosil 250×3mm
100-5 C18 AB. Chương trình pha động (gồm: dung dịch H3PO4 0,02M và hỗn hợp
metanol- axcetonitril tỷ lệ 1:1), bắt đầu với 60 % H3PO4 và đến 45 phút 45 %
H3PO4, tốc độ dòng 0,6 ml/phút. Thể tích mẫu tiêm 10 l. Bước sóng kích thích
405nm, bước sóng phát x 495nm. Phương pháp xử lý mẫu này cho hiệu suất thu
hồi nằm trong kho ng 60-70 %, với giới h n phát hiện nhỏ hơn 5

g/kg.

Năm 2010 Cheong và cộng sự[12] đã xác định dư lượng 4 SAs (Sulfadiazine
(SDZ),Sulfamethazine(SMZ),Sulfamethoxazole(SMX) và Sulfaquinoxaline(SQX))
trong gan gà sử dụng phương pháp HPLC pha đ o, detector UV t i bước sóng
266nm. Điều kiện ch y sắc ký như sau: cột C18 (5 μm, 4.6 mm x 25.0 cm). Kênh
A: amoni axetat nồng độ 0,01M(pH =4,6). Kênh B: ACN. Sử dụng gariend pha
động như sau: ban đầu 95% A- 5%B, sau 18phút: 67%A -37%B, sau 23 phút95%

A- 5%B. Tốc độ pha động 1ml/phút. Nồng độ c a SAs được phát hiện trong mẫu từ
11 tiểu bang trên bán đ o Malaysia là 0,006-0,062 μg/g trong nhu mô và 0,08-0.193
μg/g trong gan .
Rodrigo H.M.M. Granja, Alfredo M. Montes Niño, Fernanda Rabone and
Alessandro Gonzalez Salerno[25] đã sử dụng phương pháp HPLC –detector UV để
xác định sunfamit trong mật ong. Sulfonamid được trích xuất từ mật ong với
dichloromethane sau khi gi i thể với clorua natri 30%, và làm s ch với chiết pha rắn
trên các cột Florisil. Dung dịch chiết được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
với phát hiện tia cực tím. Các giới h n phát hiện được xác định t i 3 μg/kg, 4 mg/kg
và 5 mg/kg cho sulfamethazine, sulfathiazole và sulfadimethoxine, tương ng với
hiệu suất thu hồi 61,0% cho sulfathiazole; 94,5% cho sulfamethazine và 86,0% cho
sulfadimethoxine

Footer Page 17 of 148.

m c 100μg/kg.

17


Header Page 18 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Ngoài detector UV, huỳnh quang, là những detector thư ng dùng, nhiều công
trình nghiên c u còn sử dụng detector khác như detector diode array (DAD),
detector điện hóa cho độ nh y và độ chọn lọc cao.
Tác gi Ivan Pecorelli và các đồng sự [18], sử dụng phương pháp HPLC DAD để phân tích đồng th i dư lượng 10 SAs trong mẫu bắp thịt (sulfadiazin,

sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamono-methoxin, sulfachlorpyridazin, sulfamethoxazone, sulfaquinoxalin, và sulfadimethoxin). Điều kiện
ch y sắc ký: Cột C8 (250mm × 3mm, 5 m). Pha động là axetonitril (A) và dung
dịch đệm axetat pH = 4,5(B), ch y gradient: bắt đầu với 15% B, đến 22 phút 41%
B, tốc độ pha động 0,4 ml/phút. Detector DAD đặt 270nm. Chuẩn bị mẫu: Cân 10g
mẫu bắp thịt đã được nghiền đồng thể vào ống ly tâm 50ml. Thêm vào đó 10g
Na2SO4 khan và 20ml etyl axetat lắc đều trong 15 phút. Đem ly tâm với tốc độ 3000
vòng/phút trong 10 phút. Pha hữu cơ được chuyển sang bình nón 250ml. Quá trình
chiết như vậy được lặp l i lần hai. Kết hợp hai phần chiết l i đem cô c n bằng hút
chân không. Sau đó đem pha trong 40ml etyl axetat. Chiết pha rắn: Cột Speedisk
được ho t hoá bằng 2×3ml n-hexan và 2×4ml etyl axetat. Sau khi bơm mẫu vào cột
được rửa bằng 5ml nước và 5ml metanol, rửa gi i bằng 20ml hỗn hợp
metanol/amoniac (tỷ lệ 97,5/2,5 về thể tích). Dung dịch thu được làm khô trong
điều kiện chân không, rồi hoà tan trong 1ml dung dịch đệm axetat pH = 4,5 với
0,1% metanol. Lọc qua catridge 0,45 và 0,2 l trước khi bơm vào máy HPLC.
Phương pháp này có hiệu suất thu hồi các SAs khá cao 55-92%, với giới h n phát
hiện 0,05

g/kg.

W.Hela và các cộng sự [29] cũng sử dụng phương pháp HPLC - DAD để xác
định đồng th i mư i hai SAs (sulfadiazin, sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin,
sulfamethizol,sulfadimidin,sulfisoxazol,sulfamethoxazone,sulfatroxazol,sulfachlorp
yrazin, sulfaphenazol và dapsone) trong mẫu bắp thịt, gan và thận c a lợn, gà...
Điều kiện ch y sắc ký: pha tĩnh được dùng là cột Phenonmenex Luna C8 (250 ×
2mm, kích thước h t nhồi 5 m). Pha động là đệm amoniaxetat pH=4,6 (A) và
axetonitril (B), ch y gradient bắt đầu với 5% B đến 60 phút 40% B, tốc độ pha động

Footer Page 18 of 148.

18

Header Page 19 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

0,35 ml/phút. Detetor DAD đặt 260nm (đối với các SAs), và đặt 294nm (đối với
chất nội chuẩn). Phương pháp này có giới h n phát hiện các SAs là 1ppb.
Sắc ký lỏng (HPLC) là một phương pháp được lựa chọn cho việc xác định
các chất vô cơ và hữu cơ trong hỗn hợp khác nhau. Tuy nhiên, nhiều chất có thể
không được phát hiện trong HPLC vì không ch a các màu, huỳnh quang hoặc
nhóm khử oxy hóa. Điều này vấn đề có thể khắc phục bằng các ph n ng dẫn xuất
hóa. Một ph n ng dẫn xuất hóa là cần thiết để tăng độ nh y c m hay chọn lọc và
có thể đ t được b i một phát hiện cụ thể, chẳng h n như huỳnh quang hoặc hấp thụ
trong ánh sáng nhìn thấy, t i một bước sóng cao. Ngày nay, có rất nhiều công trình
nghiên c u ng dụng lý thuyết này để phát hiện và tách các sulfamit trong các mẫu
sinh học ph c t p.
PVinas, C.Lopez Erroz, N.Campillo, M.Hernandez [22] xác định dư lượng
sulfamit( sulfadiazine, sulfathiazole, sulfapyridine, sulfamerazine, sulfamethazine,
sulfamethizole,sulfamethoxypyridazine,sulfachloropyridazine,sulfamonomethoxine,
, sulfamethoxazole, sulfadimethoxine) trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC
với dẫn xuất hóa huỳnh quang sau cột. Chất dẫn xuất hóa được sử dụng

đây là

OPA (o-phthldialdehyde) kết hợp với β-mercaptoethanol (ME). Phát hiện huỳnh
quang: Eex =302nm; Eem = 412nm. Xây dựng đư ng chuẩn: Pha động ban đầu:
acetonitrile-nước (3:97) trong 5 phút sau đó gradient tuyến tính từ(3:97) đến (40:60)

trong 15 phút. Cuối cùng, lặp l i điều kiện ban đầu trong 1phút, giữ trong 15phút,
tốc độ 0,5ml/phút. Chất dẫn xuất hóa (0,01M OPA + 0,02M ME, hòa tan trong
ethanol 2% 0,7M H3PO4) được thêm b i bơm nhu động t i tốc độ 0,25ml/phút.
Chúng được trộn lẫn và ph n ng trong cuộn PTFE (2,5

0,8 I.D)

40oC. Đư ng

chuẩn c a sulphamethoxazole từ 0,01 -2 µg/ml, các sulfamit còn l i 0,02 -2 µg/ml.
Craig D.C. Salisbury, Jason C.Sweet, Roger Munro[13]sử dụng phương pháp
HPLC với dẫn xuất huỳnh quang trước cột để xác định dư lượng sulfamit
(sulfachloropyridazine,sulfadiazine,sulfadimethoxine,sulfadoxine, sulfaquinoxaline,
sulfaethoxypyridazine, sulfamethazine, sulfathiazole) trong mô lợn, gan bò, cừu
,ngựa , thịt gà, gan cá, th c ăn chăn nuôi. Mẫu trích được b o qu n trong đệm pH

Footer Page 19 of 148.

19


Header Page 20 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

3,0-ACN (60:40), mẫu được dẫn xuất hóa trước cột với fluorescamine. Các chất dẫn
xuất sulfonamide được tách bằng sắc ký lỏng sử dụng cột C18 với pha động: acid
phosphoric 0,02M-ACN(60,5: 39,5) và phát hiện bằng huỳnh quang (Eex = 405 nm;

Eem = 495nm). Giới h n phát hiện (LOD) cho tất c các sulfamit được 0,01 μg/g,
ngo i lệ sulfaquinoxaline LOD là 0,015 μg/g.
Qiong-Hui Zou, Xiang-Feng Wang,Yuan Liu, Jin Wang, Jia Song, Hui Gao,
Jie Han[23] cũng xác định dư lượng đồng th i là 12 sulfamit (sulphadiazine,
sulphamethazine,sulphathiazole,sulphadimethoxine,sulphamerazine,sulphapyridine,
sulphamethoxazole,suphamethizole,sulphaquinoxaline,sulphameter,sulphamonomet
hoxine, và sulphachloropyridazine) trong các mô động vật (gan lợn, thịt gà, bắp thịt
bò) b i HPLC với detecto UV. Chất dẫn xuất hóa trước cột c a các hợp chất
sulfamit với 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl) đã được đề xuất và các
điều kiện ph n ng đã được tối ưu hóa. Các giới h n phát hiện cho các hợp chất
sulfamit đã được c i thiện rất nhiều sau khi bước dẫn xuất hoá. Dư lượng sulfamit
trong mô động vật được chiết bằng acetonitrile và tinh chế bằng cách chiết pha rắn
với C18. Phương pháp này có độ nh y cao và lặp l i tốt và hiệu suất thu hồi trung
bình trên 70%. Các giới h n phát hiện cho hầu hết các sulfamit có thể đ t 3-5 μg/kg.
1.2.2. Một s công trình nghiên c u xác định Metronidazole bằng ph

ng pháp

s c ký l ng hi u năng cao (HPLC)
HPLC là phương pháp mới được ng dụng để xác định Metronidazole trong
những năm gần đây.
Năm 2005, Ticiano Gomes Nascimento và cộng sự [26] sử dụng HPLC – UV
xác định đồng th i ranitidine và metronidazole trong huyết tương. 250ml huyết
tương sau khi được kết t a với percloric 60%, ly tâm, sau đó tiêm trực tiếp vào
HPLC. Điều kiện tách: cột C18 Shimpak, pha động KH2PO4 10mM(pH=3,5) –
ACN(90:10,v/v), phát hiện UV t i bước sóng 315nm. Phương pháp này cho độ
chính xác cao (RSD <15%). Hiệu suất thu hồi: ranitidine (96,22 ± 3,52);
metronidazole (95,00 ± 4,50%). Định lượng ranitidine trong huyết tương là
20ng/ml, metronidazole là 40ng/ml.

Footer Page 20 of 148.

20


Header Page 21 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Năm 2007 Naser Tavakoli[20]và cộng sự cũng đã sử dụng HPLC để xác
định đồng th i metronidazole và amoxicillin. Điều kiện sắc ký: cột C18, pha động
pH =4, phát hiện b i detector UV t i bước sóng 254nm. Kho ng tuyến tính c a
amoxicillin 0,15- 600(mg/ml); metronidazole 0,13 -300mg/ml. Giới h n phát hiện
c a amoxicillin (LOD:0,05mg/ml,LOQ:0,15mg/ml);metronidazole(LOD: 0,1mg/ml,
LOQ:0,13mg/ml).
Cũng vào năm đó Han-Wen Sun[17] đã xác định đồng th i dư lượng 7
nitroimidazole:metronidazolenext,ronidazole, dimetridazole, tinidazole, Ornidazole,
secnidazole và các chất chuyển hóa chung c a ronidazole và hydroxydimetridazole
trong thịt bằng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện tách: cột silica C18, pha động
H2O- ACN, detector UV phát hiện t i bước sóng 300nm. Hiệu suất thu hồi cho các
mẫu thịt gà, thịt lợn, thịt xông khói 71,4-99,5%. Kho ng tuyến tính từ 0,7 60mg/kg. Độ lệch chuẩn tương đối c a 10 phép đo cho các mẫu thịt gà, thịt lợn và
thịt xông khói tăng,

nồng độ 1mg/kg : 6,2-13,9% và 20 mg/kg : 4,0-8,7%.

Năm 2008 Hadir M. Maher và cộng sự [16] đã xác định dư lượng đồng th i
metronidazole và spiamycin trong cá sử dụng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện
sắc ký: cột tách C18 Sep-Pak, pha động: rửa gi i gradient 0,05M đệm phosphate

(pH =2,4)-ACN, tốc độ dòng 1ml/phút. Kho ng tuyến tính c a metronidazole:
0,005-1,000mg/g, LOD:0,002mg/g, LOQ:0,005mg/g. Kho ng tuyến tính c a
piamycin: 0,025 -1,000mg/g, LOD: 0,005mg/g, LOQ: 0,025mg/g.
1.2.3. Một s

công trình nghiên c u xác định đ ng th i các sulfamit và

metronidazole bằng ph

ng pháp s c ký l ng hi u năng cao HPLC

Từ những tương đồng trong việc xác định SAs và MTD, rất nhiều công trình
đã xác định được đồng th i MTD và các SAs trong các đối tượng khác nhau
Năm 2002, Richard Lindberg và cộng sự[24] đã xác định đồng th i các chất
kháng sinh thuộc các họ sau: fluoroquinolones, sulfamit, trimethoprim,-β lactam
(penicillin và cephalosporines), nitroimidazoles và tetracycline trong nước th i bệnh
viện. Phương pháp phân tích là HPLC – MS. Các chất phân tích có nồng độ thay

Footer Page 21 of 148.

21


Header Page 22 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

đổi theo th i gian vì vậy 7 mẫu phân tích được lấy lúc 13h. Nồng độ chất phân tích

thay đổi trong ph m vi sau đây(mg/l):ciprofloxacin:3,6-101,0 (mg/l); metronidazole
0,1-90,2(mg/l);sulfamethoxazole:0,4-12,8(mg/l);ofloxacin:0,2-7,6(mg/l);
trimethoprim 0,6-7,6(mg/l); doxycycline 0,6-6,7(mg/l).
Năm 2007, Wang P, Li J, Zheng H [31] đã xác định đồng th i 7 sulfamit
(sulfacetamide,sulfapyridine,sulfamerazine,sulfamethazine,sulfamater,sulfamonome
thoxine, sulfamethoxazole) và metronidazole, chloramphenicol trong mỹ phẩm
bằng sắc ký HPLC-PDA. Điều kiện sắc ký: cột sắc ký Atlantis dC18 (150 mm x 4,6
mm, 5µm). Pha động : axit formic0,1% - acetonitrile(20: 80, v/v) tốc độ dòng ch y
1,0 ml/phút. Phát hiện b i detector PDA t i 268 nm. Giới h n định lượng 3 - 80
mg/g. Kho ng tuyến tính c a các sulfamit 20-200 mg/ml. Kho ng tuyến tính c a
metronidazol, chloramphenicol 40-400 mg / ml. Hiệu suất thu hồi trung bình là
83,8% - 105,3% . Độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 5%. Phương pháp này thư ng
được sử dụng cho việc xác định b y sulfamit và metronidazole, chloramphenicol
trong mỹ phẩm.

Footer Page 22 of 148.

22


Header Page 23 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Ch
2.5. Đ i t
2.5.1. Đ i t

ng 2 - Đ I T

Bùi Minh Thái

NG VÀ PH

NG PHÁP NGHIểN C U

ng, m c tiêu vƠ nhi m v nghiên c u
ng vƠ m c tiêu nghiên c u

Việt Nam nuôi tôm đã tr thành ho t động quan trọng nhất và được xem là
mục tiêu ch yếu c a kế ho ch phát triển nuôi trồng th y s n. Sự phát triển nhanh
chóng c a nghề nuôi tôm dẫn đến tình hình sử dụng thuốc và hóa chất cũng gia
tăng. Họ thuốc kháng khuẩn SAs, MTD là nhóm có ho t phổ rộng, được sử dụng
nhiều trong chăn nuôi tôm để phòng ngừa và chữa nhiều lo i bệnh nhiễm khuẩn cho
vật nuôi. Sau khi vật nuôi đã sử dụng các chất đó, nếu không đ m b o th i gian
cách ly để vật nuôi tự làm s ch thì sẽ có tồn dư chất kháng khuẩn có thể gây tổn h i
cho s c khoẻ ngư i tiêu dùng.
Dư lượng kháng sinh trong tôm tác động xấu cho ngư i tiêu dùng đã được
c nh báo từ nhiều năm trước nhưng đến nay vẫn còn tồn t i vì thế các nghiên c u
liên quan đến lĩnh vực này hiện rất quan trọng và có ý nghĩa lớn nhằm c i thiện sự
bền vững trong nuôi tôm theo định hướng b o vệ môi trư ng và s n xuất s n phẩm
có chất lượng và an toàn.
Vì vậy đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên c u là Metronidazole
sulfaguanidin(SGU),sulfamethoxypyridazon(SMP),sulfadoxim(SDO),sulfamethoxa
zon (SMX) được sử dụng nhiều trong chăn nuôi.
Mục tiêu c a đề tài chính là cần tìm ra phương pháp có thể tách và xác định
đồng th i các chất trên trong tôm cho độ nh y, độ chính xác cao mà đơn gi n, phù
hợp với trang thiết bị sẵn có. Xuất phát từ yêu cầu này, chúng tôi lựa chọn phương
pháp nghiên c u là phương pháp HPLC hấp phụ pha ngược, detector ghép nối là
detector UV-Vis.

2.1.2. Nhi m v nghiên c u
Với mục tiêu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên c u tách và xác định

Footer Page 23 of 148.

23


Header Page 24 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

đồng th i các Sas, MTD bằng HPLC sử dụng cột chiết pha ngược dùng detector
UV-Vis.
Vì vậy để xây dựng được một quy trình phân tích tốt, chúng tôi đã nghiên c u
một cách có hệ thống các vấn đề sau:
Tối ưu hoá các điều kiện tách và định lượng đồng th i năm chất bằng HPLC:
 Chọn bước sóng c a detector
 Chọn pha tĩnh
 Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ…
 Kh o sát kho ng tuyến tính, giới h n phát hiện và giới h n định lượng
 Đánh giá độ lặp l i và độ đúng c a phép đo.
Tối ưu hoá các điều kiện xử lý mẫu phân tích:
 Chọn phương pháp xử lý mẫu và xác định hiệu suất thu hồi
Xây dựng quy trình phân tích và ng dụng quy trình nghiên c u để phân tích
một số mẫu tôm.
2.6. Ph

ng pháp nghiên c u

Trong luận văn này đối tượng phân tích là các mẫu tôm, có thành phần nền rất
ph c t p. Vì vậy chúng tôi chọn phương pháp HPLC (High Performance Liquid
Chromatograghy - Sắc ký lỏng hiệu nâng cao) để kh o sát các điều kiện tách và
định lượng các chất.
2.6.1. Nguyên t c chung vƠ trang bị c a ph

ng pháp HPLC [4 ; 8]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất
trong đó x y ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có ch a các chất
nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ
số phân bố c a nó. Các chất nhồi cột có kích thước đ nhỏ để đáp ng hiệu qu tách
sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi để đ t được lực rửa gi i phù hợp
nhất. Chất tan sau khi chuyển tới cuối cột tách được chuyển đến detector để phát

Footer Page 24 of 148.

24


Header Page 25 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

hiện. Tuỳ thuộc vào b n chất c a chất tan mà dùng các lo i detector khác nhau.

Trong một hệ pha HPLC, dung lượng hấp phụ c a pha tĩnh được đặc trưng
bằng hệ số dung tích k’. Nếu k’ càng lớn thì chất phân tích sẽ bị lưu giữ càng nhiều
trên cột tách. Hệ số dung tích được tính theo biểu th c : k' 

tR  to
(tR: th i gian lưu
to

tổng cộng, to: th i gian không lưu giữ).
Quá trình tách chất có thể x y ra theo ba cơ chế chính như sau:
 Tương tác hấp phụ
 Tương tác trao đổi ion
 Tương tác theo cơ chế rây phân tử
 Tương ng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau:
 Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thư ng NP - HPLC và hấp phụ pha ngược RP
- HPLC)
 Sắc ký trao đổi ion (EX - HPLC)
 Sắc ký rây phân tử (Gel - HPLC)
Đối với hệ NP - HPLC, pha tĩnh là các chất phân cực, pha động là dung môi
không và kém phân cực. Ngược l i trong hệ RP - HPLC, pha tĩnh kém phân cực,
thông thư ng pha tĩnh là các chất phân cực đã được silan hoá bề mặt t o thành các
vật liệu nhồi kém phân cực. Pha động trong hệ này là các dung môi phân cực. Khác
với hệ pha thư ng dùng cho các chất không phân cực hay ít phân cực, hệ này có thể
phân tích nhiều lo i chất với độ phân cực khác nhau. Do các ưu điểm như xác định
được nhiều lo i chất, hiệu qu tách tốt, dung môi ít tốn kém hơn NP – HPLC nên
ngày nay sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế hấp phụ pha ngược được sử dụng
nhiều hơn.
Sơ đồ tổng quát c a một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau:

Footer Page 25 of 148.

25