Nghiên cứu xây dựng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng đồng thời một số hoạt chất có trong thuốc kháng sinh thuộc họ β-Lactam

Header Page 1 of 148.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN
VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG
THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

Footer Page 1 of 148.


Header Page 2 of 148.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN
VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG
THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM.

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã Số: 60440118.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người Hướng Dẫn Khoa Học: TS. Phan Thị Tuyết Mai
TS. Bùi Xuân Thành

Hà Nội – 2015

Footer Page 2 of 148.


Header Page 3 of 148.

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.Phan Thị Tuyết Mai,
TS.Bùi Xuân Thành đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Tạ Thị Thảo cùng các thầy cô
giảng dạy tại Khoa Hóa phân tích đã hết lòng giúp đỡ em trong quá trình học tập
và nghiên cứu.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hộ trợ kinh phí và thiết bị máy
móc từ đề tài nghị định thư với Cộng hòa Pháp Lotus 2014- 2016, mã số
39/2014/HD- NĐT.
Cuối cùng em xin gửu lời cảm ơn tới gia đình và các bạn học viên,sinh viên
bộ môn Hóa Phân tích đã giúp đỡ em trong thời gian làm luận văn.

Hà nội, ngày 19 tháng 7 năm 2015
Học viên
Nguyễn Thị Ánh Tuyết

Footer Page 3 of 148.


Header Page 4 of 148.

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1.

Tổng quan về nhóm kháng sinh β-lactam......................................................2

1.1.1.

Khái niệm và phân loạinhóm β-lactam...................................................2

1.1.1.1. Nhóm penicillin ...................................................................................2
1.1.1.2.Nhóm cephalosporin .............................................................................4
1.1.1.3.Các kháng sinh β-lactam khác. .............................................................8
1.1.2.
1.2.

Tính chất vật lývà hóa học các kháng sinh nhóm β- Lactam .................8

Các phương pháp phân tích định lượng nhóm kháng sinh β-lactam.............9

1.2.1. Phương pháp đo quang ...............................................................................9
1.2.2. Các phương pháp sắc ký...........................................................................11
1.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại...................................................................13
1.2.3.1.Nguyên tắc phương pháp phổ hồng ngoại FTIR ................................13
1.2.3.2. Cách chuẩn bị mẫu đo hồng ngoại.....................................................16
1.2.3.2. Ứng dụng của phương pháp phổ dao động ........................................18
1.3.Ứng dụng của phương pháp phổ hồng ngoại để xác định nhóm kháng sinh βLactam ...................................................................................................................19
1.3.1. Kỹ thuật đo hồng ngoại định lượng một hoạt chất trong thuốc ...............19
1.3.2. Các ứng dụng của phổ hồng ngoại kết hợp với Chemometric để định
lượng thuốc kháng sinh β – lactam.....................................................................20
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .............................................................................23
2.1.

Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................23

2.1.1.

Footer Page 4 of 148.

Chất phân tích. ......................................................................................23


Header Page 5 of 148.

2.1.2.

Mẫu phân tích .......................................................................................23

2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .....................................................................25
2.2.1. Hóa chất....................................................................................................25
2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị đo .....................................................................26
2.3. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................26
2.4. Phương pháp định lượng bằng phổ hồng ngoại gần .......................................26
2.4.1. Nguyên tắc phương pháp phân tích..........................................................26
2.4.2. Nội dung phương pháp .............................................................................27
2.4.3. Quy trình phân tích...................................................................................27
2.5. Phương pháp phân tích đối chứng Penicillin và Cephalexin..........................28
2.6. Chương trình máy tínhcủa phương pháp phổ hồng ngoại gần kết hợp với
thuật toán hồi qui cấu tử chính ( PCR) ..................................................................30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THỰC NGHIỆM ...................................................32
3.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ hồng ngoại xác định đồng thời Penicillin và
Cephalexin trong cùng hỗn hợp.............................................................................32
3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ các hoạt chất penicillin và cephalexin...................32
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược ........................................................35
3.1.3. Khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr .........................................................37
3.1.4. Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên .................................................38
3.2. Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích hoạt chất Penicillin 39
3.2.1. Mô hình đường chuẩn đa biến xác định hoạt chất Penicillin khi có chứa tá
dược ....................................................................................................................39
3.2.2. Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy ....................................42
3.3. Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích hoạt chất Cephalexin
...............................................................................................................................44
3.3.1. Mô hình đường chuẩn đa biến xác định hoạt chất Cephlexin khi có chứa
tá dược ................................................................................................................44
3.3.2. Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi qui .....................................46

Footer Page 5 of 148.


Header Page 6 of 148.

3.4. Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích đồng thời hoạt chất
Penicillin và Cephalexin trong cùng hỗn hợp........................................................48
3.4.1. Xây dựng mô hình đường chuẩn đa biến xác định đồng thời Penicillin và
Cephalexin có chứa tá dược. ..............................................................................48
3.4.2. Đánh giá tính phù hợp của mô hình hồi qui PCR xác định đồng thời hoạt
chất Penicillin và Cephalexin có chứa tá dược ..................................................50
3.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của phép đo (LOQ) xác
định đồng thời Penicillin, cephalexin và tá dược bằng phương pháp PCR........52
3.4.4.Định tính mẫu thực tế ................................................................................54
3.4.5. Định lượng mẫu thực tế............................................................................59
3.4.5.1. Xử lý mẫu sơ bộ.................................................................................59
3.4.5.2. Phân tích mẫu.....................................................................................60
CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN........................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................64

Footer Page 6 of 148.


Header Page 7 of 148.

DANH MỤC BẢNG
Bảng1.1. Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillin............................3
Bảng 1.2.Công thức cấu tạo của các hoạt chất trong nhóm cephalosporin.................6
Bảng 1.3.Các thế hệ Cephalosporin. ...........................................................................7
Bảng 3.4.Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr đến độ hấp thụ quang

tại các số sóng đặc trưng. ..........................................................................................37
Bảng 3.5. Khảo sát độ lặp lại quá trình ép mẫu theo độ hấp thụ và theo diện tích píc..........39
Bảng 3.6.Ma trận chuẩn hàm lượng của penicillin và tá dược trong hỗn hợp..........40
Bảng 3.7.Ma trận hàm lượng của penicillin và tá dược để kiểm tra độ đúng của mô
hình hồi qui PCR. ......................................................................................................43
Bảng 3.8.Kết quả sai số tương đối (%) khi xác định đồng thời penicillin và tá dược
trong mẫu kiểm tra bằng phương pháp PCR.............................................................43
Bảng 3.9. Ma trận chuẩn hàm lượng của Cephalexin và tá dược trong hỗn hợp......45
Bảng 3.10. Ma trận kiểm tra của cephalexin và tá dược có trong hỗn hợp ..............47
Bảng 3.11.Kết quả sai số tương đối của Cephalexin và tá dược bằng phương pháp
PCR. ..........................................................................................................................47
Bảng 3.12. Ma trận chuẩn hàm lượng của 3 cấu tử PEN,CEP và tá dược trong
hỗnhợp.......................................................................................................................49
Bảng 3.13. Ma trận kiểm tra hàm lượng của 3 cấu tử PEN,CEP và tá dược để đánh
giá tính phù hợp mô hình hồi qui. .............................................................................51
Bảng 3.14. Kết quả (%)sai số tương đối xđ đồng thời CEP,PEN và tá dược bằng
phương pháp PCR .....................................................................................................52
Bảng 3.15.Giá trị LOD, LOQ khi xác định đồng thời các cấu tử PEN, CEP và tá
dược bằng phương pháp PCR ...................................................................................53
Bảng 3.16. Thông tin về các mẫu thuốc thực tế........................................................59
Bảng 3.17.Khối lượng mẫu bột thực tế cephalexin và tá dược được thêm vàohỗn hợp ....60
Bảng 3.18. Khối lượng mẫu bột thực tế penicillin và tá dược thêm vào hỗn hợp ....61
Bảng 3.19. Hàm lượng hoạt chất CEP thực tế tìm thấy trong các mẫu thực tế ........61
Bảng 3.20. Hàm lượng hoạt chất PEN thực tế tìm thấy trong các mẫu thực tế ........62

Footer Page 7 of 148.


Header Page 8 of 148.

DANH MỤC HÌNH
Hinh 1.1: Thuốc kháng sinh penicillin......................................................................24
Hình 1.2: thuốc kháng sinh cephalexin .....................................................................24
Hình 3.3: Phổ hồng ngoại trung của Cephalexin trong vùng 4000-400 cm-.1 ..........33
Hình 3.4: Phổ hồng ngoại trung của Penicillin trong vùng 4000-400 cm-.1 .............33
Hình 3.5: Phổ hấp thụ hồng ngoại gần của Cephalexin trong vùng 7500-2800 cm-1.........34
Hình 3.6.Phổ hấp thụ hồng ngoại gần của Penicillin trong vùng 7500-2800 cm-1. ..34
Hình 3.7: phổ hồng ngoại của tinh bột sắn đối với penicillin và cephalexin...........35
Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của Magie stearat, penicilin, cephalexin.........................36
Hình 3.9: Phổ hồng ngoại của Talc, penicillin, cephalexin. .....................................36
Hình 3.10: Phổ tự tạo của Penicillin trong thư viện tham chiếu ...............................55
Hình 3.11:Phổ tự tạo của cephalexin trong thư viện tham chiếu ..............................55
Hình 3.12: Phổ định tính mẫu thực tế penicillin 1 ....................................................56
Hình 3.13: Phổ định tính mẫu thực tế penicillin 2 ....................................................56
Hình3.14 : Phổ định tính mẫu thực tế penicillin 3 ....................................................57
Hình 3.15: Phổ định tính mẫu thực tế Cephalexin 1 .................................................57
Hinh 3.16: Phổ định tính thực tế của Cẹphalexin 2 ..................................................58
Hình 3.17: Phổ định tính thực tế Cephalexin 3.........................................................58

Footer Page 8 of 148.


Header Page 9 of 148.

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
CLS

Bình phương tối thiểu thông thường (classical least square)

ILS

Bình phương tối thiểu nghịch đảo (inverse least square)

PLS

Bình phương tối thiểu từng phần (partial least square)

PC

Cấu tử chính (Principal component)

UI
EtOH

Đơn vị quốc tế chuẩn hóa
(international unit)
Ethanol

KLTB

Khối lượng trung bình viên

PCR

Hồi qui cấu tử chính (principal component regression)

PEN

Penicillin

AMO

Amoxicillin

CEP

Cephalexin

Tbot

Tinh bột

CLO

Cloxacillin

SPE

Chiết pha rắn

ACN

axetonitril

AMP

Ampicillin

Footer Page 9 of 148.

Header Page Luận
10 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Footer Page 10 of 148.

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học


Header Page Luận
11 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

MỞ ĐẦU
Hiện nay hoạt động sản xuất và buôn bán kháng sinh nói riêng và tân dược
nói chung đem đến nguồn lợi nhuận khổng lồ khiến một số tổ chức, cá nhân đã tung
ra thị trường hàng triệu viên thuốc giả mỗi ngày. Thuốc giả không chỉ đánh lừa
người tiêu dùng, còn vô hiệu hóa các liệu pháp điều trị để cứu sống bệnh nhân và
trong rất nhiều trường hợp thuốc giả gây ra tác hại to lớn như gây ra các phản ứng
dị ứng, nhiễm độc kim loại nặng cũng như làm bệnh nhân dễ kháng thuốc. Đại diện
tổ chức Y Tế Thế giới cảnh báo thuốc giả đang chiếm 7-15% tổng số thuốc ở các
nước phát triển, 25% ở các nước đang phát triển, trong đó các nước ở khu vực Châu
Á chiếm 50%. Các mẫu thuốc giả thường được phát hiện chủ yếu là các loại kháng
sinh như Ampicillin, Penicillin…Điều khiến nhiều người quan tâm là tỉ lệ thuốc giả
ở Việt Nam ngày càng một gia tăng và diễn biến trở nên phức tạp hơn dẫn đến công
tác kiểm tra khó khăn hơn.
Vì vậy, vấn đề kiểm định thuốc đúng hoạt chất, và đúng hàm lượng hoạt

chất trong thuốc là một vấn đề hết sức cấp thiết. Hiện nay có rất nhiều phương pháp
xác định hàm lượng kháng sinh hiệu quả cao như phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao ( HPLC), huỳnh quang tia X, các phương pháp quang học hay các phương
pháp điện hóa để phân tích kháng sinh được qui định trong dược điển. Tuy nhiên, hầu
như các phương pháp trên đều được thực hiện trên các thiết bị đắt tiền, chi phí cho quá
trình phân tích tốn kém, quy trình xử lí mẫu và tách chất tốn dung môi và mất nhiều thời
gian không phải phòng thí nghiệm phân tích nào cũng thực hiện được.
Xuất phát từ thực tế này, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xây dựng
phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa
biến để định lượng đồng thời một sốhoạt chất có trong thuốc kháng sinh thuộc họ βLactam”. Với mục tiêu là nghiên cứu quy trình phân tích nhóm β-Lactam bằng
phương pháp phổ hồng ngoại gần với kĩ thuật hồi qui đa biến để kiểm định nhanh
chất lượng lượng thuốc trên thị trường hiện nay.

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 11 of 148.

1

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
12 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về nhóm kháng sinh β-lactam

1.1.1. Khái niệm và phân loạinhóm β-lactam
Kháng sinh là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances) được tạo ra
bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes), có tác dụng ức chế sự
phát triển của các vi sinh vật khác [2].
Nhóm β-lactam là một họ kháng sinh rất lớn, bao gồm các kháng sinh có cấu trúc
hóa học chứa vòng β-lactam. Khi vòng này liên kết với một cấu trúc vòng khác sẽ
hình thành các phân nhóm lớn tiếp theo.
Cáckháng sinh β-lactam được chia thành 4 nhóm gồm các penicillin tự nhiên
và

tổng

hợp,cáccephalosporin

bán

tổng

hợp,các

chấtcarbapenem,

monobactam.Trong đó có hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất là nhóm các
penicillin và cephalosporin.
Các penicillin và cephalosporin tự nhiên được chiết tách từ môi trường nuôi
cây nấm penicilium notaum mà nay gọi là penicillin chrysogenum và
cephalosporium aeremonium [2].
1.1.1.1. Nhóm penicillin

Nguồn gốc: Lexander Fleming (1929) phát hiện môi trường nuôi cấy penicillium
notatum, P. chysogenum.Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillin
được đưa ra trong bảng 1.1.

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 12 of 148.

2

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
13 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Bảng1.1. Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillin.
Công thức cấu tạo nhóm Penicillin

R

Tên thuốc

Kháng sinh thuộc họ penicillin có cấu trúc mạch vòng beta- lactam (amin nội
vòng) gắn với mạch ngang R-CO-NH, được gọi là các amin của 6-Amino
penicillanie (A.6.A.P) có công thức chung R – C9H11N2O4S [4,7].
Tính chất: Là chất bột màu trắng, dễ bị phá hủy trong môi trường oxi hóa, môi
trường có tính kiềm và nhiệt độ cao, hoặc do tác dụng của nước, của men penicillin

naza (do vi khuẩn đường ruột hay vi khuẩn Gr (-) sinh ra.
Phân loại:
Sự thay đổi nhóm thế trong cấu trúc của penicilin bán tổng hợp dẫn đến sự thay
đổi tính bền vững với các enzym penicilinase và β-lactamase, thay đổi phổ kháng
khuẩn cũng như hoạt tính kháng sinh trên các chủng vi khuẩn gây bệnh.
Dựa vào phổ kháng khuẩn, có thể tiếp tục phân loại các kháng sinh nhóm
Penicilin thành các phân nhóm với phổ kháng khuẩn tương ứng bảng như sau:
 Penicillin nhóm 1: Các penicillin phổ kháng khuẩn hẹp gồm Gồm:
benzylpenicilin (penicillinG), phenoxymethylpenicilin (penicillin V),

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 13 of 148.

3

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
14 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

penicillin chậm (procain benzylpenicilin, benzathin benxylpenicilin và
benethamin penicillin).
 Penicillin nhóm 2: Các penicillin phổ kháng khuẩn hẹp đồng thời có tác
dụng trên tụ cầu gồm Methicillin, oxacillin, Cloxacillin (CLO),
Dicloxacillin, Nafcillin.
Dược động học

Tất cả các thuốc (trừ methicilin) đều bền với axit dạ dày và hấp thu tốt
qua đường tiêu hóa.Thức ăn làm giảm hấp thu nên dùng trước và sau khi
ăn một giờ.
 Penicillin nhóm 3: Các penicillin phổ kháng trung bình gồm ampicilin và
amoxilin.
 Penicillin phổ rộng: Hay penicillin chuyên trị vi khuẩn nhóm
Pseudomonas aeruginosa gồm 2

nhóm nhỏ là Carboxypenicilin và

Ureidopenicilin
-

Carboxypenicilin: Gồm các thuốc: carbenicilin, ticarcilin, temocilin…có
phổ kháng khuẩn giống aminopenicilin nhưng rộng hơn.

-

Gồm các thuốc azlocilin, mezlocilin, piperacilin có phổ kháng khuẩn
giống carboxypenicilin cộng thêm Klebsiella và một số vi khuẩn Gr (-)
khác.

1.1.1.2.Nhóm cephalosporin
Nguồn gốc:
Cephalosporin trong tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm
Cephalosporin acremonium có hoạt tính kháng khuẩn thấp nên không được dùng
trong lâm sàng. Các cephalosporin hiện đang dùng là các chất bán tổng hợp từ 7amino-cephalosporinic (7ACA).Cấu trúc vòng 7ACA cũng dễ bị cephalosporinase
phá hủy làm mất tác dụng kháng khuẩn.
Cấu trúc chung gồm vòng β- lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh.
Khi thay đổi các gốc R được các cephalosporin có độ bền,tính kháng khuẩn và dược

động học khác nhau.

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 14 of 148.

4

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
15 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Công thức hóa học:
Cấu trúc hóa học của các kháng sinh nhóm cephalosporin đều là dẫn xuất của
Axit 7-aminocephalosporanic (viết tắt là A7AC). Các cephalosporin khác nhau
được hình thành bằng phương pháp bán tổng hợp.Cấu trúc chung gồm vòng βlactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh. Khi thay đổi các gốc R1, R2 được các
cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau. Công thức
cấu tạo của một số hoạt chất trong nhóm cephalosporin được đưa ra trong bảng 1.2.
Phân loại:
Dựa vào phổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ.Các
cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn G+ mạnh hơn nhưng trên vi
khuẩn G- yếu hơn thế hệ sau. Các tên thuốc sử dụng các thế hệ Cephalosporin được
đưa ra trong bảng 1.3.

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 15 of 148.

5

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
16 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Bảng 1.2.Công thức cấu tạo của các hoạt chất trong nhóm cephalosporin.

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 16 of 148.

6

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
17 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Bảng 1.3.Các thế hệ Cephalosporin.
Thế hệ

Tên thuốc
Cefazolin

Cephalosporin thế hệ 1

Cephalexin
Cefadroxil
Cefoxitin
Cefaclor

Cephalosporin thế hệ 2

cefafrozil
cefuroxim
cefotetan
ceforanid
Cefotaxim
Cefpodoxim
Ceftibuten
Cefdinir
Cefditoren

Cephalosporin thế hệ 3
Ceftizoxim
Ceftriaxon
Cefoperazon
Ceftazidim
Cephalosporin thế hệ 3

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 17 of 148.

Cefepim

7

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
18 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

1.1.1.3.Các kháng sinh β-lactam khác.
Carbapenem
Dẫn xuất tự nhiên là thienamycin được lấy từ Streptomyces catteifa nhưng
không bền nên không dùng trong điều trị.
Imipenem là dẫn xuất của N-formidoyl và meropenem là dẫn xuất của
demethylcarbamoyl pyrolidinyl của thienamycin bền vững hơn.
Monobactam:
Kháng sinh monobatam là kháng sinh mà công thức phân tử có chứa β-lactam
đơn vòng.Chất điển hình của nhóm này là aztreonam.
1.1.2. Tính chất vật lývà hóa học các kháng sinh nhóm β- Lactam
Các β- Lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong
nước, dạng muối natri và kali dễ tan, tan được trong metanol và một số dung môi
hữu cơ có độ phân cực vừa phải, tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần
chứa đồng thời nhóm -COOH và –NH2.

Cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy thuộc vào cấu trúc khác làm
dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài,
giảm độ hấp thụ).
 Tính chất hóa học các kháng sinh nhóm β- Lactam
Tính không bền của vòng β-lactam:
Sự tấn công của các tác nhân thân điện tử (An): Các bazơ mở vòng azetidin-2on, tạo ra những dẫn xuất của axit cephalosporic không có hoạt tính sinh học [5].
Ví dụ: các bazơ (NaOH, KOH) đậm đặc tạo muối của axit cephalosporic.
Tính axit:
Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa=2,5-2,8 tùy vào cấu trúc
phân tử.Trong môi trường axit hoặc kiềm, β-lactamcó tác dụng phân cắt khung phân
tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.
Các penicillin là các axit khó tan trong nước, dạng muối natri hoặc kali dễ tan
dùng để pha thuốc tiêm.

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 18 of 148.

8

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
19 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Các cephalosporin có vòng β-lactam đều kém bền do cộng hưởng amid không
tồn tại. Cộng hưởng amit mất đi chủ yếu còn do có cộng hưởng “en-amin”.

So với penicillin thì các cephalosporin bền với axit hơn, tuy nhiên do cộng
hưởng en-amin mà phản ứng cộng hợp ái điện tử vẫn xảy ra tại trung tâm (-), kéo
theo cắt đứt đường nối amit. Đó là quá trình thủy phân axit, chất đầu tiên tạo thành
là axit cephalosporoic.Các cephalosporin có tính axit khá mạnh của axit α, β không
no.
Phản ứng chuỗi acilamino
Bản chất của chuỗi acilamino ở 7-β xác định tính bền của cephalosporin.Một
sự cản trở không gian tạo ra ở gần vòng β-lactam thì không thuận lợi cho tác dụng
của β-lactam và vì vậy có tác dụng bảo vệ.
Phản ứng của nhóm thế R2 ( nhóm R2 thuộc cấu trúc cephalosporin)
Sự thay đổi nhóm thế R2 tạo ra nhiều cephalosporin bán tổng hợp khác nhau.Vì
vậy, phản ứng tại các nhóm thế này rất quan trọng. Sự thay đổi trên R2 làm thay đổi
đặc tính dược động học phân tử .
1.2. Các phương pháp phân tích định lượng nhóm kháng sinh β-lactam.
1.2.1. Phương pháp đo quang
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang
học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang…Các phương
pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định βlactam, đặc biệt trong dược phẩm [8 ].
Các β-lactam hấp thụ các tia UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ. Chúng
tạo thành phức chất với một số ion kim loại hoặc tham gia phản ứng quang hóa giúp
nâng cao độ nhạy của phép đo.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5147-90 đã qui định phương pháp gián tiếp sử
dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS xác định Penicillin tổng số trong thịt và
sản

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 19 of 148.

9

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
20 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

phẩm thịt, dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. Phương pháp này dựa
vào phản ứng tạo phức đặc trưng và hoàn toàn định lượng của cadimi với thuốc thử
phenantrolin-cadimi sinh ra phức bền. Chiết phức này bằng nitrobenzen và đo phổ
hấp thụ nguyên tử AAS của kim loại cadimi trong phức ở pha hữu cơ, hay phân hủy
pha hữu cơ lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% và đo phổ của cadimi. Phương pháp
này phức tạp, không đặc trưng và chỉ xác định được lượng tổng Penicillin.
Wei Liu và cộng sự [36] đã sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ
luminol – K3Fe(CN)6 kết hợp với phương pháp chiết pha rắn để phân tích một số βlactam trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0,5mg/l, cefadin là 0,04 mg/l, CEP là 0,1
mg/l .
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các
phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và
trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích việc
xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần
thủy phân mới phát hiện cũng được.
Sheikha M. Al- ghannam [35] cũng đã sử dụng phương pháp hấp thụ nguyên
tử AAS để xác định hai hợp chất của cephalosporins (Cephalexin monohydrate và
Cephradine). Các quy trình này dựa trên sự tạo phức cặp ion giữa các thuốc với
muối ammonium reineckate. Các kết tủa tạo thành dùng để định lượng hoặc bằng
phương pháp đo quang trắc hoặc bằng phương pháp AAS. Các phương pháp này
gồm phản ứng của các thuốc với muối. Reinecke trong môi trường axit ở nhiệt độ
25 ± 20. Quy trình phép phổ quang kế (quy trình 1) dựa trên sự hòa tan tạo kết tủa

bằng axeton, đo độ hấp thụ của dung dịch tại bước sóng 525 nm. Còn đối các quy
trình phổ hấp thụ AAS (quy trình 2) được định lượng trực tiếp hay gián tiếp thông
qua sự tạo thành các kết tủa crom hay lượng crom dư không phản ứng trong dung
dịch lọc tại bước sóng 358,6 nm. Theo định luật Lambert – Beer cho nghiên cứu các
mẫu thuốc trong khoảng 0,1-1,5 mg mL-1 cho phổ quang kế và 5-70 μg mL-1 cho
phương pháp AAS, hệ số tương quan ≥ 0,9965. Cả hai phương pháp đều có độ

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 20 of 148.

10

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
21 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

chính xác khi phân tích các cephalosporins trong các mẫu thuốc và đều cho phần
trăm độ thu hồi tốt từ 98,90 ± 0,94 đến 100,15 ± 0,97 mà không cần thêm phụ gia.
1.2.2. Các phương pháp sắc ký
Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197-2004 qui định phương pháp định lượng
Penicillin [13] trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản được tách ra khỏi nền mẫu bằng dung dịch đệm
phosphat, pH= 9, làm sạch và cô đặc dịch chiết trên cột Bond Elut C18, dẫn xuất
hoá và định lượng bằng HPLC với detector PDA. Qui trình này trải qua quá trình
dẫn xuất phức tạp và mới chỉ dừng lại ở phạm vi thuỷ sản.

TitusA.M.Msagati và cộng sự [4] đã xác định lượng dư các β-lactam trong thực
phẩm bằng sắc ký lỏng – khối phổ bằng hỗn hợp đệm phosphat,
tetraetylammoniumclorua (Et4NCl) và acetonitril.Sau đó, các β-lactam sẽ được tách
và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ chế độ ion dương (LC-PI-ESI-MS). Giới
hạn phát hiện của phương pháp này đối với penicillin G và penicillin V trong gan và
bầu dục là là 1 ng/kg, trong sữa là 0,7 µg/l.
Helio A.Martins-Júnior [25] cũng đã sử dụng phương pháp LC/MS để xác định
lượng dư kháng sinh có trong sữa. Mục đích của nghiên cứu này nhằm phát triển
một phương pháp phân tích mới đơn giản và nhanh chóng để xác định và định
lượng mười bốn kháng sinh từ các mẫu sữa khác nhau .Trong đó, có năm β-lactam,
bốn sulfonamides, ba tetracycline, một macrolid và một cephalosporin. Các chất
này đều được xác định trong khoảng nồng độ 0,75-3,75 mg L-1, hệ số tuyến tính (r2)
cao hơn 0,9960, với thời gian phân tích ít hơn 10 phút. Giới hạn định lượng thấp
nhất và cao nhất của Dicloxacillin và erythromycin tương ứng 0,05 và 9,77 µg L-1,
có hiệu suất thu hồi dao động từ 65-125%, độ lệch chuẩn từ 2,0 to 15%.
Phương pháp bằng sắc ký lỏng khối phổ-tandem (LC-MS / MS) cũng đã được
Frédérique van Holthoon và các cộng sự [23] sử dụng để xác định tám penicillin
trong các mô của heo, sữa và thức ăn gia súc . Kết quả đạt độ chính xác dao động
trong khoảng 94-113% (cơ bắp), 83-111% (thận) và 87-103% (sữa) và 88-116%

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 21 of 148.

11

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
22 of 148.

văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

(thức ăn gia súc). Độ chính xác (độ lệch chuẩn tương đối (RSD) r) trong ngày dao
động từ 5-13% (cơ bắp, n = 18), 4-17% (thận, n = 7) và 5-18% (sữa, n = 7) đến 1132% (thức ăn gia súc, n = 18). Độ chính xác lặp lại giữa các ngày (RSDRL, n = 18)
dao động 6-23% (cơ bắp) để 11-36% (thức ăn gia súc).
Tác giả Yuko Ito và cộng sự [4] thuộc Viện sức khỏe cộng đồng (Nhật Bản)
đã ứng dụng kĩ thuật làm sạch qua cột trao đổi ion để xác định 6 penicillin:
Penicillin G, Penicillin V, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, và dicloxacillin trong
thịt. Các penicillin được chiết ra khỏi nền mẫu thịt lợn với nước, nền mẫu thịt bò
với NaCl 2%, làm sạch qua cột chiết pha rắn trao đổi ion và xác định bằng sắc ký
lỏng cặp ion với detectơ tử ngoại. Hiệu suất thu hồi của phương pháp từ 73 - 95%.
Giới hạn phát hiện của phương pháp cho các penicillin là 0,02 mg/viên.
Tác giả E.Benito-Pena và các cộng sự [22] đã sử dụng phương pháp HPLC,
detector UV để phân tích đồng thời các kháng sinh β-lactam (penicillin G,
amoxicillin, ampicillin, penicillin V, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin và nafcillin)
trong nước thải. Phương pháp này dựa trên chiết pha rắn (SPE) và sắc ký lỏng hiệu
năng cao. Các penicillin đã được tách ra bằng cách sử dụng cột LUNA C18 (150
mm x 4.6 mm, 5 µm), gradient rửa giải với các pha động bao gồm các axit
trifluoroacetic, dung dịch nước và acetonitril tại bước sóng 220 nm. Hiệu suất thu
hồi đạt trong khoảng 82-97% (RSD 2-9%) cho tất cả các kháng sinh trừ amoxicillin
(52%, RSD 8%), giới hạn phát hiện trong khoảng 8-24 ng L-1.
J.M.Cha và các cộng sự [27] cũng đã dùng phương pháp HPLC – MS để xác
định lượng vết của thuốc kháng sinh β-lactam trong mẫu nước tự nhiên và nước
thải. Mẫu nước được làm giàu bằng chiết pha rắn, cột Xterra MS C18 (2,1mm x
50mm,; 2,5 µm), pha động gồm axit focmic,metanol và acetonitil. Các chất phân
tích bao gồm amoxicillin (AMOX), ampicillin (AMP), oxacillin (OXA), cloxacillin
(ClOx) và cephapirin (CEP). Hiệu suất thu hồi trung bình trong các mẫu thường
trên 75% (trừ amoxicillin) với độ lệch chuẩn thấp hơn 10% trong các mẫu nước.

Amoxicillin có hiệu suất thu hồi kém (dưới 40%). Giới hạn phát hiện phương pháp
(MDL) được ước tính khoảng từ 8 - 10 ng/L với nước bề mặt, 13 - 18 ng / L với

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 22 of 148.

12

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
23 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

nước thải trước xử lý và 8 - 15 ng / L nước thải sau xử lý của một nhà máy xử lý
nước thải.
Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments cùng các cộng sự [19] đã
sử dụng phương pháp HPLC để xác định 8 hợp chất penicillin (benzylpenicillin,
phenoxymethylpenicillin, ampicillin, amoxicillin, nafcillin, oxacillin, cloxacillin, và
dicloxacillin) ở mức lượng vết trong các mô cơ. Các điều kiện chiết các penicillin
với đệm phosphat có pH = 9 sau khi chiết bằng cột chiết tách pha rắn C18, phản
ứng với anhydrit benzoic ở 500C trong 5 phút và với 1,2,4-triazol, dung dịch thủy
ngân (II ) clorua có pH = 9 ở 650C trong 10 phút. Các hợp chất dẫn xuất được tách
rửa trên một cột C18 với pha động chứa acetonitril và đệm phosphat (pH=6; 0,1
mol/L) được nạp với natri thiosunfat và cặp ion tetrabutylammonium-hydro sunfat.
Giới hạn phát hiện phương pháp là khoảng 3-11 µg/l.
1.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại

1.2.3.1.Nguyên tắc phương pháp phổ hồng ngoại FTIR
Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (FTIR) là một trong những kỹ thuật
phân tích rất hiệu quả.Các hợp chất hoá học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ
hồng ngoại.Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất
hoá học dao động với nhiều tần số dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ
hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại
đặc trưng cho các nhóm chức và các liên kết có trong phân tử . Do vậy, phổ hồng
ngoại của một hợp chất hoá học coi như "dấu vân tay", có thể căn cứ vào đó để
nhận dạng chúng.
Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổ hồng ngoại
vượt trội hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng
hưởng từ điện tử vv…) là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử
nhanh, không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp. Phổ hấp thu hồng ngoại
là phổ dao động quay vì khi hấp thu bức xạ hồng ngoại thì cả chuyển động dao
động và chuyển động quay đều bị kích thích.

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 23 of 148.

13

Trường ĐHKHTN


Header Page Luận
24 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Bản chất của phương pháp phổ hồng ngoại là dựa trên hiện tượng các hợp chất
hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ hồng ngoại. Các phân tử chỉ có
khả năng hấp phụ bức xạ hồng ngoại khi chúng phải thỏa mãn 2 yếu tố:
- Một là tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (các nguyên tử và các
liên kết trong phân tử) bằng chính tần số dao động của bức xạ tới.
- Hai là một phân tử chỉ hấp thụ bức xạ hồng ngoại khi nào sự hấp thụ đó gây
nên sự biến thiên momen lưỡng cực của chúng.
Do sự hấp thụ chọn lọc này mà khi chiếu chùm bức xạ điện từ với một dải tần
số khác nhau đi qua môi trường vật chất thì sau khi đi qua, chum bức xạ này sẽ bị
mất đi một số bức xạ có tần số xác định nghĩa là các tia này đã bị hấp thụ.
*Các vùng phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại thường được ghi với trục tung biểu diễn độ truyền qua T hoặc
độ hấp thụ A, trục hoành biểu diễn số sóng (cm-1).
- Độ truyền qua T: là tỷ số của cường độ bức xạ truyền qua và cường độ bức xạ tới.
- Độ hấp thụ ánh sáng (A): là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền quang.
Bức xạ hồng ngoại là một vùng bức xạ điện từ có độ dài bước sóng từ 0,8 đến
1000µm và chia thành ba vùng:
- Vùng hồng ngoại gần (near infrared): 12500-4000 cm-1 (λ = 0,8–2,5µm)
- Vùng hồng ngoại trung (medium infrared): 4000-400 cm-1 (λ = 2,5–50µm)
- Vùng hồng ngoại xa (far infrared): 400-10 cm-1 (λ = 50-100µm).
Hầu hết các nhóm nguyên tử trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ ở vùng 4000650cm-1.
1. Vùng hồng ngoại gần (NIR):

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 24 of 148.

14

Trường ĐHKHTN

Header Page Luận
25 of 148.
văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Trong vùng 12500 cm-1 -4000 cm-1 có rất nhiều đám phổ có liên quan đến
nguyên tử H. Trong số đó, dao động co giãn (bội) của O-H gần 7140 cm-1 và N-H
gần 6667 cm-1, đám phổ tổ hợp do các dao động co giãn và dao động biến dạng của
C-H của nhóm ankyl ở 1548 cm-1 và 3856 cm-1..
Độ hấp thụ của đám phổ NIR thấp hơn từ 10 đến1000 lần so với các đám phổ
vùng hồng ngoại giữa.Vùng NIR có thể ghi được với hệ quang học thạch anh, kết
nối với các detectơ nhạy với NIR và nguồn bức xạ mạnh hơn.
 Vùng hồng ngoại trung :
Vùng này được chia thành vùng "tần số nhóm" 4000 – 1300 cm-1 và vùng"dấu vân
tay" 1300 - 650 cm-1. Trong khoảng 4000 – 2500 cm-1 sự hấp thụ đặc trưng cho dao
động co giãn của H với các nguyên tố khối lượng < 19.
Phần chủ yếu trong phổ giữa 1300 và 650 cm-1, là các tần số co giãn của liên
kết đơn và tần số các dao động uốn (các tần số bộ khung) của hệ nhiều nguyên tử.
Đó là vùng "nhận dạng" "(vùng "dấu vân tay").Vùng phổ này hết sức đa dạng, khó
cho việc nhận biết riêng rẽ các đám phổ một cách chắc chắn, nhưng kết hợp các
đám phổ hấp thụ, giúp cho việc nhận biết các chất.
 Vùng hồng ngoại xa:
Vùng 667 – 10 cm-1 bao gồm các dao động biên dạng của C, N, O, F với các
nguyên tử khối lượng > 19 và các dao động biến dạng trong hệ thống mạch vòng
hoặc chưa no. Vùng dao động tần số thấp trong phổ hồng ngoại rất nhạy đối với sự
thay đổi cấu trúc phân tử, bởi vậy đám phổ vùng hồng ngoại xa thường cho phép dự
đoán các dạng đồng phân.

Chuyên ngành hóa phân tích
Footer Page 25 of 148.

15

Trường ĐHKHTN