Nghiên cứu sử dụng mủ đu đủ (enzyme papain) thủy phân cá tra chết để sản xuất phân hữu cơ sinh học và khảo sát hiệu lực trên rau ăn lá

1
TÁC GIẢ: Trương Công Phát
TÓM TẮT
Hiện nay, việc sử dụng phân hữu cơ ngày càng được chú trọng. Nước ta có điều kiện
thuận lợi để phát triển nền nông nghiệp hữu cơ như: nguồn enzyme thực vật phong phú và lượng
phụ phẩm nông nghiệp dồi dào. Trên cơ sở đó, đề tài “Nghiên cứu sử dụng mủ đu đủ thô (enzyme
papain) thủy phân cá tra chết để sản xuất phân hữu cơ sinh học và khảo sát hiệu lực trên rau ăn
lá” được thực hiện.
Chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân như: tỉ lệ
enzyme và cơ chất, lượng nước bổ sung, nhiệt độ và thời gian thủy phân. Sau đó, sản phẩm phân
hữu cơ dạng lỏng được sản xuất và đem thử nghiệm ngoài đồng ruộng để kiểm tra hiệu quả của
phân trên cây cải xanh.
Điều kiện tối ưu để sản xuất phân hữu cơ được xác định là tỉ lệ mủ đu đủ : cơ chất cá tra
là 0,18 g mủ : 30 g cơ chất (0,6 %), bổ sung 100 % nước, nhiệt độ thủy phân 55°c trong 20 giờ
cho sản phẩm phân tốt nhất.
Sau khi xây dựng qui trình thủy phân, chúng tôi tiến hành sản xuất phân hữu cơ dạng
lỏng. Kết quả thử nghiệm trên cây cải xanh cho thấy nồng độ sử dụng phân thích hợp là 7 %,
cây cải xanh phát triển tốt và hàm lượng nitrate an toàn cho người tiêu dùng.
Ngoài ra, nhờ sử dụng nguồn nguyên liệu phụ phẩm nên giá thành của phân thấp hơn
các sản phẩm cùng loại hơn thị trường.
Như vậy, việc sử dụng papain từ mủ đu đủ thủy phân cá tra chết vừa giải quyết được
vấn đề môi trường vừa mang lại lợi ích kinh tế cho người nuôi cá. Bên cạnh đó, đề tài là cơ sở
cho các nghiên cứu khác về sử dụng phụ phẩm nông nghiệp làm giàu cho đất nước.


2
1. Đặt vấn đề
Cùng với sự gia tăng dân số nhanh chóng, con người đang đứng trước thách thức to lớn
về vấn đề lương thực thực phẩm. Sự tăng năng suất cũng đem đến cho con người nhiều vấn đề
về tài nguyên và môi trường. Việc sử dụng phân bón vô cơ, thuốc bảo vệ thực vật vô tội vạ đang
làm ảnh hưởng đến môi trường và gây lãng phí nguồn tài nguyên.

Việc sử dụng phân hữu cơ đang dần tháo gỡ các khó khăn trên. Hiện nay, thị trường phân
hữu cơ đang phát triển rầm rộ và có khả năng thay thế dần nguồn phân vô cơ đang dần bị cạn
kiệt trong tương lai. Trong đó, phân hữu cơ sinh học có triển vọng rất lớn. Lĩnh vực này đang
được rất nhiều cơ quan và công ty trong và ngoài nước quan tâm và đầu tư nghiên cứu.
Bên cạnh đó, nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới và có thế mạnh về nông nghiệp. Nguồn
enzyme thực vật phong phú và sẵn có là điều kiện thuận lợi cho chúng ta phát triển lĩnh vực
phân hữu cơ sinh học. Cây đu đủ là loại cây rất phổ biến, dễ trồng và cho năng suất cao. Trung
bình 1 kg mủ chứa khoảng 200 g papain, 1 cây đu đủ cho khoảng 0,45 kg mủ đu đủ (Nguyễn
Tiến Thắng, 2004). Hoạt tính của papain lại cao (91,12 TU/mg - Nguyễn Thị Xuân Dung, 2005)
nên đây là nguồn enzyme phong phú và rẻ tiền.
Hiện nay, tại đồng bằng sông Cửu Long, sản lượng cá tra được nuôi trồng rất lớn. Năm
2008, nước ta xuất khẩu 640.000 tấn cá tra cá basa đạt giá trị 1,45 tỉ USD. Việt Nam đang nhắm
đến sản xuất khoảng 1,5 triệu tấn cá tra, cá basa năm 2009 (Helga Josupeit, 2009).
Tuy nhiên, thành tựu trên đang đặt ra cho đồng bằng sông Cửu Long vấn nạn về môi
trường. Thử làm một phép tính, với 1 triệu tấn cá tra, tỷ lệ phi lê của cá chỉ chiếm 30%, như vậy
có khoảng 700.000 tấn phụ phẩm từ các nhà máy chế biến, đấy là chưa kể tỷ lệ nuôi sống đến
lúc khai thác thường chỉ đạt 70% tương đương với 428.500 tấn cá chết. Nếu biết tận dụng hợp
lý nó sẽ đem lại nguồn thu rất lớn từ lượng phế phụ phẩm này, ước đạt 4.000 tỷđồng/năm
(Phương Uyên, 2007).
Hiện nay, công ty cổ phần Nông Nghiệp Mekong đã sản xuất thành công phân hữu cơ sinh
học từ xác cá da trơn. Các phế phụ phẩm trong các nhà máy chế biến thủy sản như vây, vảy,
máu cá v.v và xác cá tra, cá basa nguyên con được xay nhuyễn và phân hủy bằng men chuyên
dụng. Các cơ chất trên được phối trộn theo tỉ lệ thích hợp để tạo nên các dòng sản phẩm chuyên
dụng cho từng nhóm cây trồng như cây lúa, cây


3
rau màu, cây công nghiệp, cây ăn trái v.v. Tuy nhiên, với quy trình yếm khí, thời gian thủy phân
lâu nên năng suất chưa cao.
Năm 2005, Nguyễn Thị Xuân Dung đã thực hiện đề tài “Sử dụng enzyme papain để thủy

phân bánh dầu đậu nành và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình thủy phân”. Qua đó, các
điều kiện ảnh hưởng tới papain đã được xác định và đây là cơ sở để sử dụng papain thủy phân
nguồn cơ chất sẵn có để sản xuất phân hữu cơ.
Dựa trên điều kiện thực tế đó, chứng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sử dụng
mủ đu đủ thô (enzyme papain) thủy phân cá tra chết để sản xuất phân hữu cơ sinh học và khảo
sát hiệu lực trên rau ăn lá”.
Để tối ưu hóa quá trình sản xuất phân hữu cơ, chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng đến quá trình thủy phân như: tỉ lệ enzyme và cơ chất, lượng nước bổ sung, nhiệt độ và
thời gian thủy phân. Sau đó, sản phẩm phân hữu cơ dạng lỏng được sản xuất và đem thử nghiệm
ngoài đồng ruộng để kiểm tra hiệu quả của phân trên rau.
Điều kiện tối ưu để sản xuất phân hữu cơ được xác định là tỉ lệ mủ đu đủ : cơ chất cá tra
là 0,18 g mủ : 30 g cơ chất (0,6 %), bổ sung 100 % nước, nhiệt độ thủy phân 55 °c trong 20 giờ
cho sản phẩm phân tốt nhất. Với các điều kiện này, việc sản xuất phân hữu cơ không những cho
ra sản phẩm chất lượng cao mà còn tiết kiệm nguyên liệu, từ đó hạ giá thành sản xuất. Sản phẩm
sẽ có tính cạnh tranh hơn trên thị trường .
Sau khi xây dựng qui trình thủy phân, chứng tôi tiến hành sản xuất phân hữu cơ dạng
lỏng. Kết quả thử nghiệm trên cây cải xanh cho thấy nồng độ sử dụng phân thích hợp là 7 %,
cây cải xanh phát triển tốt và hàm lượng nitrate an toàn cho người tiêu dùng. 2. Mục tiêu Phương pháp 2.1 Mục tiêu của đề tài
- Xây dựng quy trình tối ưu cho việc sản xuất chế phẩm phân hữu cơ sinh học sử dụng
enzyme papain thô thủy phân cá tra chết.
- Xác định hiệu lực của loại phân này thông qua thử nghiệm trên cây cải xanh.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
Cá tra chết thu tại chợ Linh Trung, Thủ Đức, cá để nguyên con xay nhỏ, cho vào các túi
ni lông nhỏ cho vào tủ lạnh trữ trong tủ -20°c, khi nào cần dùng đem ra rã đông một lượng vừa
đủ dùng.


4
Enzyme papain thô từ mủ đu đủ được thu nhận bằng cách dùng dao vạch từ 5 - 7 rảnh,

chiều sâu 1-2 mm lên bề mặt dọc trái đu đủ xanh, mủ sẽ chảy ra, thu mủ vào ống nhựa, trữ lạnh.
Sau đó sấy khô trong tủ sấy ở 55°c đến ẩm độ của nhựa khô đạt < 8 %, nghiền mịn, rồi trữ mẫu
ở - 20°c.
Hạt giống cải xanh do Công ty Trang Nông cung cấp.
Một số loại phân hữu cơ trên thị trường như:
- Phân bón lá Toponsu của Công ty TNHH sản xuất Hưng Quốc Bảo. Thành phần dinh
dưỡng: N: 15 %; P: 15 %, các nguyên tố trung và vi lượng 4 %.
- Phân Jumb Start dạng lỏng 500 ml. Thành phần dinh dưỡng: N: 0,1 %; P2O5: 0,025
%; K20: 0,1 %; Mg: 0,05 %; Zn: 0,05 %, Fe: 0,1 %. Địa chỉ cung cấp: 67, Phạm Thành Hổ, Q.6,
TP. Hồ Chí Minh.
- Phân HPRC của Viện Sinh Học Nhiệt Đới - Xưởng sản xuất sinh học Phường Thảnh
Lộc, Q.12, TP. Hồ Chí Minh Thành phần dinh dưỡng: N: 30 %; p205: 10 %; K20: 10 %.
2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu
Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi sử dụng các phương pháp:
- Xác định đạm, lân, kali tổng số, đạm formol, đạm amoniac để xác định thành phần
của nguyên liệu và hiệu quả của quá trình thủy phân.
- Xác định hoạt tính enzyme để đánh giá khả năng thủy phân của enzyme.
- Xác định NO3" để đánh giá dư lượng NO3" còn trong cây.
- Xác định NH4+ để xác định hàm lượng NH4+ trong sản phẩm phân hữu cơ để cây có
thể sử dụng được.
- Phương pháp lấy mẫu phân tích: giúp quá trình lấy mẫu cây trồng chính xác, hạn chế
sai số trong quá trình phân tích mẫu.
2.2.2.1.

Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldhal
Nguyên tắc Tiêu chuẩn này tiến hành dựa theo phương pháp Kjeldhal. Chuyển toàn bộ

nitơ trong mẫu thành dạng amon sulfat, giải phóng NH3 bằng kiềm, hấp thu NH3 bằng axit boric
và xác định N bằng phương pháp trung hòa dung dịch chuẩn HC1 hoặc H2S04.
Cách tiến hành

Cân 1 g (hoặc 1 ml dung dịch) mẫu cho vào ống đốt, thêm 2 g hỗn hợp muối và 25 ml
H2S04 đậm đặc 5 giọt parafin, cho vào máy phá mẫu, tiến hành phá mẫu cho đến khi dung dịch
có màu trong suốt, để nguội và thêm khoảng 50 ml nước.


5
Tiến hành cất đạm: lấp ống đốt vào máy cất đạm khoảng 350 giây, NH= được hấp thu
bằng 50 ml dung dịch axit boric 5 % đã cho thuốc thử bromocresol.
Định lượng NH3 bằng cách chuẩn độ với HC1 0,25 N đến khi chuyển từ màu xanh sang
màu tía nhạt.
Cách tính % khối lượng N trong mẫu
( a-b) X N X 0,01401 X 100 N % =
--------------------------- ---------------m
Trong đó: a: thể tích dung dịch axit chuẩn sử dụng cho mẫu thử (ml).
b: thể tích dung dịch axit chuẩn sử dụng cho mẫu trắng (ml).
N:nồng độ đương lượng axit chuẩn, m: khối lượng mẫu (g).
0,01401 : mili đương lượng gam N (g).
2.2.2.2.

Phương pháp xác định nitrogen formol theo phương pháp Sorensen

Nguyên tắc Trong phân tử amino axit, peptite, protein có một đầu chức là carboxylic (COOH) xem như là một axit, còn đầu kia là chức amin ( -NH2) xem như là một bazơ; các amin
tự do cũng như ammoniac khi hòa tan thường ở dạng ammonium (NH4+) kết hợp với một anión
thường làclorua, sulfate, phosphate v.v.
Như vậy khi cho tác dụng các phân tử “phi protein” này với formol, formol sẽ tác dụng lên
nhỏm -NH2 để tạo thành phức chất metylen.

HOOC - ÇH - NH2 + HCHO I
R

------------ ► HCOO - ç = CH2 + H20
I

R - CH4C1 + HCHO ------------

R
— R - N = CH2 + H20 + HC1

Do vậy sản phẩm là một họp chất metylen và một chức -COO tự do hoặc HC1 có tính axit,
nên ta có thể định phân bằng NaOH để xác định một cách gián tiếp lượng -NH2 (Nf).
Cách tiến hành
Trung hòa formol lÁ: lấy 500 ml formol V2, thêm vào đó vài giọt thuốc thử phenolphtalein,
cho NaOH 0,1 N từng giọt cho tới khi dung dịch chuyển màu hồng nhạt (pH = 9), ta được formol
V2 đã trung hòa.
Hút 10 ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 10 lần, thêm vào đó 10 ml dung dịch formol
Vi đã trung hòa và vài giọt phenolphtalein, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó định
phân bằng NaOH 0,1 N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng.


6
Cách tính số gam N có trong 1 lít nguyên liệu là: Np = 1,4 X X X (Vt - Vo)
Trong đó:

Vo: thể tích NaOH trung bình của 3 lần thử không.
Vt: thể tíchNaOH trung bình của 3 lần thử thật, x: là
hệ số hiệu chinh của dung dịch NaOH 0,1 N.

2.2.2.3.

Phưong pháp xác định NH3 bằng hệ thống máy Kjeldhal

Nguyên tắc Nitrogen NH3 thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với Magie
oxit (MgO) thì những loại nitrogen này sẽ bị đuổi khỏi dung dịch, nên chứng sẽ bị lôi cuốn
theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa axit. Sau đó, đem định phân lượng axit dư cho
phép ta xác định được loại đạm này (N-NH3).
2NH4+ + Mg(OH)2 ---------------- ► 2NH3 + 2H2Ơ + Mg2+
2NH3 + H2S04 ----------------- *► (NH4)2S04
Cách tiến hành: Cân chính xác 1 g ( 1 ml) nguyên liệu cho vào ống thủy tinh rồi cho 20
ml nước cất và vài giọt phenolphtalein, thêm MgO đậy nắp lắc đều đến khi có màu hông nhạt,
cho ống thủy tinh vào máy cất đạm, hơi nước được chưng cất sang một bình tam giác chứa
lOml dung dịch H2S04 0,1N và vài giọt thuốc thử Tashiro (0,1 g methyl red + 0,2g methylen
blue pha trong 100 ml ethanol 96%). Chưng cất trong khoảng 350 giây, dừng giấy quỳ thử
xem còn NH3 không.Định phân lượng axit dư bằng NaOH đã được hiệu chỉnh X X 0,1 từ màu
tím sang màu xanh ve chai.
Cách tính: số gam ammoniac trong 1 lít nguyên liệu:
N-NH3 = 1,4 x AV x x/m (g/1)
Trong đó: AV = (Vt - Vo) là lượng NaOH tương đương với lượng đạm phóng thích đã
được hấp thu trong H2S04.
Vo: là thể tíchNaOH trung bình của 3 lần thử không.
Vt: là thể tích NaOH trung bình của 3 lần thử thật, m:
khối lượng nguyên liệu đem phân tích, x: hệ số hiệu
chỉnh của dung dịch NaOH 0,1N.
2.2.2.4.

Xác định hoạt tính protease bằng phưong pháp Anson
Nguyên tắc Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của

protease tạo sản phẩm là các đoạn peptide ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA),
xác định lượng tyrosine và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin.

7
Hóa chất: Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung dung dịch Na2HP04 1/15 M
với dung dịch KH2P04 1/15 M đến khi pH đạt 7,6.
Dung dịch casein 1%, TCA 5%, NaOH 0,5 N, HC1 0,2 N, tyrosine 20 mM. Thuốc
thử Folin ( pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:4).
Cách tiến hành
Bảng 2.1 Xây dựng đường chuẩn tyrosine
Dung dịch hóa chất

„

Ống nghiệm
_______________________ !_
3
4
1
2

5

6

Dung dịch tyrosine chuẩn (ml)

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0

Lượng tyrosine tương ứng (pM)

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

5,0

Dung dịch HC1 0,2 N (ml)
Dung dịch NaOH 0,5 N (ml)

4,8
10

4,6
10

4,4
10

4,2
10

4,0
10

5,0
10

Thuốc thử Folin (ml)

3

3

3

3

3

3

Lăc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660 nm

Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường
chuẩn tyrosine tương quan tương quan giữa lượng tyrosine (pM) và ÀOD (AOD = ODTN ODKC ).

Bảng 2.2 Xác định lượng tyrosine trong dung dịch nghiên cứu
Dung di ch hóa chất

Ong nghiệm
Thử thật

Thử không

Dung dịch casein 1% (ml)

5

5

Dung dịch TCA 5% (ml)
Dung dịch enzyme mẫu (ml)

0

10

1

1

10

0

Lắc đều và giữ ở 35,5°c trong 20 phút

Dung dịch TCA 5% (ml)
Đẻ yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Lấy 2 ống nghiệm mới khác,cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật và cho
vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không.


8
Tiếp tục thêm và mỗi ống 10ml NaOH 0,5 N và 3 ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10
phút đo OD ở bước sóng 660 nm. ÀOD = ODTT - ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra
được pM tyrosine.
Cách tính
Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí
nghiệm ( 35,5°c, pH 7,6 v.v) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong
TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660 nm tương ứng với 1
pM tyrosine trong đường chuẩn.
pM Tyrosine* V * L Hđđ= t
*m*v
(UI/g
)
Trong đó: V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml).
V

: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml).

t : thời gian thủy phân (phút).
m : khối lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (g).
L: độ pha loãng enzyme.
pM tyrosine: lượng pM tyrosine trong V (ml) suy ra từ đường chuẩn.
2.2.2.5.

Phương pháp xác định kali tổng số (10 TCN 360-99)

Nguyên tắc Hòa tan các dạng Kali hữu hiệu trong phân bằng dung dịch HC1 0,05 N. Xác
định hàm lượng kali trong dung dịch bằng máy quang kế ngọn lửa.
Cách tiến hành
Cân chính xác khối lượng mẫu đã chuẩn bị giống như phương pháp xác định lân tổng số
cho vào bình tam giác có dung tích 200-250 ml.
Cho thêm 50 ml dung dịch HC1 0,05 N, lắc 30 phút sau đó lọc.
Rửa cặn trên phễu 5 lần, mỗi lần 10ml dung dịch HC1 0,05 N.
Gom dung dịch lọc và dung dịch rửa vào bình định mức 200 ml và thêm dung dịch HC1
0,05 N đến vạch định mức.
Làm tương tự với mẫu trắng.
Lập thang tiêu chuẩn kali:
Sử dụng các bình định mức 200 ml, lần lượt cho vào các bình định mức số ml dung dịch
tiêu chuẩn 1000 ppm K và số ml dung dịch HC1 IN theo bảng sau, rồi cho nước đến vạch định
mức.


9
Bảng 2.3 Xây dựng đường chuẩn Kali
Nồng độ K (ppm) trong dung

Số ml dung dịch tiêu chuẩn Số ml dung dịch HCl 1

dịch tiêu chuẩn

1000 ppm K

N

0

0

10

10

2
4

10

6

10

40

8

10

50

10

10

60

12

10

20
30

10

Pha loãng dung dịch chiết mẫu bằng dung dịch HC1 0,05 N theo hệ số thích hợp. Đốt
các dung dịch dãy tiêu chuẩn, dung dịch mẫu trắng và các dung dịch mẫu trên quang kế ngọn
lửa tại bước sóng 768 nm.
Lập đồ thị đường chuẩn tương quan giữa nồng độ kali trong dung dịch tiêu chuẩn và số
đo trên máy, căn cứ vào đò thị chuẩn tính nồng độ kali trong mẫu.
Cách tính
% khối lượng kali trong mẫu
c X f X V X 1,025 X 100
K2Ơ ( % ) = ----------------- - ----------1000 X 1000 x m
Trong đó:

C: Nồng độ K trong dung dịch tương ứng số đo trên máy (ppm).
f: Hệ số pha loãng, m:
khối lượng mẫu (g).
V: thể tích (ml).

2.2.2. Ó. PhưoTig pháp xác định lân tổng số (10 TCN 306-97)
Nguyên tắc
Nguyên tắc chung là đun ướt mẫu với hỗn hợp cường thủy và xác định hàm lượng phốt

pho bằng phương pháp đo màu sử dụng molypdovadanat tạo màu vàng.
Cách tiến hành
Cân 0,5 g mẫu cho vào bình đốt, thêm 15 ml HN03 đặc, đun sôi nhẹ khoảng 30- 45 phút
cho oxy hóa toàn bộ các chất có thể oxy hóa.


10
Đe nguội bình và cho thêm 10-20 ml hỗn hợp cường thủy, đun nhẹ một cách cẩn thận cho
đến khi dung dịch không có màu hoặc gần như hết màu và trong bình xuất hiện khói trắng đậm
đặc.
Sau khi đốt xong, để hơi nguội thêm vào 50 ml nước cất và đun sôi ít phút.
Chuyển toàn bộ dung dịch và cặn trong bình công phá sang bình định mức 200ml, thêm
nước cất đến vạch 200 ml, lắc đều hoặc lọc để lắng trong.
Chuẩn bị các dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ 0,4 mg/ml - 1,0 mg P205/ml. Chuẩn bị 7
bình tam giác 100 ml và lần lượt cho vào mỗi bình số ml dung dịch tiêu chuẩn 4 mg p205/ml như
bảng 2.4.
Bảng 2.4 Xây dựng đường chuẩn p205
Số thứ tự dung

Nồng độ dung dịch sau khi pha Thể tích dung dịch tiêu chuẩn 4

dịch

(mg p205/ml)

mg P2Os/ml (ml)

1

0,4

10,0

2

0,5

12,5

3

0,6

15,0

4
5

0,7

17,5

6

0,8
0,9

20,0
22,5

7

1,0

25

Sau đó thêm nước đến vạch và lắc đều.
Xây dựng thang tiêu chuẩn: chuẩn bị 7 bình định mức 100 ml. Dừng pipet lần lượt lấy 5
ml dung dịch của 7 dung dịch tiêu chuẩn bị cho vào 7 bình định mức theo thứ tự. Thêm vào mỗi
bình 45 ml nước cất và trong vòng 5 phút thêm 20 ml dung dịch molypdovanadat và thêm nước
cất đến vạch, lắc đều, để yên 10 phút.
Đo màu trên quang phổ tại bước sóng 400-420 nm.
Lập đồ thị chuẩn tương quan giữa số đo trên máy với lượng chứa P205 trong các bình tiêu
chuẩn.
Hút VI dung dịch mẫu có tiến hành tạo màu và đo trên máy sao cho lượng P205 trong đồ
thị chuẩn.


11
Cách tính
m! X V X 100
% khối lượng p205 tổng số trong mẫu: % P2O5 =---------------------------M X Vj X 1000
Trong đó: mt: Khối lượng p205 xác định được trong phần trích so màu (mg).
Thể tích dung dịch mẫu trích để so màu (ml). m:
Khối lượng mẫu cân phân tích (g).
V: Thể tích toàn bộ dung dịch mẫu (ml).
1000: đổi mg thành g 100: hệ sô tính %
Xác định hàm lượng NO3' bằng phương pháp Grandvan - Liaz

2.2.2.7.

Nguyên tắc
NO3' tác dụng với acid disulphophenic thành nitrophenol, khi kiềm hóa dung dịch có màu
vàng và cường độ đo màu tại độ dài sóng Ằ = 410 nm phụ thuộc NO 3' có trong mẫu.
C6H3(HS03)20H + 3HNO3 ------------- ►C6H2(0H)(N03) + 2H2S04 + H20
Acid phenoldisulíonic
C6H2(0H)2(N03) + NH3 ----------------- * C6H2(N02)0NH4
Nitrophenol, dd màu vàng
Trình tự phân tích
Chiết mẫu: Mầu cắt nhỏ, trộn đều, cân 10 g mẫu cho vào cốc 250 ml, thêm nước cất đến
khoảng 200 ml.
Cho cốc vào lò vi ba và đun trong 7 phút ở mức năng lượng cao 100 %.
Lấy ra để nguội, lọc bỏ bã và định mức dung dịch lọc bằng nước cất đến 200 ml: dung
dich lọc.


12
nến hành
Bảng 2.5 Xác định đường chuẩn N03' và N03'trong mẫu cây trồng
Đường chuẩn

Mấu phân tích

Mầu 1

23

4

5

DD 100 ppm N03'(ml) 0

0,5 1

1,5

2

6

7

1

2

2,5

3

10

10

Đun cách thủy cho bay hơi đền cô cạn, không cháy, đế nguội *
Acid phenoldisulíonic 1

11

1

1

1

1

1

1

H20 cất ml khoảng 20

20 20

20

20

20

20

20

20

NH4OH (1:1) (ml) ** 8
H20 (ml) để định mức *** 50

88
50 50

8
50

8
50

8
50

8
50

8
50

8
50

Lắc mạnh và để yên 10 phút

Đo độ hấp thụ X = 410 nm

* Có thể cô cạn bằng lò vi sóng ở mức năng lượng thấp 30 % thời gian mất khoảng 7 - 10 phút
** Đe pH nằm trong khoảng 10 - 11. Có thể trung hòa bằng cách nhỏ từng giọt NaOH 10 %.Dung
dịch sẽ chuyển màu vàng, dư một ít cũng không ảnh hưởng gì đến màu cua dung dịch.
*** H20 cho vào để thể tích cuối cùng là 50 ml

Tính kết quả: NO3' (ppm) mẫu tươi = A X V X 1000/Vi X m
Trong đó:

A: Hàm lượng NO3" trong dung dịch trích (ml).
V: thể tích dung dịch trích.
Vj: thể tích dung dịch đem phân tích, m: Khối
lượng mẫu tươi đem phân tích (g).

2.2.2.8.

Xác định NH4+ bằng phương pháp Nessler
Nguyên tắc: Ammoniac trongmẫu được đẩy ra khi cho tác dụng với HC1 0,05 N và

hình thành NH4CI. Chất này có tác dụng với thuốc thử Nessler sẽ tạo thảnh hợp chất có màu
vàng cam.
NH4+ + 4KOH + 2 K2Hg2IO ----------- ► NH2Hg2IO + 7 KI + 3H20 + K+
Hợp chất NH2Hg2IO để lâu sẽ kết tủa nên người ta dùng máy quang phổ hấp thu để đo cường
độ hấp thụ của mẫu phân so sánh cường độ hấp thu của mẫu chuẩn đã


13
biết rõ nồng độ NH4+ trong vòng 1 giờ. Các ion Ca2+ và Mg2+ trong dung dịch mẫu cũng phản
ứng với thuốc thử Nessler tạo kết tủa nên cần phải cho muối Seignette vào để liên kết chúng
dưới dạng phức chất tan.
Trình tự phân tích
Cân 25 g cho vào bình tam giác có nắp đậy. Thêm 100 ml HC1 0,05 N để yên trên
máy lắc 30 phút. Sau đó đổ ra lọc ngay.
Hút 10 ml dung dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất và đảo đều:
dung dịch A.
Bảng 2.6 Phương pháp xác định NH4+

Bình số

Đường chuẩn
Mấu phân
_____________________________________________
3
4
5
1
2
6
1
2

,

DD NH4+ (5ppm)
Nước cất (ml)

0
40

5
40

10
40

15

40

20
40

25
40

20
40

20
40

Muối Seignette 20 %
Thuốc thử Nessler

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

1

1,5

2

2,5

Nước cất thêm cho đủ 50 ml
Nồng độ NH4+ (ppm)

0 0,5

Độ hấp thụ X = 428 nm

Công thức tính kết quả
NH4+reading X 100 X 50
NH4+ (mg / 100 g) =

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - X

k

a X b
Trong đó:

NH4+reading: kết quả do OD.
a :Trọng lượng phân tươi đem phân tích (g). b
:Thể tích dung dịch trích (ml).
K :Hệ số khô kiệt = 100/ (100 - %A).
% A: Ẩm độ.


14
2.2.2.9. Cách lấy mẫu phân tích cây trồng
Phải đại diện và phù hợp với mục đích phân tích lấy ở một bộ phận nhất định trong thời
kỳ thích hợp tùy từng loại cây; còn mẫu xác định tổng lượng hút dinh dưỡng của cây ngắn ngày
cần lấy toàn bộ cây với lượng lớn .
Mẩu phân tích cây trồng phải phù hợp với đặc điểm sinh lý của cây. Những quy định về
thời kỳ lấy mẫu, bộ phận lấy mẫu của từng loại cây trồng được hướng dẫn trong các quy trình
chuyên môn (xem trang cuối).

Mau phân tích cây trồng phải được lấy trong điều kiện môi trường đồng nhất (nhiệt độ,
ẩm độ), cùng một thời điểm (thường vào buổi sáng đã hết sương, không mưa, nhiệt độ không
khí và cường độ ánh sáng ở mức trung bình).
Mẩu phân tích cây trồng phải chú ý các yếu tố canh tác như thời kỳ bón phân, thời kỳ tưới
nước, để chọn thời điểm lấy mẫu thích hợp.
Cách lấy mẫu
Toàn bộ mẫu lấy ngoài đồng phải được rửa sạch đất bẩn bằng lượng lớn nước máy sau đó
rửa lại bằng nước cất và sau đó thấm khô bằng giấy lọc.
Mau sau khi làm sạch cần lập tức cho vào túi đựng mẫu, đóng kín và chuyển về phòng thí
nghiệm ngay trong ngày.
Nhanh chóng sấy khô mẫu ở TO = 70 ± 5°c trong tủ sấy thông gió, không được sấy đến
80°c vì sẽ có sự phân hủy làm mất một số nguyên tố. cần trải mỏng và đều mẫu trên ngăn tủ sấy
có lót giấy. Có thể làm khô mẫu bằng cách phơi nắng.
Những mẫu có yêu cầu phân tích các hợp chất để biến đổi như protein, acid hữu cơ, nitrate,
nitrite, vitamine, cần bảo quản mẫu tươi ở 5°c trong suốt quá trình vận chuyển, lưu giữ, không
được sấy mà phải phân tích ngay mẫu tươi. Trong trường hợp không phân tích ngay cần cố định
mấu bằng các thủ tục diệt enzyme trước khi chọn mẫu trung bình.
Trước lúc sấy mẫu cần cân khối lượng mẫu tươi đế xác định hàm lượng chất khô trong
cây.
Mau sau khi sấy, được cắt nhỏ trộn đều và chọn mẫu trung bình theo nguyên tắc “đường
chéo”, loại bỏ cho đến khi được mẫu trung bình đồng nhất có khối lượng từ 30-300 g.


15
. Giải quyêt vân đê
3.1. Nội dung nghiên cứu
3.1.2. Xác định thành phần nguyên liệu
Mục đích: việc xác định thành phần nguyên liệu là cơ sở cho việc lựa chọn nguồn cơ
chất giàu đạm và enzyme hoạt tính cao cho quá trình thủy phân.
3.1.2.1.

Thành phần cưchất

Cá tra chết được xác định thành phần:
- Đạm tổng số được xác định bằng phương pháp Kjeldhal.
- Đạm amin được xác định bằng phương pháp formol.
- Lân tổng số được xác định bằng phương pháp Meyer.
- Kali tổng số được xác định bằng phương pháp quang kế ngọn lửa.
3.1.2.2.

Hoạt tính enzyme

Hoạt tính enzyme papain được xác định bằng phương pháp Anson.
3.1.3. Khảo sát các yếu tổ ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Mục đích: nhằm tìm ra các điều kiện ảnh hưởng lên quá trình thủy phân một cách tối
ưu để xây dựng qui trình thu nhận phân hữu cơ sinh học dạng lỏng.
3.1.3.1.

Thí nghiệm 1 Xác định tỉ lệ tối ưu của Ctf chất và lượng enzyme bổ sung vào

quá trình thủy phân
a. Mục đích thí nghiệm chọn tỉ lệ enzyme sử dựng có hiệu quả cao nhất trong quá trình thủy
phân.
b. Bố trí thí nghiệm Đây là thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên
(CRD) và lặp lại 3 lần.
Sử dụng cá tra chết với lượng cố định là 30 g và bổ sung enzyme papain với tỉ lệ tương
ứng là 0,2 % , 0,4 %, 0,6 %, 0,8 %, 1,0 % (tính theo khối lượng cơ chất).
Công thức 1

= 30 g cá chết :

0,06 g mủ đu đủ (tương ứng

0,2 %)

Công thức 2

= 30 g cá chết :

0,12 g mủ đu đủ (tương ứng

0,4 %)

Công thức 3 = 30 g cá chết : 0,18 g mủ đu đủ (tương ứng 0,6 %)
Công thức 4

= 30 g cá chết :

0,24 g mủ đu đủ t(ương ứng

0,8 %)

Công thức 5

= 30 g cá chết :

0,30 g mủ đu đủ tư(ơng ứng

1,0 %)

c. Cách tiến hành: Cân vào bình tam giác 30 g cá tra đã xay nhuyễn, cho thêm 30 ml nước
cất, cân mủ đu đủ enzyme papain vào 0,06; 0,12; 0,18; 0,24; 0,3 g tương ứng với tỉ lệ 0,2; 0,4;
0,6; 0,8; 1 % trên 30 g cơ chất. Sau đó lắc đều, đậy kính bình tam giác


16
lại, cho vào máy lắc định ôn ở điều kiện 55°c trong 24 giờ. Sau khi hết giờ, lấy bình tam giác
ra đun cách thủy 15 phút để bất hoạt enzyme, để nguội, tiến hành ly tâm lạnh ở 4.000
vòng/phút trong 10 phút ở 4°c, tách dịch thủy phân, lớp mỡ và bã riêng, đem bảo quản trong tủ
mát 4°c. Sau cùng là đem dịch thủy phân phân tíchN tổng số. d. Chỉ tiêu theo dõi N tổng số
theo phương pháp Kjeldahl.
3.1.3.2. Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của lượng nước lên quá trình thủy phân
a. Mục đích Xác định lượng nước bổ sung cho hiệu quả thủy phân cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên
(CRD) và lặp lại 3 lần.
Lượng nước bổ sung theo trọng lượng cơ chất được bố trí theo các nghiệm thức: 25, 50,
75, 100, 125, 150, 175 và 200 %.
c. Cách tiến hành: Cân vào bình tam giác 30 g cá tra đã xay nhuyễn, cho thêm 7,5; 15;
22,5; 30; 37,5; 45; 52,5; 60 ml nước cất tương ứng với tỉ lệ ở cách bố trí thí nghiệm trên, cân
0,18 g mủ đu đủ (tương ứng tỉ lệ mủ 0,6 % ở thí nghiệm 1), lắc đều, đậy nắp lại, cho vào máy
lắc ổn định nhiệt ở nhiệt độ 55°c trong 24 giờ. Kết thúc quá trình thủy phân đem bất hoạt enzyme
bằng cách đun cách thủy trong 15 phút. Sau đó để nguội và ly tâm ở 4°c, 4.000 vòng/phút trong
10 phút. Cuối cùng thu phần dịch để phân tích N tổng số.
d. Chỉ tiêu theo dõi N tổng số theo phương pháp Kjeldahl.
3.1.3.3. Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả thủy phân
a. Mục đích Xác định thời gian thích họp cho quá trình thủy phân để đạt kết quả cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên
(CRD) và lặp lại 3 lần.
Thời gian thủy phân được bố trí theo các nghiệm thức: 8, 16, 20, 24, 30 giờ.
c. Cách tiến hành Cân vào bình tam giác 30 g cá tra đã xay nhuyễn, thêm 30 ml nước cất,

thêm vào 0,18 g mủ đu đủ khô. Lắc đều, đậy nắp lại. Cho các bình tam giác vào máy lắc ở nhiệt
độ 55°C. Đứng thời gian bố trí thí nghiệm lấy bình tam giác ra bất hoạt ezyme trong 20 phút, để
nguội và ly tâm ở 4°C, 4.000 vòng/phút. Sau cùng lấy dịch ra phân tíchN tổng số.
d. Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng đạm tổng số (xác định theo phương pháp

Kjeldahl).


17
3.I.3.3.

Thí nghiệm 4 Khảo sát nhiệt độ lên quá trình thuỷ phân

a. Mục đích Xác định nhiệt độ thủy phân thích họp để đạt hiệu quả thủy phân cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên
(CRD) và lặp lại 3 lần.
Nhiệt độ thủy phân được bố trí theo các nghiệm thức: 52, 54, 55, 56 và 58°c.
Cách tiến hành: Cân vào bình tam giác 30 g cá tra đã xay nhuyễn, bổ sung 30 ml

c.

nước, thêm vào 0,18 g mủ đu đủ khô, lắc đều, đậy nắp lại và cho vào máy lắc có ổn định nhiệt,
đều chỉnh nhiệt độ theo bố trí thí nghiêm trên. Sau 20 giờ (từ kết quả của thí nghiệm 3), đem
bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy trong 15 phút, sau đó đem ly tâm ở 4°c, 4.000
vòng/phút trong 10 phút. Sau cùng là thu dịch để xác định N tổng số.
d. Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng đạm tổng số (xác định theo phương pháp Kjeldahl).
Khảo nghiệm hiệu quả của chế phẩm ngoài đồng ruộng

3.1.4.
3.1.4.1.

Thí nghiệm 5 Khảo sát nồng độ sử dụng thích họp của chế phẩm phân

hữu CO’ sinh học
a. Mục đích Chọn ra nồng độ sử dụng chế phẩm thích hợp để khuyến cáo sử dụng trong
sản xuất rau an toàn.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí kiểu khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD), 3 lần
lặp lại.
Chế phẩm từ cá tra chết được bố trí theo các nghiệm thức:
NT1: Nồng độ sử dụng 0 % (theo điều kiện chăm sóc của hộ trồng rau).
NT2: Nồng độ sử dụng 1 % .
NT3: Nồng độ sử dụng 3 %.
NT4: Nồng độ sử dụng 5 %.
NT5: Nồng độ sử dụng 7 %.
c.

Cách tiến hành Thí nghiệm được bố trí với các đặc điểm:
- Tổng các ô thí nghiệm: 5x3 = 150.
- Diện tích mỗi ô thí nghiệm là: 5 m2.
- Tổng diện tích của thí nghiệm là: 75 m2.
- Khoảng cách giữa các hàng là: 0,1 m; giữa các cây là: 0,1 m.
- Thời gian phun: 3 lần phun ở các thời điểm 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày sau trồng.


18
- Phương pháp theo dõi: mỗi ô thí nghiệm theo dõi 10 cây.
d. Chỉ tiêu theo dõi Sau khi thu hoạch, tiến hành theo dõi các đặc điểm:
- Trọng lượng tươi của mỗi cây được chọn (g)
- Số lá trên cây của mỗi cây được chọn

- Chiều cao cây của mỗi cây được chọn (mm)
- Dư lượng N03' (mg/kg) trên mẫu được chọn;
- Năng suất lý thuyết (tấn/ha) = (trọng lượng trung bình của cây (g) X số cây/ha);
- Năng suất thực thu (tấn/ha) = (trọng lượng cây của ô thu hoạch X 10.000)/diện
tích của mỗi ô.
3.1.4.1.

Thí nghiệm 6 Khảo sát hiệu quả của chế phẩm phân hữu cơ sinh học dạng lỏng với

các sản phẩm thương mại trên thị trường trên cây cải xanh
a. Mục đích So sánh hiệu quả về mặt năng suất và tính an toàn của chế phẩm phân hữu
cơ sinh học với các sản phẩm trên thị trường.
b. Bổ trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD), 3
lần lặp lại, với các nghiệm thức:
NT1: Đối chứng theo điều kiện chăm sóc của hộ trồng rau.
NT2: Phun chế phẩm phân hữu pha loãng \ứi nồng độ khuyến cáo được chọn từ thí
nghiệm 5. NT3: Phun phân Toponsu.
NT4: Phun phân Jump Star.
NT5: Phun phân HPCR.
c. Cách tiến hành Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ 3.6 với các đặc điểm:
- Tổng các ô thí nghiệm: 5x3 = 15 ô;
- Diện tích mỗi ô thí nghiệm là: 5 m2;
- Tổng diện tích của thí nghiệm là: 75 m2;
- Khoảng cách giữa các hàng là: 0,1 m; giữa các cây là: 0,1 m;
- Thời gian phun: 3 lần phun ở các thời điểm 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày sau trồng;
- Phương pháp theo dõi: mỗi ô thí nghiệm theo dối 10 cây.
d. Chỉ tiêu theo dõi Sau khi thu hoạch, tiến hành theo dõi các đặc điểm:
- Trọng lượng tươi của mỗi cây được chọn (g)
- Số lá trên cây của mỗi cây được chọn

- Chiều cao cây của mỗi cây được chọn (mm)


19
- Dư lượng N03’ (mg/kg) trên mẫu được chọn
- Năng suất lý thuyết (tấn/ha) = (trọng lượng trung bình của cây (g) X số cây/ha);
- Năng suất thực thu (tấn/ha) = (trọng lượng cây của ô thu hoạch X 10.000)/diện
tích của mỗi ô.
3.2. Kết quả nghiên cứu
3.2.1. Xác định thành phần nguyên liệu
3.2.1.1.

Thành phần nguyên liệu
Việc xác định thành phần cơ chất luôn đóng một vai trò quan trọng, nó quyết định nguồn

nguyên liệu này có thích hợp để sử dụng vào mục đích nghiên cứu hay không. Cơ chất có nguồn
gốc động vật thường có hàm lượng đạm cao. Điều này thể hiện qua kết quả phân tích thành phần
dinh dưỡng của cá tra chết và bột thịt xương ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng trong cá tra và bột thịt xương
Thành phần dinh dưỡng

Cá tra chết

N (%)
Đạm amin (%)
K2O (%)
p205 ( % )
Các sô liệu tỉnh trên trọng lượng khô.

7,36

0,56
1,07
6,33

Qua bảng 3.1, chúng tôi thấy rằng hàm lượng N (%) và P2O5 trong cá tra khá cao. Cụ thể:
N (%) = 7,36 %, tức protein tổng là 7,36x6,25 = 46 % cho thấy protein động vật có hàm lượng
đạm cao, P2O5 = 6,33 % cho thấy hàm lượng xương trong nguyên liệu khá cao.
Vào thời điểm làm đề tài giá cá chết khoảng 5000 đồng, nguồn cá tra chết từ các hộ nuôi
ở đồng bằng Sông Cửu Long nên đây là nguồn cơ chất dồi dào và giá tương đối rẻ thích hợp cho
việc thủy phân để sản xuất phân hữu cơ cho cây trồng.
3.3.1.2.

Hoạt tính enzyme

Hoạt tính enzyme là yếu tố quan trọng trong việc lựa chọn enzyme để thủy phân. Kết quả
xác định hoạt tính enzyme papain là 53,79 UI/g. Điều này cho thấy hoạt tính của enzyme rất
cao. Như vậy, enzyme papain từ mủ đu đủ thô cho hoạt tính mạnh và đây là nguồn enzyme thích
hợp để thủy phân nguồn đạm cao để sản xuất phân hữu cơ sinh học.


20
3.2.2. Khảo sát các yếu tổ ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Quá trình thủy phân chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như: tỉ lệ enzyme và cơ chất, lượng
nước bổ sung, thời gian và nhiệt độ thủy phân. Do đó, việc xác định các điều kiện này rất quan
trọng để tối ưu quy trình sản xuất phân hữu cơ sinh học.
522.1. Xác định tỉ lệ tối ưu củacơ chất và lượng enzyme bổ sung vào quá trình thủy phân
Tỉ lệ enzyme và cơ chất là yếu tố rất quan trọng của một quá trình thủy phân. Khi cố
định lượng cơ chất, hiệu quả thủy phân tăng dần khi lượng enzyme tăng. Nhưng khi tỉ lệ
ezyme : cơ chất ở một mức độ nhất định, nếu ta tăng lượng enzyme thì hiệu quả thủy phân sẽ
giảm. Do đó, việc trước tiên là xác định tỉ lệ tối ưu enzyme: cơ chất để tiết kiệm enzyme lẫn cơ

chất.
Bảng 3.2 Đạm tổng số của dịch thủy phân khi bổ sung lượng mủ
đu đủ khác nhau
Tỉ lệ (%)

N (%)

0,2

1,14 e

0,4

1,25 b
1,27 a

0,6
0,8
1

1,23 c
1,21 d

cv = 0,94 %
Trong cùng một cột, các sô có cùng chữ cái giông nhau thì khác biệt
không có ý nghĩa về mặt thong kê ở mức p < 0,05.
Bảng 3.2 cho thấy sự khác biệt giữa các nghiệm thức rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở
p< 0,05. Với cùng một lượng cơ chất như nhau, khi tỉ lệ mủ đu đủ bổ sung tăng lên (từ 0,2 %
đến 0,6 %) hay lượng enzyme papain tăng lên, thì sản phẩm của quá trình thủy phân cũng tăng
theo. Điều này thể hiện qua lượng đạm tổng số của nghiệm thức 0,6 % đạt cao nhất.

Khi lượng mủ bổ sung tăng lên cao hơn (từ 0,8 % đến 1%), lượng đạm tổng số không
tăng lên tương ứng mà lại giảm, điều này có thể giải thích là do trong quá trình thủy phân, sản
phẩm sinh ra có thể ức chế hoạt động của enzyme (Whitaker John R. et al., 2003).
Từ phân tích trên, chúng tôi chọn tỉ lệ mủ đu đủ bổ sung tối ưu là 0,6 % so với cơ chất
cho thí nghiệm tiếp theo để tiết kiệm lượng enzyme và cơ chất. Kết quả này cũng phù hợp với
nghiên cứu của Nguyễn Thị Xuân Dung, 2005, Đại học cần Thơ với


21
tỉ lệ mủ đu đủ là 0,75 % so với cơ chất. Sự khác nhau có thể là do địa điểm thu nhận mủ đu đủ
khác nhau dẫn đến hoạt tính của enzyme khác nhau, cơ chất khác nhau (bánh dầu đậu nành),
điều kiện thí nghiệm khác nhau v.v.
3.2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của lượng nước bổ sung lên quá trình thủy phân
Quá trình thủy phân cần có sự tham gia của nước. Nước giúp các chất trộn đều vào nhau
và tạo điều kiện cho các chất tiếp xúc để tạo phản ứng. Nhưng lượng nước bổ sung phải hợp lý.
Nếu lượng nước ít thì nồng độ enzyme cũng như cơ chất quá cao có thể gây ức chế phản ứng
thủy phân và ngược lại, nếu lượng nước quá cao thì nồng độ enzyme cũng như cơ chất quá thấp
dẫn đến enzyme và cơ chất khó tiếp xúc với nhau dẫn đến hiệu quả thủy phân cũng không cao.
Hơn nữa, sản phẩm thủy phân phải đảm bảo hàm lượng dinh dưỡng để đáp ứng nhu cầu của cây.
Bảng 3.3 Đạm tổng số của dịch thủy phân khi bổ sung lượng nước khác nhau

Lượng nước (%)
25
50
75
100
125
150
175
200

N (%)

Thể tích dịch (ml)
24,0
32,0
40,0
48,0
56,0
63,5
72,0
79,0

1,325 a
1,168 c
1,210 b
1,294 a
1,146 c
1,064 d
0,893 e
0,818 f
cv = 1,81%
Trong cùnạ một cột, các sô có cùng chữ cái giông nhau thì khác biệt không có ỷ nghĩa
về mặt thong kê ở mức p < 0,05.
Dựa vào bảng 3.3, chúng tôi thấy rằng ở khi bổ sung lượng nước tăng dần thì hiệu quả
thủy phân tăng theo. Điều này thể hiện ở lượng N tổng số tăng từ nghiệm thức 50 % đến nghiệm
thức 100 % và sự khác biệt giữa các nghiệm thức rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức p < 0,05.
Tuy nhiên, ở lượng nước thấp nhất, lượng N tổng số lại cho kết quả cao nhất. Điều này là do thể
tích dịch thu thấp, nên nồng độ dinh dưỡng cao. Nghiệm thức 100 % cho kết quả cao và sự khác
biệt của nghiệm thức này với nghiệm thức 25 % không có ý nghĩa về mặt thống kê. Lượng dịch

thu được của nghiệm thức 100 % lại cao gấp hai lần so với nghiệm thức 25 %, nên nếu xét tổng
lượng N thì nghiệm thức 100 % cao hơn gấp hai lần nghiệm thức 25 %.


22
Khi lượng dịch thủy phân thu được càng tăng thì đạm tổng số cũng giảm theo tương
ứng, điều này phù hợp với nguyên lý khi thêm nước vào thì nó pha loãng các chất tan có trong
dịch thủy phân trong đó có đạm tổng số, thể hiện ở hàm lượng N tổng số giảm dần từ nghiệm
thức 125 % đến nghiệm thức 200 %.
Như vậy, để đảm bảo hiệu quả thủy phân và kinh tế, chúng tôi chọn nghiệm thức bổ
sung 100 % lượng nước cho thí nghiệm tiếp theo. Kết quả này phù hợp với kết quả của Nguyễn
Thị Xuân Dung, 2005: bổ sung 100 % nước khi sử dụng enzyme papain thủy phân bột đậu nành.
3.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thM gian đến hiệu quá trình thủy phân
Mỗi quá trình thủy phân có một khoảng thời gian nhất định để đạt hiệu quả cao nhất.
Nếu ta chọn thời gian thủy phân thấp hơn thời gian này thì hiệu quả thủy phân không cao do sự
phân cắt các mối nối peptid chưa triệt để, lượng axit amin sinh ra ít. Ngược lại, thời gian thủy
phân lâu thì các axit amin sinh ra sẽ bị phân hủy thành NH3, gây mùi thối. Vì vậy, ta phải chọn
thời gian thủy phân tối ưu để đạt hiệu quả kinh tế và hiệu quả thủy phân cao nhất.

Bảng 3.4 Đạm tổng số của dịch thủy phân khi thủy phân ở
các thời gian khác nhau
Thời gian (giờ)
8
16
20
24
30

N (%)
0,564 c

0,952 b

1,268 a
1,269 a
1,271 a
cv= 1,06 %
Trong cùng một cột, các sô cỏ cùng chữ cái giông nhau thì khác
biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức p < 0,05.
Bảng 3.4 cho thấy hàm lượng N tổng số của các nghiệm thức có sự khác biệt rất có ý nghĩa
về mặt thống kê. Thời gian thủy phân càng lâu ( từ nghiệm thức 8 giờ đến nghiệm thức 20 giờ)
thì đạm tổng số trong dịch thủy càng tăng tương ứng. Điều này cho thấy đây là khoảng thời gian
phản ứng thủy phân diễn ra mạnh khi còn đủ lượng cơ chất cho enzyme hoạt động, vì vậy mà
lượng N tổng số ở nghiệm thức 20 giờ tăng cao nhất. Với các nghiệm thức tiếp theo (nghiệm
thức 24 và 30 giờ), khoảng thời gian tương đương các nghiệm thức trước đó nhưng lượng N
tổng số lại


23
tăng không đáng kể. Điều này có thể giải thích do lượng cơ chất đã bị thủy phân gần như hoàn
toàn.
Như vậy, để tiết kiệm thời gian và tăng công suất thủy phân, chúng tôi quyết định chọn
thời gian thủy phân tối ưu của mủ đu đủ trên cơ chất cá tra chết là 20 giờ. Kết quả này rút ngắn
thời gian hơn so với nghiên cứu của Nguyễn Thị Xuân Dung trên cơ chất bánh dầu đậu nành
thủy phân trong 24 giờ.
3.2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình thuỷ phân
Mỗi enzyme có khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp riêng và trong đó có một nhiệt độ
hoạt động tối ưu cho hiệu quả cao nhất. Cho nên muốn đạt hiệu quả thủy phân cao nhất phải xác
định nhiệt độ tối ưu này. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5 Đạm tổng số của dịch thủy phân sau khi thủy phân ở
các nhiệt độ khác nhau

Nhiệt độ (°C)
52

N (%)
1,327 b

54

1,324 bc

55
56

1,410 a
1,372 ab

58

1,268 c
cv = 2,39 %

Trong cùng một cột, các sô có cùng chữ cải giông nhau thì
khác biệt không có ỷ nghĩa về mặt thong kê ở mức p< 0,05.
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Xuân Dung (2005), khi tiến hành thủy phân
trên bánh dầu đậu nành thì papain hoạt động trong khoảng 45 - 65°c, nhiệt độ tối ưu là 55°c.
Cho nên nhiệt độ thí nghiệm này được bố trí xoay quanh 55°c.
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy hàm lượng N tổng số của các nghiệm thức có sự khác biệt
rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Khi nhiệt độ tăng thì hiệu quả thủy phân tăng theo thể hiện ở
nghiệm thức 52, 54, 55°c và nghiệm thức 55°c cho lượng N tổng số cao nhất. Khi tăng nhiệt độ

từ 56 đến 58°c thì lượng N tổng số thu được lại giảm điều này có thể thích do enzyme bị ức chế
khi ở nhiệt độ cao. Điều này phù hợp với nhận định “Protease chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở
giới hạn nhiệt độ nhất định, nhiệt độ thích hợp tối đa của protease nằm trong khoảng 40 - 45°c
ở nhiệt độ lớn hơn 70°c đa số protease bị mất hoạt tính” (Phạm Thu Cúc, 2002).


24
Như vậy, để đạt hiệu quả thủy phân cao nhất, chúng tôi chọn nhiệt độ tối ưu là 55°c.
Điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Xuân Dung.
Trong quá trình xây dựng quy trình thủy phân cá tra chết chứng tôi không khảo sát yếu
tố pH, tuy nhiên pH là yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme vì mỗi loại enzyme thì có
vùng pH hoạt động riêng, nhưng để đáp ứng yêu cầu sản xuất phân bón theo tiêu chuẩn GAP là
không dừng hóa chất để điều chỉnh pH. Mặc dù không chỉnh pH nhưng trong quá trình sản xuất
phân chứng tôi nhận thấy môi trường pH thủy phân cũng nằm trong khoảng pH hoạt động tốt
của enzyme papain (pH = 6,5 - 7,8).
Sau khi đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá tra chết sử dụng
enzyme papain, chúng tôi xác định được các điều kiện tối ưu cho quy trình sản xuất chế phẩm
phân hữu cơ sử dụng enzyme papain thủy phân cá tra chết.

Cá tra
Xay nhỏ, bổ sung nước với tỉ lệ 1:1

Bổ sung enzyme papain thô với tỉ lệ 0,6%
Lắc, ủ ở 55°c
Thủy phân
Trong 20 giờ

Ly tâm
4.000 vòng/phút, thời gian 10 phút

Chế phẩm phân hữu cơ sinh học dạng lỏng
Sơ đồ 3.1 Quy trình thủy phân cá tra chết bằng mủ đu đủ.
Sau khi thủy phân theo quy trình trên, chúng tôi tiến hành xác định thành phần dinh
dưỡng trong dịch lỏng thu được và bã rắn còn lại.


25
Bảng 3.6 Hàm lượng dinh dưỡng của sản phẩm thu được khi thực hiện quy trình thủy phân
Thành phần
N (%)
Đạm amin (%)
K20 (%)
p205 (%)
pH

Bã rắn
5,94
1,606
0,90
1,57

Dịch lỏng
1,22
0,127
0,33
0,39

-

7,45

+
NH
460,05
4 (mg/100g)
t
t
Sô liệu của bã răn được tỉnh dựa trên trọng lượng khô.

19,04

Qua bảng 3.6, chúng tôi thấy lượng N tổng số giảm sau khi thủy phân thấp hơn so với cơ
chất. Điều này cho thấy có sự thất thoát trong quá trình làm thí nghiệm. Lượng N tổng số của
dịch khi thủy phân trên số lượng lớn thấp hơn trong quá trình thí nghiệm, điều này có thể do khi
thủy phân số lượng lớn, máy lắc không hoạt động đủ mạnh để trộn đều các chất trong dịch thủy
phân. Do đó, khi đưa vào thủy phân với khối lượng lớn, chúng ta phải trang trị máy lắc hoặc
máy khuấy mạnh hơn để đảm bảo hiệu quả thủy phân.
Lượng phốt pho trong dịch thủy phân thấp hơn so với cơ chất điều này chứng tỏ là
protease chưa thủy phân hiệu quả đối với cơ chất có chứa xương và thực tế thí nghiệm cho thấy
lượng bã thu được sau thủy phân chứa một lượng lớn xương chưa được thủy phân. Cho nên cần
bổ sung thêm loại enzyme khác để thủy phân xương tốt hơn cung cấp phốt pho cho cây trồng.
Chúng tôi nhận thấy kali trong dịch thủy phân lớn hơn kali trong bã rắn điều này rất phù
hợp với việc dừng dịch lỏng làm phân bón. Ngoài ra, sản phẩm sau thủy phân còn tạo ra lượng
NH4+ và đạm amin, đây là những yếu tố giúp cây sử dụng được ngay.
Dịch sau thủy phân có pH = 7,45, đây là pH trung tính, phù hợp làm phân bón lá dù
không điều chỉnh pH. Ưu điểm của việc dùng enzyme thực vật là ít làm thay đổi pH của dịch
thủy phân. Như vậy, chế phẩm hữu cơ tạo ra có pH trung tính, không cần điều chỉnh pH vừa
thuận lợi về mặt kinh tế vừa đáp ứng được tiêu chuẩn phân bón không dùng hóa chất để điều
chinh pH.
3.2.3. Khảo nghiệm hiệu quả của chế phẩm ngoài đồng ruộng

3.2.3.1. Khảo sát nồng độ sử dụng thích hợp của chế phẩm phân hữu Ctf sinh học
dạng lỏng trên cây cải xanh
Kết quả khảo sát nồng độ sử dụng sản phẩm được thể hiện ở bảng 3.7 và 3.8.